KR101425108B1 - 탈아실화된 환상 리포펩티드의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탈아실화된 환상 리포펩티드(Cyclic Lipopeptide)의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 악티노플라네스 유타헨시스(Actinoplanes utahensis) ATCC 14539의 변이주인 기탁번호 KCTC12266BP의 균주 및 이를 배양하여 그 배양액으로부터 고수율의 탈아실화된 환상 리포펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 아실라아제 활성이 증강된 악티노플라네스 유타헨시스 DKB 1102를 사용하여 미카펀진(Micafungin) 전구체 A에서 전구체 B로의 전환수율이 극대화하여 고효율로 미카펀진 전구체 B를 대량으로 생산할 수 있다.

Description

탈아실화된 환상 리포펩티드의 제조방법{Deacetylated Cyclic Lipopeptide and Manufacturing Method Thereof}
본 발명은 리포펩티드(Lipopeptide) 물질 및 그 유사체로 대표되는 환상 리포펩티드(Cyclic Lipopeptide) 물질의 아실(Acyl) 측쇄를 효과적으로 탈아실화(Deacetylation)할 수 있는 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP) 및 상기 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 이용한 탈아실화된 환상 리포펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)를 배양하여 미카펀진 전구체(Micafungin Precurser) A(FR901379) 물질을 효과적으로 탈아실화하여 미카펀진 전구체(Micafungin Precurser) B(FR179642)를 제조할 수 있는 탈아실화된 환상 리포펩티드의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 상업적 목적에 따라 탈아실화된 리포펩티드를 리아실화하여 의약품으로 사용가능한 물질의 대량 생산방법을 제공할 수 있다.
환상 리포펩티드의 탈아실화 기술에는 현재 생물학적 접근법만이 유일하다. 탈아실화 기술에는 목적 효소를 분리한 후 효소반응을 실시하는 방법이 있는데, 이는 반응 효율이 높은 장점은 있지만 분리정제에 드는 비용이 높고 더불어 효소를 재사용할 수 없다는 단점이 있다. 이를 보완하기 위한 고정화 효소 방법이 있는데 고정된 효소를 재사용할 수 있고 반응 특이성도 높은 장점이 있지만 고가의 지지체를 사용하고 단백질의 활성부위에 영향을 주지 않는 특화된 고정화기술이 또한 필요하다.
환상 리포펩티드 항생제에 관한 종래 기술은 기무라 등(Kimura, Y. & S. Hiraki, Behavior of polymixin acylase for ion-exchange cellulose column chromatography produced by Pseudomonas sp. M-6-3 strain, Bulletin of Mukagawa Women's University(Japanese) 14: 243-252, 1966]은 효소반응에 의한 탈아실화 방법을 소개하였고, 이와 유사한 방법으로는 쇼지 등(Shoji, J. The amino acid sequence of cerexin A.(Studies on antibiotics from the genus bacillus. Ⅶ). J. Antibtiotics 28: 764-769, 1975)은 리포펩티드 구조 연구에서 효소반응으로 탈아실화를 수행하였으나 전환수율이 20-30％에 미치지 못하는 단점을 지니고 있다.
종래의 환상 리포펩티드 항생제 개발과정에서 아실라아제 생성능이 있는 균주로부터 탈아실화에 대한 문헌이 보고되고 있다. 그람 양성 박테리아에 대해 살균활성을 가지는 리포펩티드 항생제인, A-21978C 및 유사체, 답토마이신과 아퍼질러스(Aspergillus) 곰팡이 6종류들에서 생산되는 진균제인 에키노칸딘(echinocandin) B 및 유사체, 실로펀진(cilofungin)은 리포펩티드의 아실측쇄가 항생제의 항균 활성과 독성에 중요한 역할을 담당하고 있음을 보고하고 있다. 든노보 등(Debono M. Enzymatic and chemical modifications of lipopeptide antibiotic A21978C: the synthesis and evaluation of daptomycin (LY146032), J Antibiot, Vol. XLI No. 8, 1988, Deacylation of A21978C, an Acid Lipopeptide Antibiotic Complex, By Actinoplanes Utahensis, J Antibiot, Vol. XLI No. 8, 1988)은 스트렙토마이세스 로제오스포루스 NRRL 11379의 발효산물인 A21978C 물질을 정제하여 악티노플라네스 유타헨시스 NRRL 12052 배양산물에서 탈아실화를 수행한 다음 tert-BOC 프로텍션, 디프로텍션 방법으로 항생제의 활성과 독성에 미치는 영향을 다양한 아실측쇄를 도입함으로써 그람 양성세균에 높은 살균력을 지니고 독성이 낮은 아실측쇄, 데카노익산을 도입함으로써 LY 146032로도 알려진 답토마이신(daptomycin)을 제조할 수 있었다. 실제 상용화된 답토마이신의 제조법은 상기 생물전환공법이 아닌 발효공법으로만 이루어지며 발효진행 동안 전구체인 데카노익산을 연속적으로 주입하여 생산하는 공정을 채택하고 있다. 이는 아실라아제를 생산하는 악티노플라네스 유타헨시스 NRRL 12052 균주의 아실라아제 활성은 있지만 전환수율이 낮고 tert-BOC 프로텍션, 디프로텍션 합성공정이 추가되는 등 높은 제조원가에 따른 것으로 판단된다.
