CN107022541A - 一种黑曲霉的固定化方法 - Google Patents

一种黑曲霉的固定化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107022541A
CN107022541A CN201710474115.8A CN201710474115A CN107022541A CN 107022541 A CN107022541 A CN 107022541A CN 201710474115 A CN201710474115 A CN 201710474115A CN 107022541 A CN107022541 A CN 107022541A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fibrous material
fermentation
aspergillus niger
fixation
yield
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710474115.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107022541B (zh
Inventor
应汉杰
余斌
陈勇
张欣
孙文俊
赵南
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Tech University filed Critical Nanjing Tech University
Priority to CN201710474115.8A priority Critical patent/CN107022541B/zh
Publication of CN107022541A publication Critical patent/CN107022541A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107022541B publication Critical patent/CN107022541B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/685—Aspergillus niger

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉的固定化方法，把经过预处理的纤维材料作为固定化介质，将黑曲霉活化后接入装有固定化培养基的发酵容器中培养，使菌株在培养过程中吸附于纤维材料上。以聚酯纤维为固定化介质的气升式纤维床反应器生产柠檬酸，连续生产15批，产酸水平没有降低，发酵工艺稳定。最终柠檬酸产量88.65g/L,发酵速率1.06g/L/h，得率(柠檬酸产量/葡萄糖消耗)93.3％(w/w)。和游离发酵相比，固定化发酵的产量明显提高，发酵周期缩短，发酵液中的菌体量明显减少，粘稠度也随之降低，从而有利于后期的产物和菌体的分离。

Description

一种黑曲霉的固定化方法
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，具体涉及黑曲霉的固定化方法。
背景技术
柠檬酸又名枸橼酸，化学名称2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，是一种重要的有机酸，无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。柠檬酸的物理性状一般为无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的性质。加热至175℃时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油的等能发生反应。柠檬酸在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、桃等果实中。柠檬酸的用途非常广泛，用于食品工业占生产量的75％以上，可做为食品的酸味剂，抗氧化剂，pH调节剂，用于清凉饮料、果酱、水果和糕点等食品中。用于医药工业占10％左右，主要用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品等。用于化学工业等占15％左右，用作缓冲剂、络合剂、金属清洗剂、媒染剂、胶凝剂、调色剂等。在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中都有十分广阔的应用。
黑曲霉(Aspergillus niger)属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，纵梗孢科，曲霉属真菌中的常见种。黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉的最适温度为37℃，对营养要求较低，容易培养。黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝处为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。顶部形成球形顶囊，其上面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上面长有成串黑褐色的球状分生孢子。黑曲霉的菌落形态比较特殊，容易分辨和分离。黑曲霉可以生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶等酶制剂和柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等有机酸，是一种重要的发酵工业菌种。现在工业上一般采用液体发酵培养，但是由于黑曲霉在液体培养时菌量很大，造成发酵液过于粘稠，从而影响了发酵时营养物质的传递，同时对产物与菌体的分离也会造成不利的影响。
