JP5103485B2

JP5103485B2 - 抗真菌性物質

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Publication number: JP5103485B2
Application number: JP2009552489A
Authority: JP
Inventors: 憲明岸本; 藤樹夫藤田; 佳栄北口; 隆人有本; 昌也岡本; 帆史塚本; 恵美伊藤; 梨香大西; 梨沙長田; 文秀山口
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2008-02-05
Filing date: 2009-02-04
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2029-02-04
Also published as: JPWO2009099098A1; WO2009099098A1

Description

本発明は、バーコデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌等の微生物が産生する、カビ及び／又は酵母の増殖を阻害する抗真菌性物質、胞子の発芽及び／又は菌糸の伸長を阻害する該抗真菌性物質、該抗真菌性物質を含有する防カビ剤及び食品保存料、該抗真菌性物質又は該バーコデリア属菌を用いる真菌の増殖を阻害する方法、並びに、該抗真菌性物質を産生する新規バーコデリア属菌に関する。
本願は、２００８年２月５日に日本国に出願された特願２００８−２５６９１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

微生物による腐敗や変敗を防止し、食品の保存性を高めるため、様々な抗菌性物質が、食品保存料として用いられている。食品の保存性を向上させることにより、流通過程における食品の腐敗等が効率的に防止されるため、製造コストの改善が期待でき、また、食品の安全性上も好ましい。このため、優れた抗菌性物質の開発が望まれている。ここで、抗菌性物質は、主に、プロピオン酸やソルビン酸等の化学合成物質と、微生物等から得られた天然由来の物質に分類できるが、食品保存料として用いる場合には、安全性の点から、天然由来の物質であることが好ましい。

近年、天然由来の抗菌性物質として、ナイシン等の、乳酸菌由来の様々な種類のバクテリオシンが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。バクテリオシンは、通常、ペプチド若しくはタンパク質であり、消化酵素等により容易に分解されるため、非常に安全性が高い。また、主にグラム陽性菌に対し優れた抗菌活性を有することが知られている。

その他、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に対し優れた抗菌活性を有する抗菌性物質を含む食品保存料の製造方法として、例えば、（１）酵母の増殖に必要な栄養素、無機塩類と炭素源としてグルコースを含む培地で酵母を定常期に達するまで増殖させた後、酵母を除去した培地に必要ならば炭素源を加え、再び定常期に達するまで増殖させる繰り返し培養を２回以上行って得られた水溶液であることを特徴とする酵母が産生する抗菌性物質を含む食品保存料の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
特許第２５４５７３９号公報園元ら、食品と開発、４１巻３号、ｐ７３〜７５、２００６年

グラム陽性菌等のバクテリアのみならず、カビや酵母等の真菌も、食品の腐敗等を引き起こす。特にカビは、多くの食品の腐敗の主要な要因であることから、カビの増殖を抑制することができる抗真菌活性を有する物質を、食品保存料や抗菌剤として使用できることが好ましい。
しかしながら、ナイシン等のバクテリオシンは、一般にグラム陽性菌にのみ抗菌活性を示し、カビや酵母等の真菌の増殖を抑制することができないという問題がある。また、上記（１）の方法で得られる食品保存料は、酵母由来の抗菌性物質であるため、食品に対し安全に使用することができ、また、耐熱性も有しているが、特許文献１には、カビに対する抗菌活性については一切記載がない。

一方、プロピオン酸等の有機酸は、真菌の増殖抑制に対し、一定の効果を有するものの、化学合成物質であるため、天然由来の物質に比べて安全性が劣ることに加え、独特のにおいを有するため、食品の風味上好ましくないという問題がある。
また、有機酸は、主に酸性下で抗菌活性を有し、中性の食品に対する抗菌性に乏しいという問題もある。有機酸の中性における抗菌活性の低下は、中性溶液中では、有機酸はほぼ完全に電離しているが、解離して負に帯電した有機酸は、微生物の細胞内に取り込まれ難いためと考えられている。

本発明は、中性においてカビや酵母等の真菌の増殖を抑制することのできる、抗真菌性物質を提供することを目的とする。
また、本発明は、該抗真菌性物質を含有する防カビ剤及び食品保存料、該抗真菌性物質を産生する菌、並びに、該抗真菌性物質又は該菌を用いるカビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、食品由来の微生物が産生する抗真菌性物質であれば、食品保存料としても安全に用いることができると考え、様々な種類のチーズから分離した微生物の中から、ｐＨ７．０において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）又はリゾパス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）の増殖を抑制することのできる抗真菌活性を有する微生物を見出し、さらに、該微生物が産生する抗真菌性物質を見出すことにより、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、
（１）カスピアンチーズから単離されたバーコデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌が産生する、カビ及び／又は酵母の増殖を阻害し、且つ、下記の特徴を有する抗真菌性物質。
１．ｐＨ７．０において、抗真菌性を有すること、
２．ポテトデキストロース培地で前記バーコデリア属菌を培養した培養液の上清が、抗真菌活性を有すること、
３．ポテトデキストロース培地で前記バーコデリア属菌を培養した培養液の上清を、ＭＷＣＯ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＣｕｔＯｆｆ、分画分子量）が１０ｋＤである限外濾過膜を用いて限外濾過した場合に、限外濾過膜表面に保持されること、
４．プロテイナーゼＫ処理により、前記抗真菌活性が低下すること。
（２）前記バーコデリア属菌が、バーコデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｓｐ．）ＲＯ−１（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−６９８）、又はバーコデリア・スピーシーズＴ−３４（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−４７７）である前記（１）の抗真菌性物質。
（３）胞子の発芽及び／又は菌糸の伸長を阻害する前記（１）又は（２）に記載の抗真菌性物質。
（４）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗真菌性物質を含有する防カビ剤。
（５）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗真菌性物質を含有する食品保存料。
（６）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗真菌性物質を用いることを特徴とする、真菌の増殖を阻害する方法。
（７）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗真菌性物質を産生するバーコデリア属菌を用いることを特徴とする、真菌の増殖を阻害する方法。
（８）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗真菌性物質を産生することを特徴とするバーコデリア・スピーシーズＴ−３４（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−４７７）。
（９）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗真菌性物質を産生することを特徴とするバーコデリア・スピーシーズＲＯ−１（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−６９８）。
を、提供するものである。

本発明の抗真菌性物質により、効果的にカビや酵母等の真菌の増殖を抑制することができる。本発明の、特にチーズから分離された抗真菌性物質は、チーズから分離されたバーコデリア属菌が産生する物質であるため、食品に対して安全に用いることができるのみならず、化粧品や医薬品等にも用いることが可能である。特に中性において、抗真菌活性を示すため、中性の食品等においても有効にカビ等の増殖を抑制することができる。本発明の抗真菌性物質により、食品等の保存期間を安全に延長することができるため、製造コストの改善も期待される。
また、本発明の抗真菌性物質を産生するバーコデリア属菌により、本発明の抗真菌性物質を効率よく産生することができる。
さらに、本発明のカビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法により、安全かつ簡便に、カビや酵母等の真菌の増殖を抑制することができる。

実施例４において、培養後１５時間（ＰＤ培地処理後０時間）、培養後２２時間（ＰＤ培地処理後７時間）、培養後４４時間（ＰＤ培地処理後２９時間）、及びＰＤ培地処理後２日間培養した時点のコントロールのカバーガラス上の胞子の顕微鏡写真図である。実施例４において、図１と同じ時点のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液で処理したカバーガラス上の胞子の顕微鏡写真図である。

