KR100536522B1

KR100536522B1 - 인간 피부 유래의 신규한 박테리오신 및 여드름치료제로서의 용도

Info

Publication number: KR100536522B1
Application number: KR10-2003-0014466A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 박혜정
Original assignee: (주)바이오솔루션
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2005-12-14
Also published as: KR20040079302A

Abstract

본 발명은 인간 피부 유래의 신규한 박테리오신 및 여드름 치료제로서의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 인간 피부에서 분리한 박테리오신을 생산하는 신규한 엔테로코커스 파에시움 HJ35를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명 균주로부터 생산된 엔테로신 HJ35는 항미생물 활성 범위가 넓고 살균 작용기작을 나타내며 열 안정성이 있고 다양한 pH에서 안정하며 각종 유기용매에도 안정한 특징이 있다. 특히, 본 발명 엔테로신 HJ35은 여드름 유발균인 프로피오니박테리움 애크니에 대해 뚜렷한 항균 활성을 갖는 특징이 있다. 또한, 본 발명은 박테리오신 생산 균주를 유가식 배양으로 글루코우즈와 젖산을 첨가시켜 생산성을 향상시킬 수 있는 방법을 제공하는 효과가 있다.

Description

인간 피부 유래의 신규한 박테리오신 및 여드름 치료제로서의 용도{Novel bacteriocin isolated from human skin and the use as therapeutic agent of an acne}

본 발명은 인간 피부 유래의 신규한 박테리오신 및 여드름 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인간 피부에서 신규한 박테리오신을 생산하는 미생물 엔테로코커스 파에시움 HJ35를 분리 동정하고 이로부터 생산된 박테리오신의 특성을 규명하여 여드름 치료제로서의 용도를 제공하는 것에 관한 것이다.

박테리오신은 계통학적으로 유사한 균종들에 대해 살균효과를 갖는 세균에 의해 생산되는 단백질이다. 박테리오신은 식품과 관련된 많은 미생물에서 생산되는 천연물질이므로, 현재 이들을 천연식품방부제로 사용하는데 관심이 모아지고 있다. 소비자들은 잔류성의 문제점을 갖고 있는 화학방부제를 기피하고 최근에는 식품 보존을 위해 천연 식품보존제에 관심을 갖게 되었다. 따라서, 인체에서 완전 분해되는 특징으로 인해 박테리오신을 이들을 천연 식품보존제로 사용하기 위한 관심이 고조된 상태이다. 박테리오신을 코딩하는 유전자를 유전적으로 조작할 수 있는 가능성은 박테리오신 연구를 착수하는 원인이 되기도 한다. 박테리오신 생산균주들은 그들이 생산하는 박테리오신에 대한 보호 시스템을 가지고 있다. 상기 시스템을 "자가면역"이라 하며 자체 박테리오신에 의해 영향을 받지 않도록 할 수 있다. 박테리오신은 그들의 항미생물 활성때문에 산업상 이용가능성이 매우 크다. 게다가, 박테리오신은 발효식품에서 발견되는 미생물의 생물학적 보존제 및 생물제어제로서 이용될 수 있다.

락트산 균 유래의 박테리오신을 조성, 크기, 열 안정성, 작용기작, 분비 메카니즘의 타입 및 활성 범위에 따라 여러 그룹으로 분류하였다.

클래스 I 박테리오신은 란티오닌(lanthionine), β-메틸란티오닌(β-methyl-lanthionine) 및 탈수화된 잔기 즉, 니신(nisin), 락티신 481(lacticin 481), 카르노신 U149(carnosin U149) 및 락티신 S(lacticin S)와 같은 독특한 아미노산을 포함하는 막에서 작용하는 작은 펩티드를 생산하는 란티바이오틱스(lantibiotics)이다.

클래스 II 박테리오신은 다수의 소수성 분자로 이루어진 양친성 헬릭스 구조, β-쉬트(β-sheet) 구조 및 비교적 고온에서 안정성을 갖는 것으로 보인다. 예를 들어, 페디오신 PA-1(pediocin PA-1), 락토코신 A, B, G(lactococcin A, B, G), 류코신 A(leucocin A), 사카신 A, P(sakacin A, P), 큐바신 A(curvacin A) 및 락타신 F(lactacin F) 등이 있다.

클래스 III 박테리오신은 분자량이 30 kDa 이상으로 크고, 헬베티신 J(helveticin J), V-1829, 애시도필루신 A(acidophilucin A) 및 락타신 B( lactacin B)와 같이 열에 불안정한 박테리오신을 포함하고 있다.

클래스 IV 박테리오신은 단백질과 활성부위를 포함한 하나 이상의 화학적 성분들로 구성된 복잡한 박테리오신 즉, 플란타리신 S(plantaricin S), 락토신 27(lactocin 27) 및 페디오신 SJ-1(pediocin SJ-1)을 포함하고 있다.

