DE69103945T2

DE69103945T2 - Cyclohexapeptidverbindung.

Info

Publication number: DE69103945T2
Application number: DE69103945T
Authority: DE
Inventors: Dennis M Schmatz; Robert E Schwartz; Jan S Tkacz; Mervyn Turner
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1990-03-12
Filing date: 1991-03-12
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2011-03-13
Also published as: EP0451957B1; US5310873A; EP0451957A3; DE69103945D1; CA2037959C; CA2037959A1; JP3086019B2; JPH05178895A; EP0451957A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

J. Antibiot., Bd. XLII, Nr. 3 (März 1989), 382-388, G.D. Boeck et al., "Deacylation of Echinocandin B by Actinonlanes Utahensis11, beschreibt die Herstellung von Echinocandin B, das als Zwischenstufe zur Herstellung unterschiedlich acylierter Verbindungen verwendet werden kann, die eine fungizidische Aktivität zeigen.
Die Erfindung betrifft eine Cyclohexapeptidbase, die durch die Formel
dargestellt werden kann, und die sauren Additionssalze davon. Die Verbindung ist eine nützliche Zwischenstufe bei der Herstellung von halbsynthetischen Verbindungen, die fungizidische Eigenschaften besitzen.
Das Cyclohexapeptid kann als 1-(4,5-Dihydro-L-ornithin)-5- (3-hydroxy--glutamin)-6-(3-hydroxy-L-prolin)-Echinocandin B (im folgenden Verbindung I genannt) bezeichnet werden. Die empirische Formel von Verbindung I ist C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub0;N&sub8;O&sub1;&sub6;, und das Molekulargewicht beträgt 826.
Verbindung I kann in Form der sauren Additionssalze erhalten werden. Repräsentative Säuren zur Bildung von Salzen umfassen Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Benzoesäure, Sulfaminsäure, Weinsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Glycolsäuren, Milchsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholinsäure, Pamonsäure, Schleimsäure, D-Glutaminsäure, D-Camphersäure, Glutarsäure, Phthalsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsaure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Pikrinsäure, Zimtsäure und dergleichen. Verbindung I und die Salze davon sind als Zwischenstufen bei der Herstellung von halbsynthetischen Verbindungen geeignet, die fungizidische Eigenschaften besitzen.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung stellt ein Verfahren dar, um die genannte Cyclohexapeptidbase, Verbindung I, durch Deacylierung einer Verbindung der Formel (II)
zu erhalten, die im folgenden als Verbindung II bezeichnet wird.
Die Herstellung von Verbindung II wird nachfolgend ausführlicher beschrieben und in den mitanhängigen Anmeldungen S.N. 374 416, S.N. 492 025 und S.N. 492 026, entsprechend der EP-A-0405997, beansprucht. Die Lehren darin zur Herstellung, Isolierung und über die Eigenschaften sind hier als Referenz angegeben.
Verbindung I kann hergestellt werden, indem Verbindung II in einem wäßrigen Medium (d.h. einer Pufferlösung, gelöst mit Hilfe von Dimethylsulfoxid) einem deacylierenden Enzym unterzogen wird, das erhalten wurde aus oder vorhanden ist in intakten Zellen eines Mikroorganismus der Familie Actinoplanaceae oder Pseudomondaceae oder eines Mikroorganismus, der hergestellt wurde, um das deacylierende Enzym durch DNA-Rekombinationstechnik herzustellen. Die Deacylierung kann durch den Candida-albicans-Test oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographietest (HPLC) überwacht werden, und die Umwandlung wird so lange fortgesetzt, bis die Deacylierung vollständig ist, wie durch das Verschwinden der Anti-Candida-Aktivität des Substrats (Verbindung II) oder das Auftreten des Produkts (Verbindung I) angezeigt.
Verbindung I kann sodann aus der resultierenden Nährlösung isoliert werden, indem die Fermentationslösung zentrifugiert wird, der Überstand gewonnen und auf eine Säule von "Diaion" HP-20- oder SP-207-Harz (Styrol-Divinylbenzol- Copolymer bzw. bromiertes Styrol-Divinylbenzol-Copolymer, Mitsubishi Chemical Industrie, Ltd.) aufgegeben wird, um Verbindung I auf der Säule zurückzuhalten, indem dann nach dem ersten Waschen der Säule mit deionisiertem Wasser mit Methanol eluiert wird, um Verbindung I in dem Eluat zu gewinnen. Die eluierten Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um die rohe Verbindung I zu erhalten. Letztere kann durch Kationenaustausch-HPLC, wie nachfolgend ausführlicher beschrieben, gereinigt werden.
Die Eluate werden nach der Acylierung mit einem aktivierten Ester einer geeigneten Fettsäure in Verbindungen umgewandelt, die gegen Candida albicans oder weitere Pilze aktiv sind. Somit sind die erfindungsgemäßen Produkte als Zwischenstufe zur Herstellung von Fungiziden geeignet. Die Herstellung und Eigenschaften dieser Mittel sind Aufgabe der mitanhängigen, gleichzeitig eingereichten Anmeldung, Seriennummer 492 012, eingereicht am 12. März 1990 (Anwaltsregisternummer 18003).