本発明の抗真菌性物質は、食品から得られた微生物が産生するものであって、ｐＨ７．０において、抗真菌活性を有するものである。このような抗真菌性物質であれば、食品等に安全に使用することができ、かつ、中性の食品等に対しても効果を発揮することができるためである。

本発明の抗真菌性物質を産生する微生物は、例えば、各種の食品から分離した微生物の中から、ｐＨ７．０において、カビ等の増殖を抑制することができる抗真菌活性を有する菌株を選択することにより得ることができる。ｐＨ７．０において抗真菌活性を有する菌株は、本発明の抗真菌性物質を産生していると考えられるためである。以下、本発明の抗真菌性物質、及び該抗真菌性物質を産生する微生物を得る方法を、さらに詳細に説明する。

１．Ｔ−３４株
１−１．微生物群の取得
本発明者らは、抗真菌性物質を産生する微生物を食品中から取得するにあたり、良好な発酵食品の一つであるチーズに着目し、常法により、微生物を分離した。具体的には、チーズを滅菌したチーズおろし金ですり下ろした後、０．０５ｇを、スクリューキャップ付き試験管に分注した滅菌済１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液５ｍＬに加え、２８℃で４８時間静置培養した。該スクリューキャップ付き試験管を遠心分離して回収した沈殿物を、滅菌生理リン酸緩衝液で２回洗浄した後、生理リン酸緩衝液で希釈してサンプルを調製した。該サンプルを、ＭＲＳ寒天培地に塗抹した後、２８℃で培養することにより、微生物を分離した。チーズは、カマンベールチーズ（日本製）、カマンベールチーズ（フランス製）、フロマージュ（日本製）、モツァレラチーズ（ドイツ製）、３種類のゴーダチーズ（オランダ製）、クリームチーズ（イタリア製）、山羊乳チーズ（フランス製）、チーズフード（オーストラリア製）、北海道チェダーチーズ（日本製）、ローファットチェダーチーズ（オランダ製）、ホワイトチェダーチーズ（イギリス製）、カスピアンチーズ（イラン製）の、計１４種類の市販されているチーズを用いた。一種類のチーズから分離された微生物は、１つの菌群にまとめた。

１−２．抗真菌活性を有する菌が存在する菌群の選択
得られた１４種類の菌群を、１０％（ｗ／ｗ）スキムミルク培地に接種し、２８℃で４８時間培養して菌群培養液を調製した。１０％（ｗ／ｗ）スキムミルク平板培地に、該菌群培養液を画線塗布した後、アスペルギルス・ニガーあるいはリゾパス・ストロニファーの胞子を懸濁した軟寒天培地を重層した。
該スキムミルク平板培地を、２８℃で４８時間培養した後に観察した結果、カスピアンチーズ（イラン製）由来のＯ−９菌群のスキムミルク平板培地において、一部のコロニー周辺で、アスペルギルス・ニガー等の増殖が抑制されていることが観察された。その他の１３種類の菌群では、アスペルギルス・ニガー等の増殖抑制は観察されなかった。この結果から、Ｏ−９菌群中には、抗真菌性物質を産生する菌が存在していることが分かった。

１−３．ｐＨ７．０において抗真菌活性を有する菌が存在する菌群の選択
（１）抗真菌活性を測定するサンプルの調整
Ｏ−９菌群を、１０％（ｗ／ｗ）スキムミルク培地に接種し、２８℃で３日間培養して菌群培養液を調製した。該菌群培養液を超音波処理することにより、菌体を均一に分散させた後、３，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清と沈殿物に分離し、得られた沈殿物を常法に従って凍結乾燥した。その後、得られた凍結乾燥物に蒸留水（ｐＨ７．０）を添加して溶解させ、０．１ｇ／２ｍＬのＯ−９菌群凍結乾燥物を調製した。

（２）２倍段階希釈系列法による抗真菌活性の測定
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、上記１−３（１）で調整したＯ−９菌群凍結乾燥物の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、それぞれ１３０μＬずつ添加した。具体的には、該Ｏ−９菌群凍結乾燥物をサブロー培地（グルコース：４０ｇ／Ｌ、ペプトンＳ：１０ｇ／Ｌ）を用いて希釈し、後記実施例１と同様にして行った。コントロールとして、１３０μＬのサブロー培地のみを添加したウェルを用いた。さらに、各ウェルに、後記参考例１に記載の方法で調整した１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株胞子懸濁液を５０μＬずつそれぞれ添加した。該９６ウェルマイクロプレートを２８℃で３日間培養した後、顕微鏡を用いて、各ウェルにおけるアスペルギルス・ニガーの増殖の有無を観察した。なお、アスペルギルス・ニガーの増殖は、アスペルギルス・ニガーの胞子の発芽や菌糸の伸長により判断した。つまり、アスペルギルス・ニガーの増殖抑制は、アスペルギルス・ニガーの胞子から、菌糸の発芽や伸長が阻止されている状態を意味する。

この結果、コントロールのウェルにおいて、アスペルギルス・ニガーの増殖が観察された。一方、Ｏ−９菌群凍結乾燥物の場合には、２^９倍希釈液を添加したウェルでは増殖したアスペルギルス・ニガーが観察されたが、２^０〜２^８倍希釈液を添加したウェルでは、アスペルギルス・ニガーの増殖は観察されなかった。すなわち、Ｏ−９菌群凍結乾燥物中には、本発明の抗真菌性物質が存在しており、該抗真菌性物質により、アスペルギルス・ニガーの増殖が抑制されたことが明らかである。したがって、Ｏ−９菌群には、ｐＨ７．０において抗真菌活性を有する菌、すなわち、本発明の抗真菌性物質を産生する菌が存在していることがわかった。

（３）アガースポット法による抗真菌活性の測定
参考例１と同様にして調製した１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー胞子懸濁液を混釈したＰＤＡ（ポテトデキストロースアガー）平板培地（以下、胞子混釈ＰＤＡ平板培地ということがある。）の一点に、１０μＬの上記１−３（１）で調製したＯ−９菌群凍結乾燥物を滴下して寒天培地に染み込ませた（以下、注入したという）。
この胞子混釈ＰＤＡ平板培地を、２８℃で４日間培養したところ、Ｏ−９菌群凍結乾燥物を注入した点（注入点）を中心に直径数ｍｍの円形状に白色の菌が生育していたが、この白色菌から約９ｍｍ幅の円周には全く菌は視認できなかった。この菌が視認できなかった領域の外側には、胞子混釈ＰＤＡ平板培地全面に黒色の菌が生育していた。この黒色菌は、ＰＤＡ平板培地に混釈したアスペルギルス・ニガーが増殖したものであり、白色菌はＯ−９菌群であると推察される。このように、Ｏ−９菌群が生育している領域の周囲に菌が視認できない領域が観察されたことから、Ｏ−９菌群が有する本発明の抗真菌性物質により、アスペルギルス・ニガーの増殖が抑制されたことが明らかである。特に、Ｏ−９菌群が有する本発明の抗真菌性物質により、ＰＤＡ平板培地中に予め混釈されていたアスペルギルス・ニガーの胞子の発芽のみならず、菌糸の伸長が阻害されたために、菌が視認できない領域が観察されたと推察される。したがって、このアガースポット法による測定結果から、本発明の抗真菌性物質が、胞子の発芽抑制作用のみならず、菌糸の伸長抑制作用を有していることが示唆された。

