CN100363499C

CN100363499C - 一种新的腺苷甲硫氨酸的体外酶促转化方法

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Publication number: CN100363499C
Application number: CNB2006100241588A
Authority: CN
Inventors: 庄英萍; 武鑫; 储炬; 张嗣良; 王永红; 胡晓清; 袁中一
Original assignee: GUOJIA BIOCHEMICAL ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER Co Ltd SHANGHAI; East China University of Science and Technology
Current assignee: GUOJIA BIOCHEMICAL ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER Co Ltd SHANGHAI; East China University of Science and Technology
Priority date: 2006-02-27
Filing date: 2006-02-27
Publication date: 2008-01-23
Anticipated expiration: 2026-02-27
Also published as: CN1850980A

Abstract

本发明提供了一种新的腺苷甲硫氨酸(SAM)的酶促合成方法，将(i)利用ATP生产菌株大量生产并分泌ATP，与(ii)SAM合成酶转化生产SAM两步反应相偶联。本发明的方法显著地提高了ATP生产菌株生产ATP的效率，并大大降低了胞外酶促转化生产SAM的成本，特别适用于工业化大规模生产腺苷甲硫氨酸。

Description

一种新的腺苷甲硫氨酸的体外酶促转化方法

技术领域

本发明涉及生物化工领域，更具体地，本发明涉及一种腺苷甲硫氨酸(SAM)的体外酶促转化方法。

背景技术

众所周知，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)是广泛存在于动物、植物和微生物体内的重要代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与了40多种生化反应，是重要的多疗效药物。

目前，S-腺苷甲硫氨酸的制备方法主要有化学合成法、生物转化法和体外酶促转化法三种。体外酶促转化是在体外利用S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L-甲硫氨酸(L-Met)和腺苷三磷酸(ATP)生成S-腺苷甲硫氨酸。体外酶促转化法与化学合成法、生物转化法相比，具有终产物积累量高、分离提纯容易、反应周期短以及污染小、环境好等优点，因而是较有开发前景的工业化生产方法。根据目前报道，该反应的底物L-Met和ATP均为外源添加。

但是，体外酶促转化存在的问题是商业购买ATP的成本极高，不适合用于工业化大规模生产；并且ATP非常不稳定，不易保存。另外，传统的体外酶促转化法需要外源分批加入ATP，不仅在添加时需要防止其失活，而且耗费人力物力，因此，迫切需要开发一种可降低成本且操作方便的S-腺苷甲硫氨酸生产方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转化效率高、成本低廉且操作方便的腺苷甲硫氨酸(SAM)体外酶促转化方法。

在本发明的第一方面，提供一种生产腺苷甲硫氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)培养腺苷三磷酸生产菌株，从而产生腺苷三磷酸，得到含腺苷三磷酸的反应液；

(b)在所述含腺苷三磷酸的反应液中加入L-甲硫氨酸和腺苷甲硫氨酸合成酶，使腺苷三磷酸与L-甲硫氨酸反应，生成腺苷甲硫氨酸。

在本发明的一个优选例中，腺苷三磷酸生产菌株将腺苷三磷酸前体转化为腺苷三磷酸。

在本发明的另一优选例中，所述的腺苷三磷酸前体选自：腺苷、腺苷合成前体、腺苷酸、腺苷二磷酸。

在本发明的另一优选例中，步骤(a)中，当腺苷三磷酸生产菌株培养至对数生长末期时，加入腺苷三磷酸前体。

在本发明的另一优选例中，加入腺苷三磷酸前体之后15-200分钟，直接在培养液中加入L-甲硫氨酸和腺苷甲硫氨酸合成酶。

更优选的，先进行步骤(a)25-150分钟，之后进行步骤(b)的操作；最优选的，先进行步骤(a)40-120分钟，之后进行步骤(b)的操作。

在本发明的另一优选例中，所述的腺苷甲硫氨酸合成酶获自：微生物(细菌，酵母，真菌)、植物、动物，或通过人工合成的方式制备。在另一优选例中，所述的腺苷甲硫氨酸合成酶为微生物来源。

