JPH05178895A - シクロヘキサペプチド化合物 - Google Patents
シクロヘキサペプチド化合物Info
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- JPH05178895A JPH05178895A JP3216759A JP21675991A JPH05178895A JP H05178895 A JPH05178895 A JP H05178895A JP 3216759 A JP3216759 A JP 3216759A JP 21675991 A JP21675991 A JP 21675991A JP H05178895 A JPH05178895 A JP H05178895A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 式
【化５】
のシクロヘキサペプチド及びその酸付加塩。
【効果】 抗微生物活性を有する新しい半合成化合物の
製造のための中間体として有用である。
製造のための中間体として有用である。
Description
【０００１】本発明は構造式
【化３】 で表わすことのできるシクロヘキサペプチド塩基及びそ
の酸付加塩に関する。この化合物は抗真菌特性をもつ半
合成化合物の製造における有用な中間物質である。この
シクロヘキサペプチドは１−（４，５−ジヒドロキシ−
Ｌ−オルニチン）−５−（３−ヒドロキシ−Ｌ−グルタ
ミン）−６−（３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）エキノ
カンジンＢ（以後、化合物１と呼ぶ）と命名し得る。化
合物Ｉの実験式は C34H50N8O16であり、分子量は８２６
である。
の酸付加塩に関する。この化合物は抗真菌特性をもつ半
合成化合物の製造における有用な中間物質である。この
シクロヘキサペプチドは１−（４，５−ジヒドロキシ−
Ｌ−オルニチン）−５−（３−ヒドロキシ−Ｌ−グルタ
ミン）−６−（３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）エキノ
カンジンＢ（以後、化合物１と呼ぶ）と命名し得る。化
合物Ｉの実験式は C34H50N8O16であり、分子量は８２６
である。
【０００２】化合物Ｉは酸付加塩類の形態で保存でき
る。塩を形成する代表的な酸には、塩酸、臭化水素酸、
ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、安息香酸、スルフ
ァミン酸、酒石酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、
アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、パル
ミチン酸、コール酸、パモ酸、粘液酸、Ｄ−グルタミン
酸、Ｄ−ショウノウ酸、グルタル酸、フタル酸、ラウリ
ン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、
ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、ケイ皮
酸等が含まれる。化合物Ｉとその塩は抗真菌特性を持つ
半合成化合物の製造における中間物質として役立つ。
る。塩を形成する代表的な酸には、塩酸、臭化水素酸、
ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、安息香酸、スルフ
ァミン酸、酒石酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、
アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、パル
ミチン酸、コール酸、パモ酸、粘液酸、Ｄ−グルタミン
酸、Ｄ−ショウノウ酸、グルタル酸、フタル酸、ラウリ
ン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、
ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、ケイ皮
酸等が含まれる。化合物Ｉとその塩は抗真菌特性を持つ
半合成化合物の製造における中間物質として役立つ。
【０００３】本発明のもう１つの対象は、構造式（II）
【化４】 を有し、以後化合物IIと呼ばれる化合物の脱アシル化に
より、上記シクロヘキサペプチド塩基化合物Ｉを得る方
法である。
より、上記シクロヘキサペプチド塩基化合物Ｉを得る方
法である。
【０００４】以下に述べる化合物IIの製造については、
１９８９年６月３０日提出の出願Ｓ．Ｎ．３７４，４１
６号、１９９０年３月１２日提出の出願Ｓ．Ｎ．第４９
２，０２５号及び１９９０年３月１２日提出のＳ．Ｎ．
第４９２，０２６号（Attorney Docket No. １８０８
２）により詳細に説明されかつ特許請求の範囲に記載さ
れており、そこに開示されている製造法、分離法及び特
性は、それらを参照することによりその内容をここに組
入れたものとする。
１９８９年６月３０日提出の出願Ｓ．Ｎ．３７４，４１
６号、１９９０年３月１２日提出の出願Ｓ．Ｎ．第４９
２，０２５号及び１９９０年３月１２日提出のＳ．Ｎ．
第４９２，０２６号（Attorney Docket No. １８０８
２）により詳細に説明されかつ特許請求の範囲に記載さ
れており、そこに開示されている製造法、分離法及び特
性は、それらを参照することによりその内容をここに組
入れたものとする。
【０００５】化合物Ｉは、水性培地、すなわちバッファ
溶液中の、ジメチルスルホキシドによって可溶化した化
合物IIを、アクチノプラーネス科（Actinoplanaceae)又
はシュードモナス科（Pseudomondaceae)の微生物、ある
いは組みかえＤＮＡ技術により脱アシル化酵素を産生す
るようにした微生物より得られる、もしくはそれらの処
置しない細胞内に存在する脱アシル化酵素で処理するこ
とによって製造することができる。脱アシル化はカンデ
ィダ・アルビカンス（Candida albicans) アッセイ又は
高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によってモニ
ターすることができるので、基質（化合物II）の抗カン
ディダ活性の消滅又は生成物（化合物Ｉ）の出現を示標
として、脱アシル化が完了するまで反応を継続すること
ができる。
溶液中の、ジメチルスルホキシドによって可溶化した化
合物IIを、アクチノプラーネス科（Actinoplanaceae)又
はシュードモナス科（Pseudomondaceae)の微生物、ある
いは組みかえＤＮＡ技術により脱アシル化酵素を産生す
るようにした微生物より得られる、もしくはそれらの処
置しない細胞内に存在する脱アシル化酵素で処理するこ
とによって製造することができる。脱アシル化はカンデ
ィダ・アルビカンス（Candida albicans) アッセイ又は