１−４．本発明の抗真菌性物質を産生する菌の単離
上記１−３（３）で菌が生育していない領域を形成したＯ−９菌群を塗沫したＰＤＡ平板培地を、２８℃で４８時間培養し、該ＰＤＡ平板培地から４６コロニー（Ｔ−１〜４６）を得た。１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー胞子懸濁液を混釈したＰＤＡ培地を添加した４８ウェルマイクロプレートの各ウェルに、得られた４６コロニーから釣菌した菌を、それぞれ接種し、２８℃で４日間培養した。この結果、Ｔ−３９コロニーから釣菌した菌（Ｔ−３９株）以外を移植したウェルにおいて、アスペルギルス・ニガーの増殖抑制が観察された。この増殖抑制が観察されたウェルのうち、Ｔ−３、５、３４株から採取した菌をＰＤ培地、ＹＭ培地、又はＭＲＳ培地の３種類の培地で、それぞれ、２４℃で２日間静置培養又は２８℃で２日間振とう培養した。得られた各培養物を、３，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清と沈殿物に分離した。この上清を孔径０．２０μｍのフィルターを用いて濾過した濾液を、抗真菌物質溶液とした。
上記１−３（３）と同様に、胞子混釈ＰＤＡ平板培地の一点に、１０μＬの各抗真菌物質溶液を、注入し、該胞子混釈ＰＤＡ平板培地を２８℃で４日間培養した。この結果、Ｔ−３、５、３４株のいずれの株においても、ＰＤ培地由来の抗真菌物質溶液では、注入点を中心に直径約１３ｍｍの円形状の菌が増殖していない領域（菌増殖阻止円）が形成されており、アスペルギルス・ニガーの増殖抑制が観察された。一方、ＹＭ培地及びＭＲＳ培地由来の抗真菌物質溶液では、菌増殖阻止円は形成されておらず、アスペルギルス・ニガーの増殖抑制が観察されなかった。この結果から、本発明の抗真菌物質を産生する菌は、ＰＤ培地において生育可能又はＰＤ培地において生育させた場合に本発明の抗真菌物質の産生可能であるが、ＹＭ培地又はＭＲＳ培地においては生育不可能又はＹＭ培地又はＭＲＳ培地において生育させた場合に本発明の抗真菌物質の産生不可能であることが示唆された。
さらに、各株の培養物の上清を添加したウェルでアスペルギルス・ニガーの増殖抑制が観察されたことから、該株が産生する本発明の抗真菌性物質は、ＰＤ培地で培養した場合に、分泌等により培養液中に移行し得る性質を有することが明らかである。

１−５．本発明の抗真菌性物質の大きさ
本発明の抗真菌性物質の大きさを検討するために、Ｔ−３４株をＰＤ培地に接種し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養物を、３，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清と沈殿物に分離した。この上清（ｐＨ６〜７）をＭＷＣＯが１０ｋＤである限外濾過膜を用いて限外濾過を行い、限外濾過膜表面に保持された高分子画分と、限外濾過膜を通過した低分子画分に分画した。該高分子画分又は該低分子画分を、上記１−３（３）と同様にして調製した胞子混釈ＰＤＡ平板培地の別の個所にそれぞれ１０μＬずつ注入した。また、抗真菌作用のポジティブコントロールとして、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液を用いて、同様に胞子混釈ＰＤＡ平板培地の別の個所に注入した。この結果、シクロヘキシミドでは、注入点を中心に菌の増殖が抑制されてはいるものの、明瞭な菌増殖阻止円の形成は観察されなかったが、高分子画分では、直径約６ｍｍの明瞭な増殖阻止円が形成された。これに対して、低分子画分では、菌増殖阻止円は形成されなかった。
一方、上記１−３（２）と同様にして、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、該高分子画分の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、それぞれ１３０μＬずつ添加した。ポジティブコントロールとして５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、ネガティブコントロールとして、サブロー培地のみを添加したウェルを、それぞれ用いた。さらに、各ウェルに、後記参考例１に記載の方法で調整した１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株胞子懸濁液を５０μＬずつそれぞれ添加した。該９６ウェルマイクロプレートを２８℃で３日間培養した後、顕微鏡を用いて、各ウェルにおけるアスペルギルス・ニガーの増殖の有無を観察した。この結果、コントロールのウェルにおいて、アスペルギルス・ニガーの増殖が観察されたが、該高分子画分の２^０〜２^４倍希釈液を添加したウェルと、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液の２^０〜２^３倍希釈液を添加したウェルとにおいて、アスペルギルス・ニガーの増殖は観察されなかった。
これらの結果から、本発明の抗真菌性物質が、本発明の抗真菌性物質を産生する菌を培養した培養液の上清を、ＭＷＣＯが１０ｋＤである限外濾過膜を用いて限外濾過した場合に、限外濾過膜表面に保持される特性を有することが明らかである。

１−６．本発明の抗真菌性物質の安定性
（１）熱安定性
上記１−５で調製した高分子画分を、１００℃で１０分間の加熱処理後、氷冷し、加熱処理済高分子画分を調製した。上記１−５と同様にして、この加熱処理済高分子画分の抗真菌活性を測定した。コントロールとして、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液を用いた。この結果、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液では直径約５ｍｍの不明瞭な菌増殖阻止円が、加熱処理済高分子画分では直径約１０ｍｍの明瞭な菌増殖阻止円が、それぞれ形成された。この結果から、本発明の抗真菌性物質は、１００℃で１０分間の加熱処理後でも抗真菌活性を維持し得る性質を有することがわかった。

（２）凍結乾燥処理に対する安定性
上記１−５で調製した高分子画分を、常法により凍結乾燥処理後、０．２ｇ／ｍＬ又は０．０２ｇ／ｍＬとなるように蒸留水（約ｐＨ７）に溶解させた凍結乾燥処理済高分子画分の抗真菌活性を、上記１−３（３）と同様にして測定した。コントロールとして、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液を用いた。この結果、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液では直径約５ｍｍの不明瞭な菌増殖阻止円が、０．０２ｇ／ｍＬの凍結乾燥処理済高分子画分では直径約３ｍｍの明瞭な菌増殖阻止円が、０．２ｇ／ｍＬの凍結乾燥処理済高分子画分では直径約１４ｍｍの明瞭な菌増殖阻止円が、それぞれ形成された。この結果から、本発明の抗真菌性物質は、凍結乾燥処理後でも抗真菌活性を維持し得る性質を有することがわかった。

１−７．本発明の抗真菌性物質のタンパク質分解酵素処理に対する安定性
（１）トリプシン処理に対する安定性
上記１−６（２）で調製した０．２ｇ／ｍＬの凍結乾燥処理済高分子画分に、トリプシン（最終濃度５ｍｇ／ｍＬ）を添加した後３７℃で３０分間インキュベートしたもの（トリプシン処理済高分子画分）、トリプシンに代えて同量の蒸留水を添加した後３７℃で３０分間インキュベートしたもの（トリプシン未処理済高分子画分）、５ｍｇ／ｍＬのトリプシン溶液、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液の、それぞれの抗真菌活性を上記１−３（３）と同様にして測定した。この結果、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液では直径約４ｍｍの不明瞭な菌増殖阻止円が、トリプシン処理済高分子画分とトリプシン未処理済高分子画分ではいずれも直径約１１ｍｍの明瞭な菌増殖阻止円が、それぞれ形成された。一方、トリプシン溶液では菌増殖阻止円は形成されなかった。これらの結果から、本発明の抗真菌性物質は、トリプシン処理後でも抗真菌活性を維持し得る性質を有することがわかった。