프로피오니박테리움 애크니(Propionibacterium acnes)는 그람 양성 혐기성 균이나 혹은 호기성 간균 및 인간의 피부에 기생하는 미생물이다. 그러나, 어떤 환자에서 혈액 배양 시 종종 오염되곤 하는데 생명을 위협할 수 있는 감염원으로 인식되어 있다. 최근에, 본 발명자는 뜻밖에 심각한 프로피오니박테리움 애크니 감염이 증가함을 관찰하고, 임상적 미생물학적 특징들, 위험 인자 및 이들의 유기산 및 박테리오신 등을 자세히 연구하였다. 프로피오니박테리움 애크니는 여드름 부위에서 뿐만 아니라 정상 모피낭에서 압도적으로 우세한 미생물이다. 상기 세균은 여드름을 유발시키는 주 원인이 된다. 프로피오니박테리움 애크니스는 주화성 인자 및 염증을 유발시키는 친염증성 매개인자를 생산한다. 최근에, 젖산균 및 다른 식품 관련 세균에서 생산되는 박테리오신은 리스테리아 모노사이토제네스와 같은 식품 관련 병원균에 대한 억제능때문에 식품의 생물학적 보존제로서의 가능성에 대한 많은 연구들의 대상이 되어왔다.

한편, 여드름과 염증을 일으키는 프로피오니박테리움 애크니는 피부의 모낭관을 통하여 모낭 속으로 침입하여 모낭 깊숙이 서식하면서 피지를 분해, 유리지방산을 생성하고, 여기에 포도상구균의 2차 감염으로 붉게 부어오르고 고름이 생기게 된다.

이러한 여드름을 치료하기 위한 종래에는 주로 항생물질을 사용하거나, 차나무 오일, 로얄 젤리 추출물, 인삼 추출물과 같은 천연물을 사용하였다. 그러나, 항생물질을 이용할 경우, 내성을 갖는 균주가 발생할 수 도 있고, 발진이나 염증 등의 부작용이 발생할 수 도 있어 사용에 제한이 있다. 또한, 천연물을 사용할 경우, 천연물은 대부분 단일물질이 아니므로 피부치료제나 화장품에 응용 시 다른 물질을 추가로 첨가하면서 항균 활성이 급격히 떨어지는 문제점을 안고 있었다. 결국, 천연물로부터 부작용이 없고 여드름 유발원인균에 대해 항균 활성이 높은 물질을 분리하는 것이 필요하며, 여드름 유발 미생물을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 안전성이 높은 천연물질의 개발이 시급하다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 피부에서 박테리오신을 생산하는 엔테로코커스속을 분리 동정하고 생리적 특징들을 규명하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주에서 생산되는 박테리오신의 특징을 규명하고 그것의 여드름 치료제로서의 용도를 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 인간 피부에서 박테리오신을 생산하는 신규한 미생물을 분리하고 상기 균주로부터 생산된 박테리오신의 특성을 규명하고 여드름 유발균을 포함하여 다양한 미생물에 대한 항미생물 활성을 조사하여 상기 박테리오신의 여드름 치료제로서의 용도를 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 설명한다.

본 발명은 인간 피부에서 박테리오신을 생산하는 미생물을 분리 동정하는 단계; 상기 균주에서 생산된 박테리오신의 특성 조사 단계; 상기 박테리오신의 항미생물 활성 조사단계; 상기 박테리오신의 대량생산 단계; 본 발명 박테리오신을 포함한 항여드름 화장료 조성물의 제조단계로 구성된다.

본 발명은 인간 피부에서 분리하며, 항균 활성 특히 여드름유발 원인균에 대해 높은 항균 활성을 갖는 신규한 박테리오신을 생산하는 엔테로코커스속 균주를 제공하는 특징이 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주에서 분리한 항균 활성을 갖는 신규한 박테리오신을 함유하는 여드름 치료제용 약학적 조성물을 제공하는 특징이 있다.

본 발명의 특징은 항균 활성이 있는 엔테로신 HJ35를 적당한 비율로 화장료 즉, 스킨, 로션, 크림 등에 첨가하는 것이다. 바람직하게는, 엔테로신 HJ35는 0.1 내지 20.0 중량으로 첨가된다. 엔테로신 HJ35를 0.1 중량 이하로 첨가 시 그 효과가 충분하지 않으며, 20.0 중량 이상 첨가 시 첨가용량에 대한 효과의 차이가 효율적이지 않으며 자극을 야기할 수 도 있으므로 적합하지 않다. 따라서, 화장료에 엔테로신 HJ35를 첨가할 때에는 함량이 0.1 내지 20.0 중량이 바람직하다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 인간 피부에서 본 발명 박테리오신 생산 균주의 분리 및 동정

본 발명 인간 피부 유래의 박테리오신 생산균주를 분리하기 위해, 평균 16 ~ 25세의 한국인의 대상으로 남자 65명과 여자 14명의 피부에서 윌리엄 및 클릭맨의 분리방법에 따라 HJ17, HJ20 및 HJ35 균주를 분리하였다. 일반적인 도말방법에 따라, 0.05% 트리톤 X-100 용액으로 연속 희석하고 PAGSA 아가 플레이트에 도말하고 32℃에서 48시간 동안 혐기적 조건의 자(jar)에서 배양한 다음 이때 생긴 콜로니들을 신선한 NLB 아가 플레이트에 스트리킹하였다.

상기에서 얻은 균주들의 대상 균주에 대한 항균활성을 조사하기 위해 변형 디스크 페이퍼 방법에 따라 NLB 아가 플레이트 상에서 실시하였다. 상기에서 얻은 균주들을 32℃에서 48시간 동안 NLB 아가에서 증식시켰다. 오버레이 시, 약 1 x 10⁷세포 수의 대상 균주인 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) KCCM 10240를 포함하는 0.75%의 아가가 포함된 NLB 아가 5 mL을 1.5% NLB 아가 플레이트에 깔고 지표 균주의 최적 증식 온도에서 48 시간동안 배양하였다.