在本发明的另一优选例中，所述的腺苷三磷酸生产菌株为固定化的菌株；或为游离的菌株。

在本发明的另一优选例中，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为5-500g干燥细胞/L反应液；或

所述游离的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为5-500g干燥细胞/L反应液。

在另一优选例中，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为10-200g干燥细胞/L反应液；更优选的，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为10-100g干燥细胞/L反应液；最优选的，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为15-85g干燥细胞/L反应液。

在另一优选例中，所述游离的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为10-300g干燥细胞/L反应液；更优选的，所述游离的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为20-200g干燥细胞/L反应液；最优选的，所述游离的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为30-120g干燥细胞/L反应液。

在本发明的另一优选例中，所述的腺苷甲硫氨酸合成酶为固定化的酶；或为游离的酶。

在本发明的另一优选例中，所述的腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活为0.2U/ml-20U/ml。

在本发明的另一优选例中，所述的腺苷三磷酸生产菌株选自：

(a)酵母；或

(b)细菌。

在本发明的另一优选例中，所述的腺苷三磷酸生产菌株选自：啤酒酵母、酿酒酵母、假丝酵母、或产氨短杆菌。

在本发明的另一优选例中，在步骤(a)中，培养液的温度维持在25-38℃；或在步骤(b)中，培养液的温度维持在28-38℃。

更佳地，在生产腺苷甲硫氨酸时，反应温度为30-37℃。

在本发明的另一优选例中，步骤(a)的ATP的产率(mol/L·h)和步骤(b)的SAM酶促转化的速率(mol/L·h)的比值为1∶5～5∶1。

在本发明的第二方面，提供一种用于生产腺苷甲硫氨酸的设备，所述设备中包括：

一生物反应器本体，所述生物反应器本体中盛有反应液，所述反应液中含有：腺苷三磷酸生产菌株、腺苷三磷酸前体、腺苷三磷酸生产菌株的培养基、L-甲硫氨酸、和腺苷甲硫氨酸合成酶；

一或多个位于生物反应器本体或与生物反应器本体相连接的加料口；

一或多个位于生物反应器本体或与生物反应器本体相连接的出料口；以及

一控制装置。

在本发明的另一优选例中，所述的反应液中含有：5-500g干燥细胞/L腺苷三磷酸生产菌株、20-80mM/L腺苷三磷酸前体、5-20mM/L L-甲硫氨酸0.1-10U/ml腺苷甲硫氨酸合成酶、以及余量为腺苷三磷酸生产菌株的培养基及腺苷甲硫氨酸合成所需其他成分。

在本发明的另一优选例中，所述的反应液中还含有：10-20mM/L谷胱甘肽。

在本发明的另一优选例中，所述的腺苷三磷酸生产菌株的培养基中含有：磷酸氢二钾150-250mM/L，氯化钾150-250mM/L，葡萄糖100-200mM/L，硫酸镁15-25mM/L，Tris-HCl缓冲液10-20mM/L；或

氯化钾150-250mM/L，磷酸氢二钾150-250mM/L，葡萄糖100-200mM/L，硫酸镁15-25mM/L，Tris-HCl缓冲液5-15mM/L。

在本发明的另一优选例中，所述生物反应器本体中还包括搅拌装置。

在本发明的另一优选例中，所述的生物反应器体是转动的。

在本发明的另一优选例中，所述的控制装置中包括：控制反应液温度的温控装置、控制反应液pH值的装置、控制搅拌速度的装置、控制生物反应器转动的装置、和/或控制加料或出料的装置。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了两步偶联法与常规法胞外酶促生产SAM产率比较。

