JP5908923B2 - ペプチド系抗生物質の高生産菌株及びその製造方法と使用 - Google Patents
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Description
本発明は、抗生物質の製造分野、特にペプチド系抗生物質の高生産菌株及びその製造方法と使用に関する。
過去の数十年間では、人類の健康を脅かす真菌の感染は、その発生頻度と感染の種類のいずれも、特に免疫抑制患者において、増え続けている。この間、臨床で多く応用されるアムホテリシン及びイミダゾール系とトリアゾール系の抗真菌薬も、神経毒性が高い、薬剤耐性などの原因で、臨床の実施にある程度の制限がある。新型の抗真菌薬であるエキノカンジン系抗真菌薬は、20世紀70年代で発見された一群の天然産物で、類似の環状ポリペプチドのコアと異なる脂肪酸側鎖の構造特徴を有し、真菌の細胞壁のβ-D-グルカンの合成を競争的に阻害することができる。エキノカンジン系抗真菌薬の利点は、毒性が低く、殺菌活性が強く、且つ優れた薬物動態学的性質を有することである。
エキノカンジンファミリーには、WF11899A、エキノカンジン系、シロフンギン、ニューモカンジン系、アクレアシン系やムルンドカンジンなどのメンバーが含まれる。その中でも、ミカファンギン（Micafungin）、エキノカンジン（echinocandins）及びニューモカンジン（pneumocandin）系の薬物は、最も深く研究され、しかも既に臨床で応用される抗真菌薬が得られている。
ミカファンギン（Micafungin）は、水溶性リポペプチド系のエキノカンジン系抗真菌薬で、糸状菌Colephoma empetriの発酵産物から化学修飾を経て得られ、藤沢社によって開発された広域抗真菌薬である。日本で行われた深部真菌感染（カンジダ菌またはアスペルギルス菌）の患者に対するオープン試験において、本製品の各投与量群では平均で約22日の治療後成功率が92％に達した。米国で行われた単一施設試験において、本製品50〜150mgを他の抗真菌薬と併用し、或いは併用せず、14例のカンジダ菌血症を伴った腫瘍患者に対し、12例のうち11例（92％）で有効であった。このような薬物は、溶血毒性がなく、且つ薬物の相互作用が少ないことで、従来の抗真菌薬と比べて、より優勢である。
Colephoma empetriによって生成される一種の天然抗真菌薬は、構造式I、II、IIIのようである。
受託番号がFERM BP-2635であるColephoma empetri生産菌は、構造Iの生産能力が低く、生産量が700mg/Lだけで、産業化の生産コストが非常に高い。
構造式I、II、IIIの一般式
構造式I R1=OH、R2=OH
構造式II R1=OH、R2=H
構造式III R1=H、R2=H
そのため、本分野では、構造式Iの生産量が高く、且つ産業化の生産により適合する遺伝的性状が安定した高生産の菌株が切望されている。
構造式I、II、IIIの一般式
構造式II R1=OH、R2=H
構造式III R1=H、R2=H
そのため、本分野では、構造式Iの生産量が高く、且つ産業化の生産により適合する遺伝的性状が安定した高生産の菌株が切望されている。
発明の内容
本発明の目的は、Colephoma empetriの誘導変異菌株を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、前記の誘導変異菌株の製造方法を提供することにある。
さらに、本発明のまた別の目的は、前記の誘導変異菌株の使用を提供することにある。
本発明の目的は、Colephoma empetriの誘導変異菌株を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、前記の誘導変異菌株の製造方法を提供することにある。
さらに、本発明のまた別の目的は、前記の誘導変異菌株の使用を提供することにある。
本発明の第一は、受託番号CGMCC 4129で中国微生物菌種寄託管理委員会の普通微生物センターに寄託された、Colephoma empetriの誘導変異菌株を提供する。
本発明の第二は、前述のような本発明で提供される誘導変異菌株の製造方法であって、
（a）受託番号がFERM BP-2635であるColephoma empetriの種菌液とニトロソグアニジンを混合し、混合液aを得る工程、
（b）混合液aと細胞壁溶解酵素を混合し、プロトプラストを得る工程、
（c）プロトプラストを再生させ、単一コロニーを得る工程、及び
（d）単一コロニーを培養し、前述のような誘導変異菌株を得る工程、
を含む方法を提供する。