라베르네 등(LaVerne D. B, Deacylation of Echinocandin B by Actinoplanes Utahensis, J Antibiot, Received for publication August 1, 1988)에 따르면 A21978C의 탈아실화에 사용된 악티노플라네스 유타헨시스 균주는 엑치노칸딘 B를 탈아실화할 수 있고 더 나아가 여러 지방산 아실측쇄를 도입하여 항진균력과 독성에서 가장 효과를 나타내는 LY121019로 명명된 실로펀진을 개발할 수 있었다. 상기 문헌에서 알 수 있듯이 악티노플라네스 유타헨시스 균주는 환상 리포펩타이드 물질의 아실측쇄를 범용으로 제거할 수 있는 가능성을 보여주고 있다.
환상 리포펩티드 물질 중 상업적으로 판매되고 있는 미카펀진의 제조를 위해서는 곰팡이 콜레오포마(Coleophoma) 종에서 생산되는 미카펀진 전구체 A의 지방산 측쇄부문을 절단하는 탈아실화 과정이 필요하다.최근, 일본 아스텔라스 제약에서는 스트렙토마이세스 유래의 방선균에서 뉴모칸딘(Pneumocandin) A0 아실라아제 유전자를 클로닝(cloning) 및 발현(expression) 한 논문이 발표되었는데 탈아실화 효소활성 측정법에 대한 실험적 방법(J Antibiot (Tokyo). 2011 Feb;64(2):169-75)들을 제시하였다. 또한 일본 아스텔라스 제약의 발효연구소에 속해있는 Ueda S, Sakamoto K 등은 2010년 J. Antibiot 논문에 뉴모칸딘 A0의 탈아실화 효소 활성을 갖는 미생물을 스크리닝하여 곰팡이 3종 및 방선균 4종을 발견하고 이들 미생물들의 특성 및 효소활성을 보이는 pH, 온도, 반응시간에 대한 연구(J Antibiot (Tokyo). 2010 Feb;63(2):65-70)를 하였다. 이와 같이 미생물에 의한 환상 리포펩티드와 그 유사체의 탈아실화 사례에서 보듯이 생물전환기술은 의약품이 갖추어야 할 효능과 독성 측면에서 또는 새로운 부자구조를 갖는 의약품을 개발하는 과정에서 주로 중요한 위치를 차지하고 있다. 현재 리포펩티드 항생제과 유사체의 아실측쇄를 효과적으로 탈아실화할 수 있는, 그리하여 높은 전환수율의 환상 펩티드를 갖는 균주에 대해선 알려진바 없다. 아실라아제 생산능이 보고된 악티노플라네스 유타헨시스 균주는 환상 리포펩티드의 탈아실화에 대한 방법만 소개할 뿐 높은 전환수율로 실제 대량생산공정에 적용된 사례는 없다. 이와 같이 기존의 아실라아제 활성을 갖는 균주의 개량과 더불어 최적의 전환조건으로부터 높은 전환수율의 공정 확립이 절실히 필요하다.
본 발명은 악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539 변이주로부터 얻은 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)는 아실라아제 활성이 크게 증강됨을 확인하였고, 이를 배양하여 그 배양액으로부터 환상 리포펩티드 물질 및 그 유도체의 아실측쇄를 높은 전환수율로 탈아실화를 수행할 수 있었다.
본 발명은 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP) 및 상기 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 배양하여 그 배양액으로부터 탈아실화된 환상 리포펩티드를 대량생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)를 제공한다. 또한, 상기 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)를 배양하고 그 배양액에서 환상 리포펩티드의 일종인 미카펀진 전구체 A를 미카펀진 전구체 B로의 전환을 특징으로 하는 전환기술방법을 제공한다.
상기한 바와 같은 특성을 가지는 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)는 대한민국 유전자은행에 2012년 08월 20일자로 KCTC 12266BP로서 기탁되었다.
본 발명은 기존의 악티노마이세스 유타헨시스 ATCC 14539 균주에 비하여 높은 아실라아제 활성을 나타내는 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)를 선발하였고 이를 배양하여 그 배양액으로부터 환상 리포펩티드 미카펀진 전구체 A를 높은 전환수율로 전구체 B를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 미카펀진 전구체 A의 탈아실화 반응에 따른 미카펀진 전구체 B로 전환을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 변이주 선발을 위한 아가피스 한천이중층 방법을 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주의 50L 발효조에서 pH 및 교반속도(Agitation Speed, rpm)에 따른 생육곡선을 나타낸 것이다.
도 3b는 본 발명의 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주의 50L 발효조에서 용존산소(DO), 당농도(sugar conc.), 균체량(PMV)에 따른 생육곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 미카펀진 전구체 A를 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주 배양액에 투입 후 pH(pH 4.5∼7.5)에 따른 미카펀진 전구체 B의 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 미카펀진 전구체 A를 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주 배양액에 투입 후 온도(20∼38℃)에 따른 미카펀진 전구체 B의 생산 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)를 나타낸다.
본 발명은 아실라아제 활성을 지니는 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 나타낸다.
본 발명은 하기의 미카펀진(Micafungin) 전구체 A를 탈아실화시켜 하기의 미카펀진(Micafungin) 전구체 B로 전환시킬 수 있는 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 나타낸다.
Figure 112012077786103-pat00001
Figure 112012077786103-pat00002

본 발명은 탈아실화된 환상 리포펩티드의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 미카펀진(Micafungin) 전구체 A를 탈아실화시켜 환상 리포펩티드 미카펀진 전구체 B의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 배양한 배양액에 미카펀진(Micafungin) 전구체 A를 첨가하고 미카펀진 전구체 A를 탈아실화시켜 미카펀진(Micafungin) 전구체 B로 전환시키는 것을 특징으로 하는 탈아실화된 환상 리포펩티드 미카펀진 전구체 B의 제조방법을 나타낸다(도 1 참조)
상기에서 미카펀진 전구체 A의 탈아실화 조건은 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 배양시 pH 5.5∼6.5이고, 온도는 28∼30℃일 때 미카펀진 전구체 A를 농도 1∼2g/L로 첨가하여 미카펀진 전구체 B로 전환시켜 미카펀진 전구체 B를 제조할 수 있다.
상기에서 미카펀진 전구체 A의 첨가는 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 배양 후 72∼120시간 후에 실시할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 변이주 제조방법
본 발명의 변이주는 하기와 같이 선별할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539로 하여 자외선 조사에 의한 1차 돌연변이를 수행하여 얻은 변이주 중에서 아가피스 방법으로 아실라아제 활성이 높은 변이주를 1차 선발하고, NTG(N-methyl-N'-nitrosoguanidine) 처리를 통해 2차 돌연변이를 수행하여 얻은 변이주 중에서 아가피스 방법으로 아실라아제 생산성이 보다 증강된 변이주를 선발하게 되었고 이를 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주로 명명한 후 대한민국 한국생명공학연구원 유전자은행에 2012년 08월 20일자로 기탁하여 KCTC 12266BP의 기탁번호를 부여받았다.
상기 1차, 2차 돌연변이를 수행하여 아실라아제 생산성이 높은 우수 변이주를 선별하기 위한 방법으로 아가피스 방법의 스크리닝 원리는 도 2에 묘사에서 나타나듯 페트리디쉬에 1mg/L의 미카펀진 전구체 A가 포함된 고체배지에서 콜로니를 5일 동안 성장시킨 다음, 1x103/ml 칸디다 알브리칸스가 포함된 또 다른 고체배지를 그 위에 붓고 30℃에서 16시간 배양한다. 아실라아제 활성이 높은 변이주 주변에는 칸디다 알브리칸스와 함께 자라게 되지만 아실라아제를 생산하지 못하는 변이주 주변에는 하위층의 항진균능이 있는 미카펀진 전구체 A에 의하여 칸디다 알브리칸스가 자라지 못하게 된다. 따라서 아실라아제 활성이 높은 변이주 주변에는 칸디다 알브리칸스가 넓게 자라게 되고 그 크기를 측정하여 아실라아제 생산성 정도를 평가할 수 있다.
악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539 균주는 1％의 염화칼륨이 포함된 배지에서는 자라지 못하는 특성으로부터 1차 돌연변이를 수행한 다음의 변이주 선별은 1％ 염화칼륨이 포함된 배지, 바람직하게는 포도당 4g/L, 효모추출물 4g/L, 맥아추출물 10g/L, 염화칼륨 10g/L, 한천 20g/L, pH 7.0±0.2(DK-M1)를 사용한다. 우수변이주 선별을 위한 아가피스법의 하층배지에는 DK-M1에 추가적으로 1mg/L의 미카펀진 전구체 A를 포함하고 있다. NTG에 의한 2차 돌연변이를 수행한 다음의 선별배지로는 악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539 균주가 수크로오스의 이용성이 떨어짐을 관찰하고 20％의 수크로오스를 포함하는 배지, 바람직하게는 수크로오스 20g/L, 효모추출물 4g/L, 맥아추출물 10g/L, 한천 20g/L, pH 7.0±0.2(DK-M2)를 사용한다. 우수변이주 선별을 위한 한천이중층의 하층배지에는 DK-M2 배지에 1mg/L의 미카펀진 전구체 A를 추가적으로 포함하고 있다.
상기 기탁번호가 KCTC 12266BP인 악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539 변이주는 1차, 2차 인공돌연변이 중에서 아실라아제 활성이 가장 높은 변이주 중에 선발된 것으로서 배양학적, 형태학적 및 생리학적 특성은 친주인 악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539과 유사하나 아실라아제 활성이 크게 증가하였다.
상기한 바와 같은 특성을 가지는 균주는 대한민국 유전자은행에 2012년 08월 20일자로 기탁하여 KCTC 12266BP의 기탁번호를 부여 받았으며, 이의 균학적 특성은 하기와 같았다.
표 1은 DKB1102 주를 효모엑기스·맥아엑기스 한천, 오트밀 한천, 무기염·전분 한천, 글리세린·아스파라긴 한천, 펩톤·효모 엑기스·철 한천 및 티로신 한천 배지상에서, 30℃로 14일간 배양시켰을 때, 발육 상태를 광학 및 주사형 현미경으로 관찰한 특징을 정리하여 기재한 것이다. 색명은 문헌[Methuen Handbook of Colour, Methun, London, 1978]을 사용하였다. 기균사로 성장하는 배지는 없고 색소 및 가용성 색소도 관찰되지 않았다.
악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)의 균학적 성질
배지 배지 성상
효모엑기스·맥아엑기스 한천
(ISP-2)		 G: 양호
A: 없음
R: 옅은 오렌지
S: 없음
오트밀 한천
(ISP-3)		 G: 양호
A: 없음
R: 옅은 오렌지
S: 없음
무기염·전분 한천
(ISP-4		 G: 양호
A: 없음
R: 옅은 오렌지
S: 없음
글리세린·아스파라긴 한천
(ISP-5)		 G: 양호
A: 없음
R: 옅은 오렌지
S: 없음
펩톤·효모 엑기스·철 한천
(ISP-6)		 G: 양호
A: 없음
R: 옅은 오렌지
S: 없음
티로신 한천
(ISP-7)		 G: 양호
A: 없음
R: 옅은 오렌지
S: 없음
약호; G:생육 A:기균사 R:생육 이면의 색 S:가용성 색소
악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)의 특성
특성 악티노플라네스
유타헨시스 DKB1102
형태 균사체
균락색깔 옅은 오렌지
그람염색성 양성
산소 요구성 호기성
멜라닌 색소 -
타이로신 분해 -
요소 분해 -
전분가수분해능 +
카제인 가수분해능 +
질산 환원 -
protease 활성능 약함
KCl 0.5 ％ +
KCl 1.0 ％ +
KCl 1.5 ％ -
-: 이하 또는 음성반응
+: 이상 또는 양성반응
악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)의 탄소원 이용성
탄소원 악티노플라네스
유타헨시스 DKB1102
포도당 +
아라비노스 -
수크로스 ++
과당 -
말토스 +
락토스 +
만노스 +
덱스트린 ++
전분 ++
-: Utilization negative
+: positive utilization
++: strongly positive utilization
2. 변이주를 이용한 미카펀진 전구체 A에서 B로의 전환
본 발명은 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)의 아실라아제 생산에 최적인 발효공정과 그 발효산물에서 환상 리포펩티드 중 미카펀진 전구체 A를 효과적으로 탈아실화하여 미카펀진 전구체 B를 생산하는 생물전환기술을 포함한다. 이하 실시예에 있어서, 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)의 배양은 사면배양, 1차 종균배양, 2차 종균배양, 본 배양으로 구성되는 배양공정단계와 배양액으로부터 탈아실화된 미카펀진 전구체 B를 생산하기 위한 생물전환반응단계로 나눌 수 있다.
1) 배양공정단계
사면배양에서는 수크로오스 4g/L, 맥아추출물 10g/L, 효모추출물 4g/L, 한천 20g/L, pH7.0±0.2의 배지조성을 갖고 30℃에서 7∼10일간 배양한다.
1차 종균배양에서는 사면배지에서 7∼10일간 자란 오렌지색이 풍부한 콜로니를 사용하고 포도당 20g/L, 덱스트린 10g/L, 수용성전분 10g/L, 면실박 5∼25g/L, Pre-cooked oatmeal 10g/L, 효모추출물 5∼12g/L, 펩톤 10g/L, pH6.5±0.2의 배지를 사용한다. 바람직한 실시예는 포도당 20g/L, 덱스트린 10g/L, 수용성전분 10g/L, 면실박 10g/L, Pre-cooked oatmeal 10g/L, 효모추출물 10g/L, 펩톤 10g/L, pH6.5±0.2의 배지를 사용하고 30℃에서 60∼72시간동안 배양한다.
2차 종균배양에서는 5L 발효기(Kobiotech, korea)를 사용하고 1차 종균배지에서 사용한 배지를 사용한다. 2차 종균배양은 접종량 2∼10％, 배양온도 30℃, 주입공기량 0.5VVM, 내압 0.04∼0.05Mpa, 교반속도 400rpm으로 배양을 시작하고 배양 과정동안에는 용존산소량이 30％이상 유지되도록 공기주입량과 교반속도를 증가시킨다. 배양종료는 pH가 급격히 증가하는 시점에서 본 배양기로 넘긴다.
본 배양에서는 50L 발효기(Kobiotech, korea)를 사용하고 수크로오스 30g/L, 면실박 5∼35g/L, 효모 추출물 5∼15g/L, 인산수소이칼륨 0.2g/L, 황산마그네슘 0.01g/L, 염화칼륨 0.01g/L을 이용한다. 보다 바람직한 실시예에서는 수크로오스 30g/L, 면실박 20g/L, 효모 추출물 10g/L, 인산수소이칼륨 0.2g/L, 황산마그네슘 0.01g/L, 염화칼륨 0.01g/L이다. 또한 본 배양에서는 접종량 10％, 배양온도 30℃, 공기주입량 0.5VVM, 내압 0.04∼0.05Mpa, 교반속도 200rpm에서 배양을 시작하고 배양 과정동안에는 용존산소량이 30％ 이상 유지되도록 공기주입량과 교반속도를 증가시킨다.
2) 생물전환반응단계
환상 리포펩티드의 구조를 갖는 미카펀진 전구체 A를 발효 배양액에 투입하여 전구체 B를 얻는 일련의 과정은 단회투입 또는 단계식, 연속식 모드로 수행할 수 있다. 상업적 제조의 경우에는 단회투입 모드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한 전구체 A를 투입하는 시점, 투입 후의 전구체 A 농도, 반응 온도와 pH 등의 매개요인이 전환수율에 미치는 영향이 크므로 최적화된 조건에서 이를 수행할 수 있다.
환상 리포펩티드의 투입개시는 본 배양 개시시간으로부터 아실라아제 활성이 가장 높은 72∼120 시간에서 이루어진다. 바람직한 실시예는 96시간이다. 리포펩티드의 투입개시가 너무 이른 시간에 이루어질 경우 낮은 아실라아제 활성에 의한 낮은 전환수율과 공정시간이 길어짐으로 인한 오염의 가능성과 시료의 안정성이 떨어질 수 있다. 반면 투입 개시시간을 초과하여 이루어질 경우 배양과정에서 고점도의 이차대사산물인 폴리사카라이드(polysaccharide)를 방출케 하여 탈아실화에 더 높은 교반력이 요구되며 또한 전환수율이 낮은 결과를 초래한다. 투입 후의 전구체 A의 농도는 대부분의 전구체 A가 아실라아제 의해 전환될 수 있는 농도인 1∼2g/L의 농도에서 이루어진다. 바람직한 실시예는 1.5g/L의 농도이다. 또한 최적 반응온도와 pH는 다수의 실험으로부터 전환수율을 비교했을 때 pH 5.5∼6.5, 온도 28∼32℃에서 가장 높은 전환수율을 나타내었다. 리포펩티드의 투입 후, 탈아실화 과정에서 생겨난 펩티드와 리포펩티드는 여러 중성이상의 pH에서 활성감소가 이루어진다. 예를 들어 pH 7.0에서 7.5로 0.5단위 상승하게 되면 표 7에서 보듯이 펩티드와 리포펩티드의 전환수율이 크게 떨어지게 된다. 반면 5.5 이하에서는 단량성 리포펩티드가 미셀형성을 하게 되어 비미셀 상태보다 아실라아제 반응에서 전환수율이 감소하게 된다. 또한 탈아실화 과정에서의 온도에 대한 영향은 표 8에 나타난 바와 같이 특정온도에 대한 아실라아제 활성이 다른데 생육접점 온도인 38℃에서는 낮은 전환수율을 나타내었다.
악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)는 미카펀진 전구체 A에서 B로의 전환수율이 악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539과 비교했을 때, 보다 증대된 전환수율을 갖는 것으로 나타나 높은 아실라아제 생산능에 따른 대량 생산공정에 적용가능성을 특징으로 한다. 상기 리포펩티드의 탈아실화에 대한 방법은 상용화된 진균제 미카펀진의 제조에 도 응용될 수 있음을 의미하고, 더 나아가 리포펩티드 물질의 효능을 증강시키고 독성을 줄일 수 있는 의약품의 약물구조 설계에도 응용될 수 있는 기술이다.
이하 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>; 아실라아제 생산성이 증강된 균주 선별
1-1. 변이제에 의한 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주의 분리
악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539을 UV조사하여 선별된 삼투압내성 변이주 중에서 아가피스 방법으로 아실라아제 활성이 높은 변이주를 1차 선발하게 되었고 연이은 NTG를 처리에서 당내성이 증강된 변이주 중에서 아실라아제 활성이 보다 증강된 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 선발하게 되었다.
먼저, 악티노플라네스의 유타헨시스 ATCC 14539을 30℃에서 10일간 사면배지에서 배양한 후, 1.5㎕ 에펜도르프관에 생리식염수 900㎕을 넣고 100㎕의 균사 용액을 첨가하여 10-2, 10-3, 10-4 희석배수로 연속희석을 한 후 100㎕를 DK-M1 평판배지에 도말하였다. 30℃에서 2시간 동안 전배양(preincubation)을 수행한 후, 280nm 파장의 20W 자외선등 2개가 65cm 거리에 설치된 무균상자에서 118초간 조사하였다. 이때 사멸률은 99.9％이었다. 즉시 광회복에 의한 복구(repair)를 방지하기 위해 차광하여 4℃에서 2시간 동안 보존하여 순화시키고, 30℃에서 5일간 생존한 콜로니를 대상으로 한천이중층 아가피스 방법으로 아실라아제 활성을 비교하여 1차 변이주를 선발하였다. 1차 선발된 변이주를 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 사용하여 사멸률 70％로 상기의 UV 조사방법과 동일하게 2차 돌연변이를 수행하였다. 2차 돌연변이주 선별을 위한 선별배지로는 20％의 수크로오스가 첨가된 DK-M2 배지를 사용하였다. NTG 처리 후 DK-M2 평판배지에서 30℃에서 6일간 생존한 콜로니를 대상으로 한천이충층 아가피스 방법으로 아실라아제 활성을 비교하여 아실라아제 활성이 보다 증강된 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 선발하게 되었다.
배지 조성
배지 조성
평판 및 사면배지 포도당 4g/L, 맥아추출물 10g/L, 효모추출물 4g/L, 한천 20g/L
선별배지 1 포도당 4g/L, 효모추출물 4g/L, 맥아추출물 10g/L, 염화칼륨 20g/L, 한천 20g/L
선별배지 2 수크로오스 20g/L, 효모추출물 4g/L, 맥아추출물 10g/L, 한천 20g/L
1-2. 돌연변이 균주 선발법
상기 실시예 1-1에서 돌연변이원을 이용한 아실라아제 생성능이 증강된 균주 선별은 아가피스 한천이중층 방법을 사용하였다. 페트리디쉬에 멸균된 선별배지가 응고되기 전 미카펀진 전구체 A를 넣고 최종 농도가 1mg/L가 되게 한다. 선별배지에서 자란 콜로니를 대상으로 1x103/ml 의 칸디다 알브리칸스가 포함된 또 다른 고체배지를 그 위에 붓고 30℃에서 16시간 배양하였다. 환 크기 측정으로부터 아실라아제 활성이 가장 높은 변이주의 선발할 수 있었고 수차례의 반복적인 실험으로 균주의 안정성을 확인하였다.
1-3. 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)의 특성 확인
상기 실시예 1-2에서 선발한 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)의 배양학적, 형태학적 및 생리학적 특성을 조사하였다.
악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)의 세포벽은 LL-디아미노피멜릭산(LL-diaminopimelic acid)이 관찰되는 1형(Type 1)이었다. 생장 온도는 12∼35℃이고, 최적 온도는 30℃이었다.
탄소원 이용성 실험은 프리담과 고트립의 방법(Pridham,T.G and D.Gotrlib.1948. J. Bacteriol.,56,107-114)에 따라 시행하였으며, 30℃에서 2 주간 배양후 관찰하여 하기 표 5, 표 6에 나타냈었다. 기균사의 색은 옅은 오렌지 내지 황색이고 가용성 색소는 엷은 황색으로 멜라노이드 색소의 생산은 발견되지 않았다.
악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)의 경우는 악티노플라네스 유타헨시스 ATCC 14539 보다 염내성이 강하고 수크로오스에 대한 당내성이 증강되었다.
균주의 특성
특성 악티노플라네스
유타헨시스 ATCC 14539		 악티노플라네스
유타헨시스 DKB1102
형태 균사체 균사체
균락색깔 황색 또는 옅은 오렌지 황색 또는 옅은 오렌지
그람염색성 양성 양성
산소 요구성 호기성 호기성
멜라닌 색소 - -
타이로신 분해 - -
요소 분해 + +
전분가수분해능 + +
카제인 가수분해능 + +
질산 환원 + +
protease 활성능 약함 약함
KCl 0.5 ％ + +
KCl 1.0 ％ - +
KCl 1.5 ％ - -
-: 이하 또는 음성반응
+: 이상 또는 양성반응
균주의 탄소원 이용성
탄소원 악티노플라네스
유타헨시스 ATCC 14539		 악티노플라네스
유타헨시스 DKB1102
포도당 + +
아라비노스 - -
수크로스 + ++
과당 - -
말토스 + +
락토스 + +
만노스 + +
덱스트린 ++ ++
전분 ++ ++
-: Utilization negative
+: positive utilization
++: strongly positive utilization
<실시예 2>: 균주 배양과 균주를 이용한 미카펀진 전구체 B의 생산
2-1. 균주 배양
악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)의 배양은 사면배양, 1차 종균배양, 2차 종균배양, 본 배양으로 이루어진다. 사면배양은 멸균되고 경사 응고된 수크로스 4g/L, 멕아추출물 10g/L, 효모 추출물 4g/L, 한천 20g/L, pH7.0±0.2 배지와 30℃에서 7∼10일 동안 배양한다. 1차 플라스크 종균배양은 사면배지에서 자란 오렌지 색깔의 균사체를 플라스크 종균 배양배지에 접종한 후 30℃에서 220rpm으로 60∼72시간동안 배양한다. 2차 종균 배양은 5L 발효기(Kobiotech, korea)를 사용하고 1차 종균배지와 동일한 배지를 사용한다. 접종량 2∼10％, 배양온도 30℃, 주입공기량 0.5VVM, 발효조 내압 0.04∼0.05Mpa, 교반속도 400rpm(3L)의 조건으로 배양 시작하고 배양이 진행되는 동안에는 용존산소량이 30％ 이상으로 유지되도록 공기주입량과 교반속도를 증가시킨다. 배양은 pH가 급격히 증가하는 시점에서 본 배양기로 넘긴다. 본 배양에서는 50L 발효기(Kobiotech, korea)를 사용하고 수크로오스 30g/L, 면실박 20g/L, 효모 추출물 10g/L, 인산수소이칼륨 0.2g/L, 황산마그네슘 0.01g/L, 염화칼륨 0.01g/L이 포함된 배지에 2차 종균배양액을 무균조작으로 투입한다. 접종량 10％, 배양온도 30℃, 공기주입량 0.5VVM, 발효조 내압 0.04∼0.05Mpa, 교반속도 200rpm(50L) 조건에서 배양을 시작하고 균체 PMV(Packed Mycellium Volume) 성장에 따라 용존산소량(DO)의 감소로 배양이 진행되는 동안 공기주입량과 교반속도를 증가시켜 30％ 이상 유지되게 한다(도 3a, 도 3b 참조).
2-2. 균주를 이용한 미카펀진 전구체 B의 생산
악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102(Actinoplanes utahensis DKB1102) 균주(KCTC 12266BP)의 배양 후 90시간에 75g/L의 미카펀진 전구체 A 농축액을 투입하여 최종 농도가 1-2g/L이 되게 한다. 미카펀진 전구체 A를 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주 배양액에 투입 후, 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주의 배양조건은 pH 4.5∼7.5, 온도 20∼38℃에서 수행하고 상기 균주의 pH 및 온도에 따른 미카펀진 전구체 B의 생산 결과를 아래의 표 7, 표 8 및 도 4, 도 5에 각각 나타내었다.
