FR2476074A1

FR2476074A1 - Derives de noyaux peptidiques cycliques, leur preparation et leur utilisation comme agents antifongiques

Info

Publication number: FR2476074A1
Application number: FR8026220A
Authority: FR
Inventors: Manuel Debono
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1979-12-13
Filing date: 1980-12-10
Publication date: 1981-08-21

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DE NOUVEAUX COMPOSES ANTIFONGIQUES DE FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) (CF DESSIN DANS BOPI) OU R EST H OU OH ET R, R ET R SONT DIVERS GROUPEMENTS CORRESPONDANT AUX GROUPEMENTS CORRESPONDANTS DES FACTEURS A, B, D ET H DE A-30912 ET DE L'ANTIBIOTIQUE S31794F-1, ET R EST UN GROUPEMENT N-ALCANOYL-AMINO-ACYLE DONT LE GROUPEMENT ALCANOYLE EST EN C-C.

Description

Cette invention concerne de nouveaux composés antifongiques semi-synthétiques que l'on prépare par acylation de noyaux peptidiques cycliques obtenus par désacylation enzymatique de l'antibiotique peptidique cyclique correspondant.

L'antibiotique peptidique cyclique est un composé antifongique ayant la formule générale

dans laquelle R, R1, R2, R3 et R4 sont définis ci-dessous.

Dans toute cette demande, les formules des peptides cycliques, comme la formule I, supposent que les amino-acides représentés sont en configuration L.

Les facteurs A, B, D et H de A-30912 sont des antibiotiques peptidiques cycliques de formule générale 1 où
R est le groupement linoléoyle [cis,cis CH3(CH2)4-CH=CHCH2CH=
CH-(CH2)7-CO-1.

Le facteur A de A-30912 a la formule I dans laquelle R1 R et R4 sont tous OH et R2 est H.

Le facteur B de A-30912 a la formule I dans laquelle R1 et R2 sont tous deux H et R3 et R4 sont tous deux OH.

Le facteur D de A-30912 a la formule I dans laquelle
R1, R2, R3 et R4 sont tous H.

Le facteur H de A-30912 a la formule I dans laquelle R1 et R4 sont tous deux OH, 2 est Il et R 3 est CII 30.

L'antibiotique S 31794/F01 est un peptide cyclique antifongique de formule I dans laquelle R est un groupement myristoyle et R, R et R4 sont OH et R est-CO-NH2.

Chaque facteur est isolé du complexe A30912 qui contient les autres facteurs arbitrairement appelés facteurs
B, C, D, E, F et G. Le complexe A-30912 et les facteurs A à
G individuels sont décrits par M. Hoehn et K. Nichet dans le brevet des E.U.A. N 4.024.245. Le facteur A de l'antibiotique A-30912 est identique à l'antibiotique A-22802 qui est décrit dans le brevet des E.U.A. N 4.024.246. I1 a également été trouvé que le facteur A est identique à l'échinocandine B antibiotique [voir F. Ben'et al., Helv.

Chim. Acta, 57, 2459 (1974) et brevet suisse N 568.386] et à l'antibiotique SL 7810/F [voir C. Keller-Juslen et al.

Tetrahedron Letters, 4147 (1976) et brevet belge N 834.289].

Le facteur A de l'antibiotique A-30912 est préparé par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; (b) Aspergillus nidulans NRRL 8112 (c) Aspercrillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860 ; (d) Asperqillus rugulosus NRRL 8039 ; ou (e)
Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

On a également trouve que le facteur B est identique à l'échinocandine C antibiotique [voir R. Traber et al., Helv.

Chim. Acta, 62, 1252 (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/F-II [voir le brevet belge N 834.2891.

On prépare le facteur B de l'antibiotique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; (b) Aspergillus nidulans var. echinulatus
A-32204, NRRL 3860 ; (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 ; ou (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 1440.

On a également trouvé que le facteur D est identique à l'échinocandine D antibiotique [voir R. Traber et al.,
Helv. Chim. Acta, 62, 1252 (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/F-III |voir le brevet belge N 834.289|.