HERSTELLUNG DES AUSGANGSMATERIALS

Das Ausgangsmaterial zur Deacylierung, Verbindung II, kann hergestellt werden, indem Zalerion arboricola ATCC 20868 oder eine Mutante davon in Nährmedium kultiviert wird, bis Verbindung II produziert wird, und indem nach Gewinnen von Verbindung II aus dem Nährmedium durch Extrahieren entweder des Myzels oder der gesamten Nährlösung mit Methanol, die Lösung von dem Extrakt abgetrennt wird, um einen Rückstand zu erhalten, und der Rückstand danach in einem Lösungsmittel aufgelöst wird, das zur chromatographischen Trennung zur Gewinnung von Verbindung II in dem Eluat geeignet ist.
Zalerion arboricola ATCC 20868 wird in den vorgenannten mitanhängigen Anmeldungen, Seriennummer 374 416 und Seriennummer 492 025, entsprechend der EP-A-0405997, beschrieben, und die Lehren darin sind hier als Referenz angegeben. Sie ist von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, erhältlich. Eine spezielle Mutante, Z. arboricola ATCC 20957, wurde als besonders geeignet befunden, um vorzugsweise Verbindung II, das Ausgangsmaterial, zu erhalten. Die Mutante und ihre Verwendung zur Herstellung und Isolierung von Verbindung II ist Aufgabe der mitanhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 492 024, entsprechend der EP-A-0405997. Die Lehren dieser Anmeldungen sind hier als Referenz angegeben.
Nährmedien, die zur Herstellung von Verbindung II geeignet sind, sind diejenigen, die Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze bereitstellen. Kohlenstoffquellen können Glycerin, Zucker, Zuckeralkohole, Stärken, Kohlehydratderivate oder komplexe Nährmedien, wie Weizenmehl, Maismehl, Hirse und dergleichen, sein. Stickstoffquellen können Ammoniumsalze oder Aminosäuren, wie Glycin, Threonin, Methionin und dergleichen, oder komplexe Quellen, wie Hefehydrolysate, Hefeextrakte, Getreideeinweichwasser, Baumwollsamenmehl und dergleichen, sein. Anorganische Nährstoffe werden in Form der üblichen Salze geliefert, wie Kalium, Magnesium, Calcium, Phosphat, Chlorid, Carbonat und Spurenelemente. Besonders wichtige Salze sind Ammoniumsalze und einbasige Kaliumphosphatsalze.
Bei der Durchführung der Herstellung des Ausgangsmaterials, Verbindung II, wird das Fermentationsmedium mit einer gewachsenen Kultur angeimpft, die aus gefrorenem vegetativem myzel oder aus einer Agar-Schrägkultur von Z. arboricola auf herkömmliche Weise hergestellt worden ist. Das Fermentationsproduktionsmedium wird 3 bis 30 Tage lang mit oder ohne Schütteln bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 ºC bis etwa 40 ºC bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,0 bis 8,5 inkubiert. Am Ende des Kultivierungszeitraumes wird die aktive Komponente durch Zugabe von Alkanol zu dem Medium gewonnen, wenn die Fermentation in einem festen Medium durchgeführt worden ist, oder durch Zugabe zu der gesamten Nährlösung, wenn die Fermentation in einem flüssigen Medium durchgeführt worden ist. Die wäßrige alkanolische Lösung wird filtriert, um feste Verunreinigungen zu entfernen, und sodann auf "Diaion"-HP-20 oder einem entsprechenden Styrol- Divinylbenzol-Copolymer adsorbiert und anschließend mit 100 % Alkanol eluiert. Dies kann wiederholt werden, und das rohe isolierte Gemisch kann einer chromatographischen Trennung unter Anwendung der herkömmlichen Säulenchromatographie mit einem nichtionischen Harz wie Kieselgel oder der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, wobei ein Reverse-phase-Harz oder eine Kombination davon eingesetzt wird, unterzogen werden. Mit Kieselgel liefern Ester/Alkoholgemische gute Trennungen. Mit Dextran-Adsorbens ist ein System von Chlorkohlenwasserstoff/Kohlenwasserstoff/Alkohol geeignet. Fraktionen, die die antibiotische Verbindung II enthalten, können durch einen Fungizidtest unter Verwendung von Candida albicans oder durch analytische HPLC, die mit einem zuvor bestimmten Standard verglichen wird, nachgewiesen werden. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um die rohe Verbindung II zu erhalten. Letztere kann gereinigt werden, indem ein herkömmliches Verfahren, wie eine weitere Chromatographie, angewendet wird. Es kann wünschenswert sein, Verbindung II vor der enzymatischen Deacylierung zu sterilisieren, jedoch ist es im allgemeinen nicht erforderlich. Da Verbindung II das Substrat der Deacylierungsstufe darstellt, kann bei der Diskussion der Stufe Verbindung II einfach als Substrat bezeichnet werden.
Die ausführlichen Angaben der Herstellung und Isolierung von Verbindung II werden in den vorgenannten mitanhängigen Anmeldungen beschrieben, deren Lehren hier als Referenz mitangegeben sind.