（a）受託番号がFERM BP-2635であるColephoma empetriの種菌液とニトロソグアニジンを混合し、混合液aを得る工程、
（b）混合液aと細胞壁溶解酵素を混合し、プロトプラストを得る工程、
（c）プロトプラストを再生させ、単一コロニーを得る工程、及び
（d）単一コロニーを培養し、前述のような誘導変異菌株を得る工程、
を含む方法を提供する。
本発明の第三は、構造式Iで示される化合物の製造に用いられる、前述のような本発明で提供される誘導変異菌株の使用を提供する。
本発明の第四は、式Iで示される化合物を製造する方法であって、15〜35℃で、発酵培地で前述のような本発明で提供される誘導変異菌株を培養し、式Iで示される化合物を得る工程を含む、前記方法を提供する。
前述製造方法において、発酵培地の全体積で計算すると、前述発酵培地は以下の成分：コーンスティープリカー5〜20g/L、綿実粉5〜30g/L、酵母エキス6〜15g/L、デンプン10〜80g/L、ブドウ糖5〜20g/L、無機塩1.5〜15g/L、微量元素10〜50g/Lを含む；前記無機塩はリン酸塩、硫酸塩から選ばれる一種またはその混合物である。
前述製造方法において、発酵培地の全体積で計算すると、前述のような本発明で提供される誘導変異菌株の接種量は、4〜10v/v％である。
前述製造方法において、前述発酵培地の初期pHは5.5〜6.5である。
よって、本発明は、構造式Iの生産量が高く、且つ産業化の生産により適合する遺伝的性状が安定した高生産の菌株を提供する。
前述製造方法において、前述発酵培地の初期pHは5.5〜6.5である。
よって、本発明は、構造式Iの生産量が高く、且つ産業化の生産により適合する遺伝的性状が安定した高生産の菌株を提供する。
具体的な実施形態
意外にも発明者は、Colephoma empetriのFERM BP-2635菌株は、ニトロソグアニジン（NTG）による誘導変異を経て、さらに細胞壁溶解酵素でプロトプラストを得た後、再生されたプロトプラストをスクリーニングすることによって高生産突然変異株（受託番号CGMCC 4129）を得て、当該突然変異株を発酵させることで高生産量の式I化合物が得られることを見出した。これに基づき、本発明を完成させた。
意外にも発明者は、Colephoma empetriのFERM BP-2635菌株は、ニトロソグアニジン（NTG）による誘導変異を経て、さらに細胞壁溶解酵素でプロトプラストを得た後、再生されたプロトプラストをスクリーニングすることによって高生産突然変異株（受託番号CGMCC 4129）を得て、当該突然変異株を発酵させることで高生産量の式I化合物が得られることを見出した。これに基づき、本発明を完成させた。
新規菌株
本発明は、分類学上Colephoma empetriに属し、北京にある中国微生物菌種寄託管理委員会の普通微生物センターに、受託番号CGMCC 4129で、2010年8月31日付で寄託された、式I化合物を生産する新規菌株を提供する。
本発明は、分類学上Colephoma empetriに属し、北京にある中国微生物菌種寄託管理委員会の普通微生物センターに、受託番号CGMCC 4129で、2010年8月31日付で寄託された、式I化合物を生産する新規菌株を提供する。
新規菌株の製造方法
本発明は、以下のようなプロセスで行われる、受託番号がCGMCC 4129である新規菌株の製造方法を提供する。
出発菌株→種菌液→NTGによる誘導変異処理→細胞壁溶解酵素で細胞壁を除去してプロトプラストを調製する→希釈してプレートに塗布する→単一コロニーを取って斜面で継代する→振とう培養及び初期スクリーニング→高生産菌株の選出→斜面で継代する→振とう培養及び再スクリーニング→高生産菌株の選出、発酵タンクにおける検証及び安定性試験→菌株の寄託
具体的に、本発明で提供される方法は、
（a）受託番号がFERM BP-2635であるColephoma empetriの種菌液とニトロソグアニジンを混合し、混合液aを得る工程、
（b）混合液aと細胞壁分解酵素を混合し、プロトプラストを得る工程、
（c）プロトプラストを再生させ、単一コロニーを得る工程、及び
（d）単一コロニーを培養し、新規菌株を得る工程、
を含む。
本発明は、以下のようなプロセスで行われる、受託番号がCGMCC 4129である新規菌株の製造方法を提供する。
出発菌株→種菌液→NTGによる誘導変異処理→細胞壁溶解酵素で細胞壁を除去してプロトプラストを調製する→希釈してプレートに塗布する→単一コロニーを取って斜面で継代する→振とう培養及び初期スクリーニング→高生産菌株の選出→斜面で継代する→振とう培養及び再スクリーニング→高生産菌株の選出、発酵タンクにおける検証及び安定性試験→菌株の寄託