On prépare le facteur D de l'antibiotique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; (b) AspereXillus nidulans var.

echinulatus A-32204, NRRL 3860 ; (c) Asperqillus rugulosus
NRRL 8039 (voir le brevet belge NO 834.289) ; ou (d)
Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Le facteur H est un facteur de l'antibiotique A-30912 découvert plus tard, et il est décrit dans la demande de brevet français N" 80 12212dont la description est incorporée ici par voie de référence.

Le facteur H de A-30912 est préparé par fermentation en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ou (b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Une sous-culture de A. nidulans var. roseus a été déposée et fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Laboratory,
U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service,
Peoria, Illinois 61604, où elle est disponible au public sous le numéro NRRL 11440.

Quand on utilise une souche de A. nidulans var.

roseus NRRL 11440 pour produire l'un quelconque des facteurs A-30912, on obtient un ensemble complexe de facteurs qui pour des raisons de commodité est appelé complexe antibiotique
A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du complexe antibiotique A-42355, tandis que les facteurs B, D et H sont des facteurs mineurs. Les préparations 2 à 7 suivantes illustrent la préparation du complexe A-42355 et l'isolement et la purification des différents facteurs de
A-30912.

Dans la molécule antibiotique de formule IJ la chaine latérale linoléoyle (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement a-amino du reste ornithine. On a trouvé de façon surprenante que la chaîne latérale linoléoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans modifier l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le micro-organisme
Actinoplanes utahensis NRRI 12052 ou un de ses variants.

Pour effectuer la désacylation, on ajoute le facteur approprié de l'antibiotique A-30912 à une culture du micro-organisme et on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce que la désacylation soit pratiquement complète. Le noyau cyclique ainsi obtenu est séparé du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Au contraire des facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912, le noyau cyclique (ne possédant pas la chaîne latérale linoléoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique.

L'antibiotique S31794/F-1, qui est décrit dans la demande de brevet allemand publiée après examen N 2.628.965 et dans le brevet des E.U.A. N 4.173.629, est produit par
Acrophialophora limonispora nov. spec. Dreyfuss et Muller
NRRL 8095. S30794/F-1 a les caractéristiques suivantes p.f. 178-1800C (avec décomposition) (amorphe) ou 181-1830C (avec décomposition) (cristallisé) ; [e] DO ~ 24 (c 0,5, CH30H) ou + 370 (c 0,5, pyridine) (cristallisé) ; maxima d'absorption UV dans le méthanol à 194 nm (E1%cm = 807), 225 nm (épaulement) E1%cm = 132) 276 nm (E1%cm = 12,8) 284 nm (épaulement) E1 cm = 10,5) ; un spectre RMN du 13 1 cm carbone C dans le deuterométhanol (190 mg dans 1,5 ml de deuterométhanol, en utilisant le tétraméthylsilane comme étalon interne) ayant les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé)
PPM PPM PPM
176,2 75,5 51,2
175,0 74,0 39,7
173,7 71,0 38,8
172,6 70,5 36,6
172,0 69,7 34,8
171,8 68,0 32,8
171,7 62,2 30,6
168,6 58,3 26,7
157,7 57,0 23,5
132,5 56,2 19,7
129,0 55,4 14,3
115,9 52,9 11,1
76,6 une analyse élémentaire approximative (après séchage du matériau cristallisé pendant deux heures sous vide poussé à 1000C) comme suit : 55,5-56,5 g de carbone, 7,5-7,7 % d'hydrogène, 10,5-10,8 % d'azote et 25,5-26,0 '? d'oxygène il il est facilement soluble dans le méthanol, l'éthanol, la pyridine, le diméthylsulfoxyde et faiblement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, le benzène et l'hexane ; et a une activité antifongique, en particulier contre Candida albicans.

