DE3886001T2

DE3886001T2 - Fungizides Fermentationsprodukt.

Info

Publication number: DE3886001T2
Application number: DE3886001T
Authority: DE
Inventors: Val Sagrario Mochales Del; Robert A Fromtling; George M Garrity; Robert A Giacobbe; Jerrold M Liesch; Robert E Schwartz; Carol F Wichmann
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1987-10-07
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 1994-05-26
Anticipated expiration: 2008-09-30
Also published as: JPH01163179A; DE3886001D1; JPH0670079B2; EP0311193A2; EP0311193B1; EP0311193A3

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbindung, die durch Fermentation mit einer Mikroorganismus-Kultur einer noch nicht klassifizierten Spezies von Pilz hergestellt wird, und die Verwendung der Verbindung zur Kontrolle von Pilzen, insbesondere zur Behandlung menschlicher mykotischer Infektionen. Das Verfahren zur Herstellung und Isolierung der Verbindung wird in der anhängigen europäischen Anmeldung im Namen von Merck & Co., Inc., eingereicht gleichzeitig hiermit (veröffentlicht mit der Nr. EP-A-0 311 194), beansprucht.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß eine neue Substanz, die von einem ursprünglich aus Wasser isolierten noch unidentifizierten Mikroorganismus produziert wird, sehr nützliche antimykotische Aktivitäten aufweist. Die Verbindung weist ein breites Spektrum antimykotischer Aktivität auf, insbesondere gegen humaninfektiöse Pilz-Pathogene, wie Candida albicans, Candida parapsilosis und weitere Candida-Spezies. Die Verbindung ist eine Lipopeptid mit sehr geringer Toxizität, was sie insbesondere für therapeutische Anwendungen geeignet macht, wie hier ausführlich beschrieben.
Das neue aktive Mittel ist ein farbloser Feststoff, der durch die folgenden physikalischen Eigenschaften charakterisiert werden kann:
Zersetzungstemperatur: 206-214ºC;
empirische Formel: C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub7;, bestimmt durch hochauflösende FAB (Fast Atom Bombardment-massenspektrometrische Messung, berechnet für C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub7; + Li = 1085,59 58, gefunden = 1085,6146);
Aminsäurezusammensetzung: wie bestimmt anhand des Gaschromatogramms/Massenspektrums des Trimethylsilylderivats, der gesamten sauren Hydrolysate von jeweils einem Äquivalent Threonin, Hydroxyprolin, Methylhydroxyprolin und Hydroxy-glutaminsäure.
¹H-NMH-Spektrum in CD&sub3;OD bei 400 MHz, wie in Fig. 1 ersichtlich; und
¹³C-NMR-chemische Verschiebungen, erhalten in CD&sub3;OD bei 100 MHz wie folgt: 11,20, 11,64, 19,75, 20,25, 20,78, 27,00, 28,07, 30,33, 30,37, 30,61, 30,76, 31,19, 31,29, 32,94, 34,83, 36,69, 38,10, 38,54, 39,07, 39,53, 45,93, 51,39, 53,01, 55,59, 56,31, 57,11, 58,35, 62,43, 68,18, 70,08, 70,55, 70,61, 71,26, 73,94, 75,72, 75,84, 76,86, 116,06(·2), 129,43(·2), 132,86, 158,22, 168,80, 172,16, 172,35, 172,40, 173,12, 174,24, 175,47, 176,88 ppm.
Die Substanz mit einer solchen Eigenschaft ist eine Verbindung, von der angenommen wird, daß sie aufgrund der Spektraldaten und der weiteren physikalischen Eigenschaften durch die Formel I dargestellt werden kann.
Die Verbindung kann unter Anwendung des Nomenklatursystems von Chemical Abstracts identifiziert werden als 1-[4R,5R)- 4,5-Dihydroxy-N²-(10,12-dimethyl-1-oxotetradecyl)-L-ornithin]-5-(threo-3-hydroxy-L-glutamin)-echinocandin B. Der Einfachheit halber wird die Verbindung im folgenden als Verbindung I bezeichnet.
Die Verbindung ist in einer Reihe von organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Ethylacetat und dergleichen, löslich.
Die erfindungsgemäße Verbindung besitzt nützliche antimykotische Aktivitäten, die für eine Verwendung zur Kontrolle verschiedener Pilze, sowohl von Fadenpilzen als auch Hefen, geeignet sind. Sie ist insbesondere für die geeignet, die pathogene mykotische Infektionen verursachen, wie Candida albicans, Candida parapsilosis und dergleichen, wobei nicht nur eine hohe Aktivität, sondern eine uneingeschränkt hohe Aktivität über ein ausgedehntes Spektrum von Stämmen der Organismen beobachtet worden ist.
Obwohl eine Reihe von Antibiotika und andere Antimykotika bekanntlich gegen Candida albicans und bestimmte andere Pilz-Pathogene aktiv sind, ist ihre Anwendbarkeit als Therapeutikum oftmals eingeschränkt. Beispielsweise ist Amphotericin B, ein wirksames antimykotisches Antibiotikum, im allgemeinen auf solche Situationen, in denen der Patient eine progressive potentiell tödliche Pilzinfektion aufweist, in der die mögliche lebensrettende Wirkung des Arzneimittels gegen die ungerichteten und gefährlichen Nebenwirkungen abgewogen werden muß, beschränkt. Das erfindungsgemäße antimykotische Mittel ist nicht nur ein sehr wirksames Antimykotikum, sondern ist im wesentlichen nichttoxisch und frei von unerwünschten Nebenreaktionen.
Einer der Nachteile einer Reihe von Arzneimitteln ist der recht geringe Unterschied zwischen wirksamer Dosis und Konzentration des Arzneimittels, die bei dem Patienten eine nachteilige Nebenreaktion verursacht. Eine gefährliche und potentiell tödliche Nebenreaktion stellt die Lyse der Erythrocyten dar. Verbindungen, die diese Eigenschaft bei Konzentrationen zeigen, die der wirksamen Dosis nahekommen, besitzen eine eingeschränkte Anwendbarkeit. Es wurde gefunden, daß Verbindung I unerwarteterweise nicht nur als Antimykotikum sehr wirksam ist. Außerdem wurde gefunden, daß eine Arzneimittelkonzentration erforderlich ist, die weit über der liegt, vor der vermutlich die Lyse der Erythrocyten einsetzt.
Ferner wurde gefunden, daß Verbindung I das Überleben von Mäusen mit einer Candida albicans-Infektion deutlich verlängert und auch daß Candida albicans in den Nieren experimentell infizierter Mäuse abgetötet wird. Diese Eigenschaften weisen auf ein neues antimykotisches Arzneimittel mit einem großen Potential zur Therapie menschlicher mykotischer Infektionen hin.
Abgesehen von den unerwarteten Eigenschaften, die Verbindung I als Therapeutikum bei der Behandlung von mykotischen Infektionen geeignet machen, macht sie das breite antimykotische Spektrum, das dieses Antibiotikum aufweist, als aktive Komponente immer dann geeignet, wenn eine Kontrolle von Pilzen erwünscht ist. Somit kann die Verbindung eingesetzt werden, um das Wachstum von Pilz-Spezies zu kontrollieren, die auf oder in Kosmetika, Leder, elektrischem Isolationsmaterial, Textilien, Anstrichfarben und weiteren Materialien gefunden werden können, wie Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Monilia, Aureobasidium; zur Kontrolle des Wachstums von Pilzen, die Pflanzen, Pflanzenteile oder pflanzliche Produkte infizieren, wie Erysiphe polygoni, Alternaria solani, und Cochliobolus miyabeanus; zur Kontrolle von Pilzen, die den Boden infizieren, wie Rhizoctonia solani, Fusarium solani und Pythium ultimum; von Pilzen, die Holz, Pulpe und Papier infizieren, wie Lenzites trabea und Ceratocystis pilifera.
Einige andere der speziellen Fadenpilze und Hefen, die kontrolliert werden können, schließen ein die Asperpillus- Spezies: A. niger, A. flavus, A. fumigatus, A. oryzae, A. awlamari, A. versicolor, A. sydowi, A. nidulans und A. terreus; oder die Penicillium-Spezies: P. notatum, P. roqueforti, P. chrysogenum, P. oxalicum, P. spinulosum, P. martensii, P. citrinum, P.digitatum, p. expansion, P.italcium, p. cyclopium und P. funiculosum; Neurospora sitophila; Phoma terrestris; Rhizomucor miehei; Alternaria solani; Chaetomium globosum; Trichoderma harzianum; Fusarium oxysporum; Ustilago maydis; Ceratocystis ulmi; Verticillium serrae; Botrytis allii; die Candida-Spezies wie C. albicans, C. tropicalis, C. rugosa, C. quilliermondii, C. pseudotropicalis und Torulopsis glabrata.
Das erfindungsgemäße Antimykotikum, Verbindung I, wird zweckmäßigerweise hergestellt, indem ein noch unidentifizierter Stamm eines Mikroorganismus, der in der Kultursammlung von Merck & Co., Rahway, N.J. als MF 5171 bezeichnet wird, kultiviert und das genannte Mittel aus dem Kulturmedium gewonnen wird. Eine Probe der Kultur, die in der Lage ist, die Verbindungen zu produzieren, wurde gemäß dem Budapest Treaty in der Culture Collection der American Type Culture Collection in 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt. Der Probe wurde die Eingangsnummer ATCC 20868 zugewiesen. Das Hinterlegungsdatum ist der 29. September 1987.
Es folgt die Beschreibung der Kolonie und Morphologie von ATC 20868:

A. Morphologische Beschreibung

Kugelförmig, etwa 6,0 um Durchmesser, dickwandig, dunkelfarbige Strukturen, ähnlich wie Chlamydosporen, entwickeln sich entlang des Mycels und erscheinen oft interkalar. Diese Strukturen scheinen sich zu teilen und bilden mehrzellige Gruppen mit 4-8 Zellen, die nicht leicht aufbrechen. Auf einigen Medien lagern sich die Stränge der Mycelien zu Clustern zusammen und bilden fadenartige Strukturen. Die mehrzelligen Gruppen bilden große Cluster, als ob sie durch schleimiges Material zusammengehalten werden.

B. Beschreibung der Kolonie

1. Czapek-Dox-Agar

Langsam wachsende Kolonien, Wachstum nicht extensiv, flach mit unregelmäßigen Rändern. Das Mycel ist schwarz, glänzend. Die Oberfläche wird stumpf, besitzt ein körnchenartiges Aussehen, schwarz bis grünlich-braun, wenn die Kolonie altert.

2. Getreide-Agar

Langsam wachsende Kolonien, Wachstum nicht extensiv. Das Mycel ist schwarz, glänzende Oberfläche, wird pulvrig, stumpf-schwarz beim Altern der Kolonie.
3. Kartoffeldextrose-Agar, Sabouraudmaltose-Agar und Hefeextrakt-, Malzextrakt-, Dextroseextrakt-Agar.
Die Kolonien wachsen langsam, Wachstum nicht extensiv, in der Mitte leicht erhöht, strahlig gefurchte unregelmäßige Ränder mit Ausnahme auf Sabouraudmaltose-Agar, wo die Ränder hyalin und regelmäßig sind. Mycel schwarz, glänzend, wird zu einem stumpfen Puder, schwarz beim Altern der Kolonie.
Obwohl die Erfindung anschließend hauptsächlich im Hinblick auf den speziellen Stamm behandelt wird, ist es in der Technik gut bekannt, daß die Eigenschaften von Mikroorganismen künstlich und natürlich verändert werden können. Somit werden alle Stämme der Gattung ATCC 20868, einschließlich Abänderungen und Mutanten, ob sie durch natürliche Selektion erhalten worden sind, unter Einwirkung von Mutationsmitteln, wie ionisierender Strahlung oder Ultraviolett-Bestrahlung, oder durch Einwirkung von chemischen Mutagenen, wie Nitrosoguanidin, erzeugt worden sind, als innerhalb des Umfangs der Erfindung liegend betrachtet.
Verbindung I kann in einer für die Arzneimittelverwendung geeigneten Form hergestellt werden, indem der Stamm ATCC 20868 einer noch unidentifizierten Spezies von Pilz in einem Nährmedium kultiviert wird, bis eine wesentliche Menge der antibiotischen Aktivität in dem Kulturmedium nachgewiesen und anschließend die aktive Verbindung aus dem Fermentationsmedium in einem geeigneten Lösungsmittel gewonnen wird, die Lösung der aktiven Verbindung dann konzentriert und das konzentrierte Material einer chromatographischen Trennung unterzogen wird.
Die Fermentation wird in einem Medium durchgeführt, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die von den Mikroorganismen assimilierbar sind, und im allgemeinen geringe Konzentrationen anorganischer Salze enthält. Ferner kann das Medium mit Spurenelement-Metallen angereichert sein, obwohl sie, wenn komplexe Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt werden, im allgemeinen in den komplexen Quellen vorhanden sind.
Die Kohlenstoffquellen schließen ein Glycerin, Zucker, Stärken und weitere Kohlenhydrate oder Kohlenhydrat- Derivate, wie Dextran, Cerelose, sowie komplexe Nährstoffe, wie Hafermehl, Getreidemehl, Hirse, Mais und dergleichen. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, die in dem Medium verwendet wird, hängt teilweise von den weiteren Bestandteilen in dem Medium ab, jedoch wurde im allgemeinen gefunden, daß eine Kohlenhydratmenge zwischen 0,5 und 5 Gew.-% des Mediums ausreicht. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder es können mehrere solcher Kohlenstoffquellen in demselben Medium kombiniert werden.
Die Stickstoffquellen schließen ein Aminosäuren, wie Glycin, Arginin, Threonin, Methionin und dergleichen, sowie komplexe Quellen, wie Hefehydrolysate, Hefeautolysate, Hefezellen, Tomatenpaste, Sojabohnenmehl, Caseinhydrolysate, Hefeextrakte, Getreideeinweichflüssigkeiten, lösliche Destillations-rückstände, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt und dergleichen. Die verschiedenen Stickstoffquellen können allein oder in Kombination in Mengen im Bereich von 0,2 bis 90 Gew.-% des Mediums verwendet werden.
Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingearbeitet werden können, sind die üblichen Salze, die in der Lage sind, Natrium, Kalium, Magnesium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Carbonat und ähnliche Ionen zu ergeben. Außerdem eingeschlossen sind Spurenelement-Metalle, wie Cobalt, Mangan, Eisen, Molybdän, Zink, Cadmium und dergleichen.
Die zur Durchführung der Fermentation geeigneten Medien können fest oder flüssig sein. Feste Medien können einen Grundstoff aus Hirse, Mais, Getreide, Sojabohne oder Weizen besitzen. Ein Medium, das als Grundstoff Hirse aufweist, ist Medium 2 aus Beispiel I. Weitere repräsentative feste Medien schließen die folgenden ein:
Medien Gewicht oder Volumen pro 250 ml-Kolben