具体的に、本発明で提供される方法は、
（a）受託番号がFERM BP-2635であるColephoma empetriの種菌液とニトロソグアニジンを混合し、混合液aを得る工程、
（b）混合液aと細胞壁分解酵素を混合し、プロトプラストを得る工程、
（c）プロトプラストを再生させ、単一コロニーを得る工程、及び
（d）単一コロニーを培養し、新規菌株を得る工程、
を含む。
本発明の一つの実施例において、新規菌株は、以下の方法で得られる。1〜3日間振とう培養した後のFERM BP-2635の種菌液（細胞の乾燥重量、DCWで5〜30g/l）に適量のNTGを入れ、1〜2日間培養を続けた後、種菌液を遠心、洗浄し、沈殿させて懸濁してから細胞壁溶解酵素（広東省微生物研究所から購入）で細胞壁を破壊してプロトプラストを得る。希釈したプロトプラストを高浸透圧PDA（ポテトブドウ糖寒天）プレートに塗布して培養し、組換細胞の単一コロニーを得る。前記単一コロニーをスクリーニングし、新規な誘導変異菌株を得る。
さらに、本発明は、誘導変異した新規菌株で発酵させて式I化合物を得る方法を提供する。
本発明の一つの実施例において、誘導変異した新規菌株を得る方法および新規菌株で発酵させて式I化合物を得る方法は以下のとおりである。
（1）出発菌株：Colephoma empetriのFERM BP-2635
本発明の一つの実施例において、誘導変異した新規菌株を得る方法および新規菌株で発酵させて式I化合物を得る方法は以下のとおりである。
（1）出発菌株：Colephoma empetriのFERM BP-2635
（2）出発菌株の種菌培養
寄託されたFERM BP-2635菌株のグリセロールストックを融解させた後、種菌培地に接種し（仕込み液量50mL/250mL）、25〜30℃、200〜300rpmで菌糸の乾燥重量が5〜30g/L程度に達するまでシェーカーで1〜3日間振とう培養する。
種菌培地の成分は、ショ糖 10〜20 g/L、酵母エキス4〜10 g/L、大豆ペプトン10〜20 g/L、KH2PO4 1.5-2 g/L、MgSO4・7H2O 0.4-1 g/L、微量元素10〜50 g/Lで、初期pH値は5.3〜6.0である。121℃で20分間滅菌する。
微量元素：FeSO4・7H2O 10〜20 g/L、MnSO4・H2O 10〜20 g/L、ZnSO4・7H2O 2〜10g/L、CaCl2 0.7〜2.0 g/L、H3BO3 0.56〜2.0 g/L、CuCl2・2H2O 0.25〜2.0 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19〜2.0 g/L、濃塩酸500 mL/L。
寄託されたFERM BP-2635菌株のグリセロールストックを融解させた後、種菌培地に接種し（仕込み液量50mL/250mL）、25〜30℃、200〜300rpmで菌糸の乾燥重量が5〜30g/L程度に達するまでシェーカーで1〜3日間振とう培養する。
種菌培地の成分は、ショ糖 10〜20 g/L、酵母エキス4〜10 g/L、大豆ペプトン10〜20 g/L、KH2PO4 1.5-2 g/L、MgSO4・7H2O 0.4-1 g/L、微量元素10〜50 g/Lで、初期pH値は5.3〜6.0である。121℃で20分間滅菌する。
微量元素：FeSO4・7H2O 10〜20 g/L、MnSO4・H2O 10〜20 g/L、ZnSO4・7H2O 2〜10g/L、CaCl2 0.7〜2.0 g/L、H3BO3 0.56〜2.0 g/L、CuCl2・2H2O 0.25〜2.0 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19〜2.0 g/L、濃塩酸500 mL/L。
（3）単一コロニーの分離
まず、出発菌株の種菌液をNTGによる誘導変異処理し、さらに細胞壁溶解酵素で細胞壁破壊処理し、得られたプロトプラストを再生させて突然変異菌株を獲得する。
まず、出発菌株の種菌液をNTGによる誘導変異処理し、さらに細胞壁溶解酵素で細胞壁破壊処理し、得られたプロトプラストを再生させて突然変異菌株を獲得する。
（4）誘導変異菌株のスクリーニング
プロトプラストを高浸透圧のPDA培地に塗布し、10〜12日間培養した後の単一コロニーを斜面培地に接種して培養する。8〜10日後、取り出して種菌培地に接種し（仕込み液量25mL/250mL）、25〜30℃、280rpmでシェーカーで6〜10日間振とう培養する。種菌培地を発酵培地に接種し（仕込み液量25mL/250mL）、25〜30℃、200〜300rpmでシェーカーで6〜12日間振とう培養する。培養終了後、ホルムアルデヒドで発酵液を抽出し、高速液体クロマトグラフィーで発酵液における式I化合物の含有量を測定する。