On prépare l'antibiotique S31794/F-1 par culture aérobie en immersion de Acrophialophora limonispora NRRL 8095 comme décrit dans les préparations 8 et 9. Ce microorganisme fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Center, U.S.

Department of Agriculture, Agricultural Research Culture
Collection, North Central Reyion, Peoria, Illinois 61604, où elle est disponible au public sous le numéro d'accès
NRRL indique.

L'antibiotique S31794/F-1 a une activité antifongique, en particulier contre les souches Candida comme
Candida albicans. Ainsi, la production et l'isolement de l'antibiotique peuvent être contrôlés par bioautographe en utilisant une espèce Candida comme Candida albicans.

Dans la molécule de l'antibiotique S31794/F-1 de formule I, où R1, R3 et R4 sont tous des groupements hydroxy et R2 est un groupement -CO-NH2, la chaîne latérale myristoyle (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement a-amino du reste dihydroxyornithine. On a trouvé de façon surprenante que la chaîne latérale myristoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans nuire à l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le microorganisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052 ou un de ses variants.Pour effectuer la désacylation, on ajoute l'antibiotique S31794/F-1 à une culture du micro-organisbe et on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce que la désacylation-soit pratiquement complète. re noyau cyclique ainsi obtenu est sépare du bouillon dc fermentation par des procédés connus dans le domaine. Au contraire de l'antibiotique S31794/F-1, le noyau cyclique (ne présentant pas la chaîne latérale myristoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique.

Les noyaux peptidiques cycliques fournis par les réactions de désacylations enzymatiques susmentionnées des antibiotiques de formule I sont représentés par la formule générale II.

Le composé de formule II où R1, R3 et R4 sont tous des groupements hydroxy et R2 est H est le noyau du facteur A de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912A". Le noyau de A-30912A a une formule brute de C34H51N7O15 et un poids moléculaire de 797,83.

Le composé de formule II où R et R sont tous deux
H et R et R4 sont tous deux OH est le noyau du facteur B de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelè ici "noyau de A-30912B". Le noyau de A-30912B a une formule empirique de C341150N7O14 et un poids moléculaire de 781,81.

Le composé de formule II où R1, R2, R et R4 sont tous des atomes d'hydrogène est le noyau du facteur D de
A-30912 et sera appelé ici pour des raisons de commodité "noyau de A-30912D". Le noyau de A-30912D a une formule brute de C34H51N7O12 et un poids moléculaire de 749,83.

Le composé de formule II où R et R4d sont tous deux
OH, R2 est FI et R3 est CH3O- est le noyau du facteur H de
A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-39012H".

Le composé de formule II dans laquelle R1, R3 et R 4 sont OH et R2 est -CO-NH2 est le noyau de l'antibiotique
S 31794/F-1 et sera appelé ici "noyau de S 31794/F-1". Le noyau de S 31794/F-1 a une formule brute de C35H52N8016 et un poids moléculaire de 840,87.

L'enlèvement de la chaîne latérale fournit un groupement a-amino primaire libre dans le reste ornithine du peptide cyclique. Comme le verra l'homme de l'art, les noyaux peuvent être obtenus sous la forme de l'amine libre ou sous la forme d'un sel d'addition d'acide . Bien que l'on puisse utiliser un quelconque sel d'addition d'acide approprié, on préfère ceux qui sont non toxiques et acceptables sur le plan pharmaceutique.