图2显示了本发明的生产腺苷甲硫氨酸的流程示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的试验，发现将(i)利用腺苷三磷酸(ATP)生产菌株生产ATP；与(ii)使ATP和L-甲硫氨酸(Met)在腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶的催化下生成腺苷甲硫氨酸(SAM)相偶联，可以大大促进步骤(i)中ATP生产菌株生成ATP的量，从而为步骤(ii)提供了充足的底物。并且，本发明可大大简化SAM的酶促生产步骤，避免了分次加入ATP的烦琐程序，还避免了因ATP成本高昂且不稳定所带来的问题。基于此完成了本发明。

两步反应偶联方法

本发明采用两步反应偶联方法，直接利用ATP生产菌株为腺苷甲硫氨酸合成酶的催化反应提供底物ATP。具体的，本发明的生产腺苷甲硫氨酸的流程如图2所示。

在本发明中，ATP是由ATP生产菌株从胞内向胞外分泌的，由于渗透到胞外的ATP以较快的速度被后续的(ii)步反应所消耗，从而促进(i)步中酵母利用ATP前体源源不断地生成ATP，两步偶联后使ATP生产菌株生产ATP的速率比单独时提高15-80％。采用本发明的方法，既达到了快速生产ATP的目的，又达到了利用ATP生产SAM的目的。

在本发明中，所述的SAM两步偶联转化方法，是指在同一生物反应器中，将(i)利用ATP生产菌株(如酵母)大量生产并分泌ATP，与(ii)SAM合成酶转化生产SAM两步反应相偶联。在本发明的一个优选方式中，在同一生物反应器的混合培养液中，先后置入ATP生产菌株和SAM合成酶，合成反应温度控制在28-38℃，偶联反应启动后，前一反应的产物ATP直接用作后一反应的底物，经过一段时间的偶联反应，最终获得催化产物SAM。

在本发明的优选方式中，ATP生产菌株和SAM合成酶的加入为顺序加入，即先加入ATP生产菌株达到一定的ATP产率时，再加入SAM合成酶。

两步反应偶联方法的混合体系

在本发明中，所述的两步反应偶联方法的混合体系中包含：ATP生产菌株、ATP前体、和ATP生产菌株的培养基；更优选的，其中还包含L-甲硫氨酸、腺苷甲硫氨酸合成酶；最优选的，其中还包含其他必需盐类如Mg²⁺，K⁺，或其它促进ATP生产菌株生长和生产ATP的有效成份、或其它促进腺苷甲硫氨酸合成的有效成份。

在本发明的优选方式中，先制备适于培养菌株以及进行上述反应的混合反应液，其中含有适合ATP生产分泌和SAM酶促转化两步反应的培养基以及L-Met，ATP合成的前体(如腺苷)以及其他必需盐类如Mg²⁺，K⁺，然后将ATP生产菌株投入，启动ATP的生产，然后补充加入L-甲硫氨酸以及加入SAM合成酶，从而生产SAM。

在本发明的优选方式中，所配制的混合反应液中含有：L-甲硫氨酸5-15mM/L(如10mM/L)，谷胱甘肽10-20mM/L(如16mM/L)，磷酸氢二钾150-250mM/L(如200mM/L)，氯化钾150-250mM/L(如200mM/L)，腺苷30-50mM/L(如40mM/L)，葡萄糖100-200mM/L(如150mM/L)，硫酸镁15-25 mM/L(如20mM/L)，Tris-HCl缓冲液10-20mM/L(如15mM/L)，pH为7.0-8.0(如pH7.5)。

在本发明的另一优选方式中，所配制的混合反应液中含有：L-甲硫氨酸5-15mM/L(如10mM/L)，谷胱甘肽10-20mM/L(如16mM/L)，氯化钾150-250mM/L(如200mM/L)，磷酸氢二钾150-250mM/L(如200mM/L)，腺苷30-50mM/L(如40mM/L)，葡萄糖100-200mM/L(如150mM/L)，硫酸镁15-25mM/L(如20mM/L)，Tris-HCl缓冲液5-15mM/L(如10mM/L)；pH为6.5-7.5(如pH7.0)。