プロトプラストを高浸透圧のPDA培地に塗布し、10〜12日間培養した後の単一コロニーを斜面培地に接種して培養する。8〜10日後、取り出して種菌培地に接種し（仕込み液量25mL/250mL）、25〜30℃、280rpmでシェーカーで6〜10日間振とう培養する。種菌培地を発酵培地に接種し（仕込み液量25mL/250mL）、25〜30℃、200〜300rpmでシェーカーで6〜12日間振とう培養する。培養終了後、ホルムアルデヒドで発酵液を抽出し、高速液体クロマトグラフィーで発酵液における式I化合物の含有量を測定する。
それに係る各培地の組成は、文献Improvement of FR901379 production by mutant selection and medium optimization ,Journal of Bioscience and Bioengineering VOL 107 No.5 , 530-534 , 2009 ,Journal of antibiotics, Vol 45, No.12,Dec 1992, 1867-1874.を参照する。
高浸透圧のPDAプレート培地は、ポテト300 g/L、ブドウ糖 20 g/L、寒天15 g/L、ショ糖273.6 g/Lで、121℃で20分間滅菌する。
高浸透圧のPDAプレート培地は、ポテト300 g/L、ブドウ糖 20 g/L、寒天15 g/L、ショ糖273.6 g/Lで、121℃で20分間滅菌する。
（5）誘導変異菌株の発酵
関連技術方案は文献で報告され、具体的に、Improvement of FR901379 production by mutant selection and medium optimization ,Journal of Bioscience and Bioengineering VOL 107 No.5 , 530-534 , 2009 ,Journal of antibiotics, Vol 45, No.12,Dec 1992, 1867-1874.を参照する。
関連技術方案は文献で報告され、具体的に、Improvement of FR901379 production by mutant selection and medium optimization ,Journal of Bioscience and Bioengineering VOL 107 No.5 , 530-534 , 2009 ,Journal of antibiotics, Vol 45, No.12,Dec 1992, 1867-1874.を参照する。
本発明で説明された上述の特徴、或いは実施例で説明された特徴は任意に組み合わせることができる。本願明細書で開示されたすべての特徴はいずれの組成物の態様とも併用することができ、明細書で開示された各特徴は、いずれの相同、同等或いは類似の目的の代替的特徴にも任意に替えることができる。そのため、特に説明しない限り、開示された特徴は同等或いは類似の特徴の一般的な例にすぎない。
本発明の主な利点は以下の通りである。
1、高生産量で且つ遺伝的性状が安定した新規な誘導変異菌株を得る。
2、新規菌株は、遺伝的性状が安定しており、且つ生じる不純物が少なく、式I化合物の生産における産物の分離・精製およびプロセスの拡大に有利であるため、産業化の生産に適する。
3、最適化条件で発酵させて式I化合物を生産し、生産量が1.5g/Lに達する。
1、高生産量で且つ遺伝的性状が安定した新規な誘導変異菌株を得る。
2、新規菌株は、遺伝的性状が安定しており、且つ生じる不純物が少なく、式I化合物の生産における産物の分離・精製およびプロセスの拡大に有利であるため、産業化の生産に適する。
3、最適化条件で発酵させて式I化合物を生産し、生産量が1.5g/Lに達する。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するためだけに用いられるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、一般条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われた。別の説明がない限り、すべての百分率、比率、比例或いは部は、重量で計算される。
本発明における重量体積百分率の単位は当業者にとって熟知で、例えば100mLの溶液における溶質の重量を指す。