高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によってモニ
ターすることができるので、基質（化合物II）の抗カン
ディダ活性の消滅又は生成物（化合物Ｉ）の出現を示標
として、脱アシル化が完了するまで反応を継続すること
ができる。
【０００６】その後化合物Ｉは、得られた発酵ブロスを
遠心し、上澄を回収し、そして「ダイヤイオン」ＨＰ−
２０又はＳＰ−２０７樹脂（それぞれスチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体と臭化スチレン−ジビニルベンゼン
共重合体である。三菱化成ＫＫ）にその上澄を通してカ
ラムに化合物Ｉを保持し、その後まず脱イオン水でカラ
ムを洗浄した後、メタノールで溶離して溶離液中に化合
物Ｉを回収することによって、得られた発酵ブロスより
単離できる。溶離したフラクションをまとめてから濃縮
して未精製の化合物Ｉを得る。これを、以下によりくわ
しく述べる陽イオン交換ＨＰＬＣによってさらに精製す
ることができる。
遠心し、上澄を回収し、そして「ダイヤイオン」ＨＰ−
２０又はＳＰ−２０７樹脂（それぞれスチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体と臭化スチレン−ジビニルベンゼン
共重合体である。三菱化成ＫＫ）にその上澄を通してカ
ラムに化合物Ｉを保持し、その後まず脱イオン水でカラ
ムを洗浄した後、メタノールで溶離して溶離液中に化合
物Ｉを回収することによって、得られた発酵ブロスより
単離できる。溶離したフラクションをまとめてから濃縮
して未精製の化合物Ｉを得る。これを、以下によりくわ
しく述べる陽イオン交換ＨＰＬＣによってさらに精製す
ることができる。
【０００７】活性化した適当な脂肪酸エステルによって
アシル化した場合、溶離物質はカンディダ・アルビカン
ス（Candida albicans) 及び他の真菌類に対し活性のあ
る化合物に転換される。このように、本発明の生成物は
抗真菌剤の製造における中間物質として有用である。こ
れらの薬剤の製造及び特性については１９９０年３月１
２日の出願Ｓ．Ｎ．４９２，０１２号が主題としてい
る。
アシル化した場合、溶離物質はカンディダ・アルビカン
ス（Candida albicans) 及び他の真菌類に対し活性のあ
る化合物に転換される。このように、本発明の生成物は
抗真菌剤の製造における中間物質として有用である。こ
れらの薬剤の製造及び特性については１９９０年３月１
２日の出願Ｓ．Ｎ．４９２，０１２号が主題としてい
る。
【０００８】出発物質の製造 脱アシル化の出発物質である化合物IIは、ザレビオン
アルボリコラ（Zalerion arboricola)ＡＴＣＣ２０８６
８又はその突然変異体を栄養培地で化合物IIが生成され
るまで培養し、その後メタノールで菌子体又はブロス全
体のいずれかを抽出することで化合物IIを栄養培地から
回収し、抽出物から溶媒をとりのぞいて残留物をとり出
し、そしてその後残留物を適当な溶媒に溶解してクロマ
トグラフィーによって分離して溶離液中の化合物IIを回
収することによって得ることができる。
アルボリコラ（Zalerion arboricola)ＡＴＣＣ２０８６
８又はその突然変異体を栄養培地で化合物IIが生成され
るまで培養し、その後メタノールで菌子体又はブロス全
体のいずれかを抽出することで化合物IIを栄養培地から
回収し、抽出物から溶媒をとりのぞいて残留物をとり出
し、そしてその後残留物を適当な溶媒に溶解してクロマ
トグラフィーによって分離して溶離液中の化合物IIを回
収することによって得ることができる。
【０００９】ザレビオン アルボリコラ（Zalevion arb
oricola)ＡＴＣＣ２０８６８については上記出願Ｓ．
Ｎ．３７４，４１６号及びＳ．Ｎ．第４９２，０２５号
に説明されており、それらの開示は、それらを参照する
ことによりここにその内容を組入れたこととする。それ
は、American Type Culture Collection（12301 Parkla
wn Drive, Rockville, MD 20852 ）から入手できる。特
別な突然変異体Ｚ．アルボリコラ（Z. arboricola)ＡＴ
ＣＣ２０９５７が出発物質である化合物IIを選択的に得
るのにとりわけ有用であることがわかっている。この突
然変異体及び化合物IIの生成と分離におけるその使用法
については、出願Ｓ．Ｎ．４９２，０２４が主題として
いる。これらの出願の教示は、それらを参照することに
よりその内容をここに組入れたものとする。化合物IIの
生成に有用な栄養培地は、炭素、窒素及び無機塩類を供
給するものである。炭素の供給源はグリセリン、糖類、
糖アルコール、デンプン、炭化水素誘導体であってもよ
く、またオート麦粉、トウモロコシ粉、キビ等の複合栄
養物でもよい。窒素の供給源はアンモニウム塩、又はグ
リシン、トレオニン、メチオニン等のアミノ酸でもよい
し、又イーストの加水分解物、イースト抽出物、コーン
スティープリカー、粉末綿実粕等の複合供給源でもよ
い。無機栄養は、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、リン酸塩、塩酸塩、炭酸塩等の通常の塩、及び
トレース金属として供給される。とくに重要な塩はアン
モニウム塩及び一塩基性のカリウムリン酸塩である。
oricola)ＡＴＣＣ２０８６８については上記出願Ｓ．
Ｎ．３７４，４１６号及びＳ．Ｎ．第４９２，０２５号
に説明されており、それらの開示は、それらを参照する
ことによりここにその内容を組入れたこととする。それ
は、American Type Culture Collection（12301 Parkla
wn Drive, Rockville, MD 20852 ）から入手できる。特
別な突然変異体Ｚ．アルボリコラ（Z. arboricola)ＡＴ
ＣＣ２０９５７が出発物質である化合物IIを選択的に得
るのにとりわけ有用であることがわかっている。この突
然変異体及び化合物IIの生成と分離におけるその使用法
については、出願Ｓ．Ｎ．４９２，０２４が主題として
いる。これらの出願の教示は、それらを参照することに
よりその内容をここに組入れたものとする。化合物IIの
生成に有用な栄養培地は、炭素、窒素及び無機塩類を供
給するものである。炭素の供給源はグリセリン、糖類、
糖アルコール、デンプン、炭化水素誘導体であってもよ
く、またオート麦粉、トウモロコシ粉、キビ等の複合栄
養物でもよい。窒素の供給源はアンモニウム塩、又はグ
リシン、トレオニン、メチオニン等のアミノ酸でもよい
し、又イーストの加水分解物、イースト抽出物、コーン
スティープリカー、粉末綿実粕等の複合供給源でもよ
い。無機栄養は、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、リン酸塩、塩酸塩、炭酸塩等の通常の塩、及び
トレース金属として供給される。とくに重要な塩はアン
モニウム塩及び一塩基性のカリウムリン酸塩である。
【００１０】出発物質である化合物IIの製造を実施する