DEACYLIERUNG

A. Deacylierungsenzym

Das Enzym, das zur Deacylierung geeignet ist, wird von bestimmten Mikroorganismen der Familie Actinoplanaceae und Pseudomondaceae produziert. Die Organismen der Pseudomondaceae-Familie werden bevorzugt, insbesondere Pseudomonas acidovorans und Pseudomonas diminuta.
Die Actinoplanaceae-Enzyme können dieselben Enzyme sein, die zur Deacylierung von Penizillinen verwendet werden, und sind in der U.S.-Patentschrift 3 150 059 beschrieben oder können diejenigen sein, die in der U.S.-Patentschrift 4 299 763 beschrieben sind. Unter den Spezies und Varietäten von Actinoplanaceae, die angewendet werden können, sind Actinoplanes philippinensis, Actinoplanes armeniacus, Actinoplanes utahensis, und Actinoplanes missouriensis, Spirillospora albida, Streptosporangium roseum, Streptosporangium vulgare, Streptosporangium roseum var. hollandensis, Streptosporangium album, Streptosporangium viridialbum, Amorphosporangium lariella regularis, Ampullariella campanulata, Ampullariella lobata, Ampullariella digitata, Pilimelia terevasa, Pilimelia anulata; Planomonospora parontospora, Planomonospora venezuelensis, Planobispora longispora, Planobispora rosea, Dactylosporangium aurantiacum und Dactylosporangium thailendense.
Kulturen geeigneter Spezies von Actinoplanaceae oder Pseudomondaceae können von der American Type Culture Collection, Adresse vorstehend, erhalten werden. Repräsentativ für eine bevorzugte Kultur zur Produktion des Enzyms ist P. acidovorans, ursprünglich erhalten unter der Nummer ATCC 11299B von der American Type Culture Collection und gehalten als MB 3744 in der Kultursammlung von Merck & Co., Rahway, N.J. Eine Probe von MB 3744 wurde der American Type Culture Collection wieder zur Aufbewahrung gemäß dem Budapester Vertrag unterbreitet. Ihr wurde die Zugangsnummer ATCC 53942 zugeordnet.
Die morphologischen Eigenschaften und die Eigenschaften der Kultur sind wie folgt:
gramnegative aerobe Stäbchen, etwa 0,8-1,0 um x 3,0-4,0 um. Wachstum tritt auf Trypticase-Soja-Agar bei 25-37 ºC auf. Kolonien sind undurchsichtig und konvex mit ganzen Rändern und glänzender Oberfläche. Die Kolonien besitzen eine butterartige Textur. Pigmente werden nicht beobachtet. Wachstum auf MacConkey-Agar wird ebenfalls beobachtet.
Die biochemischen Eigenschaften dieses Stammes sind wie folgt: Oxidase-positiv, Gelatine wird hydrolysiert, Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Wachstum tritt durch Assimilation der folgenden Kohlenstoffquellen in Gegenwart von Ammoniumsulfat auf: D-Gluconat, Caprat, Adipat und Malat, D-Mannit und Phenylacetat.
Wie es den Fachleuten klar wird, sind die Mikroorganismen, die das Enzym produzieren, Änderungen unterworfen. Beispielsweise können künstliche Varianten und Mutanten dieser Stämme erhalten werden, indem sie mit verschiedenen bekannten Mutagenen, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten Wellen, radioaktiven Strahlen und Chemikalien, behandelt werden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten von Pseudomondaceae und Actinoplanaceae, die das Enzym produzieren, können erfindungsgemäß verwendet werden.