균주의 타이터(titer)는 억제 효과를 나타내는 가장 높은 희석량의 역수로 나타내며, mL 당 arbitrary units (AU)로 나타냈다.

항균 활성능은 할로(halo)의 직경(mm)으로 나타냈으며, 각 결과는 두 번 실험한 결과의 평균으로 나타냈다.

PAGSA 배지를 이용하여 인간 피부에서 3개의 균주, HJ17, HJ20 및 HJ35가 우수 균주로 분리되었다. 스팟 온 론 방법에 따라 이들 분리 균주들의 다양한 대상 균주들에 대한 항균활성을 시험하였다.

또한, 변형 디스크 페이퍼 방법에 따라 상기에서 분리한 균주들의 배양 상등액을 이용하여 부패균 및 병원균, 효모, 곰팡이를 포함하여 그람 양성균과 그람 음성균에 대한 항균활성을 조사하였다. 배양 상등액을 얻기 위해서, 분리 균주들을 종래의 증식배지에서 미리 종 배양한 다음 이를 0.75%의 아가를 포함한 NLB 브로스(pH 7.0)에 접종하고 32℃에서 24시간 동안 배양하고 이를 4℃에서 12,000 x g로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 0.22㎛ 크기의 셀룰로우즈 아세테이트 필터로 여과시켰다.

부패 및 병원성 미생물에 대한 박테리오신 상등액의 항균 활성

대상균주	배양배지	배양온도(℃)	균주
대상균주	배양배지	배양온도(℃)	HJ17	HJ20	HJ35
그람양성균 Lactobacillus delbrueckii KCCM 15808 Pediococcus acidilacticiKCTC 1626 Leuconostoc mesenteroides KCCM 11324 Lactococcus lactis KCCM 40104 Propionibacterium acidipropionici P200910 Bacillus subtilis IFO 12113 Bacillus subtilis BR 40 Bacillus pumilis Bacillus cereus Staphyloccous aureusKCCM 32359 Streptococcus mutans Lactococcus lactisKCCM 32406 Listeria monocytogenes Micrococcus flavusKCCM 10240 Propionibacterium acnesP1 Propionibacterium acnesP2 Propionibacterium acnesP3 Propionibacterium acnesP5 Propionibacterium acnes KCTC 3320 Propionibacterium acnes KCTC 5212 Propionibacterium acnesKCTC 3314	MRSMRSMRSMRSNLBNBNBNBNBNBBHIMRSTSB-YENBNLBNLBNLBNLBNLBNLBNLB	373725303037373730303730303030323232323232	---+----++---+-----++/-	+---+--+-++--++ ----+	+----+--+-+--++ ---+-
그람음성균 Escherichia coliKCCM 32396 Escherichia coli JM 109 Pseudomonas cepacia SBB 9611 Pseudomonas cepaciaSBA 9613 Pseudomonas fluorescens SBB 9631 Chryseomonas luteola SBA 9634	NBLBNBNBNBNBNB	30373030303030	- -----	--+----	-------
곰팡이 Aspergillus niger KCCM 11239 Aspergillus oryzae KCCM 11371	PDAPDA	2525	--	--	--

변형 디스크 방법에 따라 상기에서 분리한 균주들의 다양한 부패 및 병원성 미생물에 대한 항균 활성 범위를 측정한 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 상기 균주들은 대부분의 프로피오니박테리아 및 바실러스 균, 스타필로코커스 뮤탄스(Staphyloccous mutans) 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) KCCM 32406, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 그람 음성균에 이르는 비교적 넓은 활성 범위를 나타냈다. 그러나, HJ35 균주는 곰팡이에 대해서 억제활성을 나타내지 않았다. 또한, 균주 HJ17 및 HJ20 균주 역시 대부분의 세균에 대해 넓은 활성 범위를 나타내었다.

상기 균주들의 여러 효소에 대한 민감도를 조사하기 위해, 단백질 분해효소 I, IV, XIII, XIV, 펩신 A, 프로티나아제 K, 리보뉴클레아제 A, α-키모트립신(α-chymotrypsin), β-키모트립신(β-chymotrypsin) 및 α-아밀라아제(α-amylase)를 최종농도가 1 mg/mL이 되도록 균주에 처리하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 모든 효소들은 완충액으로 희석시키며, 효소 대신 완충액을 처리한 균주를 대조군으로 사용하였다.

배양 상등액의 여러 효소에 의한 민감성

효소	균주
효소	HJ17	HJ20	HJ35
대조군단백질분해효소 I단백질분해효소 XI단백질분해효소XIII단백질분해효소XIV단백질분해효소IV프로티네아제 K α-키모트립신 β-키모트립신	+ND+++-+++	+-+++++++	++++-++ND+

ND: 미검출

표 2에 나타난 바와 같이, 단백질분해효소 IV, I 및 XIV는 각각 HJ17, HJ20 및 HJ35 균주의 항균 활성을 소실케 하였다. 대상균주에 대해 어떠한 영향도 미치지 않는 다른 효소 용액을 처리한 경우, HJ17 및 HJ35에서는 활성 변화가 관찰되지 않았다.