在本发明中，所述的ATP前体选自：腺苷、腺苷合成前体、腺苷酸、腺苷二磷酸；优选的，所述的ATP前体为腺苷。

ATP生产菌株

在本发明中，可以采用任何可利用ATP合成前体生产ATP的天然菌株(野生菌株)、基因工程菌株、或重组细胞来作为ATP生产菌株，并且所述菌株或细胞可自然分泌ATP或经过诸如通透性处理或诱导后分泌ATP，优选那些可大量生产和分泌ATP的菌株或重组细胞，包括但不限于：细菌、真菌、酵母等。

本发明的一种优选方式中，采用酵母作为ATP生产菌株。适用的ATP酵母生产菌株为具有生产大量ATP能力并能将之有效分泌至胞外的酵母，包括但不限于：啤酒酵母、酿酒酵母、假丝酵母等。所述的酵母比如：酿酒酵母AS 2.612、或CICC 1012等；或者啤酒酵母AS 2.604或CICC 1202等。可采用增加酵母细胞膜的通透性或是采用固定化酵母原生质体等方法来使ATP分泌。

或者，也可采用适当的细菌作为ATP生产菌株，比如可以采用产氨短杆菌作为ATP生产菌株。

ATP生产菌株存在于反应体系中的方式可以是：固定化菌株(细胞)、或游离菌株(细胞)等方式。

在本发明的一种优选方式中，使用固定化的ATP生产菌株来生产ATP。将ATP生产菌株进行固定化的方法是本领域技术人员所熟知的方法，可采用任何适用于固定菌株或细胞的技术来固定SAM合成酶。采用固定化的ATP生产菌株，使ATP生产菌株可被反复利用，并且易于将菌株从反应液中分离出来，可大大简化产物分离步骤。

在本发明的优选方式中，当采用固定化的菌株作为ATP生产菌株时，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为5-500g干燥细胞/L反应液；更优选的，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为10-200g干燥细胞/L反应液；进一步优选的，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为10-100g干燥细胞/L反应液；最优选的，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为15-85g干燥细胞/L反应液。

在本发明的优选方式中，当采用游离状态的菌株作为ATP生产菌株时，所述游离的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为5-500g干燥细胞/L反应液；更优选的，所述游离的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为10-300g干燥细胞/L反应液；进一步优选的，所述游离的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为20-200g干燥细胞/L反应液；最优选的，所述游离的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为30-120g干燥细胞/L反应液。

SAM合成酶

本发明中适用的SAM合成酶可以是人工合成的，或者可来源于微生物、植物、或动物。

在本发明的优选方式中，所述的SAM合成酶来自能有效表达该酶的所有原核及真核微生物，包括微生物(细菌，酵母，真菌)、植物，动物来源，SAM合成酶的获得可采用胞内表达和胞外分泌两种方式，SAM合成酶的酶促转化方式可采用固定化酶反应以及游离酶反应。

在本发明中，对SAM合成酶的制备纯度没有特别的限制，以能够进行有效酶促转化为宜，其酶活范围为0.2U/ml-20U/ml(加入到混合液前的酶活)。其中1U为32℃，在足量ATP和L-甲硫氨酸的反应液中，每分钟生成1μM的SAM的SAM合成酶的酶活。

在本发明的优选方式中，适用的SAM合成酶其浓度范围为：对固定化或游离态而言，混合反应液中最初酶活至少为0.1U/ml。

在本发明的一种优选方式中，使用固定化的SAM合成酶进行反应。将SAM合成酶进行固定化的方法是本领域技术人员所熟知的方法，可采用任何适用于固定酶的技术来固定SAM合成酶；比如可采用吸附法、共价结合法、交联法、包埋法等。采用固定化的SAM合成酶，酶可以被反复利用，并且易于将酶从反应液中分离出来，可大大简化产物分离步骤。