随着固定化技术的快速发展，现该技术已广泛应用于生物发酵领域。将丝状真菌菌丝体固定在谷梗或其他一些惰性材料上，或者采用海藻酸钠等载体材料包埋的方法，重复使用，既降低了发酵液粘度，利于氧气及营养物质的传递，提高了细胞利用率和生物反应速率，同时也便于产物的分离提取等后处理加工。近年来，丝状真菌的固定化发酵生产得到了越来越多的关注。
目前应用于黑曲霉的固定方法常见的有吸附法和包埋法，但是国内仍然以包埋法为主。王建龙等用质量分数为1.5％的海藻酸钠包埋一定量的孢子，于摇瓶中培养11天后，发酵液中柠檬酸产量达到40g/L，并经过了6批次连续重复发酵产酸稳定在较高水平。周剑平等采用聚乙烯醇凝胶载体固定黑曲霉的孢子，以初始糖浓度130g/L的玉米粉水解液为底物进行发酵，连续发酵8个周期后，柠檬酸产量可以保持稳定，始终保持在86～92g/L，产率达到70.7％。但是，包埋法所用到的凝胶颗粒机械性能很差，在搅拌发酵的时候很容易发生破碎，同时，包埋法仍然会对颗粒中心的菌体的氧气和营养物质的传递造成阻碍，因此对其柠檬酸的生产效率有了一定的限制。为了更进一步提高柠檬酸的生产效率，简化生产工艺，降低生产成本，仍需要寻找更加天然、高效的固定化材料。
近年来，以多孔纤维材料作为固定化介质的纤维床生物反应器作为一种新型固定化方法受到了广泛关注。用多孔纤维材料做固定材料，不仅工艺稳定，无毒，廉价易得，吸附效果好，重复使用率高，而且对细胞活性具有较好的保护作用，但是由于黑曲霉的菌丝过长，过多，很容易在纤维床表面长满，最后将纤维床包裹在一起，从而严重影响发酵性能，因此很少有人采用吸附法作为黑曲霉的固定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定高效的黑曲霉的固定化方法。
一种黑曲霉的固定化方法，把经过预处理的纤维材料作为固定化介质，将黑曲霉活化后接入装有固定化培养基的发酵容器中培养，使菌株在培养过程中吸附于纤维材料上。
优选地，所述的纤维材料为棉纤维织物、活性炭纤维、纳米纤维、竹纤维、聚醚多元醇泡沫、聚乙烯醇纤维、聚氨酯泡沫、聚乙烯、聚丙烯酰胺、树脂、聚酯纤维、丝绸、细菌纤维素膜、丝瓜瓤和甘蔗渣中的任意一种或几种。
优选地，所述纤维材料以10～50g/L的添加量置于摇瓶容器中。
其中，所述的预处理具体步骤如下：
(1)将纤维材料置于去离子水中清洗1～3h，再将清洗后的纤维材料置于质量分数为10～50％的NaOH溶液中浸泡1～6h，然后将纤维材料置于去离子水中清洗至1～3h，直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将经过步骤(1)处理后的纤维材料置于体积分数为0.1～10％的硅烷偶联剂水溶液中，浸泡10～60min，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后置于120℃烘干，保存备用。
优选地，所述的硅烷偶联剂剂为乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、1,2-双三甲氧基硅基乙烷、甲基苯基二甲氧基硅烷、甲基三乙酰氧基硅烷中的任意一种或几种。
优选地，所述固定化培养基中包括植物浸出液。培养基中添加植物浸出液可以保证黑曲霉可以更好的在纤维材料上固定生长。
浸出液制作方法为：将1～100g植物放入100～1000mL水中，在90～120℃中放置0.5～3h，再用纱布进行过滤，留下上清液，即植物浸出液。
更优选地，所述的植物浸出液为甘蔗渣、玉米芯、玉米秸秆、木薯渣、土豆、麸皮和糠的任意一种或几种浸出液。
优选地，所述的发酵容器为气升式发酵罐，将纤维材料裁剪成长条状，沿垂直方向螺旋缠绕在多条不锈钢丝条上。
优选地，所述的发酵容器为自吸式发酵罐，将纤维材料平铺在与其大小形状相同的钢丝网上，纤维材料与钢丝网一起卷成筒状。
有益效果：相对于现有技术，本发明优势如下：
1、本发明所采用的多孔纤维材料为化学惰性，对细胞没有毒害作用，机械强度高，也不会被细胞代谢分解，不影响微生物的生长代谢，黑曲霉不会在载体表面过度生长，而是均匀的吸附在载体中心，同时在发酵过程中，载体上的死细胞脱落，液体中的新细胞吸附，从而形成一个动态平衡，减少了对细胞的损耗，并且可以重复多批次发酵而产量保持稳定，减少总的发酵时间，节省成本。
2、选用的多孔纤维材料具有较高的孔隙率和比表面积，因此单位体积固定的细胞数目多，不仅固定化的细胞密度大，保证了高密度发酵的优势，而且具有良好的传质性能，传质效率高。和游离发酵相比，固定化发酵的产量明显提高，发酵周期缩短，发酵液中的菌体量明显减少，粘稠度也随之降低，从而有利于后期的产物和菌体的分离。