상기 결과로 부터 본 발명자는 항균 활성이 가장 뛰어난 HJ35 균주를 주목하고 16 S rDNA 염기서열에 따른 계통학적 위치를 추적하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 균주 HJ35는 엔테로코커스 파에시움 속이 위치한 부분에 위치하였으며, 균주 HJ35의 16S rDNA 염기서열은 엔테로코커스 파에시움 AB028120와 97%의 유사성을 가지고 있었다.

또한, HJ35 균주를 희석하여 처리할 경우, 대상 균주의 억제환의 크기는 감소하여 플라크(plaque)를 나타내지 않았다. 이는 이러한 억제가 박테리오파지의 복제에 의해서 일어나는 것이 아님을 말하는 것이다.

HJ35 균주를 그람염색, 카탈라아제 테스트, 주사전자현미경 하에서 형태를 관찰한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 균주는 그람 양성이며, 비운동성이며 카탈라아제 양성이고 세포는 구균 타입이었다.

따라서, 본 발명자는 박테리오신 생산 균주로써 HJ35 균주를 동정하고 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) HJ35이라 명명한 다음, 상기 균주를 2003년 2월 5일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM-10465로 기탁하였다.

실시예 2: 본 발명 피부 유래 균주로부터 생산된 박테리오신의 동정

상기 실시예 1에 따라 다양한 미생물에 대해 항미생물 활성이 있는 인간 피부에서 분리한 본 발명 엔테로코커스 파에시움 HJ35으로부터 항미생물 활성원을 분리하였다. 우선, 본 발명 균주를 멸균한 30 mL의 NLB 브로스에 1%(v/v)으로 접종하고 종배양액(1%, v/v)을 5L-발효조(실용량 3L용: 한국발효기(주) 제품) 로 옮긴 다음, 32℃, pH 7.0±0.1, 150 rpm의 혐기성 조건에서 배양하였다. 7일 후 시료를 무균상태에서 수집하고 생존세포를 측정하고 시간대 별로 박테리오신의 활성을 조사하였다. 세포 증식은 광학현미경 하에서 관찰하고 배양 브로스의 박테리오신 활성은 실시예 1의 방법에 따라 평가하였다. 그 결과를 도 2와 도 3에 나타내었다.

도 2에서 (a)는 본 발명 박테리오신을 처리하지 않은 대수증식기의 프로피오니박테리움 애크니 P1이며, (b)는 본 발명 박테리오신을 처리한 대수증식기의 프로피오니박테리움 애크니 P1의 세포를 나타낸 현미경 사진도이다.

또한, 도 3의 흑색 원형으로 이루어진 곡선은 균체 증식곡선을 나타낸 그래프이고, 흰색 원형으로 된 곡선은 박테리오신의 활성을 나타낸 것이다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명 균주에서 생성된 박테리오신을 여드름 피부에서 주로 발견되는 프로피오니박테리아 애크니 P1에 처리한 결과, 형태적 변화 뿐만 아니라 살균효과를 나타내었다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명 균주에서 생성된 박테리오신은 여드름 피부에서 주로 발견되는 프로피오니박테리아 애크니 P1에 대해 억제 활성을 나타내었으며, 배양 후 7일 째에 1,600 AU/mL으로써 최고에 도달하였다. 또한, 박테리오신은 전형적인 1차 대산산물의 키네틱스(kinetics)를 보여주었다. 이후, 박테리오신의 활성이 급격히 감소하는 이유는 억제물질의 형성, 균체외 단백질분해효소에 의한 분해, 박테리오신과 균체 세포의 결합, 다른 균체외 산물과의 복합체 형성 등이 있을 것이다. 대부분의 젖산균의 박테리오신은 대수증식기 동안 생성된다. 또한, 몇몇 란티오닌계 물질들 역시 생산 균주의 대수증식기 동안 합성된다. 한편, 본 발명 균주 HJ35에 의한 박테리오신 생성이 비교적 빠른 것은 산업적으로 유용한 특징이 될 수 있으리라 사료된다.

실시예 3: 본 발명 균주로부터 생산된 박테리오신의 항균활성 조사

본 발명 균주로부터 생산되는 박테리오신의 항균활성을 조사하기 위해, 우선 박테리오신을 부분 정제하고 이를 엔테로신(enterocin) HJ35로 명명하였다.

본 발명 균주를 NLB 브로스에서 32℃에서 24시간 동안 증식시킨 다음, 세포를 모으고 배양 상등액으로부터 박테리오신을 암모늄 설페이트 침전법(75%, w/v)을 이용하여 분리하고 농축하였다. 4℃에서 추가로 1시간 동안 서서히 교반한 다음, 12,000 ×g에서 20분 동안 원심분리하여 침전물을 얻고, 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0)에서 재현탁하고 2L의 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 4℃에서 12~24 시간 동안 투석하였다. 투석된 시료는 -70℃에서 저장하였다.

그 결과, 엔테로신 HJ35의 활성은 51,200 AU/mL이었다.

상기에서 엔테로신 HJ35의 다양한 미생물에 대한 항균활성을 실시예 1의 방법에 따라 실시하였다.