Das Enzym kann unter den Bedingungen produziert werden, die für das Wachstum des produzierenden Organismus genügen. Für den Organismus Actinoplanaceae sind die Bedingungen im allgemeinen eine Temperatur im Bereich von 25 bis 30 ºC und ein pH-Wert zwischen etwa 5,0 und 8,0 unter Rühren und Belüften. Das Kulturmedium sollte enthalten (a) eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Saccharose, Glucose, Glycerin oder dergleichen, (b) eine Stickstoffquelle, wie Pepton, Harnstoff, Ammoniumsulfat oder dergleichen, (c) eine Phosphatquelle, wie lösliches Phosphatsalz und (d) anorganische Salze, die im allgemeinen als wirksam befunden werden, um das Wachstum der Mikroorganismen zu beschleunigen. Eine wirksame Menge des Enzyms wird im allgemeinen etwa 10 bis etwa 40 Stunden nach Beginn des Wachstumszyklus erhalten und bleibt für einige Zeit nach Erreichen des wirksamen Wachstums bestehen.
Für den Organismus Pseudomonas sind die Bedingungen im allgemeinen eine Temperatur im Bereich von 20 bis 40 ºC, ein pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 unter Rühren und Schütteln. Das Kulturmedium sollte enthalten (a) eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Kohlenhydrate, Zuckeralkohole und Zuckerderivate, Fettsäuren, Dicarbonsäuren, Hydroxysäuren, aliphatische Aminosäuren, weitere Aminosäuren und verwandte Verbindungen oder dergleichen, (b) eine Stickstoffquelle, wie Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, ein Sojabohnen- Abbauprodukt, ein Casein-Abbauprodukt, Gehirn-Herz-Infusion oder dergleichen, (c) anorganische Salze, die im allgemeinen als wirksam befunden werden, um das Wachstum der Mikroorganismen zu beschleunigen. Eine wirksame Menge des Enzyms wird im allgemeinen etwa 16 bis etwa 48 Stunden nach Beginn des Wachstumszyklus erhalten.
Beispielhaft für ein Medium, das zur Produktion einer Deacylase durch die Pseudomonas-Spezies geeignet ist, ist Luria-Bertani-Medium der folgenden Zusammensetzung: pro Liter Bacto-Trypton Bacto-Hefeextrakt Natriumchlorid keine PH-Einstellung
Im allgemeinen ist das Enzym hüllengebunden und in intakten Zellen nicht kryptisch, wodurch die Verwendung ruhender Suspensionen von gewaschenen lebenden Zellen zur Deacylierung möglich ist. Die Menge des produzierten Enzyms variiert von Spezies zu Spezies des Organismus als Reaktion auf die verschiedenen Wachstumsbedingungen.
Statt wachsende oder ruhende Zellen zu verwenden, können jedoch lösliche oder immobilisierte Enzyme verwendet werden, die durch dem Fachmann bekannte Verfahren zugänglich sind.
Außerdem können auch deacylierende Enzyme eingesetzt werden, die durch Rekombinationstechnik mit Genen produziert werden, die aus den Mikroorganismen erhalten werden.