別の定義がない限り、本文に用いられるすべての専門用語と科学用語は、本分野の技術者に知られている意味と同様である。また、記載の内容と類似或いは同等の方法及び材料は、いずれも本発明の方法に用いることができる。ここで記載の好ましい実施方法及び材料は例示のためだけである。
別の定義がない限り、本文に用いられるすべての専門用語と科学用語は、本分野の技術者に知られている意味と同様である。また、記載の内容と類似或いは同等の方法及び材料は、いずれも本発明の方法に用いることができる。ここで記載の好ましい実施方法及び材料は例示のためだけである。
本発明の実施例において、発酵液における式I化合物の含有量の高速液体クロマトグラフィーの測定方法：
高速液体クロマトグラフィーで測定する発酵液における式I化合物の含有量：
カラム：Calesil DOS-100 (4.6mm×250 mm、5μm)
移動相：アセトニトリル：水＝50：50、0.05N リン酸二水素アンモニウム
カラム温度：35℃
等勾配溶出で、流速が1.0 mL/分で、
仕込み量5μL、検出波長210nm。
高速液体クロマトグラフィーで測定する発酵液における式I化合物の含有量：
カラム：Calesil DOS-100 (4.6mm×250 mm、5μm)
移動相：アセトニトリル：水＝50：50、0.05N リン酸二水素アンモニウム
カラム温度：35℃
等勾配溶出で、流速が1.0 mL/分で、
仕込み量5μL、検出波長210nm。
実施例1
誘導変異で得られた新規菌株CGMCC 4129
1．誘導変異
寄託されたFERM BP-2635菌株のグリセロールストックを融解させた後、4％の接種量で種菌培地に接種し（仕込み液量50mL/250mL）、25℃、280rpmで菌糸の乾燥重量が5〜30 g/L程度に達するまでシェーカーで2日間振とう培養した。種菌液に10μg/mLの濃度で変異誘発剤であるNTGを入れ、1日間培養を続けた。1日間培養した後、NTGを含有する種菌液10mLを5000rpmで10分間遠心し、得られた沈殿を2倍体積の0.6MのNaClで2回洗浄して培地とNTGを除去し、この誘導変異の過程の致死率が85〜90％であった。
誘導変異で得られた新規菌株CGMCC 4129
1．誘導変異
寄託されたFERM BP-2635菌株のグリセロールストックを融解させた後、4％の接種量で種菌培地に接種し（仕込み液量50mL/250mL）、25℃、280rpmで菌糸の乾燥重量が5〜30 g/L程度に達するまでシェーカーで2日間振とう培養した。種菌液に10μg/mLの濃度で変異誘発剤であるNTGを入れ、1日間培養を続けた。1日間培養した後、NTGを含有する種菌液10mLを5000rpmで10分間遠心し、得られた沈殿を2倍体積の0.6MのNaClで2回洗浄して培地とNTGを除去し、この誘導変異の過程の致死率が85〜90％であった。
種菌培地は、ショ糖 10 g/L、酵母エキス5 g/L、大豆ペプトン10 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、微量元素10 g/Lで、初期pH値は5.3であった。121℃で20分間滅菌した。
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2 g/L、CaCl2 0.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19 g/L、濃塩酸500 mL/L。
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2 g/L、CaCl2 0.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19 g/L、濃塩酸500 mL/L。
2．プロトプラストの調製および単一コロニーの分離
洗浄した菌糸に20mg/mLの細胞壁溶解酵素（2000単位/mg）、10mg/mlのスネイラーゼ（5単位/mg）及び10mg/mlのセルラーゼ（15単位/mg）を含有する酵素混合液（0.5M NaClのリン酸水素二ナトリウム-クエン酸緩衝液で溶解させたもの（pH6.0））10mLを入れ、30℃で80rpmで振とうして5h酵素分解した。ワタで酵素分解した反応液をろ過して菌糸を除去し、プロトプラストだけを含む単細胞懸濁液を得た。この溶液1mLを14000rpmで10分間遠心し、沈殿を1mLの0.5M NaClを含有するリン酸水素二ナトリウム-クエン酸緩衝液（pH6.0）で溶解させた。この液を異なる倍率で希釈して均一に0.8Mショ糖を含有する高浸透圧のPDA培地に塗布し、25℃で6〜8日間培養した後、約6000個の単一コロニーを得た。