在本发明的优选方式中，在混合体系中，未偶联时ATP的产率(mol/L·h)和未偶联时的SAM酶促转化速率(mol/L·h)的比值为1∶5～5∶1。

生产腺苷甲硫氨酸的设备

在本发明中，所述的生产腺苷甲硫氨酸的设备包括：

一生物反应器本体，所述生物反应器中盛有反应液，所述反应液中含有：腺苷三磷酸生产菌株、腺苷三磷酸前体、腺苷三磷酸生产菌株的培养基、L-甲硫氨酸、和腺苷甲硫氨酸合成酶及腺苷甲硫氨酸合成所需的其他成分；

一控制装置。

在本发明的另一优选例中，所述的反应液中含有：5-500g干燥细胞/L腺苷三磷酸生产菌株、20-80mM/L腺苷三磷酸前体、5-20mM/LL-甲硫氨酸、0.1-10U/ml腺苷甲硫氨酸合成酶、以及余量为腺苷三磷酸生产菌株的培养基及腺苷甲硫氨酸和成所需的其他成分。

在另一优选例中，所述的反应液中还含有：10-20mM/L谷胱甘肽。

在本发明的另一优选例中，所述的生物反应器是转动的。

在本发明的另一优选例中，所述的控制装置中包括：控制反应液温度的温控装置，控制反应液pH值的装置，控制搅拌速度的装置，和/或控制加料或出料的装置。

本发明的主要优点在于：

(1)采用本发明的方法，将利用ATP生产菌株生产ATP与使ATP和L-Met在SAM合成酶的催化下生成SAM相偶联，即为生成SAM提供了ATP，又由于ATP被消耗而促进酵母利用ATP前体生成ATP的速度，达到了两种反应互相促进的效果。

(2)本发明的方法直接利用ATP生产菌株为腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶的催化反应提供底物ATP，从而避免ATP不稳定所带来的反应操作控制和ATP储存上的问题。

(2)商业购买成品ATP价格昂贵，而ATP合成前体(特别是腺苷)价格大大低于ATP，因此采用本发明的方法，大大降低了腺苷甲硫氨酸的生产成本，适用于工业化大规模生产腺苷甲硫氨酸。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

利用游离态酿酒酵母生产ATP与游离态SAM合成酶参与的SAM合成反应

1材料

1.1 ATP生产菌株：本实施例使用的菌种为酿酒酵母CICC 1012。

1.2 SAM合成酶生产菌株：本实施例使用的SAM合成酶生产菌株菌种保藏号为CGMCC，NO.0648，由中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所提供，其构建过程参见CN1357630A。

1.3裂解液缓冲液：

磷酸缓冲液50mM/L，甘油5％，EDTA 1mM/L，PMSF 0.5mM/L

1.4生物反应器：FUS-15L发酵罐，上海国强生化工程装备有限公司生产。

1.5培养基：YPD培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。

1.6混合反应液

L-甲硫氨酸10mM/L，谷胱甘肽16mM/L，磷酸氢二钾200mM/L，氯化钾200mM/L，腺苷40mM/L，葡萄糖150mM/L，硫酸镁20mM/L，Tris-HCl缓冲液15mM/L，pH7.5。

2方法

2.1 ATP生产菌体的制备及通透性处理

将ATP生产菌株酿酒酵母CICC 1012在YPD培养基中培养，至对数生长末期，离心收集细胞，在8℃的冷水中贮藏5天，以提高细胞膜的通透性。然后用适量无菌水清洗，并稍加稀释，立即用于偶联反应体系，最终以加入反应体系后浓度为60g干细胞/L为准。