3、以聚酯纤维为固定化介质的气升式纤维床反应器生产柠檬酸，连续生产15批，产酸水平没有降低，发酵工艺稳定。最终柠檬酸产量88.65g/L,发酵速率1.06g/L/h，得率(柠檬酸产量/葡萄糖消耗)93.3％(w/w)。
附图说明
图1为气升式发酵罐中多孔纤维材料的固定方式示意图；其中，1表示不锈钢丝条；2表示多孔纤维材料；
图2为自吸式发酵罐中多孔纤维材料的固定方式示意图；其中，1表示不锈钢丝网；2表示多孔纤维材料；
图3为采用本发明的柠檬酸固定化发酵方法的示意图；其中，1表示补料瓶；2表示蠕动泵；3表示接种口；4表示排气口；5表示空压机；6表示转子流量计；7表示空气过滤器；8表示空气分布器；
图4为植物浸出液对黑曲霉固定化发酵生产柠檬酸的影响；
图5为硅烷偶联剂对载体固定化黑曲霉效果的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明所述方法可以适用所有黑曲霉菌株，以下实施例所使用的生产柠檬酸的菌株为黑曲霉ATCC12846。
多孔纤维材料由于表面一般带有一定的亲水性，因此在一定程度上阻碍了丝状真菌孢子吸附到多孔纤维材料表面，所以要对多孔纤维材料进行相关预处理，增强载体的表面疏水性，以促进孢子吸附到载体表面。上述多孔纤维材料的预处理方法所确定的一个具体实施方案：
(1)将纤维材料置于去离子水中清洗1～3h，再将清洗后的材料置于10～50％(质量分数)NaOH中浸泡1～6h，之后将材料置于去离子水中清洗至1～3h，直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将经过步骤(1)处理后的多孔纤维材料置于0.1～10％(体积分数)的硅烷偶联剂水溶液中，浸泡10～60min，再将多孔纤维材料置于去离子水中充分漂洗后置于120℃烘干，保存备用。
所述的硅烷偶联剂为乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、1,2-双三甲氧基硅基乙烷、甲基苯基二甲氧基硅烷、甲基三乙酰氧基硅烷中的任意一种或几种。
实施例1多孔纤维材料固定化介质的制备
(1)将聚酯纤维在去离子水中清洗1h，再将其置于25％(质量分数)NaOH中浸泡3h，之后将聚酯纤维在去离子水中清洗3h直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将聚酯纤维置于6％(体积分数)的乙烯基三乙氧基硅烷水溶液中浸泡30min，再将聚酯纤维置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。
实施例2多孔纤维材料固定化介质的制备
(1)将聚乙烯载体在去离子水中清洗1.5h，再将其置于25％(质量分数)NaOH中浸泡2h，之后将聚乙烯在去离子水中清洗2h直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将聚乙烯置于3％(体积分数)的乙烯基三甲氧基硅烷水溶液中浸泡20min，再将聚乙烯置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。
实施例3多孔纤维材料固定化介质的制备
(1)将聚醚多元醇泡沫在去离子水中清洗2.5h，再将其置于25％(质量分数)NaOH中浸泡4h，之后将聚醚多元醇泡沫在去离子水中清洗3h直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将聚醚多元醇泡沫置于2％(体积分数)的甲基三乙酰氧基硅烷水溶液中浸泡15min，再将聚醚多元醇泡沫置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。
实施例4多孔纤维材料固定化介质的制备
(1)将竹纤维载体在去离子水中清洗1.5h，再将其置于25％(质量分数)NaOH中浸泡2h，之后将竹纤维在去离子水中清洗2h直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将竹纤维置于5％(体积分数)的乙烯基三甲氧基硅烷水溶液中浸泡20min，再将聚乙烯置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。
实施例5多孔纤维材料固定化介质的制备
(1)将聚丙烯酰胺在去离子水中清洗3h，再将其置于50％(质量分数)NaOH中浸泡6h，之后将竹纤维在去离子水中清洗3h直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将聚丙烯酰胺置于10％(体积分数)的1,2-双三甲氧基硅基乙烷水溶液中浸泡60min，再将聚丙烯酰胺置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。
实施例6多孔纤维材料固定化介质的制备
(1)将聚氨酯泡沫在去离子水中清洗1h，再将其置于10％(质量分数)NaOH中浸泡1h，之后将竹纤维在去离子水中清洗1h直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将聚氨酯泡沫置于0.1％(体积分数)的甲基苯基二甲氧基硅烷水溶液中浸泡10min，再将聚氨酯泡沫置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。