B. Deacylierung und Gewinnung von Verbindung I

Das Substrat, das als Ausgangsmaterial verwendet wird (Verbindung II), wird vorzugsweise als Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer ruhenden Suspension von gewaschenen Pseudomonas acidovorans-Zellen in einem Phosphatpuffer, pH 6,5, hinzugegeben, nachdem die Zellen in einem Nährmedium 16 bis 24 Stunden lang gewachsen sind. Die Konzentration des Substrats in dem Umwandlungsmedium kann stark variieren. Für eine maximale Verwendung der Enzymquelle und eine im wesentlichen vollständige Deacylierung innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden liegt jedoch die Konzentration an Substrat im allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 2,0 mg/ml. Niedrigere Konzentrationen können verwendet werden, jedoch kann dann das Enzym nicht maximal ausgenützt werden. Höhere Konzentrationen können ebenfalls verwendet werden, jedoch kann dann das Substrat aufgrund seiner Unlöslichkeit nicht vollständig deacyliert werden.
Alternativ kann das Substrat unter ähnlichen Bedingungen zu einer Kultur von Actinoplanaceae gegeben werden.
Die geeignetsten Bedingungen nicht nur für eine Umwandlung des Substrat-Antibiotikums zu dem Cyclopeptid, Verbindung I, sondern auch für die Stabilität der produzierten Verbindung I liegen vor, wenn ein pH-Wert des Reaktionsmediums im Bereich von etwa 6,0 bis 7,0 eingehalten wird. Ein pH-Wert von etwa 6,5 wird bevorzugt.
Nach Zugabe des Substrats sollte die Inkubation der Kultur etwa 24 Stunden lang oder länger fortgesetzt werden. Die Reinheit des Substrats beeinflußt die Deacylierungsgeschwindigkeit. Wenn Substrate geringerer Reinheit verwendet werden, läuft die Deacylierung langsamer ab. Mehrfachzugaben von Substrat können eingesetzt werden.
Die Deacylierung kann über einen breiten Temperaturbereich, d.h. von etwa 20 º bis etwa 60 ºC, durchgeführt werden. Bevorzugte Temperaturen liegen zwischen 30 º und 60 ºC.
Die Deacylierung kann unter Verwendung eines Candida- albicans-Test kontrolliert werden, da Verbindung II gegen C. albicans sehr aktiv ist, während Verbindung I biologisch inaktiv ist. Sowohl Nährmedium als auch alkoholische Extrakte der Fermentationsfeststoffe sollten getestet werden, da der Feststoff in wäßrigen Lösungen nur leicht löslich ist.
Verbindung I kann aus der Fermentationslösung durch in der Technik bekannte Verfahren, wie durch Zentrifugieren, um die Zellen abzutrennen, Aufgeben des Überstandes auf eine Chromatographiesäule, vorzugsweise SP-207 oder HP-20, um Verbindung I daran zu adsorbieren, Rückgewinnen von dem Harz durch Elution in Ethanol und Konzentrieren der aktiven Eluate, abgetrennt werden. Die Eluate können durch präparative Kationenaustausch-HPLC und anschließend durch Entsalzen auf SP-207 weiter gereinigt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sollen sie jedoch nicht einschränken.