Medium A

Korn (gequetscht) 10,0 g
Hefeextrakt 0,5 g
Natriumtartrat 0,1 g
Mononatriumglutamat 0,1 g
Maisöl 0,1 ml
Eisen(II)-sulfat 0,01 g
Wasser 15-20 ml

Medium B

Hirse 15 g
Hefeextrakt 0,5 g
Natriumtartrat 0,1 g
Eisen(III)-sulfat·7H&sub2;O 0,01 g
Saccharose 0,5 g
Alfalfa 0,5 g
Maisöl 0,1 ml
Wasser 15 ml
Medium C
Hirse 15 g
Hefeextrakt 0,5 g
Natriumtartrat 0,1 g
Eisen(III)-sulfat·7H&sub2;O 0,01 g
Silicagel 0,5 g
Alfalfa 0,5 g
Mononatriumglutamat 0,1 g
Maisöl 0,1 ml
Wasser 15 ml

Medium D

Hirse 15 g
Hefeextrakt 0,5 g
Natriumtartrat 0,1 g
Eisen(III)-sulfat·7H&sub2;O 0,01 g
Ferner können die Medien hergestellt werden, indem Hirse oder Mais von oben durch Weizen, Gerste, Hafer oder Sojabohne ersetzt werden.
Flüssige Medien können ebenfalls eingesetzt werden. Die Fermentation im größeren Maßstab wird im allgemeinen zweckmäßigerer durchgeführt, indem ein flüssiges Medium eingesetzt wird. Es wurde gefunden, daß, obwohl herkömmliche flüssige Medien eingesetzt werden können, um Verbindung I zu erhalten, sich solche Medien nicht als geeignet erwiesen haben, um gute Ausbeuten des gewünschten Antibiotikums zu erhalten. Jedoch wurde gefunden, daß durch Einarbeiten von etwa 6 bis 9 Gew.-% Glycerin gute Ausbeuten der gewünschten antibiotischen Verbindung erhalten werden können. Somit stellen die Verfahren und die Zusammensetzungen zur Herstellung von Verbindung I in einem flüssigen Medium einen Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Ein bevorzugtes flüssiges Medium ist eines, das in Beispiel III beschrieben wird. Weitere gebräuchlichere flüssige Medien, wie das folgende oder eine Modifikation davon, können ebenfalls eingesetzt werden:

Medium E

Dextrose 10 g
Glycerin 10 ml
Sojamehl 4g
peptonisierte Milch 4g
Tomatenpaste 4g
Speckwasser 4g
Kaliumdihydrogenphosphat 2g
Cobaltchlorid-Hexahydrat 0,01 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH 7
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird ein Fermentationsmedium, das ATCC 20868 enthält, hergestellt, indem Sporen oder Mycelien des antikörperproduzierenden Organismus in ein geeignetes Medium überimpft und dann unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden.
Das Verfahren besteht im allgemeinen darin, daß zunächst eine aufbewahrte Ursprungskultur von einer nährmediumhaltigen Agar-Schrägkultur in ein samenproduzierendes Nährmedium überimpft wird und daß vorzugsweise über ein zweistufiges Verfahren ein Wachstum der Organismen erreicht wird, die bei der Produktion des Fungizids als Samen dienen.
Bei diesem Verfahren wird ein Teil der Schrägkultur einer konservierten Kultur von ATCC 20868 in ein geeignetes flüssiges Samen-Nährmedium eines pH-Wertes im Bereich von 5 bis 8,1, am besten von 6 bis 7,5, überimpft und die Kolben mit oder ohne Schütteln bei Temperaturen im Bereich von etwa 15ºC bis etwa 30ºC, vorzugsweise 20ºC bis 28ºC, inkubiert. Das Schütteln kann, falls angewendet, bis zu 400 Upm, vorzugsweise etwa 200 bis 220 Upm, annehmen. Die Inkubation wird 2 bis 30 Tage lang, vorzugsweise 2 bis 14 Tage lang, durchgeführt. Bei reichlichem Wachstum, im allgemeinen zwischen 2 und 5 Tagen, kann die gezüchtete Kultur verwendet werden, um das Produktionsmedium zur Produktion des Fungizids anzuimpfen. Vorzugsweise wird jedoch eine zweistufige Fermentation durchgeführt, indem mit einem Teil der gezüchteten Kultur angeimpft wird und dann ähnliche Bedingungen eingesetzt werden, jedoch im allgemeinen mit einer verkürzten Inkubationszeit von etwa 1 bis 3 Tagen. Die gezüchtete Kultur wird dann verwendet, um das Produktionsmedium anzuimpfen.
Das Fermentationsmedium zur Produktion, das mit der gezüchteten Kultur angeimpft worden ist, wird 3 bis 30 Tage lang, im allgemeinen 7 bis 14 Tage lang, mit oder ohne Schütteln inkubiert. Die Fermentation kann aerob bei Temperaturen im Bereich von etwa 20ºC bis etwa 40ºC durchgeführt werden. Für optimale Ergebnisse ist es am zweckmäßigsten, diese Fermentationen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 24ºC bis etwa 30ºC durchzuführen. Temperaturen von etwa 24ºC bis 28ºC werden am meisten bevorzugt. Der pH-Wert des Nährmediums, der zur Produktion der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignet ist, kann von etwa 5,0 bis 8,5 variieren, mit einem bevorzugten Bereich von etwa 6,0 bis 7,5. Nach einem geeigneten Zeitraum zur Produktion der gewünschten Verbindung oder Verbindungen werden letztere aus dem Fermentationsmedium gewonnen, wie im folgenden ausführlicher beschrieben.
Das aktive Material kann aus dem Fermentationsmedium durch die Stufen gewonnen werden, die umfassen
(1) Zugeben von Alkohol zu dem genannten Medium, Rühren und Filtrieren, um die aktive Verbindung in der resultierenden wäßrigen alkoholischen Lösung zu gewinnen;
(2) Konzentrieren der wäßrigen alkoholischen Lösung auf ein kleines Volumen einer hauptsächlich wäßrigen Lösung;
(3) Inniges Kontaktieren der resultierenden konzentrierten alkoholischen wäßrigen Lösung mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel oder einem aromatischen oder halogenierten Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, um die aktive Verbindung darin zu extrahieren oder zu verteilen, und Konzentrieren;
(4) Unterwerfen des in Stufe (3) gewonnenen Materials mindestens einer chromatographischen Trennung, wobei bei jeder chromatographischen Trennung die aktive Verbindung aus den Eluaten, die Aktivität gegen Candida albicans zeigen, vereinigt und konzentriert wird, um Verbindung I zu gewinnen.
Die genauen Stufen können etwas variieren, je nachdem, ob die Fermentation in einem flüssigen oder festen Medium durchgeführt worden ist, welches Lösungsmittel und welches Adsorbens oder welche Kombination von Adsorbentien eingesetzt worden ist.
Wenn die Fermentation in einem festen Medium durchgeführt wird, kann die erste Stufe durchgeführt werden, indem ein alkoholisches Lösungsmittel zu dem Fermentationsmedium hinzugegeben wird, sorgfältig vermischt, dann filtriert, das wäßrige alkoholische Filtrat gewonnen und konzentriert wird. Vorzugsweise wird das konzentrierte Filtrat zuerst rückextrahiert oder mit einem niedrigen aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Hexan oder einem anderen Alkan gewaschen, um alkanlösliche Verunreinigungen zu entfernen. Das mit Alkan gewaschene Filtrat kann mit einem wasserunmischbaren sauerstoffhaltigen organischen Lösungsmittel oder einem aromatischen oder halogenierten Kohlenwasserstoff- Lösungsmittel extrahiert oder verteilt werden, und die resultierende Lösung kann konzentriert und dann auf eine Säule für mindestens eine, im allgemeinen mehrere chromatographische Trennstufen aufgegeben werden. Alternativ kann die Verteilung oder der Extrakt in dem wasserunmischbaren Lösungsmittel konzentriert und überschichtet werden oder während der Konzentration über Silicagel überschichtet werden, und das überschichtete Gel kann zur chromatographischen Trennung auf eine Silicagel-Säule aufgegeben werden.
Wenn die Fermentation in einem flüssigen Medium durchgeführt wird, werden die Mycel-Feststoffe filtriert und aus dem Fermentationsmedium gewonnen. Alkohol wird zu dem Mycelkuchen gegeben und der Mycel-Feststoff sorgfältig mit dem Alkohol vermischt, filtriert und das Filtrat gesammelt und konzentriert. Dann wird gleichermaßen, wie bei der Isolierung aus festen Medien beschrieben, die wäßrige alkoholische Lösung innig mit einem wasserunmischbaren sauerstoffhaltigen organischen Lösungsmittel oder einem aromatischen oder halogenierten Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel vermischt, um das Produkt darin zu extrahieren oder zu verteilen. Die resultierende Lösung wird dann zur chromatographischen Trennung eingesetzt.
Das alkoholische Lösungsmittel, das zur ersten Extraktion des aktiven Mittels aus dem festen Nährmedium oder aus dem Mycelkissen eingesetzt werden soll, kann irgendeines der niedrigen Alkohole sein, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol und dergleichen. Methanol wird bevorzugt.
Die wasserunmischbaren unpolaren organischen Lösungsmittel, die zur Extraktion und Verteilung des aktiven Mittels aus der methanolischen Lösung geeignet sind, sind Ester, wie Ethylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat und dergleichen und Ketone, wie Methylethylketon. Jedoch können Halogenkohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol oder Toluol, verwendet werden. Niedere aliphatische Ester werden bevorzugt.
Die chromatographische Trennung kann durchgeführt werden, indem die herkömmliche Säulenchromatographie mit einem nichtionischen Harz angewendet wird, oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, indem ein reversed phase-Harz eingesetzt wird. Die Fraktionen, die die antibiotische Verbindung I enthalten, können durch Bioautographie unter Verwendung von Candida albicans nachgewiesen werden. Im allgemeinen wird mehr als eine chromatographische Trennstufe angewendet. Gemäß dem am meisten bevorzugten Verfahren werden eine oder mehrere Trennungen durchgeführt, indem Säulenchromatographie angewendet und eine letzte Trennung durchgeführt wird, indem Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem reversed phase-C&sub1;&sub8;-Harz angewendet wird.
Wird die herkömmliche Säulenchromatographie für die chromatographischen Trennungen eingesetzt, ist Silicagel das bevorzugte Adsorbens. Im allgemeinen ist mehr als eine chromatographische Trennung erforderlich. Bei allen Trennungen kann Silicagel verwendet werden, während verschiedene Elutionsmittel eingesetzt werden. Jedoch kann es mit der Verwendung eines unterschiedlichen Adsorbens, wie eines Dextran-Adisorbens, das unter dem Handelsnamen Sephadex LH-20 (Pharmacia) verkauft wird, vorteilhaft kombiniert werden. Weitere Adsorbentien, wie Aluminiumoxid, Styrol- Divinylbenzolcopolymere, käuflich erhältlich als Diaion HP- 20, HP-30, HP-40 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) und Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-16 (Röhm und Haas Co.) können ebenfalls eingesetzt werden.
Bei der Fraktionierung und Gewinnung der aktiven Verbindung durch Chromatographie über Silicagel liefern Ester/Alkohol- Gemische mit zunehmender Konzentration des Alkohols gute Trennungen. Ein Gemisch aus Ethylacetat und Methanol erwies sich als besonders geeignet. Diese können bei einem isokratischen Stufen- oder kontinuierlichen Gradientensystem eingesetzt werden. Wird ein Dextran-Adsorbens wie Sephadex LH- 20, eingesetzt, kann ein Chlorkohlenwasserstoff/ Kohlenwasserstoff/Alkohol-Lösungsmittelsystem eingesetzt werden. Ein Gemisch aus Methylenchlorid/Hexan/Methanol erwies sich als besonders geeignet.
Bei der Durchführung der HPLC-Trennung wird die alkoholische Lösung, die das durch eine herkömmliche Chromatographie gewonnene Material enthält, konzentriert und der Rückstand in Methanol aufgelöst und auf eine Säule aufgegeben, die mit einem handelsüblichen reversed phase-Harz gepackt ist, oder er wird auf eine Säule aufgegeben, die mit einem Silicagel/ C&sub1;&sub8;-reversed phase-Harz gefüllt ist, das hergestellt wurde, wie in der Literatur ausführlich beschrieben. Die Säule wird dann unter Verwendung von Acetonitril/Wasser (1 : 1 oder gegebenenfalls anderen Verhältnissen) bei 800-2000 psi betrieben, wodurch eine Flußgeschwindigkeit von etwa 20 ml/min erzeugt wird. Die Trennung wird bei 210 nm aufgezeichnet.
Das Produkt wird durch irgendeines der chromatographischen Verfahren gewonnen, indem die gegen Candida albicans aktiven Fraktionen kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert werden.
Das bessere Potential der erfindungsgemäßen antibiotischen Verbindung I als therapeutisches Mittel bei der Behandlung mykotischer Infektionen beruht nicht nur auf der antimykotischen Aktivität, sondern auch darauf, daß bei therapeutischen Konzentrationen keine Lyse der Erythrocyten auftritt und darauf, daß jegliche Form von Toxizität im wesentlichen fehlt. Die Wirksamkeit gegen Pilze, insbesondere menschliche Pathogene, kann anhand der Ergebnisse der Tests gegen Candida albicans, Candida parapsilosis und bestimmte weitere Candida-Spezies erläutert werden.
Die Aktivität ist anhand eines Agar-Verdünungstests ersichtlich, wobei ein Dextrose-Agarmedium mit Hefe als Stickstoffgrundlage eingesetzt wird. Bei der Durchführung des Tests wurde Verbindung I in 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), das mit einem Tropfen Tween 20 angereichert war, gelöst. Es wurden zweifache Verdünnungen mit sterilem destilliertem Wasser/10% DMSO hergestellt, um auf den Agarverdünungstestplatten Arzneimittel-Endkonzentrationen im Bereich von 128 bis 0,06 ug/ml zu erhalten.