변형 디스크 페이퍼 법에 따른 엔테로신 HJ35의 항미생물 활성 범위

대상균주	배양배지	배양온도(℃)	부분정제된엔테로신 HJ35
그람양성균 Lactobacillus delbrueckii KCCM 15808 Pediococcus acidilacticiKCTC 1626 Leuconostoc mesenteroides KCCM 11324 Lactococcus lactis KCCM 40104 Propionibacterium acidipropionici P200910 Bacillus subtilis IFO 12113 Bacillus subtilis BR 40 Bacillus pumilis Bacillus cereus Staphyloccous aureusKCCM 32359 Streptococcus mutans Lactococcus lactisKCCM 32406 Listeria monocytogenes Micrococcus flavusKCCM 10240 Propionibacterium acnesP1 Propionibacterium acnesP2 Propionibacterium acnesP3 Propionibacterium acnesP5 Propionibacterium acnes KCTC 3320 Propionibacterium acnes KCTC 5212 Propionibacterium acnesKCTC 3314	MRSMRSMRSMRSNLBNBNBNBNBNBBHIMRSTSB-YENBNLBNLBNLBNLBNLBNLBNLB	373725303037373730303730303030323232323232	+-+--++---+++++++/-^a --+-
그람음성균 Escherichia coliKCCM 32396 Escherichia coli JM 109 Pseudomonas cepacia SBB 9611 Pseudomonas cepaciaSBA 9613 Pseudomonas fluorescens SBB 9631 Chryseomonas luteola SBA 9634	NBLBNBNBNBNBNB	30373030303030	+++_- +++-
곰팡이 Aspergillus niger KCCM 11239 Aspergillus oryzae KCCM 11371	PDAPDA	2525	--

a: 불명확

표 3에 나타난 바와 같이, 상기 엔테로신 HJ35는 모든 비병원균 및 병원균에 대해 활성을 나타냈지만, 곰팡이에 대해서는 항균 활성을 나타내지 않았다. 또한, 젖산균, 엔테로코커스속, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 25923, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCCM 32359, 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) ATCC 12228, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) ATCC 3624, 바실러스속 균, 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) ATCC 10240, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) ATCC 15313, 리스테리아 이바노비(L. ivanovii) ATCC 19119, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) KCCM 32396, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) JM 109, 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 및 프로피오니박테리아 애크니(Propionibacterium acnes)에 대해 뚜렷한 활성을 나타내었다.

실시예 4: 본 발명 엔테로신 HJ35에 대한 효소, 열, pH 및 유기용매의 효과

본 발명 엔테로신 HJ35의 활성에 대한 효소, 열, pH 및 유기용매의 효과를 알아보기 위해, 본 발명 분리 균주인 엔테로코커스 파에시움 HJ35를 배양하여 정지기에서 얻은 배양 상등액을 사용하였다. 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) KCCM 10240를 대상 균주로 사용하였다.

엔테로신 HJ35의 효소에 의한 효과는 실시예 1의 방법에 따라 실시하였다.

엔테로신 HJ35의 열 안정성을 알아보기 위해, 박테리오신의 앨리쿼트에 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100℃ 에서 30분간, 그리고 121℃에서 15분간 열처리한 후 즉시 얼음에서 냉각시키고 항균활성을 시험하였다.

pH 안정성은 부분 정제한 박테리오신에 완충액(50 mM 시트레이트 완충액, pH 3-6; 50 mM 인산염 완충액, pH 7.0; 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 8-9)을 첨가하고 4℃에서 4시간 동안 유치한 후 측정하였다.

엔테로신 HJ35에 에탄올, 메탄올, 아세톤, 클로로포름 및 톨루엔과 같은 50% 유기용매를 처리하였다. 용매를 처리한 시료를 30℃에서 1시간 동안 배양한 다음 남아있는 용매는 30℃에서 2시간 동안 휘발시켰다. 이 경우, 용매를 첨가하지 않은 완충액을 넣은 엔테로신 HJ35를 대조군으로 하였다. 잔여 박테리오신의 활성은 스팟 온 론 방법에 따라 측정하였다. 상기 실험은 두 번 반복하여 그 결과를 나타내었다.

엔테로신 HJ35 활성에 대한 여러 효소의 효과

효소	잔여 활성(AU/mL)
대조군단백질분해효소 I단백질분해효소 IV단백질분해효소XIII단백질분해효소XIV펩신 A리보뉴클레아제 A α-키모트립신 β-키모트립신α-아밀라아제	51,20051,20051,20051,20080051,20051,20051,20051,20051,200

ND: 미검출

표 4에 나타난 바와 같이, 단백질분해효소 XIV를 처리한 경우 엔테로신 HJ35의 활성이 사라졌다. 엔테로신 HJ35에 다른 효소들(단백질분해효소 I, 단백질분해효소 IV, 단백질분해효소 XIII, 단백질분해효소 XIV, 펩신 A, 프로티나아제 K, 리보뉴클라아제 A, α-키모트립신, β-키모트립신 및 리파아제)을 처리한 경우 활성 변화는 관찰되지 않았다. 완충액과 효소용액 만을 처리한 경우 대상 균주에서는 어떠한 영향도 미치지 않았다. 엔테로신 HJ35에 리파아제 및 아밀라아제를 처리한 경우, 엔테로신 HJ35의 활성은 변하지 않았다. 이들 결과로부터, 항균물질이 단백질 성분임을 확인하였으며 지질이나 탄수화물 성분들이 박테리오신 활성에 필수적인 것은 아님을 알 수 있었다.