洗浄した菌糸に20mg/mLの細胞壁溶解酵素（2000単位/mg）、10mg/mlのスネイラーゼ（5単位/mg）及び10mg/mlのセルラーゼ（15単位/mg）を含有する酵素混合液（0.5M NaClのリン酸水素二ナトリウム-クエン酸緩衝液で溶解させたもの（pH6.0））10mLを入れ、30℃で80rpmで振とうして5h酵素分解した。ワタで酵素分解した反応液をろ過して菌糸を除去し、プロトプラストだけを含む単細胞懸濁液を得た。この溶液1mLを14000rpmで10分間遠心し、沈殿を1mLの0.5M NaClを含有するリン酸水素二ナトリウム-クエン酸緩衝液（pH6.0）で溶解させた。この液を異なる倍率で希釈して均一に0.8Mショ糖を含有する高浸透圧のPDA培地に塗布し、25℃で6〜8日間培養した後、約6000個の単一コロニーを得た。
3．高生産菌株CGMCC 4129のスクリーニング
8日間培養した単一コロニーを選択し、斜面培地に接種して培養した。8日間後、面積0.5〜1.0cm2の集落を種菌培地に接種し（仕込み液量25mL/250mL）、計4000個の単一コロニーを25℃、280rpmでシェーカーで5日間振とう培養する。種菌培地は4％の接種量で発酵培地に接種し（仕込み液量25mL/250mL）、25℃、280rpmでシェーカーで10日間振とう培養した（培養6日目で5％デンプンを追加した）。
8日間培養した単一コロニーを選択し、斜面培地に接種して培養した。8日間後、面積0.5〜1.0cm2の集落を種菌培地に接種し（仕込み液量25mL/250mL）、計4000個の単一コロニーを25℃、280rpmでシェーカーで5日間振とう培養する。種菌培地は4％の接種量で発酵培地に接種し（仕込み液量25mL/250mL）、25℃、280rpmでシェーカーで10日間振とう培養した（培養6日目で5％デンプンを追加した）。
培養終了後、50mLのホルムアルデヒドで発酵液を抽出し、高速液体クロマトグラフィーで発酵液における式I化合物の含有量を測定したところ、その中に高生産菌株が5株あった。その中では、得られた一株の高生産菌株CGMCC 4129を再スクリーニングし、式I化合物の生産量が1.4g/Lに達した。
実施例2
新規菌株CGMCC 4129による式I化合物の生産
種菌培地は4％の接種量で実施例1で得られた新規菌株CGMCC 4129を発酵培地に接種し、50リットルの発酵タンクで培養し、培養温度が25℃で、発酵液のpHを6.5に維持した。10日間培養した後、式I化合物の生産量が1.5g/Lに達した（培養6日目で5％デンプンを追加した）。
新規菌株CGMCC 4129による式I化合物の生産
種菌培地は4％の接種量で実施例1で得られた新規菌株CGMCC 4129を発酵培地に接種し、50リットルの発酵タンクで培養し、培養温度が25℃で、発酵液のpHを6.5に維持した。10日間培養した後、式I化合物の生産量が1.5g/Lに達した（培養6日目で5％デンプンを追加した）。
発酵培地は、コーンスティープリカー20g/L、綿実粉10g/L、酵母エキス（Oxiod社から購入）8g/L、デンプン40g/L、ブドウ糖5〜10g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、微量元素10mL/Lで、初期pH値が5.3であった。121℃で20分間滅菌した。ブドウ糖は単独で115℃で20分間滅菌した。
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2 g/L、CaCl2 0.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19 g/L、濃塩酸500 mL/L。
比較例
以下の方法で出発菌株FERM BP-2635と突然変異株CGMCC 4129の式I化合物の生産能力を比較した。
実施例2の培養方法でそれぞれ出発菌株と突然変異株を培養し、培養終了後二倍体積のホルムアルデヒドで発酵液を抽出し、高速液体クロマトグラフィーで発酵液における式I化合物の含有量を測定した。結果を表1に示す。
以下の方法で出発菌株FERM BP-2635と突然変異株CGMCC 4129の式I化合物の生産能力を比較した。
実施例2の培養方法でそれぞれ出発菌株と突然変異株を培養し、培養終了後二倍体積のホルムアルデヒドで発酵液を抽出し、高速液体クロマトグラフィーで発酵液における式I化合物の含有量を測定した。結果を表1に示す。
それに係る各培地の組成は以下のようであった。