2.2 SAM合成酶的制备

在种子培养平板上挑取SAM生产菌株单菌落，接入种子培养基，培养1天，接入发酵罐培养基，批发酵、甘油分批发酵及甲醇诱导阶段的调控策略同Pichia protocols(《毕赤酵母方法》，David R.Higgins和James M.Cregg编著，Humana Press Inc.出版)。诱导时间大于20h后，待DO₆₀₀达到300(干重为72g/L)时，取出发酵液，离心得到细胞，加适量细胞裂解液混合均匀，高压破碎，再离心得上清，加入硫酸铵24.48g/L，沉淀完全后取上清液，再加8.64g/L的硫酸铵，弃上清，将沉淀装入透析袋内，用40Mm的磷酸缓冲液(pH6.8)进行透析，透析后所得的浓缩液用清水稀释到酶活为1.0U/ml，即得粗酶液，4℃保存备用。

2.3 ATP生产和SAM转化的偶联

以15L发酵罐为反应器，首先加入混合反应液，然后加入上述处理过的ATP生产菌体，通气量为VVM：0.2，转速为100RPM，35℃，启动ATP的合成反应，1h后，加入L-甲硫氨酸10mM/L，谷胱甘肽16mM/L，再加入上述SAM合成酶进行酶促反应，反应温度设为32℃，使其在反应液中的酶浓度为酶活0.35U/ml。反应1.5h后，加入浓度为20％的高氯酸终止反应。

3结果

采用酿酒酵母生产ATP与SAM合成酶催化生产SAM的偶联方法，酶促反应60分钟后，SAM产率达到了6.2g/L，是常规酶促转化方法SAM产率的98％。本实施例的两步偶联法与常规法胞外酶促生产SAM产率比较见图1。

并且经检测，在反应中，两步偶联后使ATP生产菌株生产ATP的速率比单独生产ATP时提高了75％。与常规法酶促转化SAM相比，无需添加外源ATP，大大地降低了生产成本。

实施例2

固定化啤酒酵母生产ATP与固定化SAM合成酶参与的SAM合成反应

1.材料

1.1 ATP生产菌株：本实施例使用的菌种为啤酒酵母CICC 1202。

1.2 SAM合成酶的生产菌株，酵母裂解液缓冲液，生物反应器或摇瓶，及酵母生长所需的YPD培养基都同实施例1。

1.3固定化酵母与固定化SAM合成酶偶联的反应液含：

L-甲硫氨酸10mM/L，谷胱甘肽16mM/L，氯化钾200mM/L，磷酸氢二钾200mM/L，Ado 40mM/L，葡萄糖150mM/L，硫酸镁20mM/L，Tris-HCl缓冲液10mM/L；反应pH7.0。

2方法

2.1 SAM合成酶的制备同实施例1。

2.2 SAM合成酶的固定化

将初步得到的粗酶液用pH6.8的磷酸缓冲液稀释到酶活1.0U/ml，在30℃-32℃下加入到预先煮沸灭菌再经冷却的3％海藻酸钠溶液中，粗酶液与海藻酸钠溶液混合的比例为：1∶1。然后搅拌均匀，逐滴滴入无菌1.5％的CaCl₂溶液中，使之成小球状，直径2-3mm，固化5小时后，用无菌水将固化后的海藻酸钠凝胶球洗涤3次，再加入1.2％的硫酸锰，4℃固化过夜，备用。

2.3 ATP生产菌株的制备、通透性处理

将啤酒酵母在YPD培养基中培养，至对数生长末期，离心收集细胞。然后进行通透性处理，采用空气干燥法：取10g过滤分离的细胞，均匀地分布在细目过滤网上，过滤网放在一个相应大小的布氏漏斗上，从漏斗底部均匀地通入压缩空气，24℃，气流干燥24h，然后进行固定化。