（２）プロテイナーゼＫ処理に対する安定性
上記１−６（２）で調製した０．２ｇ／ｍＬの凍結乾燥処理済高分子画分に、プロテイナーゼＫ（最終濃度４ｍｇ／ｍＬ）を添加した後３７℃で３０分間インキュベートしたもの（プロテイナーゼＫ処理済高分子画分）、プロテイナーゼＫに代えて同量の蒸留水を添加した後３７℃で３０分間インキュベートしたもの（プロテイナーゼＫ未処理済高分子画分）、４ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液の、それぞれの抗真菌活性を上記１−３（３）と同様にして測定した。この結果、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液では直径約４ｍｍの不明瞭な菌増殖阻止円が、プロテイナーゼＫ処理済高分子画分では直径約７ｍｍの明瞭な菌増殖阻止円が、プロテイナーゼＫ未処理済高分子画分では直径約１０ｍｍの明瞭な菌増殖阻止円が、それぞれ形成された。一方、プロテイナーゼＫ溶液では菌増殖阻止円は形成されなかった。これらの結果から、本発明の抗真菌性物質は、プロテイナーゼＫ処理により若干抗真菌活性が低下する性質を有することがわかった。また、本発明の抗真菌性物質は、ポリペプチド又はタンパク質である可能性が示唆された。

１−８．Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の調製
５ｍＬのＰＤ培地にＴ−３４株を接種した後、２８℃１〜２日間培養したものを前培養物とした。この前培養物を４０ｍＬの滅菌生理食塩水に懸濁したものを、１．０×１０^８ｃｆｕ／ｍＬとなるように、７００ｍＬのＰＤ培地に接種し、２４℃で７日間培養し、培養物を得た。１％炭酸ナトリウム溶液を用いて、この培養物をｐＨ６．８〜７に調整した後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清と沈殿物に分離し、この上清を孔径０．２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液の抗真菌活性を、上記１−３（３）のアガースポット法により確認した後、さらに８，０００×ｇで２０分間遠心分離を行い、上清と沈殿物に分離し、この上清を孔径０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液を、ＭＷＣＯが１０ｋＤである限外濾過膜を用いて限外濾過し、限外濾過膜表面に保持された溶液を、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液とした。

１−９．Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液中の本発明の抗真菌性物質のｐＨ処理に対する安定性
（１）Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液のｐＨ処理
１ｍＬの上記１−８で調製したＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を透析カップに入れ、表１に示すｐＨ２〜１０の１６種類のバッファーを用いてそれぞれ透析した。透析は、各バッファーの透析液を３〜４回交換することにより行った。透析後、透析カップ中のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を試験管に移し、ｐＨを確認した後、３０分間室温で放置した。その後、塩酸溶液又は炭酸ナトリウム溶液を用いて、各Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液のｐＨを７．０に調整し、液量を揃えた。

（２）２倍段階希釈系列法による抗真菌活性の測定
上記１−３（２）と同様にして、４枚の９６ウェルマイクロプレートＡ〜Ｄの各ウェルに、上記１−９（１）で調製したｐＨ処理後の各Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、それぞれ１３０μＬずつ添加した。ポジティブコントロールとして５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液とｐＨ処理をしていないＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、ネガティブコントロールとして、サブロー培地のみを添加したウェルを、それぞれ用いた。さらに、各ウェルに、後記参考例１に記載の方法で調整した１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株胞子懸濁液を５０μＬずつそれぞれ添加した。該９６ウェルマイクロプレートを２８℃で培養し、２日後又は３日後に、顕微鏡を用いて、各ウェルにおけるアスペルギルス・ニガーの増殖の有無を観察した。

表１は、９６ウェルマイクロプレートＡ〜Ｄの顕微鏡観察の結果に基づき、ｐＨ処理後の各Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の２倍段階希釈系列において、菌の増殖抑制が観察されたウェルのうち、最も抗真菌性物質濃度の低いウェルの希釈倍率、すなわち、最大生育阻止希釈倍率を示したものである。表中、各バッファー及びｐＨは、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液のｐＨ処理に用いたものを示しており、「ｐＨ処理無し」は、ｐＨ処理をしていないＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を示している。また、表中、「２^ｎ」の記載は、抗真菌性物質溶液等の２^ｎ倍希釈溶液以下の希釈倍率の溶液、すなわち、２^０〜２^ｎ倍希釈溶液を添加したウェルにおいて、菌の増殖抑制が観察されたことを、「−」の記載は、２^０倍希釈溶液（原液）を添加したウェルにおいても活性が観察されなかったことを、それぞれ示している。
この結果、ｐＨ２のグリシン−塩酸バッファーと、ｐＨ９のトリス−塩酸バッファーで処理した場合には若干活性が低下する傾向が観察されたが、その他はｐＨ未処理のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液とほぼ同等の抗真菌活性を有していた。これらの結果から、ｐＨ２〜１０の幅広いｐＨ範囲において、本発明の抗真菌性物質は安定であることが明らかとなった。

（３）アガースポット法による抗真菌活性の測定
上記１−３（３）と同様にして、上記１−９（１）で調製したｐＨ処理後の各Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の抗真菌活性をアガースポット法により測定した。表２は、各ＰＤＡ平板培地に形成された増殖阻止円のおおよその直径を示したものである。表中、各バッファー、ｐＨ、及び「ｐＨ処理無し」の記載は、表１と同様である。
この結果、ほぼ全てのｐＨ処理後のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液は、ｐＨ未処理のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液とほぼ同等の抗真菌活性を有していることが分かった。すなわち、これらの結果からも、上記１−８（２）と同様に、ｐＨ２〜１０の幅広いｐＨ範囲において、本発明の抗真菌性物質は安定であること、特に本発明の抗真菌性物質が有する菌糸の伸長抑制作用は、ｐＨ２〜１０で処理しても失われ難いことが明らかとなった。

１−１０．Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液中の本発明の抗真菌性物質の熱安定性
（１）Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の熱処理
上記１−８で調製したＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を、炭酸ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整した後、スクリューコック付試験管（直径１６．５ｍｍ）に１ｍＬずつ分取した。各スクリューコック付試験管を、ドライインキュベーターを用いて、１０、３０、５０、７０、９０、１００、１１０、１２１℃の各温度でそれぞれ１０分間加熱処理した後、室温まで冷却し、孔径０．２μｍのフィルターを用いて濾過し、得られた濾液を、加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液とした。

（２）２倍段階希釈系列法による抗真菌活性の測定
上記１−３（２）と同様にして、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、上記１−１０（１）で調製した各加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、それぞれ１３０μＬずつ添加した。ポジティブコントロールとして５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液と加熱処理をしていないＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、ネガティブコントロールとして、サブロー培地のみを添加したウェルを、それぞれ用いた。さらに、各ウェルに、後記参考例１に記載の方法で調整した１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株胞子懸濁液を５０μＬずつそれぞれ添加した。該９６ウェルマイクロプレートを２８℃で培養し、２日後又は３日後に、顕微鏡を用いて、各ウェルにおけるアスペルギルス・ニガーの増殖の有無を観察した。