Le procédé de préparation de chaque noyau à partir de l'antibiotique approprié à l'aide d'une fermentation utilisant Actinoplanes utahensis NRRL 12052 est décrit dans la demande de brevet déposée le même jour que la présente demande de brevet sous le N
Des cultures d'especes représentatives d'Actinopnanaceae sont mises à la disposition du public au Northern
Regional Research Laboratory sous les numéros d'accès suivants
Actinoplanes utahensis NRRL 12052
Actinoolanes missouriensis NRRL 12053
Actinoplanes sp. NRRL 8122
Actinoplanes sp. NRRL 12065
Streptosporangium roseum
var. hollandensis NRRL 12064
L'efficacité d'une quelconque souche- donnée de micro-organismes appartenant à la famille des Actinoplanaceae pour la mise en oeuvre de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le micro-organisme un milieu de culture approprié. On fait incuber la culture à environ 280C pendant deux ou trois jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture l'un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient le pH du milieu de fermentation à environ 6,5. On contrôle la culture pour son activité en utilisant une analyse par
Candida aibîcans. La perte de l'activité antibiotique est unie indication que le micro-organisme a produit l'enzyme nécessaire pour la désacylation.Ceci doit cependant etre vérifié en utilisant l'un des procédés suivants : 1) analyse par chromatographie liquide sous pression élevée pour déterminer la présence du noyau intact ; ou 2) réacylation avec une chaîne latérale appropriée (par exemple linoléoyle, stéaroyle, palmitoyle ou myristoylè) pour rétablir l'activité.

On sait que d'autres substances antibiotiques possèdent le même noyau que celui de facteur A de l'antibiotique A-30912. Ces antibiotiques diffèrent du facteur A de l'antibiotique A-30912 en ce que des groupements acyledifférents sont présents à la place du groupement linoléoyle (R) de la formule I. De tels antibiotiques sont : (a) le facteur A de A-30912-tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F tétrahydro échinocandine B) décrit dans le brevet belge NO 834.289 et par F. Benz et al., Helv. Chim. Acta, 57 2459 (1974), composé qui est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle ; et (b) l'aculaécine A, qui est un composant du complexe d'aculaécine (préparée par fermentation en utilisant Aspergillus aculeatus NRRL 8075) et est décrit dans le brevet des E.U.A. NO 3.978.210. Comme décrit dans le brevet belge NO 859.067, dans l'aculaécine A, la chaîne latérale palmitoyle est présente à la place du groupement linoléoyle. Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur A de A-30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol sous une pression positive. Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné et l'aculaécine A peuvent tous deux être utilisés comme substrats pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

On sait également qu'une autre substance antibiotique possède le même noyau que le facteur B de l'antibiotique A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur B de l'antibiotique A-30912 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du ropemcnt linoléoyle R de la formule I, est le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné (tetrahydro-SL 7810/F-II ; tétrahydro échinocandine C) décrit par R. Traber et al., llelv.

Chim. Acta, 62 1252 (1979). Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur B de A-30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol sous pression positive. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur B de l'antibiotique A-30912 pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

On sait en outre qu'une autre substance antibiotique possède le meme noyau que le facteur D de A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur D de l'antibiotique
A-30912 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du groupement linoléoyle (R) de la formule I, est le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-III ; tétrahydro-échinocandine D) décrit par R.

Traber et al., Helv. Chim. Acta, 62 1252 (1979). Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné est décrit par la formule I quand
R est un groupement stéaroyle. Le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur D de l'antibiotique A-30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol sous pression positive. Le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut etre utilisé comme substrat à la place du facteur D de A-30912 antibiotique pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

Dans le facteur FI de l'antibiotique A-30912, le groupement 5-hydroxy présent dans le reste dihydroxyornithine du noyau peptidique est méthylé, tandis que dans le facteur A de l'antibiotique A-30912, le groupement 5hydroxy n'est pas substitué. On verra donc que l'on peut préparer le facteur H de façon synthétique en méthylant le facteur A selon des procédés classiques pour préparer un éther aliphatique à partir d'un alcool. On verra également que le facteur A peut être alkylé avec d'autres groupements alkyle inférieur pour former des homologues à groupements alkyloxy de la molécule du facteur H. Les homologues à groupements alkyloxy du facteur H que l'on peut préparer par synthèse à partir du facteur A, sont connus sous le nom d'homologues du type facteur H de A-30912.Les composés de formule II où R1 et R4 sont tous deux OH, R2 est Il et R3 est un groupement alkyloxy en C2-C6 sont ici appelés comme les "noyaux du type A-30912H".

