CN105219808B - 一种将右旋糖酐发酵废液用于丁二酸发酵生产的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种将右旋糖酐发酵废液用于丁二酸发酵生产的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法是以右旋糖酐发酵废液为母液配制丁二酸发酵培养基，分批发酵可产丁二酸30‑40g/L；或者采用10‑40g/L葡萄糖为起始发酵培养基的碳源，后续补加浓缩右旋糖酐发酵废液的方式进行补料分批发酵生产丁二酸，40‑60h产丁二酸可达40‑55.0g/L，生产强度0.8‑1.0g/L/h，糖酸转化率为0.70‑0.83g/g。本发明可充分利用右旋糖酐发酵废液中的还原糖作为丁二酸发酵生产的碳源，有效减少右旋糖酐生产过程中的废水排放量，减少丁二酸发酵培养基制备时的葡萄糖用量，实现右旋糖酐发酵废液的废物利用。

Description

一种将右旋糖酐发酵废液用于丁二酸发酵生产的方法

技术领域

本发明公开了一种将右旋糖酐发酵废液用于丁二酸发酵生产的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

右旋糖酐是一种高分子葡萄糖聚合物，是最早使用和得到公认的一种优良血浆代用品，在医药、食品和石油等方面都有着广泛的应用。右旋糖酐也是世界上第一个工业化生产的微生物多糖，高浓度蔗糖通过肠膜明串珠菌发酵，生成高分子葡萄糖聚合物，再经过精制处理得到不同分子量的右旋糖酐产品，提取产物之后剩下的发酵液为右旋糖酐发酵废液。右旋糖酐发酵废液一般被作为工业废水进行环保处理，但给企业增加额外的环保处理费用。由于生产右旋糖酐时使用的的碳源为蔗糖，且发酵生产过程中主要利用的是其水解后的葡萄糖，所以右旋糖酐发酵废液中存在较高浓度的果糖和少量葡萄糖，人们尝试了从发酵废液中提取果糖、发酵生产饲用复合酶制剂、发酵生产衣康酸等研究，但还没有用于发酵生产丁二酸的报道。陈峡华等研究了从右旋糖酐发酵废液中提取果糖，将废液离心后过HD-Ⅰ离子交换柱吸附废液中果糖，再以65℃去离子水将果糖洗脱下来，经浓缩结晶后得到果糖，该方法投入大、产出少，不适于大范围推广(淀粉与淀粉糖,1993:15-18.)。中国专利CN 200810172073.3公布了以右旋糖酐发酵废液为原料发酵生产饲用复合酶制剂的方法，其生产工艺以黑曲霉和枯草芽孢杆菌作为产酶菌株，以右旋糖酐发酵废液调制后作为液体发酵原料，通过无机膜过滤获得含有较高浓度菌体、酶类等有机物质的发酵液，后发酵阶段采用固体发酵工艺，麦麸等农副产品作为发酵原料在通风发酵池里进行固体发酵，发酵结束后经过干燥、粉碎、制粒和包装等工序制成饲用复合酶制剂产品，该方法能极大降低右旋糖酐发酵废液的处理成本，但经济效益不高。中国专利CN 201210003818.X公布了以右旋糖酐发酵废液为原料发酵生产衣康酸，先以氢氧化钙处理废液，然后以处理后的废液为母液配制衣康酸发酵培养基，将废液中还原糖作为衣康酸发酵生产的碳源直接进行发酵，该方法可有效减少右旋糖酐生产的废水排放量，并减少衣康酸发酵培养基制备时的葡萄糖用量。

丁二酸是一种重要的C4平台化合物，目前已广泛应用于食品、医药、农业等领域，在将来还可作为生产可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚酯多元醇、增塑剂、聚氨酯和原材料型化学产品1,4-丁二醇的基础材料，应用前景十分广阔。目前文献报道的发酵生产丁二酸研究所用的培养基碳源主要是葡萄糖，开发价格低廉的碳源是降低发酵法生产丁二酸成本的途径之一。