表３は、顕微鏡観察の結果に基づき、各加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の２倍段階希釈系列における最大生育阻止希釈倍率を示したものである。表中、「加熱処理無し」は、加熱処理をしていないＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を示している。また、表中、「２^ｎ」及び「−」の記載は表１と同様である。
この結果、ほぼ全ての加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液は、加熱未処理のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液とほぼ同等の抗真菌活性を有していることが分かった。

（３）アガースポット法による抗真菌活性の測定
上記１−３（３）と同様にして、上記１−１０（１）で調製した各加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の抗真菌活性をアガースポット法により測定した。表４は、各ＰＤＡ平板培地に形成された増殖阻止円のおおよその直径を示したものである。表中、「加熱処理無し」の記載は、表３と同様である。
この結果、ほぼ全ての加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液は、加熱処理無しのＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液とほぼ同等の抗真菌活性を有していることが分かった。すなわち、これらの結果からも、上記１−１０（２）と同様に、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液に含まれる本発明の抗真菌性物質は、優れた熱安定性を有することが明らかである。

１−１１．Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の精製
（１）精製
上記１−８で調製したＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を４℃で冷蔵保存すると、白濁し沈殿を生じた。また、この沈殿は、加熱処理により可溶化した。そこで、４℃で冷蔵保存後のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清と沈殿物に分離した。得られた上清と沈殿物の両方に対して、それぞれルゴール液を添加したところ、両方とも紫色に発色した。この結果及びＰＤ培地を用いた培養液であること等から、この沈殿物はデンプンではないかと推察された。そこで、この沈殿物の除去を試みた。
まず、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液に等量の２−プロパノールを添加して混合した。この混合液を４℃で一晩放置した後、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清と沈殿物に分離した。得られた沈殿物は、５０％２−プロパノール溶液で２回洗浄後、少量の蒸留水に溶解させて減圧乾固させた。得られた乾固物は、さらに、少量の蒸留水に溶解させた後、孔径１０ｋＤの透析膜を用いて透析処理し、これを沈殿物由来試料とした。一方、得られた上清は、沈殿物を洗浄した後の５０％２−プロパノール溶液を加えた後、減圧乾固させた。得られた乾固物は、少量の蒸留水に溶解させた後、孔径１０ｋＤの透析膜を用いて透析処理し、これを上清由来試料とした。この上清由来試料と沈殿物由来試料は、蒸留水を用いて、２−プロパノール溶液添加前のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液と等量になるように調整した。
２−プロパノール溶液添加前のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液、上清由来試料、及び沈殿物由来試料にルゴール液を添加し、ヨウ素デンプン反応を行ったところ、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液と沈殿物由来試料は紫色に呈色したが、上清由来試料は呈色しなかった。この結果から、２−プロパノール溶液処理により、デンプンを沈殿物として除去し得ることが分かった。

（２）２倍段階希釈系列法による抗真菌活性の測定
上記１−１１（１）において調製した、２−プロパノール溶液添加前のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液、上清由来試料、及び沈殿物由来試料の、それぞれの抗真菌活性を測定した。
具体的には、上記１−３（２）と同様にして、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、上記１−１１（１）で調製した各試料の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、それぞれ１３０μＬずつ添加した。ポジティブコントロールとして５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液の２倍段階希釈系列（２^０〜２^９倍）を、ネガティブコントロールとして、２０ｍＭのコハク酸塩−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）のみを添加したウェルを、それぞれ用いた。さらに、各ウェルに、後記参考例１に記載の方法で調整した１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株胞子懸濁液を５０μＬずつそれぞれ添加した。該９６ウェルマイクロプレートを２８℃で２日間培養した後、顕微鏡を用いて、各ウェルにおけるアスペルギルス・ニガーの増殖の有無を観察した。

表５は、顕微鏡観察の結果に基づき、各試料の２倍段階希釈系列における最大生育阻止希釈倍率を示したものである。表中、「Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液」は、２−プロパノール溶液添加前のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を、「ネガティブコントロール」は２０ｍＭのコハク酸塩−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を、それぞれ示している。また、表中、「２^ｎ」及び「−」の記載は表１と同様である。
この結果、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液、上清由来試料を添加したウェルでは、シクロヘキシミド溶液を添加したウェルと同様にアスペルギルス・ニガーの増殖抑制が観察されたが、沈殿物由来試料を添加したウェルでは、コハク酸塩−水酸化ナトリウム緩衝液と同様にアスペルギルス・ニガーの増殖抑制は観察されなかった。すなわち、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液に２−プロパノール溶液を添加した後、遠心分離処理することにより、本発明の抗真菌性物質は上清、デンプンは沈殿物に、それぞれ分離し得ることが明らかになった。

（３）アガースポット法による抗真菌活性の測定
上記１−３（３）と同様にして、上記１−１１（１）で調製した２−プロパノール溶液添加前のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液、上清由来試料、及び沈殿物由来試料の抗真菌活性をアガースポット法により測定した。表６は、各ＰＤＡ平板培地に形成された増殖阻止円のおおよその直径を示したものである。表中、「Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液」及び「ネガティブコントロール」の記載は、表５と同様である。また、表中「−」の記載は、増殖阻止円が形成されなかったことを示すものである。
この結果、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液及び上清由来試料は、シクロヘキシミド溶液と同様に増殖阻止円を形成したが、沈殿物由来試料は、コハク酸塩−塩化ナトリウム緩衝液と同様に増殖阻止円を形成しなかった。すなわち、これらの結果からも、上記１−１１（２）と同様に、２−プロパノール溶液処理により、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液からデンプンを除去し、本発明の抗真菌性物質を精製し得ることが明らかになった。

１−１２．Ｔ−３４株の同定
まず、遺伝学的性質を調べるため、Ｔ−３４株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を常法により同定した。具体的には、Ｔ−３４株の培養液から抽出したＤＮＡと、９Ｆ，３３９Ｆ、７８５Ｆ、１０９９Ｆ、５３６Ｒ、８０２Ｒ、１２４２Ｒ、及び１５１０Ｒプライマー（中川恭好、外１名、遺伝子解析法１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定法、「放線菌の分類と同定」、日本放線菌学会編集、第８８〜１１７ページ、２００１年）を用いて、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を同定した。なお、ＤＮＡの抽出にはＩｎｓｔａＧｅｎｅＭａｔｒｉｘ（ＢｉｏＲａｄ社製）を、ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）及びＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を、塩基配列の同定にはＡＢＩＰＲＩＳＭ３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒＳｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を、それぞれ用いた。
国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）上で、該塩基配列について相同性検索を行ったところ、バーコデリア由来の１６ＳｒＤＮＡに対して高い相同性を示し、バーコデリア・スピーシーズ３８３株（アクセッション番号：ＣＰ０００１５２）と１００％の相同性を示した。一方、基準株由来の１６ＳｒＤＮＡに対しては、バーコデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ）の基準株であるＡＴＣＣ２５４１６株と９９．７％という最も高い相同性を示した。

表７は、Ｔ−３４株の菌学的性質を測定したものである。なお、菌学的性質の測定は、ＹＭ寒天培地で、２８℃で２日〜１ヶ月間培養したＴ−３４株を用い、常法により行った。また、表中「＋」の記載は陽性を、「−」は陰性を示すものである。
この結果、Ｔ−３４株は、生理学・生化学的性状において、バーコデリア・セパシアの基準株とインドール産生とアラビノースの資化性が異なるものの、それ以外の性状はほぼ一致する菌学的性質を示した。