際には、発酵用培地に、冷凍した栄養培地菌子体又は
Ｚ．アルボリコラのかんてん傾斜培地から通常の方法で
用意した培養成長物を接種して、この発酵生成用培地を
３日ないし３０日間、振とうしながら又は振とうせずに
約２０℃〜４０℃の範囲の温度で、約5.０〜8.５の範囲
のpHでインキュベートする。培養期が終りに、発酵を固
形培地で行なった場合には培地に、又液体培地で行なっ
た場合には全ブロスに、アルカノールを加えて活性成分
を回収する。水性アルカノール溶液を濾過して固形不純
物をとりのぞいた後に、「ダイヤイオン」ＨＰ−２０又
は同様のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体に吸着さ
せて、その後１００％アルカノールで溶離する。この操
作をくりかえしてもよい。そして分離した未精製の混合
物をシリカゲル等の非イオン樹脂を有する通常のカラム
クロマトグラフィーを用いて、又は逆相樹脂を用いた高
性能液体クロマトグラフィーもしくはその両者を組み合
わせたものによって、クロマトグラフィーによる分離に
かける。シリカゲルを用いた場合にはエステル／アルコ
ール混合物がよい分離をもたらし、デキストラン吸着剤
を用いた場合にはクロロ炭化水素／炭化水素／アルコー
ル系が役立つ。抗生物性化合物IIを含むフラクションは
カンディダ・アルビカンス（Candida albicans) を用い
た抗真菌アッセイ又は前もって決定された基準と対照す
る分析ＨＰＬＣによって検出される。活性を示すフラク
ションをまとめて濃縮し、未精製の化合物IIを得る。こ
れをさらにクロマトグラフィー等の通常の技術を用いて
精製してもよい。化合物IIを酵素脱アシル反応に先だっ
て滅菌するのが望ましいが一般にこれは必要ではない。
化合物IIはこの脱アシル化の工程において基質であるの
で、この工程を論ずる際には化合物IIを単に基質と呼
ぶ。化合物IIの生成及び単離の詳細については、前記出
願中に記載されているが、それらの教示は、ここにそれ
らを参照することにより、それらの内容をここに組入れ
たものとする。
際には、発酵用培地に、冷凍した栄養培地菌子体又は
Ｚ．アルボリコラのかんてん傾斜培地から通常の方法で
用意した培養成長物を接種して、この発酵生成用培地を
３日ないし３０日間、振とうしながら又は振とうせずに
約２０℃〜４０℃の範囲の温度で、約5.０〜8.５の範囲
のpHでインキュベートする。培養期が終りに、発酵を固
形培地で行なった場合には培地に、又液体培地で行なっ
た場合には全ブロスに、アルカノールを加えて活性成分
を回収する。水性アルカノール溶液を濾過して固形不純
物をとりのぞいた後に、「ダイヤイオン」ＨＰ−２０又
は同様のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体に吸着さ
せて、その後１００％アルカノールで溶離する。この操
作をくりかえしてもよい。そして分離した未精製の混合
物をシリカゲル等の非イオン樹脂を有する通常のカラム
クロマトグラフィーを用いて、又は逆相樹脂を用いた高
性能液体クロマトグラフィーもしくはその両者を組み合
わせたものによって、クロマトグラフィーによる分離に
かける。シリカゲルを用いた場合にはエステル／アルコ
ール混合物がよい分離をもたらし、デキストラン吸着剤
を用いた場合にはクロロ炭化水素／炭化水素／アルコー
ル系が役立つ。抗生物性化合物IIを含むフラクションは
カンディダ・アルビカンス（Candida albicans) を用い
た抗真菌アッセイ又は前もって決定された基準と対照す
る分析ＨＰＬＣによって検出される。活性を示すフラク
ションをまとめて濃縮し、未精製の化合物IIを得る。こ
れをさらにクロマトグラフィー等の通常の技術を用いて
精製してもよい。化合物IIを酵素脱アシル反応に先だっ
て滅菌するのが望ましいが一般にこれは必要ではない。
化合物IIはこの脱アシル化の工程において基質であるの
で、この工程を論ずる際には化合物IIを単に基質と呼
ぶ。化合物IIの生成及び単離の詳細については、前記出
願中に記載されているが、それらの教示は、ここにそれ
らを参照することにより、それらの内容をここに組入れ
たものとする。
【００１１】脱アシル化 Ａ．脱アシル化酵素 脱アシル化に有用な酵素はアクチノプラーネス科（Acti
noplanaceae)及びシュードモナス科（Pseudomondaceae)
のある種の微生物によって産生される。シュードモナス
科（Pseudomondaceae)の微生物とくにＰ．アシドボラン
ス（Pseudomomas acidovorans)及びＰ．ディミヌタ（Ps
eudomomas diminuta) が好ましい。
noplanaceae)及びシュードモナス科（Pseudomondaceae)
のある種の微生物によって産生される。シュードモナス
科（Pseudomondaceae)の微生物とくにＰ．アシドボラン
ス（Pseudomomas acidovorans)及びＰ．ディミヌタ（Ps
eudomomas diminuta) が好ましい。
【００１２】アクチノプラーネス科（Actinoplanaceae)
の酵素はペニシリンの脱アシル化に用いる米国特許第
３，１５０，０５９号記載の酵素あるいは米国特許第
４，２９９，７６３号記載の酵素と同じものであり得
る。用いることのできるアクチノプラーネス科（Actino
planaceae)の種及び変種のうちには、Ａ．フィリピネン
シス（Actinoplanes philippinensis)、Ａ．アルメニア
クス（Actinoplanes armeniacus)、Ａ．ウタヘンシス
（Actinoplanes utahensis) 、及びＡ．ミズ−リンシス
（Actinoplanes missouriensis) ；スピリロスポラ ア
ルビダ（Spirillosporaalbida) ；ストレプトスポラン
ギウム ロゼウム（Streptosporiangium roseum)、Ｓ．
ブルガレ（Streptosporangium vulgre) 、ストレプトス
ポランギウム ロゼウムの変種のホランデンシス（holl
andensis) 、Ｓ．アルブム（Streptosporangium albu
m)、Ｓ．ビリジアルブム（Streptosporangium viridial
bum)、アモルスポランギウム ラリエラ レグラリス
（Amorphosporangium lariella regularis) 、アンプラ
リエラ カンパヌラタ（Ampullariella campanulata)、
Ａ．ロバータ（Ampullariella lobata) 、Ａ．ジギター
タ（Ampullariella digitata) ；ピリメリア テレバサ
（Pilimelia terevasa) 、Ｐ．アヌラタ（Pilimelia an
ulata)；プラノモノスポラ・パロントスポラ（Planomon
ospora parontospora)、Ｐ．ベネズエレンシス（Planom
onospora venezuelensis) 、プラノビスポラ ロンギス