엔테로신 HJ35 활성에 대한 열, pH 및 유기용매의 효과

열 처리(℃)	잔여 활성(AU/mL)	pH	잔여 활성(AU/mL)	유기용매	잔여 활성(AU/mL)
대조군40^a 50^a 60^a 70^a 80^a 90^a 100^a 121^b	51,20051,20051,20051,20051,20051,20051,20051,2000	대조군3456789	51,20051,20051,20051,20051,20051,20051,20051,200	대조군에탄올메탄올아세톤클로로포름톨루엔	51,20051,20051,20051,20051,20051,200

a: 30분간 열처리 함.

b: 15분간 증기멸균함.

표 5에 나타난 바와 같이, 엔테로신 HJ35는 100℃에서 30분간 열 처리에 안정하였으며, 121℃ 에서 15분간 가열 시에는 불활성화되었다. 또한, 이러한 열 안정성은 억제작용이 박테리오파아지 때문일 가능성을 배제시켰다. 아마도, 열 안정성은 작은 구멍이 형성되었기 때문일 수 있다. 또한, 엔테로신 HJ35는 다양한 유기용매를 처리하여도 안정성을 나타냈다. 즉, 엔테로신 HJ35는 강한 소수성 부분과 안정한 가교결합 및 글리신 함량이 높은 구조를 가지고 있는 것 같다.

실시예 5: 본 발명 엔테로신 HJ35의 작용 기작

본 발명 엔테로신 HJ35가 살균 효과나 세균 생육억제 효과가 있는지를 측정하기 위해, 대수증식기에서 얻은 프로피오니박테리움 애크니 P1의 균체를 멸균한 100 mM 인산염 완충액(pH7.0)으로 현탁하고, 엔테로신 HJ35를 최종 농도가 500 AU/mL 및 1,000 AU/mL이 되도록 첨가하고 균체를 32℃에 놓아두었다. 배양 상등액을 첨가하여 실험하였다. 또한, 프로피오니박테리움 애크니 P1에 대한 엔테로신 HJ35의 증식 억제를 연구하였다. 표준 플레이트 카운팅 방법에 따라 NLB 아가 플레이트 상에서 생존 균수(CFU/mL)를 측정하였다.

도 4에서 흑색 네모로 이루어진 곡선은 대조군을, 흑색 원형은 500 AU/mL 처리를, 흰색 원형은 1000 AU/mL의 엔테로신 HJ35를 처리한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명 엔테로신 HJ35를 여드름 유발균에 처리한 결과 엔테로신 HJ35의 농도에 의존적으로 대상 균체의 CFU/mL이 감소함으로써 항균 작용을 나타냈다.

실시예 6: 본 발명 엔테로신 HJ35의 분자량 측정

본 발명 엔테로신 HJ35의 분자량을 측정하기 위해, Laemmli의 방법에 따라 18% 불연속 젤을 이용하여 SDS-PAGE (소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 젤 일렉트로포레시스, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다. 단백질을 전기영동한 다음, 쿠마시 브릴리안트 블루 R-250으로 염색하였다. 표준 단백질과 분자량은 다음과 같다: 오브알부민(ovalbumin), 43,000; 카보닉 언하이드라아제(carbonic anhydrase), 29,000; 락토글로불린(lactoglobulin), 18,400; 라이소자임(lysozyme), 14,300; 보바인 트립신 인히비터(bovine trypsin inhibitor), 6,200; 및 인슐린(insulin), 3,000. 엔테로신 HJ35와 완충액을 1:1 비율로 혼합하고 100℃에서 5분간 끓였다.

일정 전압(150V)의 완충시스템 하에서, 3시간 동안 버티칼 슬랩 젤 장치(Protein Cell Ⅱ; 미국 바이오래드 사)에서 전기영동을 실시하였다.

분석할 젤 부분을 고정용액에서 2시간 동안 고정시키고 멸균 증류수에서 4시간 동안 놓아둔 다음, 멸균한 페트리 디쉬에 무균상태로 놓고 1 x 107의 대상 균주 M. flavus KCCM 10240를 포함한 20 mL 아가로 덮었다. 상기 플레이트를 32℃에서 12시간 동안 배양하고 억제환을 조사하였다.

또한, 직접 살균 활성을 알아보기 위해, Daba의 방법에 따라 PVDF 막으로의 일렉트로블랏팅을 실시하였다.

우선, 두개의 고형 일렉트로드 플레이트가 7 cm 떨어져 장착되어 있는 탱크 트랜스퍼 장치를 이용하여 0.2% SDS를 포함한 적절한 퍼센트의 램리 젤에서 보유능이 큰 프로블랏(바이오시스템 사), 트랜스 블랏(바이로래드 사)과 같은 PVDF 멤브레인으로 단백질을 일렉트로블랏팅을 하였다. 간단히 설명하자면, 전기영동 후 전기영동장치에서 젤을 분리하고 즉시 트랜스퍼 완충액으로 옮기고 15분 동안 놓아두었다. 유리접시에서 100% 메탄올로 적셔 둔 PVDF 멤브레인을 트랜스퍼 완충액을 포함하는 트레이로 옮겨 5분 동안 놓아두었다. 그 후 젖은 스폰지, 다공질 폴리에틸렌 시트, 젤, 미리 적셔둔 PVDF 멤브레인, 백업 PVDF 멤브레인(선택적), 젖은 여과지 및 젖은 스폰지(양극쪽)를 조립하여 트랜스퍼 "샌드위치" 를 제작하였다. 비록 상기 장치에는 트랜스퍼 샌드위치를 3개까지 넣을 수 있지만, 구조적 분석을 위해서 중간 슬랏에 트랜스퍼 샌드위치를 놓고 일정 시간에 시료 하나 만을 트랜스퍼하였다. 전극 완충액은 10 mM Tris 염, 100 mM 글리신, 및 10% 메탄올을 포함하며 pH는 조정하지 않았지만 대략 8.3이었다. 일렉트로트랜스퍼는 2 ~3 시간 동안 150 mA의 일정 전류 하에서 실시하였다. PVDF 멤브레인을 공기 중에서 건조시키고 플라스틱 백에 밀봉하여 -20℃에서 보관하였다. 트랜스퍼 후, 젤은 쿠마시 브릴리안트 블루로 염색하여 전기영동한 젤 상에서 남아있는 단백질이 있는 지를 알아보았다.