2.4 ATP生产菌株的固定化

2.4.1载体的制备：

用0.1mol/L，pH 5.8的磷酸缓冲液配制12％-18％(w/v)的明胶溶液。并置于33℃-37℃水浴中保温。

2.4.2固定化酵母细胞的制备：

取通透性处理后的酵母细胞，36℃水浴中恒温5min，然后立即加入到36℃明胶溶液中(约0.35g酵母细胞每毫升溶液)，搅拌混匀，倒入盘中铺成2-4mm厚的膜，4℃凝固3小时，取出后切成10目大小的颗粒，并置于1.5％的戊二醛水溶液中，4℃交联强化20-25分钟。交联后的固定化酵母细胞依次用0.5％的赖氨酸水溶液、1％的亚硫酸氢钠水溶液、及去离子水清洗后，即得酶促反应所需要的固定化酵母细胞。

2.5固定化酵母和固定化SAM合成酶的偶联

取500ml摇瓶，加入混合反应液，温度37℃，转速为250RPM，首先将固定化酵母加入，启动ATP的合成反应，固定化细胞浓度为0.25g/ml反应液。1.5h后，加入L-甲硫氨酸10mM/L，谷胱甘肽16 mM/L，再加入上述固定化SAM合成酶，加入的固定化酶浓度为1.0g/ml反应液，37℃，启动SAM的合成反应。反应3h后，加入浓度为20％高氯酸终止反应。

3结果

采用固定化啤酒酵母生产ATP与固定化SAM合成酶催化生产SAM的偶联方法，SAM合成反应启动90分钟后，SAM产率达到了5.97g/L，是直接添加外源ATP、固定化SAM合成酶催化生产SAM产率的97.5％。

并且经检测，在反应中，两步偶联后使ATP生产菌株生产ATP的速率比单独生产ATP时提高了70％。另一方面，有效解决了常规酶促转化方法当中外源添加ATP成本高的问题。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种生产腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)培养腺苷三磷酸生产菌株，所述的腺苷三磷酸生产菌株能够将腺苷三磷酸分泌到胞外，从而产生腺苷三磷酸，得到含腺苷三磷酸的反应液；和

(b)在步骤(a)所述含腺苷三磷酸的反应液中加入L-甲硫氨酸和腺苷甲硫氨酸合成酶，使腺苷三磷酸与L-甲硫氨酸反应，生成腺苷甲硫氨酸；

并且，步骤(a)和步骤(b)偶联进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的腺苷三磷酸生产菌株为固定化的菌株；或为游离的菌株。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定化的腺苷三磷酸生产菌株的浓度为5-500g干燥细胞/L反应液；或

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的腺苷甲硫氨酸合成酶为固定化的酶；或为游离的酶。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的腺苷三磷酸生产菌株选自：

(a)酵母；或

(b)细菌。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的腺苷三磷酸生产菌株选自：啤酒酵母、酿酒酵母、假丝酵母、或产氨短杆菌。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

在步骤(a)中，培养液的温度维持在25-38℃；或

在步骤(b)中，培养液的温度维持在28-38℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)和步骤(b)在同一反应器中进行偶联。

9.一种用于生产腺苷甲硫氨酸的设备，其特征在于，所述设备中包括：

一生物反应器本体，所述生物反应器本体中盛有反应液，所述反应液中含有：腺苷三磷酸生产菌株、腺苷三磷酸前体、腺苷三磷酸生产菌株的培养基、L-甲硫氨酸、和腺苷甲硫氨酸合成酶；和

一或多个位于生物反应器本体或与生物反应器本体相连接的加料口；和

一控制装置。

10.如权利要求9所述的设备，其特征在于，所述的腺苷三磷酸生产菌株的培养基中含有：磷酸氢二钾150-250mM/L，氯化钾150-250mM/L，葡萄糖100-200mM/L，硫酸镁15-25mM/L，Tris-HCl缓冲液10-20mM/L；或

氯化钾150-250M/L，磷酸氢二钾150-250mM/L，葡萄糖100-200mM/L，硫酸镁15-25mM/L，Tris-HCl缓冲液5-15mM/L。