ポラ（Planobispora longispora)；Ｐ．ロゼア（Planob
ispora rosea) ；ダクチロスポランギウム アウランチ
アクム（Dactylosporangium aurantiacum)及びＤ．タイ
レンデンセ（Dactylosporangium thailendense) があ
る。
の酵素はペニシリンの脱アシル化に用いる米国特許第
３，１５０，０５９号記載の酵素あるいは米国特許第
４，２９９，７６３号記載の酵素と同じものであり得
る。用いることのできるアクチノプラーネス科（Actino
planaceae)の種及び変種のうちには、Ａ．フィリピネン
シス（Actinoplanes philippinensis)、Ａ．アルメニア
クス（Actinoplanes armeniacus)、Ａ．ウタヘンシス
（Actinoplanes utahensis) 、及びＡ．ミズ−リンシス
（Actinoplanes missouriensis) ；スピリロスポラ ア
ルビダ（Spirillosporaalbida) ；ストレプトスポラン
ギウム ロゼウム（Streptosporiangium roseum)、Ｓ．
ブルガレ（Streptosporangium vulgre) 、ストレプトス
ポランギウム ロゼウムの変種のホランデンシス（holl
andensis) 、Ｓ．アルブム（Streptosporangium albu
m)、Ｓ．ビリジアルブム（Streptosporangium viridial
bum)、アモルスポランギウム ラリエラ レグラリス
（Amorphosporangium lariella regularis) 、アンプラ
リエラ カンパヌラタ（Ampullariella campanulata)、
Ａ．ロバータ（Ampullariella lobata) 、Ａ．ジギター
タ（Ampullariella digitata) ；ピリメリア テレバサ
（Pilimelia terevasa) 、Ｐ．アヌラタ（Pilimelia an
ulata)；プラノモノスポラ・パロントスポラ（Planomon
ospora parontospora)、Ｐ．ベネズエレンシス（Planom
onospora venezuelensis) 、プラノビスポラ ロンギス
ポラ（Planobispora longispora)；Ｐ．ロゼア（Planob
ispora rosea) ；ダクチロスポランギウム アウランチ
アクム（Dactylosporangium aurantiacum)及びＤ．タイ
レンデンセ（Dactylosporangium thailendense) があ
る。
【００１３】有用なアクチノプラーネス科（Actinoplan
aceae)又はシュードモナス科（Pseudomondaceae)の種の
培養菌株は前記住所のAmerican Type Culture Collecti
onから入手できる。酵素の生成に好ましい代表的な培養
はＰ．アシドボランス（P. acidovorans) であるが、こ
れははじめ American Type Culture Collection からＡ
ＴＣＣ１１２９９Ｂとして得られて、Merck & Co. (Rah
way, N. J.) の培養コレクション中にＭＢ３７４４とし
て維持されている。ＭＢ３７４４のサンプルはブタペス
ト条約にもとづく寄託のために、American Yype Cultur
e Collectionに再提出してあり、アクセスナンバーＡＴ
ＣＣ５３９４２が付されている。
aceae)又はシュードモナス科（Pseudomondaceae)の種の
培養菌株は前記住所のAmerican Type Culture Collecti
onから入手できる。酵素の生成に好ましい代表的な培養
はＰ．アシドボランス（P. acidovorans) であるが、こ
れははじめ American Type Culture Collection からＡ
ＴＣＣ１１２９９Ｂとして得られて、Merck & Co. (Rah
way, N. J.) の培養コレクション中にＭＢ３７４４とし
て維持されている。ＭＢ３７４４のサンプルはブタペス
ト条約にもとづく寄託のために、American Yype Cultur
e Collectionに再提出してあり、アクセスナンバーＡＴ
ＣＣ５３９４２が付されている。
【００１４】この培養菌の形態学的な、及び培養菌株特
徴は以下のようである：およそ0.８〜1.０μｍ×3.０〜
4.０μｍのグラム陰性好機性桿菌である。成育は２５〜
３７℃のトリプチケースソイ寒天培地上で生じる。コロ
ニーは不透明で完全な周縁と光沢表面を持った突状であ
る。コロニーはバター状構造をもつ。色素を全く見られ
ない。MacConkey 寒天培地上の成育も観察されている。
徴は以下のようである：およそ0.８〜1.０μｍ×3.０〜
4.０μｍのグラム陰性好機性桿菌である。成育は２５〜
３７℃のトリプチケースソイ寒天培地上で生じる。コロ
ニーは不透明で完全な周縁と光沢表面を持った突状であ
る。コロニーはバター状構造をもつ。色素を全く見られ
ない。MacConkey 寒天培地上の成育も観察されている。
【００１５】この種の生化学的特徴は以下のようであ
る：オキシダーゼ陽性。ゼラチンを加水分解し、硝酸塩
を亜硝酸塩に還元する。成育は硫酸アンモニウムの存在
下に以下の炭素供給源の同化により生ずる：Ｄ−グルコ
ン酸塩、カプリン酸塩、アジピン酸塩及びマレイン酸
塩、Ｄ−マンニトール及びフェニル酢酸塩である。
る：オキシダーゼ陽性。ゼラチンを加水分解し、硝酸塩
を亜硝酸塩に還元する。成育は硫酸アンモニウムの存在
下に以下の炭素供給源の同化により生ずる：Ｄ−グルコ
ン酸塩、カプリン酸塩、アジピン酸塩及びマレイン酸
塩、Ｄ−マンニトール及びフェニル酢酸塩である。
【００１６】この分野を専門とする者には明らかなよう
に、酵素を産する微生物は変異をしやすい。たとえば、
これらの菌株の人工的な変異体及び突然変異体は、紫外
線、Ｘ線、高周波、放射線及び化学物質等の様々な既知
の変異源を処理することによって得られる。酵素を産生
するシュードモナス科（Pseudomondacea) 、アクチノプ
ラーネス科（Actinoplanaceae)の天然及び人工的なすべ
ての変異体及び突然変異体を本発明に用いることができ
る
に、酵素を産する微生物は変異をしやすい。たとえば、
これらの菌株の人工的な変異体及び突然変異体は、紫外
線、Ｘ線、高周波、放射線及び化学物質等の様々な既知
の変異源を処理することによって得られる。酵素を産生
するシュードモナス科（Pseudomondacea) 、アクチノプ
ラーネス科（Actinoplanaceae)の天然及び人工的なすべ
ての変異体及び突然変異体を本発明に用いることができ
る
【００１７】この酵素は、産生生物の成育に十分な条件
下で産生される。アクチノプラーネス科（Actinoplanac
ea) によってこの条件は、一般的には振とう及び通気を
しつつ２５℃〜３０℃の範囲の温度でpHがおよそ５．０
ないし８．０の間にあることである。培地は（ａ）スク