단백질의 농도는 Lowry 법에 따라 정량하였으며 표준 단백질로 보바인 씨럼 알부민을 사용하였다.

도 5의 (a)는 본 발명 엔테로신 HJ35의 분자량을 측정하기 위한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이고, (b)는 대상 균주로 오버레이한 젤 사진도를 나타낸 것이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명 엔테로신 HJ35의 항균 활성은 약 4-4.5 kDa의 밴드에서 나타났다. 따라서, SDS-PAGE 후 직접 항균활성을 측정함으로써 본 발명 엔테로신 HJ35의 분자량은 약 4-4.5 kDa으로 결정하였다.

실시예 7: 본 발명 엔테로신 HJ35의 대량생산방법

본 발명 엔테로신 HJ35의 생산성을 높이기 위해 회분식 배양과 유가식 배양(fed-batch fermentation culture)을 실시하였다.

소규모 회분식 배양을 위해서, 발효 배지는 기질로써 1.2% 소듐 락테이트를 포함한 MLB로 하였다. NLB에 1%(v/v) 접종한 다음 32℃에서 24시간 동안 발효시켰다. 이때 3 M NaOH를 첨가하여 pH를 7.0±0.1으로 유지시켰다. 교반 속도는 150 rpm으로 하여 혐기 조건 하에서 발효시켰다.

유가식 발효는 회분식 발효로 시작하여 250 시간까지 배양하였다. 발효조에서 NLB 브로스에 1%(v/v)으로 접종하고 32℃, pH 7.0의 조건에서 발효시키며, 글루코우즈와 젖산은 배양 후 약 48시간 째에 처음 공급하고 12시간 마다 첨가하였다.

도 6에서 흰색 원형으로 된 곡선은 균체 증식곡선을, 흑색 원형은 박테리오신의 활성을, 흑색 세모는 젖산 처리 후 결과를 나타낸 것이다.

도 6에 나타난 바와 같이, 최대 생균수와 포자수는 32℃, pH 7.0 및 150 rpm 에서 나타났다. 회분식 발효에서 전형적인 균체 증식 및 포자 생성을 나타냈다. 회분식 배양은 최대 2,300 AU/mL 까지 이른다.

도 7과 도 8에 나타난 바와 같이, 10 g/L(w/v) 글루코우즈 및 6 g/L(w/v) 젖산을 첨가할 경우 균체 증식이 증가함을 볼 수 있었다. 각각 최대 12,800 AU/mL 까지 얻었으며, 접종 후 24시간부터 시작하여 60시간까지 계속되었다. 48시간 간격으로 글루코우즈와 젖산 농도는 배지 내에서 약 10 g/L 의 글루코우즈와 6 g/L 의 젖산의 최종농도에 도달하였다. 발효조의 실용량은 거의 일정하였다. 이는 글루코우즈 및 젖산을 첨가하여 시료의 부피가 균형을 이루고 있기 때문이다. 글루코우즈가 첨가되었을 때 빠르게 소비되었으며, 공급율은 pH 7.0을 유지하도록 하면서 실시하였다. 이때, 도 7의 흑색 원형은 균체 증식곡선을, 흑색 세모는 박테리오신의 활성을, 흰색 원형은 글루코우즈 처리 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 8의 흑색 원형은 균체 증식곡선을, 흑색 세모는 박테리오신의 활성을, 흰색 원형은 젖산 처리 결과를 나타낸 것이다.

실시예 8 ~ 11: 본 발명 엔테로신 HJ35를 함유한 화장료 조성물

상기 실시예 7의 회분식 혹은 유가식 배양을 통해 대량생산한 엔테로신 HJ35를 부분 정제하고, 표6의 조성으로 화장료 조성물을 제조하였다. 우선, 유상성분과 수상성분을 각각 80℃까지 완전용해한 후 수상과 유상을 별도의 용해조에서 3,000 rpm으로 5분 간 유화시킨 후, 45℃까지 냉각 및 탈포한 다음 본 발명 엔테로신 HJ35를 첨가하여 마지막으로 30℃까지 냉각하여 숙성하였다. 대상 균주로써 여드름 유발원인균인 프로피오니 애크니 P1를 선택하여 패트리 디쉬에 부어 굳히고 윗부분에는 배양한 여드름균을 접종하고 직경 20 mm의 종이접시에 준비된 샘플을 500 ㎛씩 올려 놓았다. 37℃의 혐기조건에서 2일 간 배양한 후 억제부위(inhibition zone)의 직경을 측정하여 결과를 얻었다.