これらの結果から、Ｔ−３４株の遺伝学的及び菌学的性質は、バーコデリア・セパシアの遺伝学的及び菌学的性質に最も近いことが確認された。したがって、Ｔ−３４株は、バーコデリア・セパシアに近縁なバーコデリア・スピーシーズに属する新規な菌種であると推定された。

そこで、出願人は、Ｔ−３４株を、『バーコデリア・スピーシーズＴ−３４株』として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（寄託日：２００８年１月１６日）。受託番号は、ＮＩＴＥＢＰ−４７７である。

２．ＲＯ−１株
２−１．本発明の抗真菌性物質を産生する菌の単離
まず、上記１−１とは異なるロットのカスピアンチーズを用いて、Ｔ−３４株と同様の手法により、微生物群を取得した。次に、上記１−３（１）〜（３）と同様にして、取得された菌群が有する本発明の抗真菌性物質により、アスペルギルス・ニガーの増殖が抑制されたことを確認した。また、上記１−４と同様にして、ＲＯ−１株を単離し、該株が産生する本発明の抗真菌性物質が、ＰＤ培地で培養した場合に、分泌等により培養液中に移行しうる性質を有することを確認した。

２−２．ＲＯ−１株ＰＤ培養濃縮液中の本発明の抗真菌性物質の活性
まず、上記１−８と同様にして、ＲＯ−１株ＰＤ培養濃縮液を調整した。次に、上記１−９〜１−１０と同様にして、２倍段階希釈系列法を用い、該株ＰＤ培養濃縮液中の本発明の抗真菌性物質の抗真菌活性を測定した。その結果、Ｔ−３４株とほぼ同程度に抗真菌活性を有することを確認した。

２−３．ＲＯ−１株の同定
まず、遺伝学的性質を調べるため、ＲＯ−１株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を、Ｔ−３４株と同様にして同定した。国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）上で、該塩基配列について相同性検索を行ったところ、バーコデリア由来の１６ＳｒＤＮＡに対して高い相同性を示し、バーコデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）の公知株であるＨＩ２４２４株（アクセッション番号：ＣＰ０００４５８）と９８％の相同性を示した。

次に、ＲＯ−１株の菌学的性質を、Ｔ−３４株と同様にして測定した。結果を表７に示す。
この結果、ＲＯ−１株は、生理学・生化学的性状において、バーコデリア・セノセパシアの公知株と一致する菌学的性質を示した。

これらの結果から、ＲＯ−１株の遺伝学的及び菌学的性質は、バーコデリア・セノセパシアの遺伝学的及び菌学的性質に最も近いことが確認された。したがって、ＲＯ−１株は、バーコデリア・セノセパシアに近縁なバーコデリア・スピーシーズに属する新規な菌種であると推定された。

そこで、出願人は、ＲＯ−１株を、『バーコデリア・スピーシーズＲＯ−１株』として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した（寄託日：２００９年１月２７日）。受託番号は、ＮＩＴＥＢＰ−６９８である。

本発明における抗真菌活性とは、カビや酵母等の真菌の増殖を抑制する活性である。本発明の抗真菌性物質は、特に、胞子の発芽及び菌糸の伸長を阻害する活性を有する。このように、菌糸の伸長を阻害することにより、効果的にカビ等の真菌の発生及び増殖を防止することができる。

本発明の抗真菌性物質は、明確な物質名は未だ明らかではないが、バーコデリア属菌が産生するカビや酵母等の真菌の増殖を抑制し、並びに、胞子の発芽及び菌糸の伸長を阻害する抗真菌性物質である。

また、本発明の抗真菌性物質は、（１）ｐＨ７．０において、抗真菌活性を有すること、（２）ＰＤ培地で前記バーコデリア属菌を培養した培養液の上清が、抗真菌活性を有すること、（３）ＰＤ培地で前記バーコデリア属菌を培養した培養液の上清を、ＭＷＣＯが１０ｋＤである限外濾過膜を用いて限外濾過した場合に、限外濾過膜表面に保持されること、等の特徴を有するものである。さらに、（４）プロテイナーゼＫ処理により、前記抗真菌活性が低下すること、等の特徴を有するものであってもよい。その他、（５）トリプシン処理により、前記抗真菌活性が維持されること、等の特徴を有するものであってもよい。

本発明の抗真菌性物質を産生するバーコデリア属菌は、バーコデリア・スピーシーズ、バーコデリア・プランタリ、又はバーコデリア・フェナジニウムであることが好ましく、バーコデリア・スピーシーズであることがより好ましい。特に、バーコデリア・スピーシーズＴ−３４株、バーコデリア・スピーシーズＲＯ−１株、バーコデリア・プランタリＪＣＭ５４９２株、又はバーコデリア・フェナジニウムＪＣＭ１０５６４株等があることが好ましい。

本発明の抗真菌性物質は、カスピアンチーズに含まれる菌が有する抗真菌性物質であることが好ましい。良好な発酵食品であるチーズに由来する菌が産生する抗真菌性物質であれば、食品や化粧品、医薬品等にも安全に用いられ得る可能性があるからである。
本発明におけるカスピアンチーズとは、カスピ海近隣の牛の乳に、カスピ海ヨーグルトと同種の乳酸菌；クレモリス菌及びアセトバクター菌；及び、酵素を入れて製造されるチーズである。他のチーズと比較して塩分濃度が高く、クレモリス菌を多く含有することを特徴とする。このカスピアンチーズを、常法により好気培養すると、酵母及び細菌が分離される。本発明者らが、実際に好気培養したところ、酵母と、性状の異なる２種類の細菌が分離された。これらを遺伝子解析したところ、分離された酵母はキャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）であり、分離された細菌はストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とバーコデリア属菌であった。異なるロットのカスピアンチーズを用い、上記と同様にして分析を行った場合においても、上記微生物が分離された。この結果から、キャンディダ・マルトーサ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、及びバーコデリア属菌が、イランのカスピアンチーズ工場の加工工程に常在していると推定された。

本発明のバーコデリア属菌、すなわち、本発明の抗真菌性物質を産生するバーコデリア属菌は、常法により培養することができ、培地や温度等の培養条件は、通常、バーコデリア属菌等の微生物を培養する条件であれば、特に限定されるものではない。該培地として、例えば、ＰＤ培地、ＹＭ培地、ＭＲＣ培地、１０％（ｗ／ｗ）スキムミルク培地等がある。本発明の抗真菌性物質の活性が阻害されるおそれが少ないため、及び、該抗真菌性物質の精製が簡便になるため、ＰＤ培地であることが好ましい。また、培養温度は、２７〜３０℃が好ましい。

本発明の抗真菌性物質は、本発明のバーコデリア属菌を培養することにより得ることができる。ここで、上記１−４からも明らかであるように、本発明の抗真菌性物質を得るために本発明のバーコデリア属菌を培養する場合には培養液としてＰＤ培地を用いることが好ましい。例えば、本発明のバーコデリア属菌の培養液を、遠心分離処理をすることによって得た上清中に、本発明の抗真菌性物質は存在する。該遠心分離処理の条件は、該培養液中の菌体等の固体成分を除去できる条件であれば、特に限定されるものではないが、菌体由来の他の物質の混入を避けるため、２，５００〜５，０００×ｇの低速で遠心分離処理を行うことが好ましい。また、該上清を、ＭＷＣＯが１０ｋＤである限外濾過膜を用いた限外濾過処理を行うことにより、該上清中に含まれる低分子の不純物を除去することもできる。このようにして得た該上清を、本発明の抗真菌性物質含有溶液として、防カビ剤や食品保存料として用いることもできる。

