CN101302506A - 一种羽毛角蛋白降解菌的固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种羽毛角蛋白降解菌的固定化方法及其固定化发酵条件，包括：(1)将壳聚糖的醋酸溶液逐滴注入到NaOH、CH₃OH的凝结液中，得到白色球形壳聚糖，水洗至中性，丙酮洗涤脱色，用滤纸吸去其表面水分；(2)用灭过菌的蒸馏水把羽毛角蛋白降解菌嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ从斜面培养基上洗下，加入到装有增殖培养基的摇瓶中，置于摇床增殖10～20h；(3)将上述球形壳聚糖经灭菌，于无菌条件下加入到增殖培养基，再置于摇床中固定化1～5天，过滤，即得壳聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品，将其加入到发酵培养基中发酵培养。本发明方便可行，产品具有一定的生物相容性，寿命长，易回收，不污染环境。

Description

一种羽毛角蛋白降解菌的固定化方法

技术领域

本发明涉及微生物菌种的固定化领域，特别是涉及一种羽毛角蛋白降解菌的固定化方法及其固定化发酵条件。

背景技术

在现代农业中，大规模的家禽养殖产生了大量的蛋白质废物，其中羽毛废弃物产量最多。随着工业进步、人民生活水平的提高、医疗保健的加强及畜牧业的发展，动物蛋白质资源的短缺逐渐明显，已慢慢成为我国饲料工业发展的制约因素，国内氨基酸原料(蛋白质)的短缺越来越严重，因此，大力的研究开发动物蛋白质、氨基酸及其连锁产品非常有必要。目前，处理角蛋白多数是用物理(高温、高压)和化学(强碱、强酸)水解法，但是存在能耗多，破坏氨基酸、三废不易处理、环境污染严重、经济效益不高等问题。为了更好地利用角蛋白资源并且保护环境，许多研究者试图采用生物技术来处理羽毛粉，以提高其蛋白品质，从而节省家禽口粮中大豆、鱼粉的用量，促进家禽业的发展，或作其他用途。

用微生物降解羽毛，可裂解二硫键，完全降解羽毛，脱水干燥即得成品，但目前国内的研究多停留在菌种筛选，角蛋白酶分离提纯及降解机理上，尚未得到工业化生产应用，随着发酵工程的进一步发展，此类方法在未来的羽毛粉加工中将会有广阔的前景。

在2006年11月15日公开的专利号为200610051886.8的《一种微生物降解羽毛的方法》中提及利用地衣芽孢杆菌ZJUEL31410降解羽毛的工艺，但是该专利未对菌种固定化，给产业化带来不便。

固定化细菌能够保持细胞内酶系的原始状态与天然环境，有效地利用游离细菌细胞的完整酶系统和细胞的选择通透性，既有固定化酶的优点，又具有自身的优越性。省去酶的分离费用；多酶系统，无需辅酶再生；细菌生长停滞时间短，细胞多，反应快；对污染的抵抗力强；可连续发酵；蒸馏或提取前不用分离出细胞，保持酶的原始状态，从而加强了稳定性，可连续使用，节约养料；使用固定化细胞反应塔，一边进料，一边排出发酵液，避免反馈抑制和产物消耗，因此，越来越广泛地应用于食品与发酵工业中。

壳聚糖因其来源丰富，价格低廉，机械性能和生物相容性好等特点，可以应用于固定化的载体。在2007年10月3日公开的专利号为200710067561.3的《一种废水处理用微生物固定化材料的制备方法》中是利用壳聚糖及膨润土等为材料制成的固定化材料用于微生物固定化水处理技术，但不涉及具有某种特殊降解功能的菌种发酵的固定化。

本发明人认为利用固定化微生物发酵法降解羽毛极具开发前景，关键在于能选择高效的菌株和合适的固定化材料，固定化工艺，并优化出最佳发酵条件。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，该方法方便可行，产品寿命长，易回收，不污染环境。

本发明的一种羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，包括：

(1)将1wt％～6wt％的壳聚糖的醋酸溶液逐滴注入到20wt％NaOH、30wt％CH₃OH的凝结液中，得到白色球形壳聚糖，水洗至中性，丙酮洗涤脱色，用滤纸吸去其表面水分；

(2)用灭过菌的蒸馏水把羽毛角蛋白降解菌嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ从斜面培养基上洗下，加入到装有40～120mL增殖培养基的250mL摇瓶中，置于30～70℃，120～160rpm的摇床增殖10～20h；