BEISPIEL I

VERBINDUNG I

A. Herstellung des Deacylierungsenzyms

P. acidovorans ATCC 53942, gehalten auf Schrägkulturen von Luria-Bertani-Medium, verfestigt mit 2 % Agar, wurde eingesetzt, um das Deacylierungsenzym zu produzieren.
Eine Stammkultur wurde zunächst hergestellt, indem eine 50-ml-Portion Luria-Bertani-Medium mit einer Überimpfportion Bakterien angeimpft und die Kultur 24 Stunden lang bei 28 ºC unter Schütteln inkubiert wurde. Die Zellen zur Deacylierung wurden sodann durch Verdünnen der Stammkultur 1:500 in zwanzig 50-ml-Portionen frischem Luria-Bertani-Medium in 250-ml-Kolben und Inkubieren für 16 Stunden bei 28 ºC unter Schütteln angezogen.
Die Zellen aus 1 Liter Kultur wurden durch Zentrifugieren bei 6600 g für 20 Minuten geerntet. Die Zellen wurden in 1 % NaCl resuspendiert und wiederum durch Zentrifugieren bei 6600 g 20 Minuten lang gesammelt. Die Zellen wurden sodann in 475 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, suspendiert und die Suspension auf 37 ºC aufgewärmt, um das Deacylierungsenzym zu erhalten.

B. Herstellung der Verbindung II (Substrat)

250-ml-Kolben werden vorbereitet, die 54 ml KF-Stammedium der folgenden Zusammensetzung enthalten: KF-Stammedium pro Liter Getreideeinweichwasser Tomatenpaste Hafermehl Glucose Spurenelemente destilliertes Wasser Spurenelemente pro Liter
Die Kolben wurden mit einer Agar-Schrägkultur von MF 5404 Zalerion arboricola ATCC 20957 angeimpft und bei 25 ºC 4 Tage lang bei 220 Upm inkubiert.
Eine 20-ml-Probe der resultierenden Kultur wurde verwendet um jeweils vier 2-l-Kolben anzuimpfen, die 500 ml KF-Medium enthielten, die anschließend bei 25 ºC 3 Tage lang bei 220 Upm inkubiert wurden. Der Kolbeninhalt wurde sodann zur Verwendung als Inokulum für einen 300-l-Stammfermenter, der 180 l KF-Medium und 2 ml/l Polypropylenglycol P-2000 (Dow Chemical Co.) zur Verringerung des Schäumens enthielt, vereinigt. Der Stammfermenter wurde 3 Tage lang bei einer Temperatur von 25 ºC, einem Luftstrom von 90 l pro Minute, einem Druck von 0,7 kg/cm² Überdruck und einer Rührgeschwindigkeit von 200 Upm betrieben. Eine 25-l-Probe der Kultur wurde verwendet, um einen 800-l-Produktionsfermenter, der 475 l eines Mediums (TG103) der folgenden Zusammensetzung (mit 2 ml/l Polypropylenglycol P-2000) enthielt, anzuimpfen: TG103-Produktionsmedium pro Liter D-Mannit NZ-Amin Typ E Fidco-Hefeextrakt deionisiertes Wasser
Keine pH-Einstellung am Anfang, Sterilisation bei 120 ºC für 25 Minuten.
Das vorgenannte Produktionsmedium wird in den mitanhängigen Anmeldungen, Seriennummer 374 416, Seriennummer 492 025 und Seriennummer 492 026, entsprechend EP-A-0405997, beschrieben.
Der Produktionsfermenter wurde 5 Tage lang bei einer Temperatur von 25 ºC, einem Luftstrom von 250 l pro Minute, einem Druck von 0,7 kg/cm² Überdruck und einer Rührgeschwindigkeit von 150 Upm betrieben. Der pH-Wert wurde von einem anfänglichen Wert von 6,0 auf 5,5 abgesenkt, dann bei 5,5 ± 0 4 gehalten, wobei NaOH und H&sub2;SO&sub4; verwendet wurden. Nach 5 Tagen wurde die Nährlösung aus zwei Chargen zur Produktisolierung geerntet.
750 l Methanol (MeOH) wurden zu 750 l Fermentations- Komplettlösung gegeben und das Gemisch 8 Stunden lang gerührt. Der Extrakt aus der Komplettlösung wurde zentrifugiert, um den unlöslichen Fermentationsfeststoff zu entfernen, so daß sich 1436 l eines geklärten Überstandes ergaben, dessen pH sodann auf 7 eingestellt wurde.
Ein 77-l-"Diaion"-SP-207-Bett wurde durch Waschen mit Methanol und Vorequilibrieren mit 50:50 MeOH/H&sub2;O hergestellt. Der geklärte Überstand wurde sodann auf die "Diaion"-SP-207-Säule mit nach oben gerichteter Fließrichtung mit einer Fließbettgeschwindigkeit von 5,7 l pro Minute aufgegeben. Nach dem Aufgeben wurde die Säule mit 567 l 65:35 MeOH/H&sub2;O gewaschen und mit 454 l 100 % MeOH gespült.
Die Fraktionen 65:35 MeOH/H&sub2;O und 100 % MeOH von "Diaion"-SP-207 wurden vereinigt und durch Zugabe von H&sub2;O auf eine Zusammensetzung von 50:50 MeOH/H&sub2;O eingestellt, so daß sich 945 l an Fraktionen, die reich an Produkt waren, ergaben. Diese produktreichen Fraktionen wurden auf eine 108-l-"Diaion"-HP-20-Säule (gewaschen mit MeOH und vorequilibriert mit 50:50 MeOH/H&sub2;O) bei einer Fließgeschwindigkeit von 2-4 l pro Minute aufgegeben. Das Harz wurde anschließend mit 567 l 65:35 MeOH/H&sub2;O gewaschen und mit 454 l 100 % MeOH eluiert.
Die HP-20-Fraktion, die reich an Verbindung IIA war, wurde bis zu einem Endvolumen von 6 l konzentriert, indem zuerst mit H&sub2;O verdünnt und sodann an eine kleinere HP-20-Säule (10 l) in einer Weise adsorbiert und davon eluiert wurde, die ähnlich war wie die, die bei der größeren (108 l) HP-20-Säule angewendet wurde.
2 l (von insgesamt 6 l) der konzentrierten produktreichen HP-20-Fraktion wurden mit 2 l Wasser verdünnt und auf ein präparatives HPLC-System aufgegeben, ausgestattet mit einer 3,9-l-Amicon-C18-Säule, vorgewaschen mit MeOH und vorequilibriert mit 50:50 MeOH/H&sub2;O. Auf das Aufgeben folgten 500 ml 50:50 MeOH/H&sub2;O und ein Eluieren mit einer Fließgeschwindigkeit von 212 ml/min mit einem linearen Gradienten von 50:50 MeOH/H&sub2;O bis 100 % MeOH für 60 Minuten. Die Fraktionen wurden über HPLC analysiert, vereinigt und zur Trockene konzentriert, um etwa 20 g der Verbindung II mit 88%iger Reinheit zu erhalten.