预处理后的多孔纤维材料的孔隙率＞90％，比表面积＞30m2/m3，不仅固定化的细胞密度大，而且具有良好的传质性能。
实施例7以聚醚多元醇泡沫为固定化介质于摇瓶中生产柠檬酸
按照实施例3的方法将聚醚多元醇泡沫进行预处理，将处理过的聚醚多元醇泡沫以10g/L的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产柠檬酸的固定化介质。
固定化培养基成分：葡萄糖50g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠1g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，甘蔗渣浸出液10ml/L(甘蔗渣与水以质量比为1.5％混合，100℃煮2h后8000rpm离心得到浸出液)；
发酵换液培养基成分：葡萄糖100g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，甘蔗渣浸出液10ml/L，pH4～5。
方法步骤如下：
(1)平板活化：将冻存保藏的黑曲霉孢子接种到平板培养基上，恒温培养箱中35℃静置培养3～4天活化。
(2)挂膜：用无菌水充分洗涤黑曲霉平板得到孢子悬液，转接于装100mL固定化培养基的500ml摇瓶中，于32～35℃，250rpm摇床中培养24～56h，测定发酵液中的残糖浓度。当残糖浓度低于5g/L，挂膜结束，将发酵液全部移出。
(3)固定化反复批次发酵：将相同体积的发酵换液培养基补入摇瓶中，于32～35℃，250rpm摇床中培养64～78h。中途测定残糖含量，当残糖含量低于5g/L时，将瓶中的发酵液全部移出，再补入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产10批，产酸水平基本没有下降。最终柠檬酸产量90.63g/L,发酵速率1.11g/L/h，得率(柠檬酸产量/葡萄糖消耗)95.4％(w/w)。
实施例8以聚酯纤维为固定化介质的气升式纤维床反应器生产柠檬酸
按实施例1的方法将聚酯纤维进行预处理，如图1所示，将聚酯纤维材料2裁剪成长条状，呈螺旋状缠绕在不锈钢丝柱1的侧柱上，作为气升式发酵罐(如图3)中发酵生产柠檬酸的固定化介质，聚酯纤维的添加量为35g/L。
固定化培养基成分：葡萄糖50g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠1g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，木薯渣浸出液10ml/L(木薯渣与水以质量比为3％混合，100℃煮1h后8000rpm离心得到浸出液)；
发酵换液培养基成分：葡萄糖100g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，木薯渣浸出液10ml/L，pH4～5。
方法步骤如下：
(1)平板活化：将冻存保藏的黑曲霉孢子接种到平板培养基上，恒温培养箱中35℃静置培养3～4天活化。
(2)挂膜：用无菌水充分洗涤黑曲霉平板得到孢子悬液，转接于装10L固定化培养基的15L内循环气升式发酵罐中，温度32～35℃，罐压0.8～1.5MPa，通气量1.6～2.0m3/h，培养24～56h，测定发酵液中的残糖浓度。当残糖浓度低于5g/L，则挂膜结束，将发酵液全部移出。
(3)固定化反复批次发酵：将10L的发酵换液培养基用蠕动泵泵入15L气升罐中，温度32～35℃，罐压0.8～1.5MPa，通气量1.6～2.0m3/h，培养60～82h。中途测定残糖含量，当残糖含量低于5g/L时，将发酵罐中的发酵液全部移出，再泵入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产10批，发酵周期稳定在同一水平。最终柠檬酸产量91.27g/L,发酵速率1.15g/L/h，得率(柠檬酸产量/葡萄糖消耗)96.0％(w/w)。
实施例9以竹纤维为固定化介质的自吸式纤维床反应器生产柠檬酸
按实施例4的方法将竹纤维进行预处理，如图2，将处理过的竹纤维材料2以10g/L的添加量平铺在与之大小形状均相同的钢丝网1上，与其卷成筒状，纤维材料层与层之间保持疏松均匀，填充在自吸式发酵罐中作为生产柠檬酸的固定化介质。
固定化培养基成分：葡萄糖50g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠1g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米芯浸出液10ml/L(玉米芯与水以质量比为2.5％混合，100℃煮3h后8000rpm离心得到浸出液)；
发酵换液培养基成分：葡萄糖100g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米芯浸出液10ml/L，pH4～5。
发酵方法步骤如下：
(1)平板活化：将冻存保藏的黑曲霉孢子接种到平板培养基上，恒温培养箱中35℃静置培养3～4天活化。
(2)挂膜：用无菌水充分洗涤黑曲霉平板得到孢子悬液，转接于装有6L固定化培养基的自吸式纤维床反应器中，温度32～35℃，罐压0.5～1.2MPa，通气量0.6～1.2m3/h，培养24～56h，测定发酵液中的残糖浓度。当残糖浓度低于5g/L，则挂膜结束，将发酵液全部移出。