スクリーニング培地は、ポテト300 g/L、ブドウ糖 20 g/L、寒天15 g/L、ショ糖273.6 g/Lで、121℃で20分間滅菌した。
斜面培地は、ポテト300 g/L、ブドウ糖 20 g/L、寒天15 g/Lで、121℃で20分間滅菌した。
スクリーニング培地は、ポテト300 g/L、ブドウ糖 20 g/L、寒天15 g/L、ショ糖273.6 g/Lで、121℃で20分間滅菌した。
斜面培地は、ポテト300 g/L、ブドウ糖 20 g/L、寒天15 g/Lで、121℃で20分間滅菌した。
種菌培地は、ショ糖 10 g/L、酵母エキス5 g/L、大豆ペプトン10 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、微量元素10 g/Lで、初期pH値は5.3であった。121℃で20分間滅菌した。
発酵培地は、コーンスティープリカー20g/L、綿実粉10g/L、酵母エキス（Oxiod社から購入）8g/L、デンプン40g/L、ブドウ糖5〜10g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、微量元素10mL/Lで、初期pH値が5.3であった。121℃で20分間滅菌した。ブドウ糖は単独で115℃で20分間滅菌した。
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2 g/L、CaCl2 0.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19 g/L、濃塩酸500 mL/L。
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2 g/L、CaCl2 0.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19 g/L、濃塩酸500 mL/L。
実施例3
新規菌株CGMCC 4129の安定性
実施例2の培養方法および培地の組成を使用し、継代培養を行った。結果を表2に示す。
結果から、新規菌株の安定性が優れていることがわかった。
新規菌株CGMCC 4129の安定性
実施例2の培養方法および培地の組成を使用し、継代培養を行った。結果を表2に示す。
以上の説明は本発明の好ましい実施例だけで、本発明の実質の技術内容の範囲を限定するものではなく、本発明の実質の技術内容は広義的に出願の請求の範囲に定義され、他の人が完成した技術実体或いは方法は、出願の請求の範囲に定義されたものとまったく同じものであれば、或いは効果が同等の変更であれば、いずれもその請求の範囲に含まれるとみなされる。
Claims (8)
- 受託番号CGMCC 4129で中国微生物菌種寄託管理委員会の普通微生物センターに寄託された、Colephoma empetriの誘導変異菌株。
- 請求項1に記載の誘導変異菌株の製造方法であって、
（a）受託番号がFERM BP-2635であるColephoma empetriの種菌液とニトロソグアニジンを混合し、混合液aを得る工程、
（b）混合液aと細胞壁分解酵素を混合し、プロトプラストを得る工程、
（c）プロトプラストを再生させ、単一コロニーを得る工程、及び
（d）単一コロニーを培養し、請求項1に記載の誘導変異菌株を得る工程、
を含むことを特徴とする、前記製造方法。 - 構造式Iで示される化合物の製造に用いられることを特徴とする、請求項1に記載の誘導変異菌株の使用。
- 式Iで示される化合物の製造方法であって、15〜35℃で、発酵培地で請求項1に記載の誘導変異菌株を培養し、式Iで示される化合物を得る工程を含むことを特徴とする、前記製造方法。
- 発酵培地の全体積で計算すると、前記発酵培地は以下の成分：コーンスティープリカー5〜20g/L、綿実粉5〜30g/L、酵母エキス6〜15g/L、デンプン10〜80g/L、ブドウ糖5〜20g/L、無機塩1.5〜15g/L、微量元素10〜50g/Lを含むことを特徴とする、請求項4に記載の製造方法。
- 前記無機塩はリン酸塩、硫酸塩から選ばれる一種またはその混合物であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
- 発酵培地の全体積で計算すると、請求項1に記載の誘導変異菌株の接種量は、4〜10v/v％であることを特徴とする、請求項4に記載の製造方法。
- 前記発酵培地の初期pHは5.5〜6.5であることを特徴とする、請求項4に記載の製造方法。
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