本発明の真菌の増殖を阻害する方法は、本発明の抗真菌性物質又は本発明のバーコデリア属菌を用いる方法であって、本発明の抗真菌性物質の抗真菌活性が得られる方法であれば、特に限定されるものではない。本発明の抗真菌性物質を用いる方法として、例えば、該抗真菌性物質を含有する該バーコデリア属菌の培養液の上清等を、生物農薬として植物等に噴霧又は塗布する方法や、食品等に原料として添加する方法や、製造された食品に噴霧又は塗布する方法等がある。本発明の抗真菌性物質は、ｐＨ２〜１０というｐＨ領域で使用し得るものであり、また、非常に優れた耐熱性を有するものであるため、幅広い分野において使用可能である。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［参考例１］
アスペルギルス・ニガーの胞子懸濁液の調整
アスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株は、ＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）平板培地に塗布した後、２８℃で３日間培養して得られた胞子を、０．０５％ｔｗｅｅｎ８０添加生理食塩水に懸濁し、懸濁液を綿濾過後、−８０℃で凍結保存したものを用いた。該凍結保存後のアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株を、生理食塩水を用いて希釈した後、サブロー培地を用いて、１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー胞子懸濁液を調製した。

［実施例１］
２倍段階希釈系列法により、本発明の抗真菌性物質の耐熱性を調べた。
まず、上記１−８と同様にして調製したＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を、炭酸ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整した後、スクリューコック付試験管（直径１６．５ｍｍ）に１ｍＬずつ分取した。各スクリューコック付試験管を、ドライインキュベーターを用いて、１００℃で１０分間、２０分間、３０分間、６０分間加熱処理した後、孔径０．２μｍのフィルターを用いて濾過し、得られた濾液を、加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液とした。

その後、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、これらの加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液を、それぞれ１３０μＬずつ添加した。該加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の希釈には、サブロー培地を用いた。具体的には、９６ウェルマイクロプレートの１列目に該加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液を添加し、２列目に、該加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の２倍希釈液を添加し、３列目に、該加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の４（２^２）倍希釈溶液を添加した。各列に、順次、２倍段階希釈液をウェルに添加し、最後に１０列目に、該加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の５１２（２^９）倍希釈溶液を添加した。コントロールとして、１３０μＬのサブロー培地のみをウェルに添加した。さらに各ウェルに、上記参考例１に記載の方法で調整した１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー胞子懸濁液を５０μＬずつそれぞれ添加した。該９６ウェルマイクロプレートを２８℃で３日間培養した後、顕微鏡を用いて、各ウェルにおけるアスペルギルス・ニガーの増殖の有無を観察した。

表８は、各加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の２倍段階希釈系列において、菌の増殖抑制が観察されたウェルのうち、最も抗真菌性物質濃度の低いウェルの希釈倍率、すなわち、最大生育阻止希釈倍率を示したものである。この結果、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液は、１００℃で６０分間加熱処理した後であっても、十分な抗真菌活性を有していることが分かった。

［実施例２］
アガースポット法により、本発明の抗真菌性物質の耐熱性を調べた。
具体的には、まず、加熱処理を、１００℃で１０分間、２０分間、３０分間、６０分間処理する以外は、実施例１と同様にして、加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液を調製した。次に、参考例１と同様にして調製した１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー胞子懸濁液を混釈したＰＤＡ平板培地（以下、胞子混釈ＰＤＡ平板培地ということがある。）の一点に、１０μＬの各加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液を注入した。これらのＰＤＡ平板培地を、２８℃で３日間培養した後、ＰＤＡ平板培地上に形成された増殖阻止円の直径等を測定した。
この結果、加熱処理無しのＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液では、ＰＤＡ平板培地にほぼ円形の増殖阻止円が形成されたが、その他の加熱処理済Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液では、ほぼ楕円形の増殖阻止円が形成された。なお、菌増殖阻止円が楕円形になった原因は、試料液が完全に寒天培地の中に染み込む前に、平板培地を移動させたため試料溶液も移動したためと推察される。表９は、各ＰＤＡ平板培地に形成された増殖阻止円のおおよその「短径×長径」を示したものである。なお、表中、「−」の記載は、表６と同様である。この結果、実施例１と同様に、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液は、１００℃で６０分間加熱処理した後であっても、十分な抗真菌活性を有していることが分かった。

［実施例３］
本発明の抗真菌性物質のカビの胞子発芽抑制作用について調べた。具体的には、顕微鏡と微量の溶液を保持し得る凹部（ホール）を有するホールグラスを用いて、カバーガラス上の同一地点における胞子の発芽と菌糸の伸長を経時的に観察することにより、本発明の抗真菌性物質の胞子発芽抑制作用の有無を検出した。
まず、２×１０^５ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬとなるように、アスペルギルス・ニガー胞子を、寒天を溶かして４０〜４５℃に保った液状のＰＤＡ培地に懸濁し、胞子混釈ＰＤＡ培地を調製した。この液状の胞子混釈ＰＤＡ培地中にカバーガラスを浸漬させた後、ＰＤＡ培地を固めることにより、表面にアスペルギルス・ニガー胞子を混釈したＰＤＡ培地の薄膜を乗せたカバーガラス（胞子混釈ＰＤＡ培地付カバーガラス）を作製した。
次に、該胞子懸濁培地付カバーガラスを、胞子混釈ＰＤＡ培地を下にして、上記１−８と同様にして調製したＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液をホールに添加したホールグラス上に、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液と胞子混釈ＰＤＡ培地が接する状態で１０分間保持した後、ホール内のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を除去して、２８℃で静置培養した。Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液に代えてＰＤ培地を添加したものをコントロールとして、同様に培養した。
２日後、顕微鏡でカバーガラスの同一地点を観察したところ、コントロールでは胞子が発芽し菌糸も伸長していたが、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液で処理したカバーガラスでは、胞子の発芽は観察されなかった。この結果から、本発明の抗真菌性物質が、カビの胞子発芽抑制作用を有することが明らかである。

［実施例４］
本発明の抗真菌性物質のカビの菌糸伸長抑制作用について調べた。
まず、実施例３と同様にして作製した胞子混釈ＰＤＡ培地付カバーガラスを、ホールに溶液を添加していないホールグラス上に設置し、２８℃で静置培養した。１５時間培養後、胞子の発芽と菌糸の伸長を確認してから、上記１−８と同様にして調製したＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を、培養中のホールグラスのホールに胞子混釈ＰＤＡ培地と接するまで添加し、１０分間保持した後、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液を取り除いた。さらに２８℃で２日間静置培養し、カバーガラス上の同一地点の胞子や菌糸を経時的に観察した。Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液に代えてＰＤ培地を添加したものをコントロールとして、同様に培養した。
図１は、培養後１５時間（ＰＤ培地処理後０時間）、培養後２２時間（ＰＤ培地処理後７時間）、培養後４４時間（ＰＤ培地処理後２９時間）、及びＰＤ培地処理後２日間培養した時点のコントロールのカバーガラス上の同一地点の胞子の顕微鏡写真図である。図２は、図１と同じ時点のＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液で処理したカバーガラス上の同一地点の胞子の顕微鏡写真図である。コントロールのカバーガラス上では、菌糸の伸長が確認された。例えば、培地添加後７時間の写真中の塗潰し矢印が指し示している非常に短い菌糸は、伸長を続けた結果、培地添加後２９時間の写真中の塗潰し矢印が指し示している太い菌糸にまで伸長した。また、培地添加後２９時間の写真中の白抜き矢印が指し示している短い菌糸は、伸長を続けた結果、培地添加２日後の写真中の白抜き矢印が指し示している長い菌糸にまで伸長した。一方で、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液を添加したカバーガラス上では、菌糸の伸長は確認されなかった。この結果から、本発明の抗真菌性物質が、カビの菌糸伸長抑制作用を有することが明らかである。