(3)固定化反复批次发酵：将6L的发酵换液培养基用蠕动泵泵入自吸式纤维床反应器中，温度32～35℃，罐压0.5～1.2MPa，通气量0.6～1.2m3/h，培养64～88h。中途测定残糖含量，当残糖含量低于5g/L时，将发酵罐中的发酵液全部移出，再泵入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产15批，产酸水平没有降低，发酵工艺稳定。最终柠檬酸产量88.65g/L,发酵速率1.06g/L/h，得率(柠檬酸产量/葡萄糖消耗)93.3％(w/w)。
实施例10以聚醚多元醇泡沫为固定化介质于摇瓶中生产柠檬酸
同实施例7，不同的是聚醚多元醇泡沫以50g/L的添加量置于摇瓶中。
实施例11添加和不添加植物浸出液对黑曲霉固定化发酵生产柠檬酸的影响
本实施例说明植物浸出液对固定化黑曲霉产柠檬酸的影响，为探讨是否添加植物浸出液对黑曲霉固定化的影响，对比了添加与未添加植物浸出液时固定化黑曲霉的发酵数据。
设置两组实验，第一组实验的固定化培养基和发酵换液培养基中均包括甘蔗渣浸出液，第二组实验的固定化培养基和发酵换液培养基中没有甘蔗渣浸出液，其他成分与第一组实验相同。除培养基成分不同外，两组实验的其他步骤相同。
按实施例4的方法将竹纤维进行预处理，将处理过的竹纤维材料以10g/L的添加量放入500mL锥形瓶中，作为生产柠檬酸的固定化介质。
固定化培养基成分：葡萄糖50g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠1g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，甘蔗渣浸出液10ml/L(甘蔗渣与水以质量比为1.5％混合，100℃煮2h后8000rpm离心得到浸出液)；
发酵换液培养基成分：葡萄糖100g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，甘蔗渣浸出液10ml/L，pH4～5。
发酵方法步骤如下：
(1)平板活化：将冻存保藏的黑曲霉孢子接种到平板培养基上，恒温培养箱中35℃静置培养3～4天活化。
(2)挂膜：用无菌水充分洗涤黑曲霉平板得到孢子悬液，转接于装有100ml固定化培养基的锥形瓶中，温度32～35℃，转速250～300rpm，培养24～56h，测定发酵液中的残糖浓度。当残糖浓度低于5g/L，则挂膜结束，将发酵液全部移出。
(3)固定化反复批次发酵：将100mL的发酵换液培养基换入锥形瓶中，温度32～35℃，转速250～300rpm，培养72～96h。中途测定残糖含量，当残糖含量低于5g/L时，发酵结束。
发酵结果由图4所示，当培养基中未添加植物浸出液时，由于缺乏黑曲霉固定化时所需的一些微量营养因子，造成耗糖缓慢，柠檬酸产量很低。当培养基中添加了植物浸出液之后，耗糖速率明显上升，同时，柠檬酸产量达到了81.4g/L，因此在固定化黑曲霉发酵时需要添加植物浸出液以保证足够的营养因子。
实施例12硅烷偶联剂对载体固定化黑曲霉效果的影响
本实施例说明硅烷偶联剂对固定化黑曲霉产柠檬酸的影响，为探讨偶联剂处理和未处理的纤维材料对黑曲霉固定化的影响，对比了添加未处理的载体和处理后的载体时固定化黑曲霉的发酵数据。
按实施例3的方法将聚醚多元醇进行预处理，将处理过的聚醚多元醇材料以10g/L的添加量放入500mL锥形瓶中，作为生产柠檬酸的固定化介质。同时，将未经过处理的聚醚多元醇材料以10g/L的添加量放入500mL锥形瓶中，同样作为生产柠檬酸的固定化介质。
固定化培养基成分：葡萄糖50g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠1g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，麸皮浸出液10ml/L(麸皮与水以质量比为1.0％混合，100℃煮2h后8000rpm离心得到浸出液)；
发酵换液培养基成分：葡萄糖100g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸钠0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，麸皮浸出液10ml/L，pH4～5。
发酵方法步骤如下：
(1)平板活化：将冻存保藏的黑曲霉孢子接种到平板培养基上，恒温培养箱中35℃静置培养3～4天活化。
(2)挂膜：用无菌水充分洗涤黑曲霉平板得到孢子悬液，转接于装有100ml固定化培养基的锥形瓶中，温度32～35℃，转速250～300rpm，培养24～56h，测定发酵液中的残糖浓度。当残糖浓度低于5g/L，则挂膜结束，将发酵液全部移出。
(3)固定化反复批次发酵：将100mL的发酵换液培养基换入锥形瓶中，温度32～35℃，转速250～300rpm，培养72～96h。中途测定残糖含量，当残糖含量低于5g/L时，发酵结束。
发酵结果如图5所示，当载体未经过偶联剂处理时，载体表面的疏水基团较少，疏水力较弱，无法吸附黑曲霉孢子，大部分孢子仍然进行游离培养，造成固定化效果较差，耗糖速度较慢，柠檬酸产量较低。当添加了处理过的载体之后，84h糖已经基本耗完，同时，柠檬酸产量达到了85.2g/L，因此对固定化载体进行硅烷偶联剂预处理对固定化黑曲霉发酵产柠檬酸有着重要的作用。

Claims (10)