(3)将上述球形壳聚糖经121℃灭菌20-30min，称取1～5g，于无菌条件下加入到40mL～120mL增殖培养基，再置于30～70℃，120～160rpm的摇床中固定化1～5天，过滤得壳聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品，将其加入到发酵培养基中发酵培养，测定发酵液中的可溶蛋白含量和氨基酸含量，以确定降解效果。

所述的步骤(1)中壳聚糖溶液是3wt％的壳聚糖的醋酸溶液。

所述的步骤(2)中斜面培养基(g/100mL)为0.5g牛肉膏，1g蛋白胨，0.5g氯化钠，2g琼脂，pH＝7.4～7.6。

所述的步骤(2)中的增殖培养基为50mL。

所述的步骤(2)、(3)的增殖培养基(g/100mL)为牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，pH＝7.4～7.6。

所述的步骤(3)中球形壳聚糖与增殖培养基的投加量为2.5g/50mL，固定化2天。

所述的步骤(3)中最优发酵条件为：发酵温度40℃，发酵培养基pH＝7.4-7.6，摇床转速150rpm，种龄12h，固定化时间2天，投加量2.5g/50mL。

所述的步骤(3)中发酵培养基(g/100mL)为羽毛粉2.0g，葡萄糖1g，干酪素0.2g，KCl 0.04g，NaCl 0.03g，吐温800.4g，磷酸氢二钠∶磷酸二氢钾＝0.4∶0.03，pH＝7.4-7.6。

本发明是利用壳聚糖表面吸附法固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ，固定化机理是当球形壳聚糖加到角蛋白降解菌的培养液中时，由于球形壳聚糖表面的吸附作用，在其周围形成了一个潜在的丰富营养源。同时，角蛋白降解菌孢子可通过扩散、对流或主动运输方式转移到球形壳聚糖表面，在水动力及物化作用下，吸附在其表面，然后利用其周围形成的营养源进行生长、繁殖，就形成固定化的角蛋白降解菌。

本发明首次利用壳聚糖为主要原料来固定化本实验室分离纯化的一种高降解能力的羽毛角蛋白降解菌，并优化了发酵条件，为工业连续发酵降解羽毛提供了良好的条件，其中3％的壳聚糖的醋酸溶液制成的壳聚糖成球性能较好，固定化时间2天，50mL增殖培养基中加入2.5g壳聚糖小球载体的固定化效果最好。且在发酵培养基中加入干酪素可以诱导固定在壳聚糖中的羽毛角蛋白降解菌DHHJ产生角蛋白酶，进而在羽毛这种非均相环境下发生降解现象。壳聚糖材料及制备的壳聚糖凝胶小球具有一定的生物相容性，且壳聚糖小球在发酵过程中具有较强的机械性能，寿命远大于实验进行的10批发酵，具备韧性高，使用寿命长的特点。

所选用的嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)是由本课题组分离纯化得到的，其降解羽毛能力较强，分解羽毛效果显著，菌株及其代谢产物——角蛋白酶，不产生有害物质，其降解羽毛产物——可溶蛋白和氨基酸，能作为安全的饲料添加剂及其他用途。

菌种的分离和来源：见申请号为200710171939.4的《一种产角蛋白酶的菌株及其应用》。该微生物的培养方法：该嗜麦芽寡养单胞菌降解羽毛的种子培养方法和发酵培养方法见下：将菌株DHHJ接种于活化培养基，于40℃恒温活化培养12h。取活化后的培养液以4％的浓度比接种于只含鸡毛的发酵培养基中，于40℃、150rpm培养。活化培养基为牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g。

有益效果

(1)本发明方便可行，易回收，不污染环境；

(2)制备的球形壳聚糖具有一定的生物相容性和较强的机械性能，韧性高，寿命长。

附图说明

图1为球形壳聚糖固定化羽毛角蛋白降解菌DHHJ的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

3wt％壳聚糖的醋酸溶液用移液管逐滴注入到20％NaOH、30％CH₃OH凝结液中，得到白色球形壳聚糖，水洗至中性，丙酮洗涤脱色，用灭过菌的蒸馏水把羽毛角蛋白降解菌DHHJ从斜面培养基上洗下，加入到装有增殖培养基(50mL)的250mL摇瓶中，置于40℃，130rpm的摇床增殖15h，用滤纸把制得的壳聚糖小球表面水分吸去，称取10g，经121℃灭菌30min，在无菌条件下向50mL增殖培养基加入已灭菌得球形壳聚糖2.5g，置摇床中，40℃，130rpm固定化3天，过滤得壳聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品。