On verra également que la chaîne latérale linoléoyle du facteur Il de A-30912 ou des homologues de type facteur H de A-30912 peut être hydrogénée selon des techniques classiques pour former le facteur H de A-30912 tétrahydrogéné ou le dérivé tétrahudrogéne correspondant des homologues à groupements alkyloxy (R est un groupement stéaroyle). On peut également préparer les dérivés tétrahydrogénés en hydrogénant d'abord le facteur A de l'antibiotique A-30912 pour obtenir le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné puis en formant le dérivé alkyloxy désiré.

Il est entendu que le facteur H de l'antibiotique A-30912, le facteur H de A-30912 tétrahydrogéné,.un homologue à groupements alkyloxy en C2-C6 du facteur H ou un dérivé tétrahydrogéné d'un homologue du facteur H à groupement alkyloxy en C2-C6 peuvent être utilisés comme substrat pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

L'invention qui fait l'objet de la présente demande de brevet décrit de nouveaux composés obtenus par acylation de noyaux peptidiques cycliques de formule II. Les composés de la présente invention ont la formule chimique décrite par la formule III

dans laquelle R est H ou OH et,
quand R est H, R est H et R et R4 sont tous deux
H ou tous deux OH, et
quand R est OH, R est H, R est OH ou un groupement alkyloxy en C1-C6 et R4 est OH ou bien R est -CO-NH2 et R et
R4 sont tous deux OH ;
R5 est un groupement N-alcanoyl -amino-acyls de formule

oû ::
W est un radical aminoacyle divalent de formule

où A est un groupement alkylene en C1-C10 ou cycloalkylène en C5-Cs

dans laquelle R7 est un groupement hydroxyméthyle, hydroxyéthyle, mercaptométhyle, mercaptoéthyle, méthylthioéthyle, 2-thiényle, 3-indole-méthyle, phényle, benzyle ou phényle substitué ou benzyle substitué dont le noyau benzène est substitué par un radical chloro, bromo, iodo, nîtro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C3

dans laquelle X est un atome d'hydrogène, de chlore, de brome ou d'iode ou un groupement nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alcoxy en C1
C3, mercapto, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylecarbamyle en C1-C3

dans lesquelles X1 est un atome de chlore, de brome ou d'iode

ou

où B est un radical divalent de formule -(CH2)n- où n est un entier de 1 à 3 ; -CH=CH -CH=CH-CH2- ; ou

et R6 est un groupement alkyle en C1-C17 ou alcényle en C2 C17.

Tels qu'utilisés ici,les termes alkylène, alkyle, alcoxy, alkylthio et alcényle designent les chaînes hydrocarbonées ramifiées et droites. Le terme alkyle désigne un radical hydrocarboné saturé monovalent. Le terme alcényle désigne un radical hydrocarboné insaturé monovalent contenant une, deux ou trois doubles liaisons, qui peuvent être en configuration cis ou trans. Alkylène désigne un radical hydrocarboné saturé divalent. Cycloalkylène désigne un radical hydrocarboné sature cyclique divalent.

Des exemples des groupements alkylène en C1-C10 que l'on préfère pour les besoins de cette invention sont -CH2- ;

où R8 est un groupement alkyle en C1
C4 (c'est- -dire méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, nbutyle, t-butyle, iso-butyle ou 1-methylpropyle) ; -(CEI2)m où m est un entier de 2 à 10 , et CH3-(CH2)q-CH-(CH2)p-, où p est un entier de 1 à 8 et q est un entier de 0 à 7, pourvu que p + q ne soit pas supérieur à 8.

Des exemples de groupements alkyle en C1-Cl7 que l'on préfère pour les besoins de la présente invention sont
(a) CH3- (b) -(CH2)nCH3 où n est un entier de 1 à 16 cet et

où r et s sont indépendamment un entier de 0 à 14 pourvu que r + s ne soit pas supériour à 14.