1.一种黑曲霉的固定化方法，其特征在于，把经过预处理的纤维材料作为固定化介质，将黑曲霉活化后接入装有固定化培养基的发酵容器中培养，使菌株在培养过程中吸附于纤维材料上。
2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述的纤维材料为棉纤维织物、活性炭纤维、纳米纤维、竹纤维、聚醚多元醇泡沫、聚乙烯醇纤维、聚氨酯泡沫、聚乙烯、聚丙烯酰胺、树脂、聚酯纤维、丝绸、细菌纤维素膜、丝瓜瓤和甘蔗渣中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述纤维材料以10～50g/L的添加量置于发酵容器中。
4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述纤维材料的预处理具体步骤如下：
(1)将纤维材料置于去离子水中清洗1～3h，再将清洗后的纤维材料置于质量分数为10～50％的NaOH溶液中浸泡1～6h，然后将纤维材料置于去离子水中清洗至1～3h，直到NaOH被清洗干净，载体表面呈中性；
(2)将经过步骤(1)处理后的纤维材料置于体积分数为0.1～10％的硅烷偶联剂水溶液中，浸泡10～60min，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后烘干，保存备用。
5.根据权利要求4所述的固定化方法，其特征在于，所述步骤(2)中硅烷偶联剂为乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、1,2-双三甲氧基硅基乙烷、甲基苯基二甲氧基硅烷、甲基三乙酰氧基硅烷中的任意一种或几种。
6.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化培养基中包括植物浸出液。
7.根据权利要求6所述的固定化方法，其特征在于，所述植物浸出液为甘蔗渣、玉米芯、玉米秸秆、木薯渣、土豆、麸皮和糠的任意一种或几种浸出液。
8.根据权利要求7所述的固定化方法，其特征在于，将1～100g植物放入100～1000mL水中，在90～120℃中放置0.5～3h，再用纱布进行过滤，留下上清液，即为植物浸出液。
9.根据权利要求1所述的固定化培养基，其特征在于，所述的发酵容器为气升式发酵罐，将纤维材料裁剪成长条状，沿垂直方向螺旋缠绕在多条不锈钢丝条上。
10.根据权利要求1所述的固定化培养基，其特征在于，所述的发酵容器为自吸式发酵罐，将纤维材料平铺在与其大小形状相同的钢丝网上，纤维材料与钢丝网一起卷成筒状。
CN201710474115.8A 2017-06-21 2017-06-21 一种黑曲霉的固定化方法 Active CN107022541B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710474115.8A CN107022541B (zh) 2017-06-21 2017-06-21 一种黑曲霉的固定化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710474115.8A CN107022541B (zh) 2017-06-21 2017-06-21 一种黑曲霉的固定化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107022541A true CN107022541A (zh) 2017-08-08
CN107022541B CN107022541B (zh) 2019-05-03

Family

ID=59531703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710474115.8A Active CN107022541B (zh) 2017-06-21 2017-06-21 一种黑曲霉的固定化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107022541B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107557400A (zh) * 2017-10-12 2018-01-09 东北电力大学 一种提高玉米秸秆水解液培养油脂酵母产油量的方法
CN108977431A (zh) * 2018-06-25 2018-12-11 华南农业大学 蔗渣固定化棘孢曲霉及其在喹诺酮类抗生素污染修复中的应用
CN110157603A (zh) * 2019-06-20 2019-08-23 南京高新工大生物技术研究院有限公司 一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器及其方法
CN111073880A (zh) * 2020-01-07 2020-04-28 南京工业大学 一种毕赤酵母的固定化方法及其应用
CN111454827A (zh) * 2020-05-27 2020-07-28 南京工业大学 一种微生物普适固定化发酵装置及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103571818A (zh) * 2013-11-21 2014-02-12 南京工业大学 一种桔青霉的固定化方法