C. Deacylierung und Herstellung von Verbindung I

Eine Menge von 1 g der Verbindung II wird in 25 ml Dimethylsulfoxid aufgelöst, die Lösung wird tropfenweise zu einer gerührten Suspension von P. acidovorans-ATCC-53942-Zellen gegeben, und das Reaktionsgemisch verbleibt 18 Stunden lang bei 37 ºC, worauf gefunden wird, daß die Deacylierung unter Bildung von Verbindung I beendet ist, was durch den C.-albicans-Test bestätigt wird.
Das Reaktionsgemisch wird sodann bei 6600 g 20 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen zu trennen und um Verbindung I im Überstand zu gewinnen.
Der Überstand wird mit Wasser auf HP-20-Harz adsorbiert. Die rohe Verbindung I wird von dem Harz zurückgewonnen, indem mit Methanol eluiert wird und die Eluate konzentriert werden.
Die Eluate werden vereinigt, mit Wasser verdünnt, auf ein präparatives HPLC-System aufgegeben, das mit einer 50-cm-Partisil-10 SCX-(starker Kationenaustausch, Phenyl- SO&sub3;)-Magnum-20-Säule von Whatman ausgestattet ist, und sodann mit 20 ml/min 0,01 M Kaliumphosphatpuffer (pH = 6) eluiert und mittels UV bei 210 nm aufgezeichnet. Fraktionen, die reich an deacylierten Produkten sind, was durch Ionenaustausch-HPLC analysiert wurde, wurden vereinigt. Das resultierende Gemisch wurde adsorbiert und von dem HP-20-Harz mit Methanol eluiert, um Puffersalze zu entfernen und um Verbindung I eines Molekulargewichts von 826 zu erhalten.
Verbindung I kann acyliert werden, um neue Antibiotika bereitzustellen. Somit sind die Verbindungen zur Herstellung halbsynthetischer Derivate geeignet, die gegen Pilze nützlich sind und besonders wünschenswerte Eigenschaften zur Verwendung als Arzneimittel aufweisen. Die Herstellung und Eigenschaften solcher Verbindungen sind Aufgabe der gleichzeitig eingereichten mitanhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 492 012 (Anwaltsregisternummer 18003), die vorstehend erwähnt wurde.
Die Acylierung kann durch Umsetzung von Verbindung I mit einem aktivierten Derivat der entsprechenden Säure zu der gewünschten Acylseitenkettengruppe erreicht werden. Kurz gesagt wird Verbindung I mit einem Acylhalogenid, einem Säureanhydrid oder einem aktivierten Ester, wie Pentafluorphenyl-, 3,4,5-Trichlorphenyl-, p-Nitrophenyl- oder Pentachlorphenylester, der Säure bei Raumtemperatur in einem inerten Lösungsmittel wie Dimethylformamid 15 bis 20 Stunden lang umgesetzt. Am Ende dieses Zeitraums wird das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand durch ein herkömmliches Verfahren wie Säulenchromatographie über Kieselgel mit Ethylacetat/Methanol (3/2) als Elutionsmittel gereinigt.
Die Derivate, insbesondere diejenigen mit Acylgruppen, die länger als etwa 8 Kohlenstoffatome sind, sind zur Hemmung des Wachstums pathogener Pilze, sowohl als Antiseptika, indem das Wachstum auf den Oberflächen kontrolliert wird, als auch zur Behandlung von durch Pilze verursachten Infektionen, geeignet. Insbesondere sind die Verbindungen aktiv gegen Candida albicans und weitere Pilze, die mykotische Infektionen verursachen, wie in der zuvor genannten Anmeldung beschrieben.
Ferner kann das Derivat zur Kontrolle von Schlauchpilzen verwendet werden, insbesondere für Pilze, die Pflanzen infizieren, wie die Spezies Cochliobolus, Miyabeanus und Aspergillus und von Pilzen, die Papier, Papierprodukte, Textilien, Leder, Farbe und weitere Gebrauchsgüter infizieren.

Claims

1. Cyclohexapeptid der Formel

und saure Additionssalze davon.

2. Verfahren zur Herstellung eines Cyclohexapeptids nach Anspruch 1, welches umfaßt Unterziehen einer Verbindung der Formel

einem Deacylierungsenzym, das von einem Mikroorganismus der Familie Pseudomondaceae oder Actinoplanaceae produziert wird, in einem wäßrigen Medium, bis eine wesentliche Deacylierung erreicht ist und Gewinnen aus dem Kultivierungsmedium.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Deacylierungsenzym von einem Mikroorganismus der Familie Pseuäomondaceae produziert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Mikroorganismus Pseudomonas acidovorans ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der pH-Wert des Kultivierungsmediums im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 7,0 gehalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Verbindung nach Anspruch 1 aus dem Kultivierungsmedium gewonnen wird, indem zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert wird, der Überstand auf eine Chromatographiesäule aufgegeben, mit Methanol eluiert und konzentriert wird.