将成品连续分批发酵得第一批羽毛角蛋白分解率最高，达70％，而后依次下降，当发酵进行到第三批时，羽毛分解率趋于稳定，一直保持到发酵进行到第10批，仍无明显下降，均接近60％。

实施例2

3wt％壳聚糖溶液用移液管逐滴注入到20％NaOH、30％CH₃OH凝结液中，得到白色球形壳聚糖，水洗至中性，丙酮洗涤脱色，用灭过菌的蒸馏水把羽毛角蛋白降解菌DHHJ从斜面培养基上洗下，加入到装有增殖培养基(50mL)的250mL摇瓶中，置于40℃，130rpm的摇床增殖12h，用滤纸把制得的壳聚糖小球表面水分吸去，称取5g，经121℃灭菌30min，在无菌条件下向50mL增殖培养基加入已灭菌得球形壳聚糖2.5g，置摇床中，40℃，150rpm固定化2天，过滤得壳聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品。将成品连续分批发酵得发酵第一批的蛋白质和氨基酸含量较高，分别达50.6mg/mL和0.49mg/mL，而后有些许下降，当发酵进行到第三批时，蛋白质和氨基酸含量趋于稳定，一直保持到发酵进行到第10批，仍无明显下降，分别接近48.3mg/mL0.41mg/mL。

实施例3

3wt％壳聚糖溶液用移液管逐滴注入到20％NaOH、30％CH₃OH凝结液中，得到白色球形壳聚糖，水洗至中性，丙酮洗涤脱色，用灭过菌的蒸馏水把羽毛角蛋白降解菌DHHJ从斜面培养基上洗下，加入到装有增殖培养基(50mL)的250mL摇瓶中，置于40℃，130rpm的摇床增殖18h，用滤纸把制得的壳聚糖小球表面水分吸去，称取5g左右，经121℃灭菌30min，在无菌条件下向50mL增殖培养基加入已灭菌得球形壳聚糖2.5g，置摇床中，40℃，150rpm固定化2天，过滤得壳聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品。将成品连续分批发酵得羽毛角蛋白降解菌生长较为稳定，始终保持着较高的菌体浓度和酶活力，分别为2.8DO660和12.2U/mL由于菌体浓度和酶活力与羽毛降解能力有着直接的关系，因此也说明了固定化的角蛋白降解菌能连续稳定降解羽毛的原因。

实验中经过10批发酵的壳聚糖小球形态保持稳定，无腐烂现象。

Claims (8)

1.一种羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，包括：

(1)将1wt％～6wt％的壳聚糖的醋酸溶液逐滴注入到20wt％NaOH、30wt％CH₃OH的凝结液中，得到白色球形壳聚糖，水洗至中性，丙酮洗涤脱色，用滤纸吸去其表面水分；

(2)用灭过菌的蒸馏水把羽毛角蛋白降解菌嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ从斜面培养基上洗下，加入到装有40～120mL增殖培养基的250mL摇瓶中，置于30～70℃，120～160rpm的摇床增殖10～20h；

(3)将上述球形壳聚糖经121℃灭菌20-30min，称取1～5g，于无菌条件下加入到40mL～120mL增殖培养基，再置于30～70℃，120～160rpm的摇床中固定化1～5天，过滤得壳聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品，将其加入到发酵培养基中发酵培养。

2.根据权利要求1所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于：所述的步骤(1)中壳聚糖溶液是3wt％的壳聚糖的醋酸溶液。

3.根据权利要求1所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于：所述的步骤(2)中斜面培养基g/100mL为0.5g牛肉膏，1g蛋白胨，0.5g氯化钠，2g琼脂，pH＝7.4～7.6。

4.根据权利要求1所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的增殖培养基为50mL。

5.根据权利要求1所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于：所述的步骤(2)、(3)的增殖培养基g/100mL为牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，pH＝7.4～7.6。

6.根据权利要求1所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于：所述的步骤(3)中球形壳聚糖与增殖培养基的投加量为2.5g/50mL，固定化2天。

7.根据权利要求1所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于：所述的步骤(3)中发酵条件为：发酵温度40℃，发酵培养基pH＝7.4-7.6，摇床转速150rpm，种龄12h，固定化时间2天，投加量2.5g/50mL。

8.根据权利要求1所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于：所述的步骤(3)中发酵培养基g/100mL为羽毛粉2.0g，葡萄糖1g，干酪素0.2g，KCl 0.04g，NaCl 0.03g，吐温800.4g，磷酸氢二钠∶磷酸二氢钾＝0.4∶0.03，pH＝7.4-7.6。

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