［実施例５］
アスペルギルス・ニガーを蛍光染色することにより、本発明の抗真菌性物質が有する胞子の発芽阻害作用と菌糸の伸長阻害作用を調べた。
胞子の発芽阻害作用を調べるために、６００μＬのＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液と、４００μＬの２．４×１０^６ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー胞子懸濁液を混合し、２８℃で１時間インキュベートしたものを蛍光染色した。菌糸の伸長阻害作用を調べるために、２．４×１０^６ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー胞子懸濁液を２８℃で２３時間静置培養し、これに６００μＬのＴ―３４株ＰＤ培養液濃縮液を添加して１時間インキュベートしたものを蛍光染色した。なお、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液は、上記１−８と同様にして調製し、アスペルギルス・ニガー胞子懸濁液は参考例１と同様にして調製した。
この培養液１ｍＬに、２００μＬの０．５μＭ蛍光色素ＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）を添加し、さらに２８℃で０．５時間インキュベートした。その後、この培養液を３，０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上清を除去することにより蛍光色素を除去した。得られた沈殿に蒸留水を添加して懸濁させた後、再度遠心分離処理して上清を除去して沈殿を洗浄した。
この沈殿にさらに１ｍＬの蒸留水を添加して、胞子懸濁液を調製した。この胞子懸濁液を通常の光学顕微鏡を用いて、蛍光及び透過光観察したところ、ＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎで染色された胞子と菌糸が観察された。特にＴ−３４株ＰＤ培養液で処理した菌糸内部は強く蛍光染色されていた。
ここで、ＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎは、ＤＮＡと特異的に結合し得る色素であるが、細胞膜を通過することはできない。にもかかわらず、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液とインキュベートしたアスペルギルス・ニガーの胞子と菌糸が染色されたのは、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液が有する抗真菌性物質の作用により、胞子及び菌糸の細胞壁が損傷を受けたためと推察される。

［実施例６］
本発明の抗真菌性物質の、様々な真菌に対する抗真菌活性を測定した。抗真菌活性のポジティブコントロールとして、真核細胞に対するタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドを用いた。
まず、上記１−８と同様にして、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液を調製した。また、表１０記載の１８菌株の１．０×１０^４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬの胞子懸濁液を、参考例１と同様にしてそれぞれ調製した。次に、実施例２と同様にして、各胞子懸濁液を混釈したＰＤＡ平板培地を作製した。これらのＰＤＡ平板培地に、１０μＬのＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を注入した後、２８℃で３日間培養し、ＰＤＡ平板培地上に形成された増殖阻止円の直径等を測定した。
表１０は、各ＰＤＡ平板培地上の増殖阻止円の大きさ等を示したものである。なお、表中、「＋＋」は直径１０ｍｍ以上の増殖阻止円が形成されたことを、「＋」は直径１０ｍｍ未満の増殖阻止円が形成されたことを、「±」は不明瞭な増殖阻止円が形成されたことを、「−」は増殖阻止円が形成されなかったことを、それぞれ意味する。ここで、「不明瞭な増殖阻止円」とは、完全に真菌の増殖が阻害されているわけではなく、ＰＤＡ平板培地上の他の領域に比較すれば真菌の密度が低い円形の領域を意味する。
この結果、表１０記載の全ての菌株において、５００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液よりも、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液の注入によるほうが、より大きな増殖阻止円が形成されていることが観察された。すなわち、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液が有する本発明の抗真菌性物質は、多様な真菌に対して非常に良好な抗真菌活性を有していることが明らかである。

［実施例７］
アガースポット法により、本発明の抗真菌性物質の、酵母および細菌に対する抗菌活性を測定した。
まず、上記１−８と同様にして、Ｔ−３４株ＰＤ培養濃縮液を調整した。また、表１１記載の５菌株の１．０×１０^６ｃｆｕ／ｍＬの菌懸濁液を、常法によりそれぞれ調整した。次に、実施例２と同様にして、各菌懸濁液を混釈したＰＤＡ平板培地を作製した。これらのＰＤＡ平板培地に、１０μＬのＴ−３４株ＰＤ培養濃縮液を注入した後、２８℃で３日間培養し、ＰＤＡ平板培地上に形成された増殖阻止円の直径等を測定した。抗菌活性のポジティブコントロールとして、酵母３菌株に対しては実施例６と同様にシクロヘキシミドを用い、細菌２菌株に対しては広範な微生物に対するタンパク質合成阻害剤であるクロラムフェニコールを用いた。ポジティブコントロールの使用濃度は表１１中に示す。
表１１は、各ＰＤＡ平板培地上に形成された増殖阻止円のおおよその直径を示したものである。なお、表中の記載は、表６と同様である。
この結果、酵母３菌株においては、シクロヘキシミド溶液と同様に増殖阻止円を形成したが、細菌２菌株においては、増殖阻止円は形成されなかった。すなわち、Ｔ−３４ＰＤ培養濃縮液が有する本発明の抗真菌性物質は、酵母に対して抗真菌活性を有するが、細菌に対して抗菌活性を有しないことが分かった。

本発明の抗真菌性物質は、チーズ由来の微生物が産生するため安全であり、中性において抗真菌活性を示すことから、特にカビの増殖が問題となる食品分野等で利用が可能である。

Claims

カスピアンチーズから単離されたバーコデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌が産生する、カビ及び／又は酵母の増殖を阻害し、且つ、下記の特徴を有する抗真菌性物質。
（１）ｐＨ７．０において、抗真菌性を有すること、
（２）ポテトデキストロース培地で前記バーコデリア属菌を培養した培養液の上清が、抗真菌活性を有すること、
（３）ポテトデキストロース培地で前記バーコデリア属菌を培養した培養液の上清を、ＭＷＣＯ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＣｕｔＯｆｆ、分画分子量）が１０ｋＤである限外濾過膜を用いて限外濾過した場合に、限外濾過膜表面に保持されること、
（４）プロテイナーゼＫ処理により、前記抗真菌活性が低下すること。
前記バーコデリア属菌が、バーコデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ
ｓｐ．）ＲＯ−１（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−６９８）、又はバーコデリア・スピーシーズＴ−３４（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−４７７）である、請求項１記載の抗真菌性物質。
胞子の発芽及び／又は菌糸の伸長を阻害する請求項１又は２に記載の抗真菌性物質。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗真菌性物質を含有する防カビ剤。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗真菌性物質を含有する食品保存料。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗真菌性物質を用いることを特徴とする、真菌の増殖を阻害する方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗真菌性物質を産生するバーコデリア属菌を用いることを特徴とする、真菌の増殖を阻害する方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗真菌性物質を産生することを特徴とするバーコデリア・スピーシーズＴ−３４（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−４７７）。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗真菌性物質を産生することを特徴とするバーコデリア・スピーシーズＲＯ−１（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−６９８）。