为了解决上述问题，本发明提供了一种以右旋糖酐发酵废液为碳源发酵生产丁二酸的方法，可为解决右旋糖酐发酵废液的处理提供新途径，实现其废物利用的价值，同时也能进一步降低生物基丁二酸的生产成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：根据国内右旋糖酐生产厂家废液处理难、资源浪费大的问题，提供一种有效的废液综合利用的方法，该方法对丁二酸的生产水平和产品质量无明显不良影响，且工艺步骤少、经济效益和环境效益好。

本发明的将右旋糖酐发酵废液用于丁二酸发酵生产的方法，是利用琥珀酸放线杆菌，以右旋糖酐发酵废液为碳源配制发酵培养基、采用分批发酵方式发酵生产丁二酸，或者是以葡萄糖为碳源配置发酵培养基、以浓缩右旋糖酐发酵废液为补料液、采用补料分批发酵方式发酵生产丁二酸。

所述右旋糖酐发酵废液，是高浓度蔗糖通过肠膜明串珠菌发酵、生产右旋糖酐过程中提取产物之后剩下的发酵废液。

在本发明的一种实施方式中，右旋糖酐发酵废液pH 3.5-4.5，总还原糖1.5-2.0％，其中果糖15-20g/L，葡萄糖0.3-0.6g/L，总氮0.75-0.90g/L，总磷0.35-0.45g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述分批发酵使用的发酵培养基，是以浓缩至还原糖浓度为40-90g/L的右旋糖酐发酵废液为母液，添加玉米浆15-35g/L，K₂HPO₄ 1.5-3g/L，NaH₂PO₄ 2.2-3g/L，谷氨酸钠0.05-2g/L，生物素0.01-0.5g/L，Na₂S 0.01-2g/L，调节pH至6.0-6.5。

在本发明的一种实施方式中，所述右旋糖酐发酵废液的还原糖浓度调整为60-90g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述分批发酵或补料分批发酵是在温度37-38℃、转速150-200r/min条件进行发酵40-60h，并控制发酵过程pH 6.0-6.5，当发酵液中还原糖浓度低于1-5g/L或丁二酸浓度不再增加时结束发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述pH是采用重量体积分数30-50％的碳酸钾或碳酸镁液体乳浊液控制。

在本发明的一种实施方式中，所述补料分批发酵是以10-40g/L葡萄糖为碳源配制发酵培养基(添加玉米浆15-35g/L，K₂HPO₄ 1.5-3g/L，NaH₂PO₄ 2.2-3g/L，谷氨酸钠0.05-2g/L，生物素0.01-0.5g/L，Na₂S 0.01-2g/L，调节pH至6.0-6.5)，待发酵液中葡萄糖消耗至5-15g/L时间歇流加还原糖浓度200-300g/L的浓缩右旋糖酐发酵废液，发酵过程中控制发酵液总糖浓度在10-30g/L之间。

在本发明的一种实施方式中，所述补料分批发酵中葡萄糖浓度为30g/L，浓缩右旋糖酐发酵废液中还原糖浓度为300g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述分批发酵或补料分批发酵的发酵时间为50-55h。

在本发明的一种实施方式中，所述琥珀酸放线杆菌的种子培养方法：先接种于一级种子培养基中，厌氧培养箱中静置培养10-16h，培养温度37-38℃，将一级种子以2-4％(体积分数)接种量接入二级种子培养基中，并于37-38℃，在通N₂与CO₂混合气体的厌氧条件下培养6-12h。然以5-10％(体积分数)接种量接种于3L发酵罐中开始发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基组成为：葡萄糖5-10g/L，酵母膏5-10g/L，K₂HPO₄ 20-30g/L，NaH₂PO₄ 10-20g/L，自然pH，115-121℃灭菌20min

产物分析方法：果糖、葡萄糖及丁二酸的测定按文献(刘宇鹏,郑璞,孙志浩等.采用离子排斥色谱法分析发酵液中的琥珀酸等代谢产物[J].食品与发酵工业,2006,32(12):119-123.)的方法。