Des exemples des radicaux alcényle en C2-C17 que l'on préfère pour les besoins de cette invention sont
(a) -(Ch2)t-CH=CH-(CH2)u-CH3 où t et u sont
indépendamment un entier de 0 à 14 pourvu que
t + u ne soit pas supérieur à 14.

(b) -(CH2)dv-CH=CH-(CH2)y-CH=CH-(CH2)2-CH3
où v et z sont indépendamment un entier de 0
à 11 et y est un entier de 1 à 12 pourvu que
v + y + z ne soit pas supérieur à 11.

On préfère en particulier les exemples suivants de groupements alkyle en C1-C17 :
CH3
CH3(CH2)5 CHj(CEI2)6-
CH3(CH2)8
CH3(CH2)10
CH3(CH2)12
CH3(CH2)14
CH3(CH2)16
On préfère en particulier les exemples suivants de groupements alcényle en C2-C17 cis-CH3(CEl2)5CH=CH(CH2)7
trans-CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7
cis-CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4
trans-CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4
cis-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7
trans-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-
cis-CH3(CH2),CH"CH(CH2 )9-
trans-CH3(CH2)5CH=CH(CH2)9-
cis, cis-CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)
trans, trans-CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7
cis, cis, cis-CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH-(CH2)7
Quand "W" est un radical divalent de formule

l'homme de l'art verra que la fonction

et la fonction -NH- peuvent être placées sur le noyau benzénique en position ortho, meta ou para l'une par rapport à l'autre. Le substituant représenté par X peut se trouver en une quelconque position disponible sur le noyau benzénique. Les composés préférés sont ceux dans lesquels X est un atome d'hydrogène et les fonctions

et -Nil- sont placées en configuration para.

Les expressions "phenyle substitué" et "benzyle substitué" telles qu'utilisées pour R7 dans la formule III, désignent la substitution d'un groupement sur l'une quelconque des positions disponibles du noyau benzène, c'est à-dire que le substituant peut se trouver en position ortho, mèta ou para. L'expression "alkyle en C1-C3,, telle que définie par R ou X dans la formule III comprend les groupements methyle, éthyle, n-propyle et iso-propyle.

L'invention fournit en particulier un composé de formule

dans laquelle R1 est H ou 011 et quand R est H, R est H et R et R4 sont tous
deux H ou tous deux OH, et
quand R est OH, R est H, R est OH ou un groupement alkyloxy en C1-C6 et R4 est OH, ou bien R2 est un groupement -CO-NH2 et R3 et R4 sont tous deux OH R5 est un groupement N-alcanoyl-amino-acyle de formule

où
W est un radical aminoacyle divalent de formule

où A est un groupement alkylène en C1-C10 ou cycloalkylène en C5-C6 ;;

où R7 est un groupement hydroxyméthyle, hydroxyéthyle, mercaptométhyle, mercaptoéthyle, méthylthioéthyle, 2-thiényle, 3-indole-méthyle, phényle, benzyle ou phényle substitué ou benzyle substitué dont le noyau benzène est substitué par un radical chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alkylthio en
C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C3;

où X est un radical hydrogène, chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alcoxy en C1-C3, mercapto, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C ;

où X1 est un atome de chlore, de brome ou d'iode

où B est un radical divalent de formule
(CH2)n où n est un entier de 1 à 3 ; -CH=CH -CH=CH-CH2 ; ou

et R6 est un groupement alkyle en C1-C17 ou alcényle en C2 cl7 .

Les composés de formule III inhibent la croissance des champignons pathogènes comme le montrent des modes opératoires d'essais biologiques classique. Les composés sont donc utilisables pour lutter contre la croissance de champignons sur des surfaces d'environnement (en tant qu'antiseptiques) ou pour le traitement d'infections provoquées par des champignons. L'activité antifongique des composés a été démontrée vis-à-vis de Candida albicans in vitro dans des essais de diffusion sur disques et plaques de gélose et dans des essais de dilution sur gélose, ou dans des essais in vivo sur des souris infectées par C. albicans. Les composés sont ainsi particulièrement utilisables pour traiter les infections provoquées par des souches de C. albicans (candidose).Les composés de formule III présentent également une activité in vitro dans les essais de diffusion sur disques et plaques de gélose vis-à-vis de Trichophyton mentagrophytes, un organisme dermatophyte. On a également trouvé une activité dans les essais de diffusion sur disques et plaques de gélose in vitro vis-à-vis de Saccharomyces pastorianus et Neurospora crassa. Certains composés (comme décrit dans l'Exemple 40,
Tableau 8), donnent des niveaux sanguins significatifs après administration orale chez les souris.