ロース、グルコール、グリセリン等の資化性の炭素供給
源；（ｂ）ペプトン尿素、硫酸アンモニウム等の窒素供
給源；（ｃ）可溶性リン酸塩等のリン酸塩供給源；そし
て（ｄ）微生物の成育をうながすのに効果があることが
一般に知られている無機塩類を含んでいなければならな
い。有効量の酵素は一般に、成育サイクルの開始後およ
そ４０ないし６０時間で得られ、効果的な成長に達した
後しばらく持続する。
下で産生される。アクチノプラーネス科（Actinoplanac
ea) によってこの条件は、一般的には振とう及び通気を
しつつ２５℃〜３０℃の範囲の温度でpHがおよそ５．０
ないし８．０の間にあることである。培地は（ａ）スク
ロース、グルコール、グリセリン等の資化性の炭素供給
源；（ｂ）ペプトン尿素、硫酸アンモニウム等の窒素供
給源；（ｃ）可溶性リン酸塩等のリン酸塩供給源；そし
て（ｄ）微生物の成育をうながすのに効果があることが
一般に知られている無機塩類を含んでいなければならな
い。有効量の酵素は一般に、成育サイクルの開始後およ
そ４０ないし６０時間で得られ、効果的な成長に達した
後しばらく持続する。
【００１８】生物体シュードモナス（Pseudomonas)から
酵素を得る場合の条件は一般に、振とうと通気をしつつ
２０℃〜４０℃の範囲の温度で、pHが5.５ないし8.５の
間にあることである。培地は（ａ）炭化水素、糖アルコ
ール及び糖誘導体、脂肪酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ
酸、脂肪酸アミノ酸、他のアミノ酸及び関連化合物等の
資化性の炭素供給源；（ｂ）牛肉エキス、ペプトン、イ
ースト抽出物、大豆分解物カゼイン分解物、ブレーンハ
ートインフュージョン等の窒素供給源；及び（ｃ）微生
物の成育をうながす効果が一般に知られている無機塩類
を含まなければならない。有効量の酵素は一般に、成育
サイクル開始後約１６ないし４８時間後に得られる。
酵素を得る場合の条件は一般に、振とうと通気をしつつ
２０℃〜４０℃の範囲の温度で、pHが5.５ないし8.５の
間にあることである。培地は（ａ）炭化水素、糖アルコ
ール及び糖誘導体、脂肪酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ
酸、脂肪酸アミノ酸、他のアミノ酸及び関連化合物等の
資化性の炭素供給源；（ｂ）牛肉エキス、ペプトン、イ
ースト抽出物、大豆分解物カゼイン分解物、ブレーンハ
ートインフュージョン等の窒素供給源；及び（ｃ）微生
物の成育をうながす効果が一般に知られている無機塩類
を含まなければならない。有効量の酵素は一般に、成育
サイクル開始後約１６ないし４８時間後に得られる。
【００１９】シュードモナス（Pseudomonas)種によるデ
アシラーゼの産生に適した代表的な培地は、以下の成分
を有する Luria-Bertani培地である： リットル当り バクト−トリプトン １０ｇ バクト−イースト抽出物 ５ｇ 塩化ナトリウム １０ｇ pHの調整は行なわない
アシラーゼの産生に適した代表的な培地は、以下の成分
を有する Luria-Bertani培地である： リットル当り バクト−トリプトン １０ｇ バクト−イースト抽出物 ５ｇ 塩化ナトリウム １０ｇ pHの調整は行なわない
【００２０】一般に酵素は膜上に存在し、完全細胞内に
潜在しないので、脱アシル化反応には洗浄して生きた細
胞の休止懸濁液を使用することができる。生産される酵
素の量は、生物体の種ごとに、そして異なった成長条件
に対応して変化する。しかしながら、成育又は休止細胞
を使うかわりに、当業者に知られている方法により得ら
れる可溶性又は固定した酵素を用いてもよい。さらに、
微生物より得られる遺伝子を用いた組みかえ技術によっ
て産生された脱アシル化酵素を用いてもよい。
潜在しないので、脱アシル化反応には洗浄して生きた細
胞の休止懸濁液を使用することができる。生産される酵
素の量は、生物体の種ごとに、そして異なった成長条件
に対応して変化する。しかしながら、成育又は休止細胞
を使うかわりに、当業者に知られている方法により得ら
れる可溶性又は固定した酵素を用いてもよい。さらに、
微生物より得られる遺伝子を用いた組みかえ技術によっ
て産生された脱アシル化酵素を用いてもよい。
【００２１】Ｂ．化合物Ｉの脱アシル化と回収 出発物質として用いられる基質（化合物II）を、望まし
くはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液として、培
地で１６ないし２４時間成長させた後に洗浄したＰ．ア
シドボランス（Pseudomonas acidovorans)の細胞のpH
６．５のリン酸バッファ中の休止懸濁液に加える。反応
を行なう培地中の基質濃度は大きな範囲で変えることが
できる。しかしながら、酵素を最大限有効に用いて、ま
た２４時間以内に実質的に完全な脱アシル化を行なうに
は、基質濃度は一般に、約０．５ないし２．０mg／mlの
範囲となるであろう。より低濃度で用いることもできる
が、その場合には酵素を最大限に利用できない。より高
濃度でも用い得るが、その場合には基質はその不溶性の
ために、完全には脱アシル化しない。
くはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液として、培
地で１６ないし２４時間成長させた後に洗浄したＰ．ア
シドボランス（Pseudomonas acidovorans)の細胞のpH
６．５のリン酸バッファ中の休止懸濁液に加える。反応
を行なう培地中の基質濃度は大きな範囲で変えることが
できる。しかしながら、酵素を最大限有効に用いて、ま
た２４時間以内に実質的に完全な脱アシル化を行なうに
は、基質濃度は一般に、約０．５ないし２．０mg／mlの
範囲となるであろう。より低濃度で用いることもできる
が、その場合には酵素を最大限に利用できない。より高
濃度でも用い得るが、その場合には基質はその不溶性の
ために、完全には脱アシル化しない。
【００２２】別の方法として、基質を同様な条件下で、
アクチノプラネース科（Actinoplaceae)の培養菌に加え
ることができる。抗生物性の基質をシクロペプチドの化
合物Ｉに転換するためばかりでなく、又産生される化合
物の安定性のためにも最適な条件は、反応培地のpHが約
６．０ないし７．０の範囲に保たれた場合である。pH約
６．５がより好ましい。
アクチノプラネース科（Actinoplaceae)の培養菌に加え
ることができる。抗生物性の基質をシクロペプチドの化
合物Ｉに転換するためばかりでなく、又産生される化合
物の安定性のためにも最適な条件は、反応培地のpHが約
６．０ないし７．０の範囲に保たれた場合である。pH約
６．５がより好ましい。
【００２３】基質を加えた後、培養物のインキュベーシ
ョンを約２４時間以上続けなければならない。基質の純
度が脱アシル化の速度に影響する。純度の低い基質を用
いた場合、脱アシル化はより低速度で進行する。基質の
多重添加を行なってもよい。脱アシル化は広い温度範
囲、すなわち約２０℃から６０℃までで行なうことがで