Die Hefekulturen, die in einer Hefe-Maltosenährlösung (YM) gehalten wurden, wurden in ein frisches YM-Medium übergeführt und über Nacht bei 35ºC unter Schütteln (250 Upm) inkubiert. Nach der Inkubation wurde jede Kultur mit steriler Salzlösung verdünnt, um eine Endkonzentration von 3·10&sup5; bis 3·10&sup6; koloniebildenden Einheiten zu ergeben (CFU)/ml.
Jede hergestellte Platte-wurde angeimpft, indem ein Denley- Multipoint-Inoculator (Denley, Sussex, England) angewendet wurden der etwa 0,001 ml auf die Agar-Oberfläche abgibt, was zu einem Animpfen mit 3·10² bis 3·10³ CFUs führt. Die Platten wurden bei 28ºC 48 Stunden lang inkubiert. Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MICs) wurden als die niedrigsten Konzentrationen des Arzneimittels aufgezeichnet, bei denen sich kein Wachstum oder weniger als drei CFU/Fleck zeigte.
Die geeigneten antimykotischen Eigenschaften können anhand der Ergebnisse erläutert werden, die die überlegene Wirksamkeit von Verbindung I gegenüber verschiedenen Candida-Spezies zeigt, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht: Pilz Stamm Nr. minimale inhibitorische Konzentration (mg/ml) Verbindung I Candida albicans C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. pseudotropicalis C. krusei C. stellatoidea C. rugosa * Es wurde ein wesentlich verringertes Wachstum beobachtet; mögliche Störung der Arzneimittelaktivität durch das Medium.
Bei einem ähnlichen Test wurde Verbindung I gegen ein ausgedehntes Sortiment von 34 verschiedenen Stämmen von Candida albicans und 13 verschiedenen Stämmen von Candida parapsilosis getestet. Im Falle von Candida albicans wurde gefunden, daß gegen 28 der Stämme die MIC im Bereich von 0,063 bis 0,25 ug/ml lag, und nur gegen 5 Stämme war sie höher als 1 ug/ml. Im Falle von Candida parapsilosis wurde gefunden, daß gegen 12 der 13 Stämme die MIC im Bereich von 2,0 bis 8 lag.
Die vorgenannten Ergebnisse sind hauptsächlich beispielhaft für die überlegenen und beständigen antimykotischen Eigenschaften, die Verbindung I aufweist. Wie anschließend ersichtlich, ist die Verbindung ein Breitband-Antibiotikum, das gegen viele Pilz-Spezies, einschließlich weiteren menschlichen Pathogenen wirksam ist.
Die Eigenschaft von Verbindung I, eine Arzneimittelkonzentration weit über den therapeutischen Dosierungskonzentrationen zu benötigen, um eine Lyse der Erythrocyten zu bewirken, wurde in einem Titrations-/Hämolyse- Standardtest unter Verwendung von frischem Blut gefunden, das weiblichen CD-1 Mäusen entnommen wurde. Eine Arzneimittelkonzentration im Bereich von 0,39 bis 400 ug/ml in 5% Dextrose und eine arzneimittelfreie Kontrolle wurden eingesetzt.
Bei der Durchführung der Bestimmung wurden die Teströhrchen, die hergestellt worden waren, indem 2 ml der geeigneten Arzneimittelverdünnung und 0,5 ml Erythrocyten-Suspension miteinander vermischt wurden, vorsichtig geschüttelt, um den Inhalt zu vermischen. Die Röhrchen wurden dann bei 25ºC 2 Stunden lang inkubiert. Danach wurden die Röhrchen visuell auf eine vollständige oder teilweise Hämolyse der Erythrocyten geprüft und mit einer arzneimittelfreien Kontrolle verglichen. Die minimale Lysekonzentration (MLC) wurde als die höchste Arzneimittelkonzentration herangezogen, die keine Lyse der Erythrocyten verursachte. Die MLC für Verbindung I betrug 400 ug/ml. Dasselbe Experiment, durchgeführt mit Amphotericin B, zeigte, daß die MLC für Amphotericin B 12,5 ug/ml betrug.
Aufgrund der verschiedenen Testergebnisse steht fest, daß für eine therapeutische Anwendung im allgemeinen etwa 1,4 bis etwa 2,8 mg/kg Körpergewicht des Antibiotikums eingesetzt werden können, wenn die Gesundheit, das Gewicht, das Alter des Patienten und weitere Faktoren berücksichtigt werden, die die Reaktion auf ein Arzneimittel beeinflussen. Diese Mengen liegen, ausgedrückt als Dosen, die für Menschen geeignet sind, im Bereich von etwa 100 mg bis etwa 200 mg täglich bei oraler oder parenteraler Verabreichung.
Die außergewöhnlichen Eigenschaften werden am wirksamsten eingesetzt, wenn die Verbindung zu neuen pharmazeutischen Präparaten mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff gemäß den herkömmlichen pharmazeutischen Kompoundierungstechniken formuliert wird.
Die neuen Präparate enthalten mindestens 1 Gew.-% der aktiven Verbindung. Bei der Herstellung der Präparate wird Verbindung I mit irgendeinem der üblichen pharmazeutischen Medien innig vermischt.
Die Präparate werden vorzugsweise in einer oralen Dosierungsform hergestellt. Für flüssige Präparationen wird das Fungizid mit flüssigen Trägerstoffen, wie Wasser, Glycolen, Ölen, Alkoholen und dergleichen, formuliert und für feste Präparationen, wie Kapseln und Tabletten, wird es mit festen Trägerstoffen, wie Stärken, Zuckern, Kaolin, Ethylcellulose, Calcium- und Natriumcarbonat, Calciumphosphat, Kaolin, Talk, Lactose, im allgemeinen mit einem Gleitmittel, wie Calciumstearat, zusammen mit Bindemitteln, Zerfallsmitteln und dergleichen formuliert. Wegen ihrer leichten Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste Dosierungsform dar. Es ist besonders vorteilhaft, die Präparate für eine leichte Verabreichung und eine gleichmäßige Dosierung in einer Einheitsdosierungsform zu formulieren. Ein Präparat in einer Einheitsdosierungsform ist ein Aspekt der Erfindung.
Das Fungizid wird in den antimykotischen Präparaten zur Injektion formuliert und kann in der Einheitsdosierungsform in Form von Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern, nötigenfalls mit einem zugegebenen Konservierungsstoff, dargereicht werden. Die Präparate können auch solche Formen annehmen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Vehikeln, wie 0,85% Natriumchlorid oder 5% Dextrose in Wasser, und können Formulierungsmittel enthalten, wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel. Puffer sowie Additive, wie Salzlösung oder Glucose, können hinzugegeben werden, um die Lösungen isotonisch zu machen. Alternativ können die aktiven Bestandteile in Pulverform zur Aufbereitung mit einem geeigneten Trägerstoff vor der Verabreichung vorliegen.
Die Bezeichnung "Einheitsdosierungsform", wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge des aktiven Bestandteils enthält, die berechnet worden ist, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzeugen, in Verbindung mit dem pharmazeutischen Trägerstoff. Beispiele für solche Einheitsdosierungsformen sind Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulverpäckchen, Waffeln, abgemessene Einheiten in Ampullen oder in Mehrfachdosis- Behältern und dergleichen. Eine erfindungsgemäße Einheitsdosis enthält im allgemeinen jeweils 100 bis 200 mg der Arzneimittel-Komponenten.
Soll die Anwendung topisch sein, kann das Arzneimittel in herkömmlichen Cremen und Salben formuliert werden, wie als weiße Vaseline, wasserfreies Lanolin, Cetylalkohol, cold cream, Glycerylmonostearat, Rosenwasser und dergleichen. Im allgemeinen wird eine 1-2%ige Creme oder Lösung hergestellt und auf die zu behandelnde Stelle aufgetragen.
Verbindung I zeigt auch ein breites Spektrum an antimykotischer Aktivität. Dies ist ersichtlich anhand eines antimykotischen Tests, bei dem ein Scheibendiffusionsverfahren gegen Hefen und Fadenpilze (Schimmel) eingesetzt wird.
Bei dem Scheibendiffusionsverfahren werden zunächst angesäte Testplatten auf eine der folgenden Weisen, je nach Typ des Organismus, hergestellt.
Impfmedien für Fadenpilze werden hergestellt, indem die Oberfläche von Stamm-Platten, die auf Kartoffeldextrose-Agar gehalten werden, mit einem angefeuchteten sterilen Dacron- Tupfer abgekratzt wird. Die Sporen und Mycelien werden in 10 ml sterilem Kartoffeldextrose-Nährmedium suspendiert und auf 70% Transmission bei 660 nm eingestellt.
Die Impfmedien für Hefen werden aus über Nacht gezüchteten Lösungskulturen hergestellt, dann auf Kartoffeldextrose-Agar auf eine Endkonzentration von entweder 40% oder 70% Transmission bei 660 nm verdünnt.
Für drei Stämme von Candida albicans und einen Stamm von Saccharomyces cerevisiae wird anstelle von Kartoffeldextrose-Nährlösung sterile Salzlösung verwendet. Testplatten werden hergestellt, indem das Impfmedium mit einem geeigneten geschmolzenen Agarmedium verdünnt und auf 45ºC abgekühlt wird, um eine Endkonzentration von 4% (Vol./Vol.) zu erhalten.
Die so hergestellten angesäten Agarmedien werden für die Tests auf Petri-Schalen verteilt (11 ml pro Schale).
Die auf die Produktion des antimykotischen Mittels zu testenden Proben werden auf 6,2 mm Filterpapierscheiben (25 ul/Scheibe) aufgebracht und bei 24ºC an der Luft getrocknet. Wenn die zu testende Probe eine rohe Lösung ist, kann sie vor dem Aufbringen zentrifugiert werden. Die Scheiben, die das zu testende Material tragen, werden dann unter sterilen Bedingungen auf die angesäten Testplatten aufgebracht und die Proben mit 25% sterilem wäßrigen Dimethylsulfoxid (25 ul/ Scheibe) erneut benetzt. Die Testplatten werden dann entweder bei 28ºC oder 37ºC 24 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation werden die gehemmten Zonen gemessen und aufgezeichnet.
Es wurde gefunden, daß gute antimykotische Eigenschaften gesehen wurden gegen die Fadenpilze Cochliobolus miyabeanus, penicillium sp. (drei Stämme), Aspergillus niger, Trichoderma sp., Trichoderma lignorum, Alternaria solani, Verticillium serrae, Botrytis allii, Scopulariopsis communis, Cephalosporium sp., Cercospora beticola, Rhizomucor miehei, Apsergillus flavus und Aspergillus fumigatus; und gegen die Hefen Sacchaomyces cervisiae, Candida albicans, Candida rugosa, Brettanomvces bruxellensis, Torulospora hansenii, Candida guilliermondii, Candida pseudotropicalis, Torulopsis glabrata und Kluyveromyces fragilis.
Hinsichtlich des breiten Spektrums der Aktivität ist das erfindungsgemäße Antibiotikum geeignet, um bei verschiedenen Anwendungen antimykotischer Präparate verwendet zu werden. Bei einer solchen Anwendung können die Verbindungen mit einem biologisch inerten Trägerstoff, im allgemeinen mit Hilfe eines oberflächenaktiven Dispersionsmittels, vermischt werden, dessen Natur variiert, je nachdem, ob die Anwendung zur Kontrolle von human- oder tierinfektiösen Pathogenen oder zur Kontrolle von Pilzen in der Landwirtschaft, wie im Boden oder auf Pflanzenteilen, oder zur Kontrollen von Pilzen aufleblosen Objekten gedacht ist.
Präparate für therapeutische Anwendungen können, wie zuvor beschrieben, hergestellt werden.
Für eine nichtmedizinische Anwendung kann das erfindungsgemäße Produkt entweder einzeln oder als Gemisch in Präparaten in einem inerten Trägerstoff eingesetzt werden, welcher einschließt fein verteilte trockene oder flüssige Verdünnungsmittel, Streckmittel, Füllstoffe, Konditioniermittel und Hilfsstoffe, einschließlich verschiedener Tone, Diatomeenerde, Talk und dergleichen oder Wasser und verschiedene organische Flüssigkeiten, wie niedrige Alkanole, beispielsweise Ethanol und Isopropanol oder Kerosin, Benzol, Toluol oder weitere Erdöldestillatfraktionen oder Gemische davon.
Bei der Durchführung der Erfindung kann eine antimykotische Menge der Präparate direkt auf Bereiche aufgetragen werden, wo eine Pilz-Kontrolle gewünscht wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sind jedoch nicht als Einschränkung gedacht:

BEISPIEL I

FERMENTATION

Eine gefrorene Kultur in Glycerin von Isolat 2 der Kultur 8525-307P, ursprünglich aus Wasser isoliert, als ATCC 20868 identifizierbar und in der Merck-Kulturkollektion aufbewahrt, wurde zur Fermentation eingesetzt.
Eine Portion von 2 ml der gefrorenen Kultur wurde aufgetaut und aseptisch in einen unverschlossenen 250 ml-Erlenmeyer- Kolben übergeführt, der 54 ml Medium 1 enthielt. Medium 1 wurde nach dem Animpfen 3 Tage lang bei 28ºC unter Rotationsbewegung (220 Upm, 2'' Drehschüttler) inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums wurden 2,0 ml des Wachstumsmediums aseptisch in jeweils mehrere unverschlossene 250 ml-Erlenmeyer-Kolben übergeführt, die Medium 1 enthielten. Die angeimpften Kolben wurden 2 Tage lang bei 28ºC inkubiert.
12,5 ml der reifen Samenlösung wurden auf fünf Produktionskolben, die Medium 2 enthielten, überimpft und bei 25ºC 7 Tage lang unter statischen Bedingungen inkubiert, um in dem Fermentationsmedium eine antibiotische Verbindung zu erhalten.
Die bei der vorgenannten Fermentation eingesetzten Medien waren folgende:

MEDIUM 1 (KF-Samenmedium)

Getreideeinweichwasser 5g
Tomatenpaste 40 g
Hafermehl 10 g
Glucose 10 g
Spurenelementen-Gemisch 10 ml
destilliertes Wasser pH 6,8 1000 ml
Spurenelementen-Gemisch:
FeSo&sub4;·7H&sub2;O 1g
MnSO&sub4;·4H&sub2;O 1g
CuCl&sub2;·2H&sub2;O 25 mg
CaCl&sub2; 100 mg
H&sub3;BO&sub3; 56 mg
(NH&sub4;)&sub6;MoO&sub2;·4H&sub2;O 19 mg
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 200 mg
destilliertes Wasser 1000 ml

MEDIUM 2 (festes F204 Medium)

Menge/Kolben
Hirsegrundstoff 15 g
Hefeextrakt 0,5 g
Natriumtartrat 0,1 g
Eisen(II)-sulfat-Kristalle 0,01 g
Mononatrium-Glutaminsäure 0,1 g
Maisöl 0,1 ml

ISOLIERUNG

500 ml Methanol wurden jeweils in die fünf 2 l-Kolben der Festphasenfermentation gegeben. Der Kolbeninhalt wurde dann vermischt und gerührt, um das methanollösliche Material zu extrahieren. Das Gemisch wurde dann filtriert. Der extrahierte Filterkuchen wurde dann mit weiteren 2 500 ml Methanol gerührt, um erneut methanollösliches Material zu extrahieren. Das Gemisch wurde dann filtriert.
Das Filtrat und die Waschlösung wurden vereinigt und auf 500 ml konzentriert.
Das so erhaltene wäßrige methanolische Konzentrat wurde dann mit zwei 500 ml-Portionen Ethylacetat extrahiert. Die extrahierte wäßrige Lösung wurde auf eine Diaion HP-20-Säule aufgegeben, um das aktive Material daran zu adsorbieren, und letzteres dann davon mit Methanol zu eluieren. Die Eluate wurden mit den zuvor erhaltenen Ethylacetat-Extrakten vereinigt. Die vereinigten Ethylacetatlösungen wurden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf 200 ml Sephadex LH-20 chromatographiert, wobei als Elutionsmittel Methylenchlorid/ Hexan/Methanol 5 : 5 : 2 verwendet wurde.
Die aktiven Fraktionen, wie bestimmt mit Candida albicans, wurden vereinigt und auf 200 ml Silicagel (EM Science, Kieselgel 60, 230-400 mesh) chromatographiert, wobei eine Stufengradient-Elution mit Ethylacetat/Methanol angewendet wurde. Die aktiven Fraktionen aus dieser Chromatographie wurden vereinigt, konzentriert und auf Silicagel chromatographiert, wobei ein isokratisches System von 75 : 25 Ethylacetat/Methanol verwendet wurde.
Die aktiven Portionen aus dieser Chromatographie wurden dann vereinigt und auf 100 ml Sephadex LH-20 aufgegeben, wobei Methanol als Elutionsmittel verwendet wurde. Das Eluat ergab nach dem Verdampfen des Lösungsmittels 95 mg einer gereinigten Verbindung. Die Verbindung war ein farbloser Feststoff mit einem ¹H-NMH-Spektrum, das in Fig. 1 abgebildet ist.

BEISPIEL II

FERMENTATION

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel I beschrieben, wurde der Inhalt eines gefrorenen Röhrchens mit ATCC 20868 aus der Merck-Kultursammlung aufgetaut und aseptisch in einen unverschlossenen 250 ml-Kolben übergeführt, der 54 ml KF-Medium (Medium 1), enthaltend 0,4% Agar, enthielt. Das modifizierte Medium 1 wurde nach dem Animpfen bei 28ºC 48 Stunden lang unter Rühren bei 220 Upm inkubiert. Danach wurden 10 ml Wachstumsmedium in einen unverschlossenen 2 l-Kolben, der 500 ml KF-Medium, enthaltend 0,4 Agar, enthielt, übergeführt. Nach dem Animpfen wurde das resultierende Medium bei 28ºC 24 Stunden lang unter Rühren bei 220 Upm inkubiert.
20 2 l-Kolben, die jeweils 120 g Medium 2 und 120 ml einer Stammlösung enthielten, die aus folgendem bestand
Hefeextrakt 5 Gewichtsteile
Natriumtartrat 1 Gewichtsteil
Eisen(II)-sulfat-Kristalle 0,1 Gewichtsteil
Mononatrium-Glutaminsäure 1 Gewichtsteil
Maisöl 1 Gewichtsteil
wurden 20 Minuten lang bei 120ºC autoklaviert und dann erneut mit 80 ml Wasser für weitere 20 Minuten bei 122ºC autoklaviert. Die Kolben wurden abkühlen gelassen, dann mit 20 ml Samenmedium, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, angeimpft. Die angeimpften Kolben wurden bei 25ºC unter statischen Bedingungen 14 Tage lang inkubiert.

ISOLIERUNG

In 19 2 l-Kolben zur Feststoff-Fermentation wurde jeweils 1 l Methanol gegeben und der Kolbeninhalt vermischt, gerührt und filtriert. Der ausgelassene Filterkuchen wurde zweimal mit 6 l Methanol extrahiert. Die wäßrigen methanolischen Filtrate wurden dann konzentriert. Das Konzentrat wurde zweimal mit 3 l Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatextrakte wurden vereinigt, getrocknet und auf etwa 100 ml konzentriert.
Das Konzentrat wurde dann auf Silicagel aufgebracht, indem 100 ml Methanol und 100 ml Silicagel hinzugegeben wurden, die die Komponenten gut überschichteten. Dann wurde das Lösungsmittel an einem Rotationsverdampfer entfernt. Das getrocknete Silicagel wurde dann auf eine Säule von 500 ml Silicagel aufgetragen, die Säule wurde mit Ethylacetat gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen und mit Ethylacetat/Methanol 9 : 1 eluiert. Die Eluate, die das antibiotische Material enthielten und sich im Test gegen Candida albicans als positiv erwiesen, wurden gesammelt und vereinigt.
Der antibiotikumreiche Abschnitt der Silicagel- Chromatographie wurde in 200 ml Methylenchlorid/Hexan/ Methanol 10 : 10 : 1 aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde mit 40 ml Sephadex LH-20 kombiniert (das zuvor hergestellt wurde, indem es über Nacht in Methanol eingeweicht und anschließend zweimal mit 200 ml Methylenchlorid/Hexan/ Methanol gewaschen wurde). Nach einigen Minuten wurde der Überstand durch Filtration entfernt. Das Sephadex LH-20 wurde mit 200 ml Methylenchlorid/Hexan/Methanol gewaschen und dann filtriert. Es wurde gefunden, daß die Filtrate nicht den aktiven Bestandteil enthielten, und sie wurden verworfen. Der aktive Bestandteil, der sich zwischen den Dextran-Sephadex LH-20-Perlen verteilt hatte, wurde davon extrahiert, indem zweimal mit 200 ml Methanol gewaschen wurde. Diese Methanol-Waschlösungen wurden vereinigt und konzentriert.
Das methanolische Konzentrat wurde dann auf 200 ml Silicagel aufgegeben und mit 25 : 75 Ethylacetat/Methanol eluiert. Die Eluate wurden vereinigt und das Lösungsmittel eingedampft, um Verbindung I zu erhalten. Verbindung I ist ein farbloses Pulver mit einem Zersetzungspunkt von 206-214ºC.

BEISPIEL III

FERMENTATION

Es wurde aus ATCC 20868 auf ähnliche Weise, wie in Beispiel I beschrieben, eine Samenlösung hergestellt. 2 ml der reifen Samenlösung wurden in Produktionskolben überimpft, die 45 ml Medium 3 pro Flasche enthielten und auf einem Rotationsschüttler 13 Tage bei 25ºC und 50% relativer Luftfeuchtigkeit mit 220 Upm geschüttelt wurden, um die antibiotische Verbindung I in dem Fermentationsmedium zu erhalten.
Medium 3 besitzt die folgende Zusammensetzung:

MEDIUM 3

(Gramm/Liter H&sub2;O)
Glycerin 85 g
Pectin 10 g
Erdnußmehl 4g
peptonisierte Milch 4g
Tomatenpaste 4g
Getreideeinweichwasser 4g
Speckwasser 4g
Glycerin 2g
KH&sub2;PO&sub4; 2g
pH = 7,0

BEISPIEL IV

ISOLIERUNG

Nach Beendigung der Fermentation in einem flüssigen Medium wird das Medium filtriert, um die Mycelfeststoffe zu entfernen. Es wird ein Überschuß an Methanol zu dem Mycelkuchen gegeben, die Mycelfeststoffe werden sorgfältig mit dem Methanol vermischt, das Gemisch wird filtriert und das Filtrat dann konzentriert. Es wird Ethylacetat zu dem Konzentrat hinzugegeben und das Material verteilt oder damit extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird dann konzentriert und die konzentrierte Lösung über eine Silicagel-Säule unter Verwendung von Ethylacetat/Methanol-Gemischen chromatographiert, um das gewünschte Produkt zu erhalten.

BEISPIEL V

ISOLIERUNG

1000 komprimierte Tabletten, die jeweils mg von Verbindung I enthielten, wurden aus der folgenden Formulierung hergestellt:
Gramm
Verbindung I 500
Stärke 750
zweibasiges wasserfreies Calciumphosphat 5000
Calciumstearat 2,5
Die fein gepulverten Bestandteile werden gut vermischt und mit 10% Stärkepaste granuliert. Die Granulation wird getrocknet und zu Tabletten komprimiert.

BEISPIEL VI

1000 Hartgelatinekapseln, die jeweils 210 mg von Verbindung I enthielten, wurden aus der folgenden Formulierung hergestellt.
Verbindung Gramm
Verbindung I 500
Stärke 250
Lactose 750
Talk 250
Calciumstearat 10
Ein einheitliches Gemisch der Bestandteile wird durch Vermischen hergestellt und verwendet, um zweiteilige Hartgelatinekapseln zu füllen.

BEISPIEL VII

250 ml einer injizierbaren Lösung werden durch die herkömmlichen Verfahren hergestellt und haben die folgende Formulierung:
Dextrose 12,5 g
Wasser 250 ml
Verbindung I 400 mg
Die Bestandteile werden vermischt und dann zur Verwendung sterilisiert.

BEISPIEL VIII

Eine Salbe, die zur topischen Anwendung geeignet ist, kann hergestellt werden, indem 13 mg von Verbindung I in 1 g käuflich erhältlichem Polyethylen/Kohlenwasserstoffgel innig dispergiert werden.

Claims

1. Fungizide Antibiotikum-Verbindung, die ein weißer amorpher Feststoffist mit

a. einer Zersetzungstemperatur von 206-214ºC;

b. einer empirischen Formel von C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub7;, die erhalten wurde durch hochauflösende Fast Atom Bombardment-Massenspektralanalyse;

c. einem ¹H-NMR-Spektrum in CD&sub3;OD, das bei 400 MHz aufgenommen worden ist und in Fig. 1 gezeigt ist; und

d. folgenden chemischen ¹³C-NMR-Verschiebungen in CD&sub3;OD bei 300 MHz: 11,20; 11,64; 19,75; 20,25; 20,78; 27,00; 28,07; 30,33; 30,37; 30,61; 30,76; 31,19; 31,29; 32,94; 34,83; 36,69; 38,10; 38,54; 39,07; 39,53; 45,93; 51,39; 53,01; 55,59; 56,31; 57,11; 58,35; 62,43; 68,18; 70,08; 70,55; 70,61; 71,26; 73,94; 78,72; 75,84; 76,86; 116,06(2·); 129,43 (2·); 132,86; 158,22; 168,80; 172,16; 172,35; 172,40; 173,12; 174,24; 175,47; 176,88 ppm.

2. Verbindung nach Anspruch 1, die hergestellt wird durch Kultivierung des Mikroorganismus ATCC 20868.

3. Verbindung nach Anspruch 1, die durch die folgende Formel dargestellt wird

und 1-[(4R,5R)-4,5-Dihydroxy-N²-(10,12-dimethyl-1-oxotetradecyl)-L-ornithin]-5-(threo-3-hydroxy-1-glutamin)echinocandin B heißt.

4. Fungizid-Präparat, welches enthält eine Verbindung nach Anspruch 3 in einem Gemisch mit einem biologisch inerten Trägerstoff

5. Präparat nach Anspruch 4, in dem der Trägerstoff ein pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff ist.

6. Verfahren zur Hemmung des Pilzwachstums in landwirtschaftlichen oder aufleblosen Objekten, umfassend Ausbringen einer antifungizid-wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 3 auf die Fläche, auf der das Wachstum kontrolliert werden soll.

7. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Medikaments, das geeignet ist zur Kontrolle von Pilzinfektionen ohne eine Lyse von Erythrocyten zu verursachen.

8. Verwendung nach Anspruch 7, bei der der Pilz, der die Infektion verursacht, ein menschliches Pathogen ist.

9. Verwendung nach Anspruch 8, bei der das Pathogen Candida albicans ist.

10. Verwendung nach Anspruch 8, bei der das Pathogen Candida parapsilosis ist.