CN104894096A (zh) * 2015-06-10 2015-09-09 南京工业大学 一种利用细菌纤维素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103571818A (zh) * 2013-11-21 2014-02-12 南京工业大学 一种桔青霉的固定化方法
CN104894096A (zh) * 2015-06-10 2015-09-09 南京工业大学 一种利用细菌纤维素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘鸿鸣等: "表面亲水改性聚丙烯纤维的性能研究", 《化工时刊》 *
朱俊晨等: "产糖化酶黑曲霉的固定化研究", 《微生物学杂志》 *
李银聚等: "《生物技术原理与应用》", 31 March 2001, 兵器工业出版社 *
杜连启: "薯渣生产柠檬酸和柠檬酸钙的技术", 《农产品加工》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107557400A (zh) * 2017-10-12 2018-01-09 东北电力大学 一种提高玉米秸秆水解液培养油脂酵母产油量的方法
CN107557400B (zh) * 2017-10-12 2022-05-31 东北电力大学 一种提高玉米秸秆水解液培养油脂酵母产油量的方法
CN108977431A (zh) * 2018-06-25 2018-12-11 华南农业大学 蔗渣固定化棘孢曲霉及其在喹诺酮类抗生素污染修复中的应用
CN110157603A (zh) * 2019-06-20 2019-08-23 南京高新工大生物技术研究院有限公司 一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器及其方法
CN111073880A (zh) * 2020-01-07 2020-04-28 南京工业大学 一种毕赤酵母的固定化方法及其应用
CN111073880B (zh) * 2020-01-07 2021-08-27 南京工业大学 一种毕赤酵母的固定化方法及其应用
CN111454827A (zh) * 2020-05-27 2020-07-28 南京工业大学 一种微生物普适固定化发酵装置及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107022541B (zh) 2019-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107022541B (zh) 一种黑曲霉的固定化方法
CN105255953B (zh) 物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法
CN104498258B (zh) 一种柿子白兰地酿造工艺
CN106399422A (zh) 一种细菌纤维素的制备方法
CN103571818B (zh) 一种桔青霉的固定化方法
CN101513161A (zh) 一种北虫草液体菌种培养基配方及培养方法
CN107509532A (zh) 一种富含多糖香菇的栽培方法
CN107488640A (zh) 一种耐氧化低温葡萄糖氧化酶及其生产方法与应用
CN107488600A (zh) 一株高产耐氧化低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉
CN104830626B (zh) 一种野樱桃果酒的降酸方法
CN106906253A (zh) 一种利用表面固定化技术发酵生产l‑乳酸的方法
CN104277978B (zh) 黑曲霉种子液的制备方法以及发酵制备柠檬酸的方法
CN102649971B (zh) 黑曲霉麸曲的培养方法以及发酵制备柠檬酸的方法
CN103343151B (zh) 一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法
CN104131042B (zh) 一种控制米根霉生长形态产l‑乳酸的方法
CN102851328A (zh) 一种利用固定化黑曲霉发酵玉米糖液制备柠檬酸的方法
CN107057926B (zh) 一种混合果汁红曲酒的制备方法
CN102517380A (zh) 一种筛选高效降解茶籽饼粕的微生物菌株的方法
CN102994400B (zh) 降解脐橙囊衣微生物、含有其的酶制剂及应用
US20230052976A1 (en) Method for fermenting biomass and producing material sheets and suspensions thereof
CN102660520B (zh) 一种发酵营养助剂、营养助剂在木聚糖酶制备中的应用及应用方法
CN105463861B (zh) 一种亚麻粗纱生物脱胶方法
CN103990441A (zh) 一种基于改性细菌纤维素的重金属离子吸附剂制备方法
CN104664053B (zh) 一种利用剑麻废水发酵豆粕的方法
CN85104280A (zh) 一种利用微生物连续酿造水果醋的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant