KR101222233B1 - 항생물질의 고 생산 균주와 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항생물질의 고 생산 균주와 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 상기 고 생산성 균주는 Glarea lozoyensis에 속하는 돌연변이 균주이며 중국미생물균종보존관리위원회 보통미생물센터에 기탁 된 기탁번호가 CGMCC 2933인 균주이다. 그 제조방법에는 (a) 기탁번호가 ATCC20957인 종자액과 니트로소구아니딘을 혼합하여 혼합액a를 얻는 단계, (b) 혼합액a를 세포벽 분해효소와 혼합시켜 원형질체를 얻는 단계, (c) 원생질체를 재생시켜 싱글 콜로니는 얻는 단계, 및 (d)싱글 콜로니를 배양시켜 돌연변이 균주를 얻는 단계가 포함된다. 얻은 균주는 유전적 안정성이 양호하고 생산량이 안정하며 발효 생성 시 불순물이 적어 산업화생산에 유리하다.

Description

항생물질의 고 생산 균주와 그 제조방법 및 용도{HIGH-YIELD ANTIBIOTICS PRODUCING FUNGUS STRAIN, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF}

본 발명은 항생물질의 제조분야에 관한 것이며, 특히는 항생물질의 고 생산 균주와 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

지난 몇십년 동안 인류의 건강을 해쳐 온 진균감염은 그 발생빈도나 감염종류가 부단히 증가하고 있으며 특히는 면역억제 환자에게 영향을 미치고 있다. 그동안 임상에서 비교적 많이 사용되고 있는 암포테리신,이미다졸계 및 트리아졸계의 항진균제는 신경독성이 강하고 약물내성을 갖고 있는 등 원인으로 임상사용에 일정한 한계를 가지고 있다.신규성 항진균제인 에키노칸딘계 항생물질은 20세기 70년대에 발견된 새로운 천연물질이며 유사한 고리형 폴리펩티드 코아 및 부동한 지방산 측쇄의 구조 특징을 가지고 있고 진균세포벽의 β-D-글루칸의 합성을 경쟁적으로 억제시킨다. 에키노칸딘계 약물의 우점은 독성이 낮고 살균활성이 강한 동시에 우수한 약물동역학 성질을 가지고 있는 것이다.

에키노칸딘족에는 에키노칸딘(echinocandins), 시로펀긴( cilofungin), 프뉴모칸딘(pneumocandins), 아큐레신(aculeacins), 물룬도칸딘(mulundocandin), WF11899A 등이 포함된다. 그 중, echincandins와 pneumocandin 약물의 연구가 깊게 진행되고 있으며 임상응용에도 사용되고 있는 두 가지 종류의 항진균약물이다.

Caspofungin속 pneumocandin의 일종의 수용성 반합성 유도체는 Merck 회사에서 개발한 일종의 항진균/항폐낭충약물이다. 제2기 임상대조실험에서 폐 감염성 아스페르질루스증에 걸린 면역억제 환자를 대상으로, 암포테리신 B와 아졸계 약물을 투여했지만 뚜렷한 효과를 보지 못했던 환자에게 다시 카스포펀진(caspofungin)(정맥주사50－70mg/d)를 투여한 결과 좋은 효과를 보았다. 128예의 HIV감염 환자 중, caspofungin을 투여할 경우, 칸디다 식도염에 대한 효과가 85%에 달했으나　암포테리신 B에 대한 효과는 겨우 66.7% 달하였다. 이런 약물은 아졸계 및　암포테리신 B에 내성을 가지고 있는 진균에 효과적이다. 용혈독성이 없으며 비교적 약한 약물 상호작용으로 인해 기존의 항진균성 약물에 비해 효과가 더 좋다.

Caspofungin의 구조

Pneumocandin는 Glarea lozoyensis로부터 생성된 천연 항진균약물이며, 구조 중의 프롤린상의 부동한 치환기의 따라 주로 세가지 부류로 나눈다. 즉, A₀（3-히드록실-4-메틸프롤린）、B₀（3-히드록실프롤린）및 C₀（4-히드록실프롤린）이다. 또한 고리형 폴리펩티드 상의 부동한 치환기에 따라 pneumocandin A₀는 다시 A₀，A₁，A₂，A₃，A₄，A₅ 등 여섯 가지로 나뉘며, B₀는 B₀，B₁，B₂，B₃，B₄，B₅로 나뉜다. 그 중, A₀，A₁，A₃，A₄ 및 B₀ 등 5가지 종류는 야생형 균주 ATCC20868로부터 생성되나 주요 생성물은 A₀이다. ATCC20868에 대해 NMU 돌연변이를 걸쳐 동시에 A₀및 B₀를 생성할 수 있는 돌연변이 균주 ATCC20957를 얻었다. ATCC20957는 B₀의 생산능력이 비교적 낮으며 불순물A₀의 함량도 놓다.

그리하여, 본 분야에서는 B₀의 생산량이 높고 불순물A₀의 함량이 비교적 낮은 산업화생산에 더 적합하며 유전성이 안정하고 생산량이 높은 균주를 절실히 필요로 하고 있다.

본 발명의 목적은 ATCC20957의 돌연변이 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신 균주의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신 균주의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 네번째 목적은 상기 신 균주를 이용한 식I화합물의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 첫번째 방면으로는, Glarea lozoyensis의 돌연변이 균주를 제공한다. 상기 균주는 중국미생물균종보존관리위원회 보통미생물센터에 기탁된 기탁번호가 CGMCC 2933인 Glarea lozoyensis의 돌연변이균주이다.

본 발명의 두번째 방면으로는 상기 돌연변이 균주의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법에는

(a)기탁번호가 ATCC20957인 Glarea lozoyensis의 종자액과 니트로소구아니딘을 혼합하여 혼합액a를 얻는 단계,

(b)혼합액a를 세포벽 파괴효소와 혼합시켜 원형질체를 얻는 단계,

(c)원생질체를 재생시켜 싱글 콜로니는 얻는단계,

(d)싱글 콜로니를 배양시켜 청구항1의 돌연변이 균주를 얻는 단계,

를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 단계(a) 중, 혼합액a의 총체적에 대한 니트로소구아니딘의 농도는 10 내지 20μg/ml이며, 단계(b) 중, 혼합액a과 세포벽 분해효소를 혼합 한 후의 총체적에 대한 세포벽 분해효소의 농도가 10 내지 50mg/ml이다.

다른 바람직한 실시예에서, 상기 세포벽 파괴효소에는 세포벽 분해효소, 스네일 효소(snail enzyme) 및 셀룰라아제에서 선택되는 한가지 또는 한가지 이상의 물질이 포함된다.

다른 바람직한 실시예에서, 각 단일 효소의 농도범위는 10 내지 40mg/ml이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단계(a) 중, 종자액 중의 균사는 대수증장기에 있다.

다른 바람직한 실시예에서, 단계(a) 중,종자액의 총체적에 대한 세포 건조중량은 5 내지 10g/L이다.

본 발명의 세번째 방면으로는 상기 돌연변이체를 식Ⅰ화합물을 제조하는데 사용하는 용도를 제공한다.

I

본 발명의 네번째 방면으로는, 식Ⅰ화합물의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법에는 (1) 15 내지 35℃하에, 발효배지에서 상기 돌연변이균주를 배양하여 식Ⅰ의 화합물을 얻는 단계를 포함한다.

더 바람직한 실시예에서, 발효배지 총체적에 대하여, 상기 발효배지에는 L-프롤린 15-50g/l，글루탐산　나트륨 6-20g/l，효모추출물 6-20g/l，프럭토스 4－20g/L，무기염 1.5－7g/L，미량원소 10－50g/L 이 포함되어 있다.

더 바람직한 실시예에서, 상기 무기염은 인산염, 유산염에서 선택되는 한가지 또는 그 혼합물이다.

더 바람직한 실시예에서, 배양 시, 상기 발효배지에는 10-100g/L의 만니톨이 더 포함되어 있다.

더 바람직한 실시예에서, 발효배지의 총체적에 대한 상기 돌연변이균주의 접종량은 4 내지 10 v/v％이다.

더 바람직한 실시예에서, 상기 발효배지의 초기 pH치가 5.3 내지 6.0이다.

본 발명의 목적은 B₀생산량이 높고 불순물A₀의 함량이 적은 산업화생산에 더욱 적합한 유전적 안정성이 우수한 고 생산성 균주를 제공하고자 하는데 있다.

도1은 본 발명에서 제공하는 신 균주 CGMCC 2933의 실험흐름도이다.
도2는 Pneumocandin계 약물의 구조이다. 그 중 Pneumocandin B₀는 본 발명의 식I의 화합물이다.

본 발명의 발명자는 의외로 균주 Glarea lozoyensis ATCC20957를 대상으로 니트로소구아니딘(NTG) 변이를 유도한 후, 세포벽 분해효소(lywallzyme)를 이용하여 원형질체를 얻은 후 다시 재생한 원형질체에 대한 선별을 거쳐 고 생산 돌연변이체(기탁번호 CGMCC 2933)를 얻었다. 이 돌연변이 균주에 대한 발효를 거쳐 고 생산량의 식I화합물을 얻을 수 있다. 이 기초상에서 본 발명을 완성하였다.

신 균주

분 발명에서는 식I화합물을 생성하는 새로운 균주를 제공한다. 이 균주는 분류학상으로는 Glarea lozoyensis에 속하며 중국 미생물균종 보관관리위원회 보통미생물센터에 기탁되어 있으며 기탁번호는 CGMCC 2933이다.

신 균주의 제조방법

본 발명에서 제공하는 기탁번호가 CGMCC 2933인 신 균주의 제조방법은 다음과 같다.

출발 균주→종자액→NTG돌연변이 유도→세포벽 분해효소를 이용한 세포벽 제거를 통해 원형질체 획득→희석 및 배지에 도포→싱글 콜로니를 취하여 사면배지에 접종→플라스크를 흔들어 1차 스크리닝 진행→고 생산 균주 선별→사면배지에 접종→플라스크를 흔들어 2차 스크리닝 진행→고 생산 균주 선별,탱크에 확인 및 안정성실험 진행→균주 기탁.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 방법은

(a）기탁번호가 ATCC20957인 Glarea lozoyensis의 종자액 및 니트로소구아니딘을 혼합하여 혼합액a를 얻는 단계,

(b）혼합액a와 세포벽 분해효소를 혼합하여 원생질체를 얻는 단계,

(c）원생질체를 재생시켜 싱글 콜로니를 얻는 단계,

(d）싱글 콜로니를 배양하여 새로운 균주를 얻는 단계,

를 포함한다.

본 발명의 한 실시예에서, 신 균주는 다음과 같이 얻는다. 즉, 플라스크를 흔들면서 1 내지 3일간 배양한 ATCC20957 종자액(세포 건조중량, DCW 5 내지 10g/L )중에 적당한 양의 NTG를 넣어 계속하여 1 내지 2일간 배양 한 후 원심분리, 세척, 침전현탁 후, 세포벽 분해효소를 이용하여 세포벽을 제거하여 원형질체를 얻는다. 희석 후의 원생질체를 고 침투 PDA(포테이토 덱스트로스　아가) 평판배지에 도말하여 배양 한 후, 형질전환 세포의 싱글 콜로니를 얻는다. 상기 싱글 콜로니에 대한 선별을 통해 돌연변이의 새 균주를 얻는다.

또한, 본 발명에서는 돌연변이를 거쳐 얻은 신 균주를 발효시켜 식I화합물을 얻는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 실시예에서, 돌연변이를 거쳐 신 균주를 얻는 방법 및 신 균주를 발효시켜 식I화합물을 얻는 방법은 다음과 같다:

(1)출발 균주: Glarea lozoyensis ATCC20957

(2)출발 균주 종자배양

기탁 된 ATCC 20957 균주의 글리세린관을 녹인 후 종자 배지(배양액의 양 50mL/250mL)에 접종시킨다. 25 내지 30℃, 200 내지 300 rpm조건으로 진탕배양기에서 균사 건조중량이 5 내지 10g/L에 달할 때까지 1 내지 3일간 배양시킨다.

종자배지의 조성은 다음과 같다. 즉, 자당 10 내지 20 g/L，효모추출물 4 내지 10 g/L，콩 트립톤 10 내지 20 g/L，KH₂PO₄ 1.5 내지 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 내지 1 g/L，미량 원소 10 내지 50 g/L，초기 pH치 5.3 내지 6.0. 121℃에서 20분간 멸균.

미량원소：FeSO₄·7H₂O 10 내지 20 g/L，MnSO₄·H₂O 10 내지20 g/L，ZnSO₄·7H₂O 2 내지 10g/L，CaCl₂ 0.7 내지 2.0 g/L，H₃BO₃ 0.56 내지 2.0 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.25 내지 2.0 g/L，（NH₄）₆Mo₇O₂₄·7H₂O 0.19 내지 2.0 g/L，농염산 500 ml/L。

(3)싱글 콜로니 분리

출발 균주 종자액에 대해 NTG변이를 유도시킨 후, 세포벽 분해효소를 이용하여 세포벽을 파괴시켜 얻은 원생질체를 다시 재생시켜 돌변변이 균주를 얻는다.

(4)돌연변이 균주 선별

원생질체를 고 침투 PDA 배지에 도말하여, 10 내지 12일간 배양시킨 후 얻은 싱글 콜로니를 다시 사면배지에 접종한다. 8 내지 9일간 배양시킨 후, 종자배지(배양액 양: 25 mL/250 mL)에 다시 접종시켜 25-30℃, 280 rpm 조건 하에 진탕배양기에서 6 내지 10일간 배양시킨다. 종자배지에서 발효배지(배양액 양:25 mL/250 mL)에 접종 시킨 후, 25-30℃, 200-300 rpm 조건하에 진탕배양기에서 6 내지 12일간 배양시킨다. 배양이 끝난 후, 메탄올로 발효액을 추출한 후, 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 식I화합물의 함량을 측정한다.

그 중, 각종 배지의 조성은 참고문헌 Pneumocandins from Zalerion arboricola ,Journal of antibiotics, Vol 45, No.12,Dec 1992, 1867-1874를 참고로 한다.

고 침투 PDA 평반배지: 포테이토 300 g/L，포도당 20 g/L，아가 15 g/L，자당 273.6 g/L，121℃에서 20분간 멸균.

고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 식I화합물의 함량을 측정.

크로마토그래픽 컬럼: Phenomex C18 (4.6mm X 50 mm, 5μm) ,

이동상: 아세토니트릴 : 물 = 50:50,

컬럼온도: 35℃,

기울기 용리, 유속: 1.0 mL/분，

주입량: 5μL, 검출파장: 210nm.

(5)돌연변이 균주의 발효

관련 기술방안은 기존문헌에 이미 기재되어 있다. 구체적으로, Biotechnology and Bioengineering,Vol 78, No.3,May 5 2002 및 Journal of industrial microbiology , 11(1993), 95-103를 참고로 한다.

본 발명에서 기재된 상기 특징, 또는 실시예에 기재된 특징은 임의로 재조합 할수 있다. 본 명세서에 기재된 모든 특징은 임의의 조합 형식으로 사용할 수 있으며 명세서에 기재 한 각 특징은 동일하거나 균등하거나 또는 비슷한 목적을 제공할 수 있는 교체성 특징으로 바꿀 수 있다. 하여, 특별한 설명이 없는 경우, 기재된 특징은 균등하거나 비슷한 특징의 일반적인 예에 불과하다.

본 발명의 주요 이점은 다음과 같다.

1.고 생산 및 유전적 안정성이 양호한 돌연변이 신 균주를 얻었다.

2.신 균주의 유전적 안정성이 양호하고 불순물의 생성이 적어 식I화합물의 생성 과정에서 생성물의 분리,정제 및 제조공정의 확대에 유리하여 산업화생산에 적합하다.

3.최적화 조건하에서 발효를 통해 식I화합물을 제조할 수 있으며, 생산량이 5g/L에 달한다.

아래에, 구체적인 실시예와 결부하여, 본 발명을 진일보 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니라 설명하려는데 있다. 아래 실시예 중, 구체적인 조건과 실험방법을 밝히지 않은 것은 통상의 조건, 또는 제조업체에서 건의한 조건에 따라 실시한다. 특별한 설명이 없는 경우, 백분비, 비율,비례 및 부는 중량으로 계산한다.

본 발명의 중량체적백분비에 쓰이는 단위는 당업자가 숙지하고 있는 단위이다.예하면, 100밀리리터의 용액 중의 용질의 중량이다.

특별한 설명이 없는 경우,본 명세서에 쓰인 모든 전공 및 과학용어는 본 분야의 기술자가 숙지하고 있는 의미와 동일하다. 또한 기재된 내용과 비슷하거나 균등한 방법 및 재료는 모두 본 발명의 방법에 적용할 수 있다. 명세서에 기재된 바람직한 실시방법 및 재료는 예일 뿐이다.

고성능 크로마토그래피를 이용한 본 발명의 실시예의 발효액 중 식I화합물의 함량 측정방법은 다음과 같다.

크로마토그래픽 컬럼：Phenomex C18 (4.6mm×250 mm, 5μm)，

이동상：아세토니트릴：물＝50：50，

컬럼 온도:35℃，

기울기 용리, 유속:1.0 mL/분간，

주입량:5μL，검출 파장:210nm。

실시예1

돌연변이를 통한 신 균주 CGMCC 2933의 획득

1.돌연변이 유도

기탁번호가 ATCC 20957인 균주의 글리세린관을 녹인 후, 4%의 접종량으로 종자배지(배양액 양:50mL/250mL)에 접종시켰다. 25℃, 280 rpm조건 하에 진탕배양기에서 2일간 배양시켜 균사의 건조 중량이 약 5 내지 10에 도달하게 하였다. 종자액에 농도가 10μg/mL에 도달하게 돌연변이제 NTG를 첨가시킨 후 다시 1일간 배양하였다. 배양 후, NTG를 함유한 종자액 10mL를 취하여 5000 rpm으로 10분 동안 원심분리시켜 얻은 침전을 2배 체적의 0.6M의 NaCl로 두번 세척시켜 남아있는 배양액 및 NTG를 제거하였다.

종자배지: 자당 10 g/L，효모추출물 5 g/L，콩 트립톤 10 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L，미량원소 10 g/L，초기 pH치 5.3, 121℃에서 20 분간 멸군.

미량원소：FeSO₄·7H₂O 10 g/L，MnSO₄·H₂O 10 g/L，ZnSO₄·7H₂O 2 g/L，CaCl₂ 0.7 g/L，H₃BO₃ 0.56 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.25 g/L，（NH₄）6Mo₇O₂₄·7H₂O 0.19 g/L，농염산 500 ml/L。

2.원생질체의 제조 및 싱글 콜로니의 분리

세척 후의 균사에 20mg/mL의 세포벽 분해효소（2000단위/mg)，10mg/ml의 스네일 효소(snail enzyme)（5단위/mg） 및 10mg/ml의 셀룰라아제（15단위/mg）의 효소 혼합액（0.5MNaCl 인산수소이나트륨-구연산 완충용액（pH6.0))을 10mL 첨가한 후, 30℃, 80rpm 조건으로 흔들어 5시간 효소분해시켰다. 솜으로 효소분해 후의 반응액을 여과시켜 균사를 제거한 후, 원형질체만을 포함 한 싱글 세포 현탁액을 얻었다. 1 mL를 취하여 14000 rpm으로 10분간 원심분리시킨 후, 1 mL의 0.5M NaCl 인산수소이나트륨-구연산 완충용액（pH6.0）으로 용해시켰다. 용해액을 부동한 배수로 희석시켜 0.8M의 자당을 포함한 고 침투 PDA배지에 균일하게 도말한 후 25℃에서 8 내지 10일간 배양하여 싱글 콜로니를 얻었다.

3.고 생산 균주 CGMCC 2933의 선별과정

10일간 배양시킨 싱글 콜로니를 선택하여 사면배지에 접종시켜 배양하였다. 8일 후, 0.5 내지 1cm² 면적의 콜로니를 취하여 종자배지(배양액 양: 25 mL/250 mL)에 접종시킨 후, 25℃, 280 rpm 조건 하에서 진탕배양기에 8일간 배양시켰다. 종자배지를 4%의 접종량으로 발효배지（배양액 양:25 mL/250 mL）에 접종시킨 후, 25℃, 280 rpm조건 하에 진탕배양기에서 14일간 배양시켰다（7일간 배양 후 5% 만니톨, 0.5% 프롤린을 보충한다）.

실시예2

신 균주 CGMCC 2933를 이용한 식I화합물의 생성

종자배지에서 4%의 접종량으로 실시예1에서 얻은 신 균주 CGMCC 2933를 발효배지에 접종시킨 후, 플라스크에 넣어 흔들면서 배양하였다. 25℃의 배양온도에서 14일간 배양 시킨 후의 식I화합물의 생산량이 5g/L에 달했다（7일간 배양 후 5% 만니톨, 0.5% 프롤린을 보충한다）.

발효배지：L-프롤린 15 g/L，글루탐산　나트륨 6 g/L，효모추출물（Oxiod 회사에서 구매）6 g/L，프럭토스 4g/L， KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L，만니톨 50 g/L，미량원소 10ml/L，초기 pH치 5.3, 121℃에서 20 분간 멸균.