반응종료는 HPLC 분석에서 전구체 A가 전구체 B로 80％ 이상으로 전환되었을 때 종료한다. HPLC 분석은 배양액을 4000rpm에서 10분간 원심분리한 상등액을 0.22um로 여과하여 하기의 미카펀진 전구체 A, B의 정량방법에 따라 분석한다.
미카펀진 전구체 A, B의 정량방법
1. 용매 전달 시스템:
방식(Mode): 등용매 펌프(Isocratic Pumping) 방식
유속: 1ml/분
운전시간: 30분
2. 용매 A: 0.5％ NaH2PO4 중의 95％ 아세토니트릴
용매 B: 0.5％ NaH2PO4 중의 5％ 아세토니트릴
표적(target)조건은 20.0± 0.5분일 때 전구체 A를 보유시키는 것이다. 용매 A와 함께 용매 B를 사용하여, HPLC 이동상 조건을 조절함으로써, 소정의 머무름 시간(retention time)을 달성할 수 있다.
3. 자동 시료 주입기(autosampler) 냉각기: 5℃(4 내지 6℃)
4. 주입 부피: 5㎕ 내지 75㎕(통상 20㎕)
5. 컬럼: Optimapak C-18(RStecch co., Ltd.), 5μ, 4.6 mm×250 mm (또는 등가물)
6. 검출파장: 210 nm
7. 컬럼 온도: 상온
생물전환 배양액을 4000rpm에서 10분간 원심분리한 후의 상등액을 0.22um 여과 필터한다. Optimapak C18 4.6×250mm(RStecch co., Ltd.)과 Waters HPLC를 사용하고, 분석조건은 이동상 95％ 아세토니트릴-물(0.5％ NaH2PO4 포함)=3:97, UV 210nm, 유량속도 1ml/min, 주입량 20㎕이다. 표준품은 사에서 생산되는 미카펀진을 사용하여 수행하였다.
pH에 따른 미카펀진 전구체 B의 전환수율
Reaction pH MPA (mg/l) MPB (mg/l) Convension yield (％)
4.5 1,025 533 52
5.0 1,023 696 68
5.5 1,009 793 79
6.0 1,004 803 80
6.5 1,015 795 78
7.0 1,011 758 75
7.5 1,012 627 62
*MPA은 미카펀진(Micafungin) 전구체 A
*MPB : 미카펀진(Micafungin) 전구체 B
온도에 따른 미카펀진 전구체 B의 전환수율
Reaction Temperature(℃) MPA (mg/l) MPB (mg/l) Convension yield (％)
20 1,008 504 50
25 1,013 658 65
28 1,010 727 72
30 1,006 785 78
32 1,013 750 74
35 1,014 629 62
38 1,016 427 42
*MPA은 미카펀진(Micafungin) 전구체 A
*MPB : 미카펀진(Micafungin) 전구체 B
본 발명은 높은 아실라아제 활성을 나타내는 KCTC 12266BP를 배양하여 그 배양액으로부터 환상 리포펩티드 미카펀진 전구체 A를 높은 전환수율로 전구체 B를 대량 생산하는 방법을 제공한다. 따라서 산업상 이용가능성이 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12266BP 20120820

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 탈아실화된 환상 리포펩티드 미카펀진 전구체 B의 제조방법에 있어서,
    악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)를 배양한 배양액에, 상기 배양후 90~96시간 후에 1∼2g/L 농도의 미카펀진(Micafungin) 전구체 A를 첨가하고, pH 5.5∼6.5 및 28∼32℃의 온도 조건에서 미카펀진 전구체 A를 탈아실화시켜 미카펀진(Micafungin) 전구체 B로 전환시키는 것을 특징으로 하며,
    상기 악티노플라네스 유타헨시스 DKB1102 균주(KCTC 12266BP)는 모균주에 비해 탈아실화 전환수율이 향상된 것을 특징으로 하는 탈아실화된 환상 리포펩티드 미카펀진 전구체 B의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 pH가 6.0인 것을 특징으로 하는 탈아실화된 환상 리포펩티드 미카펀진 전구체 B의 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 온도가 30℃인 것을 특징으로 하는 탈아실화된 환상 리포펩티드 미카펀진 전구체 B의 제조방법.
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