与现有技术相比，本发明首次采用右旋糖酐发酵废液进行丁二酸发酵生产。所具有的有益效果是：本发明方法，可充分利用右旋糖酐发酵废液中的还原糖(主要是果糖)作为丁二酸发酵生产的碳源，有效减少右旋糖酐生产过程中的废水排放量，减少丁二酸发酵培养基制备时的葡萄糖使用量。采用本发明制得的丁二酸发酵培养基进行丁二酸发酵生产时，对发酵液丁二酸的浓度和转化率无明显不良影响，发酵液中丁二酸浓度可达55.0g/L，转化率可达0.83g/g。本发明涉及的工艺步骤较少，既可以降低废水处理费用，又可以降低丁二酸生产成本，经济和环境效益好。

具体实施方式

实施例1：以右旋糖酐发酵废液为碳源分批发酵产丁二酸

a)发酵培养基制备

取1.45L约浓缩三倍体积后的右旋糖酐发酵废液(还原糖含量检测为61.5g/L)为母液，添加发酵培养基中其它成分配制发酵培养基，玉米浆25g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，NaH₂PO₄2.2g/L，谷氨酸钠2g/L，生物素0.01g/L，Na₂S 0.01g/L，调pH至6.2，121℃灭菌0min。

b)种子培养

琥珀酸放线杆菌CCTCC NO：M2012036摇瓶一级种子在厌氧培养箱中静置培养12h，培养温度为38℃，将一级种子以2.5％(体积分数)接种量接入150mL二级种子中(种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K₂HPO₄ 20g/L，NaH₂PO₄ 10g/L，自然pH，121℃灭菌20min)，并于38℃，在通N₂与CO₂混合气体的厌氧条件下培养6h，后以10％(体积分数)接种量将二级种子接种于3L发酵罐中开始发酵。

c)丁二酸发酵

发酵培养基初始还原糖浓度为60g/L左右，温度38℃，发酵时间54h，转速200r/min，发酵过程中以33％(质量体积分数)MgCO₃控制pH 6.0-6.5，当发酵液中丁二酸浓度不再增加时结束发酵，结果如表1所示。

表1右旋糖酐发酵废液为原料分批发酵产丁二酸

实施例2：以右旋糖酐发酵废液为碳源分批发酵产丁二酸

a)发酵培养基制备

调整右旋糖酐发酵废液至还原糖含量为90g/L左右，并添加玉米浆35g/L，K₂HPO₄3g/L，NaH₂PO₄ 3g/L，谷氨酸钠0.05g/L，生物素0.5g/L，Na₂S 0.5g/L，调pH至6.0，配制成发酵培养基。

b)种子培养

制备琥珀酸放线杆菌CCTCC NO：M2012036的种子液。

c)丁二酸发酵

发酵培养基初始还原糖浓度为90g/L左右，温度37℃，发酵时间50h，转速150r/min，发酵过程中以50％(质量体积分数)K₂CO₃控制pH 6.0-6.5，当发酵液中丁二酸浓度不再增加时结束发酵，结果显示丁二酸产量可达48.2g/L。

实施例3：以右旋糖酐发酵废液为碳源补料分批发酵产丁二酸

a)发酵培养基及补料制备

取1.6L自来水，添加发酵培养基中其它成分配制发酵培养基，玉米浆25g/L，K₂HPO₄2g/L，NaH₂PO₄ 2.2g/L，谷氨酸钠2g/L，生物素0.01g/L，Na₂S 0.01g/L，葡萄糖30g/L，调pH至6.3，121℃灭菌20min。