미량원소：FeSO₄·7H₂O 10 g/L，MnSO₄·H₂O 10 g/L，ZnSO₄·7H₂O 2 g/L，CaCl₂ 0.7 g/L，H₃BO₃ 0.56 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.25 g/L，（NH₄）₆Mo₇O₂₄·7H₂O 0.19 g/L，농염산 500 ml/L。

대조예

아래 방법으로 출발균주 ATCC 20957와 돌연변이 균주 CGMCC 2933의 식I화합물의 생성율을 비교하였다.

실시예2의 배양방법으로 각각 출발균주와 돌연변이 균주를 배양한 후, 2 배체적의 메탄올로 발효액을 추출하여 고성능 크로마토그래피를 이용하여 발효액 중의 식I화합물의 양을 측정하였다. 그 결과는 표1과 같다.

균주 번호	식I화합물의 생성량（g·L-1）
ATCC20957 CGMCC 2933	1.1 5.2

그중 각 배지의 조성은 다음과 같다.

선별배양액：포테이토 300 g/L，포도당 20 g/L，아가 15 g/L，자당 273.6 g/L，121℃에서 20 분간 멸군.

사면배지：포테이토 300 g/L，포도당 20 g/L，아가 15 g/L，121℃에서 20 분간 멸균.

종자배양액：자당 10 g/L，효모추출액 5 g/L，콩트립톤 10 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L，미량원소 10 g/L，초기 pH치 5.3, 121℃에서 20분간 멸균.

발효배양액：L-프롤린15 g/L，글루탐산　나트륨6 g/L，효모추출액（Oxiod회사에서 구입）6 g/L，과당 4g/L， KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L，만니톨 50 g/L，미량원소 10ml/L，초기 pH치 5.3, 121℃에서 20분간 멸균.

미량원소：FeSO₄·7H₂O 10 g/L，MnSO₄·H₂O 10 g/L，ZnSO₄·7H₂O 2 g/L，CaCl₂ 0.7 g/L，H₃BO₃ 0.56 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.25 g/L，（NH₄）₆Mo₇O₂₄·7H₂O 0.19 g/L，농염산 500 ml/L。

실시예3

신균주 CGMCC 2933의 안정성

실시예2의 배양방법과 배지조성으로 계대배양을 진행하였다. 그 결과는 표3을 참고로 한다.

신 균종의 계대배양 안정성

계대 차수	F1	F2	F6
식I화합물의 생성량（g/L）	5.2	5.0	5.3

상기 결과로부터 신 균주의 안정성이 양호함을 알 수 있다.

본 발명에 기재된 모든 문헌은 본 발명에서 인용하여 참고로 한 것이다. 즉 매 편의 문헌은 단독으로 인용하여 참고로 한 것이다. 그 외, 본 발명의 상기 내용을 근거하여 당업자들은 본 발명을 변경 또는 수정을 할 수 있으며 이러한 등가형식도 본 발명의 청구범위에 한정 된 범위내이다.

중국보통미생물보존센터 CGMCC2933 20090309

Claims (12)

1. 중국미생물균종보존관리위원회 보통미생물센터에 기탁된 기탁번호가 CGMCC 2933인 Glarea lozoyensis의 돌연변이균주.
2. 하기 식Ⅰ의 화합물의 제조에 사용하기 위한 제1항의 돌연변이균주:
   

   

   
   [식 I].
3. 15 내지 35℃하에, 발효배지에서 제1항의 돌연변이균주를 배양하여 하기 식Ⅰ의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하기 식Ⅰ의 화합물의 제조방법에 있어서,
   상기 발효배지는 발효배지 총체적을 기준으로 하여, L-프롤린 15-50g/l，글루탐산　나트륨 6-20g/l，효모추출물 6-20g/l，프럭토스 4－20g/L，무기염 1.5－7g/L，및 미량원소 10－50g/L 이 포함되어 있는 것을 특징으로, 하기 식Ⅰ의 화합물의 제조방법:
   

   

   
   [식 I].
4. 제3항에 있어서, 상기 무기염은 인산염 또는 유산염 (sulfate)에서 선택되는 한가지 또는 그 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
5. 제3항에 있어서, 배양 시, 상기 발효배지에는 10-100g/L의 만니톨이 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
6. 제3항에 있어서, 발효배지의 총체적을 기준으로 제1항의 돌연변이균주의 접종량은 4 내지 10v/v％인 것을 특징으로 하는 제조방법.
7. 제3항에 있어서,상기 발효배지의 초기 pH 값은 5.3 내지 6.0인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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