きる。より望ましい温度は３０℃ないし６０℃の間であ
る。
ョンを約２４時間以上続けなければならない。基質の純
度が脱アシル化の速度に影響する。純度の低い基質を用
いた場合、脱アシル化はより低速度で進行する。基質の
多重添加を行なってもよい。脱アシル化は広い温度範
囲、すなわち約２０℃から６０℃までで行なうことがで
きる。より望ましい温度は３０℃ないし６０℃の間であ
る。
【００２４】化合物IIがＣ．アルビカンス（Candida al
bicans) に対して非常に活性である一方で化合物Ｉは生
物学的に不活性であるために、脱アシル化をＣ．アルビ
カンス（C. albicans)を用いてモニターできる。発酵固
形物は水性溶媒にごく少量しか溶けないので、ブロスと
固形物のアルコール抽出物の両方をアッセイしなければ
ならない。
bicans) に対して非常に活性である一方で化合物Ｉは生
物学的に不活性であるために、脱アシル化をＣ．アルビ
カンス（C. albicans)を用いてモニターできる。発酵固
形物は水性溶媒にごく少量しか溶けないので、ブロスと
固形物のアルコール抽出物の両方をアッセイしなければ
ならない。
【００２５】化合物Ｉは、遠心して細胞を分離し、上澄
をクロマトグラフカラム、望ましくはＳＰ−２０７又は
ＨＰ−２０にかけてそこに化合物Ｉを吸着させ、そして
メタノールで溶離してからその活性溶離液を濃縮するこ
とで樹脂からの回収を行なうという既知の方法により、
発酵ブロースから回収することができる。この溶離液を
さらに陽イオン交換分離用ＨＰＬＣで精製し、つづいて
ＳＰ−２０７で脱塩してもよい。
をクロマトグラフカラム、望ましくはＳＰ−２０７又は
ＨＰ−２０にかけてそこに化合物Ｉを吸着させ、そして
メタノールで溶離してからその活性溶離液を濃縮するこ
とで樹脂からの回収を行なうという既知の方法により、
発酵ブロースから回収することができる。この溶離液を
さらに陽イオン交換分離用ＨＰＬＣで精製し、つづいて
ＳＰ−２０７で脱塩してもよい。
【００２６】以下の実施例は本発明を説明するものであ
るが本発明を制限するものと考えてはならない。実施例Ｉ 化合物Ｉ Ａ．脱アシル化酵素の製造 ２％の寒天で固形化した Luria-Bertani傾斜培地に保持
したＰ．アシドボランス（P. acidovorans) ＡＴＣＣ５
３９４２を用いて脱アシル化酵素を生成した。まず一白
金耳分のバクテリアを５０mlの Luria-Bertani培地に接
種して種培養菌を用意し、培養物を２４時間２８℃で振
とうしながらインキュベートした。次に種培養菌を２５
０mlフラスコ中の新しい Luria-Bertani培地５０ml２０
個に５００分の１に希釈して入れて１６時間２８℃で振
とうしつつインキュベートした。６６００ｇで２０分間
遠心して１リットルの培養物から細胞を収穫した。細胞
を１％ NaCl に再び懸濁させてからさらに６６００ｇで
２０分間遠心して回収した。その後細胞を４７５mlのpH
６．５の５０mMリン酸カリウムバッファに懸濁させて、
懸濁液を３７℃にあたためて脱アシル化酵素を得た。
るが本発明を制限するものと考えてはならない。実施例Ｉ 化合物Ｉ Ａ．脱アシル化酵素の製造 ２％の寒天で固形化した Luria-Bertani傾斜培地に保持
したＰ．アシドボランス（P. acidovorans) ＡＴＣＣ５
３９４２を用いて脱アシル化酵素を生成した。まず一白
金耳分のバクテリアを５０mlの Luria-Bertani培地に接
種して種培養菌を用意し、培養物を２４時間２８℃で振
とうしながらインキュベートした。次に種培養菌を２５
０mlフラスコ中の新しい Luria-Bertani培地５０ml２０
個に５００分の１に希釈して入れて１６時間２８℃で振
とうしつつインキュベートした。６６００ｇで２０分間
遠心して１リットルの培養物から細胞を収穫した。細胞
を１％ NaCl に再び懸濁させてからさらに６６００ｇで
２０分間遠心して回収した。その後細胞を４７５mlのpH
６．５の５０mMリン酸カリウムバッファに懸濁させて、
懸濁液を３７℃にあたためて脱アシル化酵素を得た。
【００２７】Ｂ．化合物II（基質）の製造 以下の組成のＫＦ種培地５４mlを入れた２５０mlフラス
コを用意する。 ＫＦ種培地 毎リットル コーンスティープリカー ５．０ｇ トマトペースト ４０．０ｇ オート粉 １０．０ｇ グルコース １０．０ｇ 微量成分 １０．０ml 蒸留水 １０００ml pH ６．８ 微 量 成 分 毎リットル０．６N HCl FeSO4 ・7H2O １．０ｇ MnSO4 ・4H2O １．０ｇ CuCl2 ・2H2O ０．０２５ｇ CaCl2 ０．１ｇ H3BO3 ０．０５６ｇ (NH4)6MoO2 ・4H2O ０．０１９ｇ ZnSO4 ・7H2O ０．２ｇ
コを用意する。 ＫＦ種培地 毎リットル コーンスティープリカー ５．０ｇ トマトペースト ４０．０ｇ オート粉 １０．０ｇ グルコース １０．０ｇ 微量成分 １０．０ml 蒸留水 １０００ml pH ６．８ 微 量 成 分 毎リットル０．６N HCl FeSO4 ・7H2O １．０ｇ MnSO4 ・4H2O １．０ｇ CuCl2 ・2H2O ０．０２５ｇ CaCl2 ０．１ｇ H3BO3 ０．０５６ｇ (NH4)6MoO2 ・4H2O ０．０１９ｇ ZnSO4 ・7H2O ０．２ｇ
【００２８】フラスコにＭＦ５４０４ザレリオン アル
ボリコラ（Zalerion arboricola)ＡＴＣＣ２０９５７を
寒天傾斜培地から接種し、２５℃、２２０rpm で４日間
インキュベートした。得られた培養物のうち２０mlのサ
ンプルを、５００mlのＫＦ培地を入れた２リットルフラ
スコ４個にそれぞれ接種するのに用いた。その後それら
を２５℃、２２０rpm で３日間インキュベートした。そ
の後フラスコの内容物を、１８０リットルのＫＦ培地及
び発泡をおさえるための２ml／ｌのポリプロピレングリ
コールＰ−２０００（Dow Chemical Co.) を含んだ３０
０リットル種発酵槽に対する接種原として用いるために
プールした。種発酵槽は、２５℃、９０リットル／min
の通気、ゲージ圧０．７kg／cm2 、及び振とう速度２０
０rpm で３日間処理した。２５リットルの培養物のサン
プルを、（２ml／ｌのポリプロピレングリコールＰ−２
０００を加えた）以下の組成の培地（ＴＧ１０３）４７
５リットルを含んだ８００リットルの産生用発酵槽に接
種するのに用いた。すなわち： ＴＧ１０３生成培地 毎リットル Ｄ−マンニトール ４０ｇ ＮＺ−アミンタイプＥ ３３ｇ Fidco イースト抽出物 １０ｇ (NH4)2SO4 ５ｇ KH2PO4 ９ｇ 脱イオン水 １０００mlとなるまで
ボリコラ（Zalerion arboricola)ＡＴＣＣ２０９５７を
寒天傾斜培地から接種し、２５℃、２２０rpm で４日間
インキュベートした。得られた培養物のうち２０mlのサ
ンプルを、５００mlのＫＦ培地を入れた２リットルフラ
スコ４個にそれぞれ接種するのに用いた。その後それら
を２５℃、２２０rpm で３日間インキュベートした。そ
の後フラスコの内容物を、１８０リットルのＫＦ培地及