将右旋糖酐发酵废液浓缩约10倍体积后(检测其中还原糖含量为305.4g/L)，取0.6L于补料瓶中，115℃灭菌20min，灭菌后将补料瓶连接到发酵罐上。

b)种子培养如实施例1所述

c)丁二酸发酵

发酵培养基初始葡萄糖浓度为30g/L，温度37℃，发酵时间55h，转速200r/min，发酵过程中以33％(质量体积分数)MgCO₃控制pH 6.0-6.5，待发酵液中葡萄糖消耗至5-15g/L间歇流加补料瓶中浓缩右旋糖酐发酵废液，控制总糖浓度在20g/L以下，当发酵液中丁二酸浓度不再增加时结束发酵。结果如表2所示。

表2右旋糖酐发酵废液为原料补料分批发酵产丁二酸

实施例4：发酵工艺对丁二酸产量的影响

1、发酵培养基成分：

(1)发酵培养基中的NaH₂PO₄含量显著影响丁二酸产量及糖酸转化率，这可能是因为右旋糖酐发酵废液中残留的磷酸盐破坏了原始培养基中磷酸盐缓冲体系的平衡，影响了细胞周围的微环境，最终影响到菌体产酸。将实施例2中的NaH₂PO₄浓度替换成1.5g/L或者4g/L，其他条件不变，结果发现采用4g/L的NaH₂PO₄将导致丁二酸产量明显降低，而1.5g/L的NaH₂PO₄不仅会使丁二酸产量降低20％以上而且会导致发酵液中残糖浓度过高。

(2)右旋糖酐发酵废液成分复杂，可能存在一些抑制丁二酸生产的因素。通过在培养基中添加一定浓度的谷氨酸钠和生物素，有利于丁二酸产量的提高。发明人发现，培养基中不含有谷氨酸钠和生物素的发酵工艺，将导致丁二酸产量降低10％左右。

2、补料分批发酵方式对丁二酸生产的影响

采用两种补料分批发酵方法生产丁二醇，A是初始发酵用右旋糖酐发酵废液为碳源的培养基，后续流加葡萄糖(初始还原糖浓度约50g/L，随着发酵进行缓慢流加500g/L的外源葡萄糖溶液)，B是初始发酵用30g/L葡萄糖为碳源的培养基，后续流加浓缩至还原糖300g/L的右旋糖酐发酵废液。结果显示，与A方式相比，采用本发明的B方式，丁二酸产量提高了19％，发酵液中残还原糖浓度降低了62％，糖酸转化率提高了11％。此外，采用B方式，添加外源葡萄糖量少，单次发酵使用的右旋糖酐发酵废液多，提高了右旋糖酐发酵废液的处理量并降低了丁二酸生产成本。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种将右旋糖酐发酵废液用于丁二酸发酵生产的方法，其特征在于，所述方法是利用琥珀酸放线杆菌，以右旋糖酐发酵废液为碳源配制发酵培养基、采用分批发酵方式发酵生产丁二酸，或者是以葡萄糖为碳源配置发酵培养基、以浓缩右旋糖酐发酵废液为补料液、采用补料分批发酵方式发酵生产丁二酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分批发酵使用的发酵培养基，是以浓缩至还原糖浓度为40-90g/L的右旋糖酐发酵废液为母液，添加玉米浆15-35g/L，K₂HPO₄1.5-3g/L，NaH₂PO₄ 2.2-3g/L，谷氨酸钠0.05-2g/L，生物素0.01-0.5g/L，Na₂S 0.01-2g/L，调节pH至6.0-6.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分批发酵或补料分批发酵是在温度37-38℃、转速150-200r/min条件进行发酵40-60h，并控制发酵过程pH 6.0-6.5，当发酵液中还原糖浓度低于1-5g/L或丁二酸浓度不再增加时结束发酵。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补料分批发酵是以10-40g/L葡萄糖为碳源配制发酵培养基，待发酵液中葡萄糖消耗至5-15g/L时间歇流加还原糖浓度200-300g/L的浓缩右旋糖酐发酵废液，发酵过程中控制发酵液总糖浓度在10-30g/L之间。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pH是采用重量体积分数30-50％的碳酸钾或碳酸镁控制。