성분	실시예 8	실시예 9	실시예 10	실시예 11
디소듐 EDTA	0.05	좌동	좌동	좌동
메틸 파라벤	1.0	좌동	좌동	좌동
글리세린	2.5	좌동	좌동	좌동
1,3-부틸 글리콜	2.5	좌동	좌동	좌동
잔탄 검	0.06	좌동	좌동	좌동
프로필 파라벤	0.5	좌동	좌동	좌동
세토스테아릴 알콜	3	좌동	좌동	좌동
피마자유	0.4	좌동	좌동	좌동
글리세릴 스테아르산	2	좌동	좌동	좌동
네오펜틸 글리콜디카프레이트	5	좌동	좌동	좌동
스쿠알렌	2	좌동	좌동	좌동
사이클로메티콘	2.5	좌동	좌동	좌동
향	0.5	좌동	좌동	좌동
에탄올	3	좌동	좌동	좌동
엔테로신 HJ35	0.1	1.0	10.0	20.0
정제수	100으로채움	100으로채움	100으로채움	100으로채움

구분	실시예 8	실시예 9	실시예 10	실시예 11
엔테로신 HJ35 함량	0.1	1.0	10.0	20.0
억제부위 직경(mm)	10	30	45	55

표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명 엔테로신 HJ35를 포함한 화장료 조성물은 여드름유발원인균에 대해 농도 의존적으로 항균 효과를 뚜렸하게 나타내고 있었다.

이상, 상기 실시예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인간 피부에 분리한 박테리오신을 생산하는 신규한 엔테로코커스 파에시움 HJ35를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명 균주로부터 생산된 엔테로신 HJ35는 항미생물 활성 범위가 넓고 살균작용양식을 나타내며 열 안정성이 있고 다양한 pH에서 안정하며 각종 유기용매에도 안정한 특징이 있다. 특히, 본 발명 엔테로신 HJ35은 여드름 유발균인 프로피오니박테리움 애크니에 대해 뚜렷한 항균 활성을 갖는 특징이 있다. 따라서, 본 발명은 인간 피부에서 분리한 신규한 균주로부터 항균활성이 있는 박테리오신을 생산하여 이를 유효성분으로 함유하는 여드름 치료제로 사용할 수 있어 약학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 HJ35 균주 및 분류학적으로 유사한 몇몇 대표종을 보여주는 16S rDNA 염기서열에 따른 계통수를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명 HJ35 균주를 프로피오니박테리움 애크니 P1에 처리한 후 주사전자현미경 하에서 관찰한 사진도이다.

도 3은 본 발명 HJ35 균주의 증식곡선 및 프로피오니박테리움 애크니 P1에 대한 억제능을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명 박테리오신의 프로피오니박테리움 애크니 P1에 대한 처리 농도에 따른 억제능을 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명 박테리오신의 분자량 측정을 위한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명 HJ35 균주의 회분식 발효배양 시 증식능을 나타낸 그래프이다.

도 7은 글루코우즈를 첨가한 후 본 발명 HJ35 균주의 유가식 배양(Fed-batch culture) 시 증식능을 나타낸 그래프이다.

도 8은 젖산을 첨가한 후 본 발명 HJ35 균주의 유가식 배양(Fed-batch culture) 시 증식능을 나타낸 그래프이다.

Claims

항균활성을 갖는 하기 (a) 내지 (d)와 같은 특징을 가지는 엔테로신 HJ35를 생산하는 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium) HJ35 KCCM 10465.

(a) SDS-PAGE 측정 분자량 4 내지 4.5 kDa

(b) 온도 40 내지 100℃에서 30분 동안 안정

(c) pH 3 내지 9에서 4시간 동안 안정

(d) 에탄올, 메탄올, 아세톤, 클로로포름 또는 톨루엔의 유기용매에 안정
엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium) HJ35 KCCM 10465에 의해 생산되고, 하기 (a) 내지 (d)와 같은 특징을 가지는 엔테로신 HJ35을 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 항여드름 화장료 조성물.

(a) SDS-PAGE 측정 분자량 4 내지 4.5 kDa

(b) 온도 40 내지 100℃에서 30분 동안 안정

(c) pH 3 내지 9에서 4시간 동안 안정

(d) 에탄올, 메탄올, 아세톤, 클로로포름 또는 톨루엔의 유기용매에 안정
제 2항에 있어서, 상기 엔테로신 HJ35를 0.1 ~ 20 중량%의 함량으로 배합하는 것을 특징으로 하는 항여드름 화장료 조성물.
엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium) HJ35 KCCM 10465를 NLB 배지에 1%(v/v)로 접종하여 32℃, 150 rpm의 혐기 조건 하에서 발효시키고 배양 2일째에 10 g/L(w/v)의 글루코우즈 및 6 g/L(w/v)의 젖산을 첨가한 다음 다시 배양하여 상기 배양물로부터 하기 (a) 내지 (d)와 같은 특징을 가지는 엔테로신 HJ35를 얻는 과정을 포함함을 특징으로 하는 엔테로신 HJ35의 대량생산방법.

(a) SDS-PAGE 측정 분자량 4 내지 4.5 kDa

(b) 온도 40 내지 100℃에서 30분 동안 안정

(c) pH 3 내지 9에서 4시간 동안 안정

(d) 에탄올, 메탄올, 아세톤, 클로로포름 또는 톨루엔의 유기용매에 안정