び発泡をおさえるための２ml／ｌのポリプロピレングリ
コールＰ−２０００（Dow Chemical Co.) を含んだ３０
０リットル種発酵槽に対する接種原として用いるために
プールした。種発酵槽は、２５℃、９０リットル／min
の通気、ゲージ圧０．７kg／cm2 、及び振とう速度２０
０rpm で３日間処理した。２５リットルの培養物のサン
プルを、（２ml／ｌのポリプロピレングリコールＰ−２
０００を加えた）以下の組成の培地（ＴＧ１０３）４７
５リットルを含んだ８００リットルの産生用発酵槽に接
種するのに用いた。すなわち： ＴＧ１０３生成培地 毎リットル Ｄ−マンニトール ４０ｇ ＮＺ−アミンタイプＥ ３３ｇ Fidco イースト抽出物 １０ｇ (NH4)2SO4 ５ｇ KH2PO4 ９ｇ 脱イオン水 １０００mlとなるまで
【００２９】はじめにpH調整は行なわずに、１２０℃で
２５分間滅菌した。以上の生成培地については、１９８
９年６月３０日提出の出願Ｓ．Ｎ．３７４，４１６号及
びＳ．Ｎ．４９２，０２５号とＳ．Ｎ．４９２，０２６
号に開示されている。産生用発酵槽を２５℃、２５０リ
ットル／分の通気、ゲージ圧０．７kg／cm2、及び１５
０rpm の振とう速度で５日間処理した。pHは初期値の
６．０から５．５まで下がるにまかせて、その後 NaOH
とH2SO4 を用いて５．５±０．４に維持した。５日後、
２バッチからブロースを取り出し、産生物を分離した。
２５分間滅菌した。以上の生成培地については、１９８
９年６月３０日提出の出願Ｓ．Ｎ．３７４，４１６号及
びＳ．Ｎ．４９２，０２５号とＳ．Ｎ．４９２，０２６
号に開示されている。産生用発酵槽を２５℃、２５０リ
ットル／分の通気、ゲージ圧０．７kg／cm2、及び１５
０rpm の振とう速度で５日間処理した。pHは初期値の
６．０から５．５まで下がるにまかせて、その後 NaOH
とH2SO4 を用いて５．５±０．４に維持した。５日後、
２バッチからブロースを取り出し、産生物を分離した。
【００３０】７５０リットルのメタノール（MeOH) を７
５０リットルの発酵ブロース全量に加えて、混合物を８
時間振とうした。この全ブロス抽出物を遠心して不溶発
酵固形物をとりのぞき、１４３６リットルの透明な上澄
を得た後、そのpHを７に調整した。７７リットルの「ダ
イヤイオン」ＳＰ−２０７の層を、メタノールで洗浄し
て５０：５０のMeOH／H2O で前もって平衡させて調製し
た。透明な上澄を、5.７リットル／分の流動層速度で上
向きの流れで「ダイヤイオン」ＳＰ−２０７のカラムに
かけた。この操作のあと、カラムを５６７リットルの６
５：３５MeOH：H2Oで洗浄し、４５４リットルの１００
％MeOHで溶離した。
５０リットルの発酵ブロース全量に加えて、混合物を８
時間振とうした。この全ブロス抽出物を遠心して不溶発
酵固形物をとりのぞき、１４３６リットルの透明な上澄
を得た後、そのpHを７に調整した。７７リットルの「ダ
イヤイオン」ＳＰ−２０７の層を、メタノールで洗浄し
て５０：５０のMeOH／H2O で前もって平衡させて調製し
た。透明な上澄を、5.７リットル／分の流動層速度で上
向きの流れで「ダイヤイオン」ＳＰ−２０７のカラムに
かけた。この操作のあと、カラムを５６７リットルの６
５：３５MeOH：H2Oで洗浄し、４５４リットルの１００
％MeOHで溶離した。
【００３１】この６５：３５MeOH／H2O と１００％MeOH
「ダイヤイオン」ＳＰ−２０７のカットをまとめて、H2
O を加えて５０：５０のMeOH／H2O 組成に調整して、９
４５リットルの生成物に富むカットを得た。この生成物
に富んだ画分を２〜４リットル／分の流速で（メタノー
ル洗浄して５０：５０のMeOH：H2O で前もって平衡させ
た）１０８リットルの「ダイヤイオン」ＨＰ−２０カラ
ムにかけた。その後樹脂を５６７リットルの６５：３５
MeOH／H2O で洗浄し、４５４リットルの１００％MeOHで
溶離した。
「ダイヤイオン」ＳＰ−２０７のカットをまとめて、H2
O を加えて５０：５０のMeOH／H2O 組成に調整して、９
４５リットルの生成物に富むカットを得た。この生成物
に富んだ画分を２〜４リットル／分の流速で（メタノー
ル洗浄して５０：５０のMeOH：H2O で前もって平衡させ
た）１０８リットルの「ダイヤイオン」ＨＰ−２０カラ
ムにかけた。その後樹脂を５６７リットルの６５：３５
MeOH／H2O で洗浄し、４５４リットルの１００％MeOHで
溶離した。
【００３２】化合物IIＡに富むＨＰ−２０カットを、ま
ずH2O で希釈した後に吸着させて、より大きなＨＰ−２
０カラム（１０８リットル）に用いるのと同様な方法で
小さなＨＰ−２０カラム（１０リットル）から溶離し
て、最終的に体積６リットルまで濃縮した。この濃縮し
た生成物に富むＨＰ−２０のカットの（全量６リットル
のうちの）２リットルを水２リットルで希釈して、はじ
めにMeOHで洗浄し５０：５０MeOH／H2O で平衡状態にし
ておいた3.９リットルの Amicon Ｃ１８カラムをとりつ
けたプレパラティブＨＰＣＬシステムにかけた。つづい
て５００mlの５０：５０MeOH／H2O を通して、６０分に
わたって５０：５０MeOH／H2O から１００％MeOHまでの
リニアな勾配をかけて流速２１２ml／分で溶離した。フ
ラクションをＨＰＬＣによって分析し、まとめて濃縮、
乾固して純度８８パーセントの約２０グラムの化合物II
を得た。
ずH2O で希釈した後に吸着させて、より大きなＨＰ−２
０カラム（１０８リットル）に用いるのと同様な方法で
小さなＨＰ−２０カラム（１０リットル）から溶離し
て、最終的に体積６リットルまで濃縮した。この濃縮し
た生成物に富むＨＰ−２０のカットの（全量６リットル
のうちの）２リットルを水２リットルで希釈して、はじ
めにMeOHで洗浄し５０：５０MeOH／H2O で平衡状態にし
ておいた3.９リットルの Amicon Ｃ１８カラムをとりつ
けたプレパラティブＨＰＣＬシステムにかけた。つづい
て５００mlの５０：５０MeOH／H2O を通して、６０分に
わたって５０：５０MeOH／H2O から１００％MeOHまでの
リニアな勾配をかけて流速２１２ml／分で溶離した。フ
ラクションをＨＰＬＣによって分析し、まとめて濃縮、
乾固して純度８８パーセントの約２０グラムの化合物II
を得た。
【００３３】Ｃ．脱アシル化と化合物Ｉの製造 １グラムの化合物IIを２５mlのジメチルスルホキシドに
溶かし、溶液をかくはんしつつＰ．アシドボランス（P.
acidovorans) ＡＴＣＣ５３９４２細胞の懸濁液に滴下
して加え、反応混合物を３７℃に１８時間保ったとこ
ろ、Ｃ．アルビカンス（C. albicans)アッセイによって
化合物Ｉの形成が完了していることが確かめられた。そ
の後、反応混合物を６６００Ｇで２０分間遠心して細胞
をとりのぞき、上澄中に化合物Ｉを回収した。上澄は、
水でＨＰ−２０樹脂に吸着させた。未精製の化合物Ｉを
メタノールで樹脂から溶離し、溶離液を濃縮した。
溶かし、溶液をかくはんしつつＰ．アシドボランス（P.
acidovorans) ＡＴＣＣ５３９４２細胞の懸濁液に滴下
して加え、反応混合物を３７℃に１８時間保ったとこ
ろ、Ｃ．アルビカンス（C. albicans)アッセイによって
化合物Ｉの形成が完了していることが確かめられた。そ
の後、反応混合物を６６００Ｇで２０分間遠心して細胞
をとりのぞき、上澄中に化合物Ｉを回収した。上澄は、
水でＨＰ−２０樹脂に吸着させた。未精製の化合物Ｉを
メタノールで樹脂から溶離し、溶離液を濃縮した。
【００３４】溶離液をまとめて水で希釈し、５０cmの W
hatman Partisil １０ＳＣＸ（強カチオンイオン交換、
フェニルSO3)マグナム２０カラムをとりつけたプレパラ
ティブＨＰＬＣにかけた後、０．０１Ｍリン酸カリウム
バッファ（pH６）を用いて２０ml／分で溶離し、２１０
nmのＵＶでモニターした。イオンＨＰＬＣで分析した脱
アシル化した生成物に富んだカットをまとめて、得られ
た混合物を吸着させてメタノールでＨＰ−２０樹脂から
溶離して、バッファ塩をとりのぞくと分子量８２６の化
合物Ｉを得た。
hatman Partisil １０ＳＣＸ（強カチオンイオン交換、
フェニルSO3)マグナム２０カラムをとりつけたプレパラ
ティブＨＰＬＣにかけた後、０．０１Ｍリン酸カリウム
バッファ（pH６）を用いて２０ml／分で溶離し、２１０
nmのＵＶでモニターした。イオンＨＰＬＣで分析した脱
アシル化した生成物に富んだカットをまとめて、得られ
た混合物を吸着させてメタノールでＨＰ−２０樹脂から
溶離して、バッファ塩をとりのぞくと分子量８２６の化
合物Ｉを得た。
【００３５】化合物Ｉを、新たな抗生物質を提供するた
めにアシル化してもよい。このように、この化合物は、
抗真菌剤として有用な、とくに薬剤として用いるのに望
ましい特性を有する半合成誘導体を製造するのに役立
つ。このような化合物の製造と特性については、すでに
ふれた同時提出の出願Ｓ．Ｎ．４９２，０１２号（１８
００３）が主題としている。
めにアシル化してもよい。このように、この化合物は、
抗真菌剤として有用な、とくに薬剤として用いるのに望
ましい特性を有する半合成誘導体を製造するのに役立
つ。このような化合物の製造と特性については、すでに
ふれた同時提出の出願Ｓ．Ｎ．４９２，０１２号（１８
００３）が主題としている。
【００３６】アシル化は、化合物Ｉを、所望のアシル側
鎖基に対応する酸の活性化した誘導体に反応させて行な
うことができる。簡単にいえば、化合物Ｉを、ハロゲン
化アシル、酸無水物もしくは酸のペンタフルオロフェニ
ルエステル、３，４，５−トリクロロフェニルエステ
ル、ｐ−ニトロフェニルエステル又はペンタクロロフェ
ニルエステル等の活性化エステルと、常温でジメチルフ
ォルムアミド等の不活性溶媒中で１５〜２０時間反応さ
せる。この時間の終了後に、溶媒を蒸発させて、残留物
を、溶離剤として酢酸エチル／メタノール（３：２）を
用いるシリカゲルのカラムクロマトグラフィー等の通常
の方法で精製する。
鎖基に対応する酸の活性化した誘導体に反応させて行な
うことができる。簡単にいえば、化合物Ｉを、ハロゲン
化アシル、酸無水物もしくは酸のペンタフルオロフェニ
ルエステル、３，４，５−トリクロロフェニルエステ
ル、ｐ−ニトロフェニルエステル又はペンタクロロフェ
ニルエステル等の活性化エステルと、常温でジメチルフ
ォルムアミド等の不活性溶媒中で１５〜２０時間反応さ
せる。この時間の終了後に、溶媒を蒸発させて、残留物
を、溶離剤として酢酸エチル／メタノール（３：２）を
用いるシリカゲルのカラムクロマトグラフィー等の通常
の方法で精製する。
【００３７】誘導体、とくに炭素原子約８個以上のアシ
ル基を有する誘導体は、表面の成育を抑制して殺菌剤と
しても、また菌類による感染の治療においても真菌の成
育を阻害するのに有用である。とくにこの化合物は、前
記出願に開示されているように、真菌症感染をひきおこ
すＣ．アルビカンス（Candida albicans) 及び他の真菌
類に対する活性がある。
ル基を有する誘導体は、表面の成育を抑制して殺菌剤と
しても、また菌類による感染の治療においても真菌の成
育を阻害するのに有用である。とくにこの化合物は、前
記出願に開示されているように、真菌症感染をひきおこ
すＣ．アルビカンス（Candida albicans) 及び他の真菌
類に対する活性がある。
【００３８】さらに、誘導体は、繊維状真菌、特にコク
リオボルス ミヤベアヌス（Cochliobolus Miyabeanus)
及びアスピルギルス（Aspergillus)種等の、植物に感染
する真菌類の抑制、及び紙、紙製品、織物、皮、塗料及
び他の消費財に感染する菌類の抑制に用いることができ
る。
リオボルス ミヤベアヌス（Cochliobolus Miyabeanus)
及びアスピルギルス（Aspergillus)種等の、植物に感染
する真菌類の抑制、及び紙、紙製品、織物、皮、塗料及
び他の消費財に感染する菌類の抑制に用いることができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ロバート イー．シュワルツ アメリカ合衆国，07090 ニュージャーシ ィ，ウエストフィールド，サミット アヴ ェニュー 765 (72)発明者 ヤン エス．トカクツ アメリカ合衆国，08854 ニュージャーシ ィ，ピスカタウェイ，エス．ランドルフヴ ィル ロード 620 (72)発明者 メルヴィン ターナー アメリカ合衆国，07090 ニュージャーシ ィ，ウエストフィールド．ブールヴァード 918
Claims (6)
- 【請求項１】 構造式 【化１】 を有するシクロヘキサペプチド及びその酸付加塩。
- 【請求項２】 培養液中の構造式 【化２】 を有する化合物をシュードモナス科（Pseudomondaceae)
又はアクチノプラーネス科（Actinoplanaceae)の微生物
によって産生される脱アシル化酵素で、脱アシル化が実
質的に完了するまで処理し、培養液から回収することを
特徴とする請求項１に記載のシクロヘキサペプチドの製
造方法。 - 【請求項３】 脱アシル化酵素がシュードモナス科（Ps
eudomondaceae)の微生物によって作られる請求項２に記
載の方法。 - 【請求項４】 上記微生物がシュードモナス アシドボ
ランス（Pseudomonas acidovorans)である請求項３に記
載の方法。 - 【請求項５】 培地のpHが約６．０から約７．０の範囲
に維持されている請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】 請求項１の化合物を遠心して細胞を分離
し、上澄液をクロマトカラムにかけて、メタノールで溶
離し、そして濃縮することによって回収する、請求項２
に記載の方法。
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| NZ576965A (en) | 2006-10-24 | 2011-12-22 | Resmed Motor Technologies Inc | Brushless DC motor wherein the magnet and rotor are located in the bearing tube |
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- 1991-03-12 DE DE69103945T patent/DE69103945T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-12 JP JP03216759A patent/JP3086019B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008523789A (ja) * | 2004-12-15 | 2008-07-10 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | リポペプチド類の脱アシル化の方法 |
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| EP0451957B1 (en) | 1994-09-14 |
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