Quand on l'administre à un chien par voie intraveineuse à raison de 100 mg/kg par jour pendant cinq jours, le composé de formule III dans laquelle R1, R3 et R4 sont tous OH, R2 est H et R5 est un groupement n-dodécanoyle p-aminobenzoyle, ne présente pas de signes extérieurs de toxicité bien que l'on observe des niveaux accrus de transaminase glutamo-pyruvique sérique.

On prépare les composés de formule IIT en acylant le noyau approprié sur le groupement a-amino de l'ornithine avec la chalne latérale N-alcanoyl-aminoacyle ou N-alcénoylamino-acyle appropriée en utilisant les procedés classiques dans le domaine pour former une liaison amide. L'acylation est généralement effectuée en faisant réagir les noyau avec un dérivé activé de l'acide (formule IV) correspondant -à la chaîne latérale acyle désire.

(W et R6 sont tels que définis précédemment).

Par l'expression "dérivé activé", on désigne un dérivé qui rend la fonction carboxy de l'agent d'acylation réactive à la copulation avec le groupement amino primaire pour former la liaison amide qui lie la chaîne latérale acyle au noyau. Les dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et leurs procédés d'utilisation comme agents d'acylation d'une amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivé activés préférés sont : (a) un halogénure d'acide (par exemple le chlorure d'acide), (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride d'acide alcoxyformique ou un anhydride d'acide aryloxyformique) ou (c) un ester activé (par exemple un ester 2,4,5-trichlorophénylique, un ester de N.-hydroxy- benzotriazole ou un ester de N-hydroxysuccinimide).D'autres procédés d'activation de a fonction carboxy comprennent la réaction de l'acide carboxylique avec un carbonyldiimide (par exemple le N,N-dicyclohexylcarbodiimide ou le N,N'diisopropylcarbodiimide) pour obtenir un intermédiaire réactif qui, en raison de son instabilité, n'est pas isolé, la réaction avec l'amine primaire etant effectuée in situ.

Un procédé préféré de préparation des composés de formule III est le procédé utilisant l'ester actif.

L'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique du Nalcanoylamino-acide ou N-alcénoylamino-acide désiré de formule IV comme agent d'acylation est nettement préférée.

Dans ce procédé, on fait réagir un excès de l'ester actif avec le noyau, à la température ambiante dans un solvant organique non réactif comme le diméthylformamide (DMF). La durée de la réaction n'est pas déterminante bien que l'on préfère une durée d'environ 15 à environ 18 heures. A la fin de la réaction, on chasse le solvant et on purifie le résidu, comme par chromatographie sur colonne en utilisant du gel de silice comme phase fixe et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant.

On peut préparer commodément les esters 2,4,5trichlorophényliques des N-alcanoylamino-acides ou Nalcénoylamino-acides, en traitant l'amino-acide désiré (formule IV) par le 2,4,5-trichlorophénol en presence d'un agent de copulation, comme le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide.

D'autres procédés appropriés de préparation des esters d'amino-acides seront évidents pour l'homme de l'art.

Les N-alcanoylamino-acides ou N-alcénoylamino- acide s sont des composés connus ou bien ils peuvent être préparés par acylation de l'amino-acide approprié avec le groupement alcanoyle ou alcénoyle approprie en utilisant des procédés classiques, comme ceux décrits ci-dessus. Une façon préférée de préparation des N-alcanoylamino-acides consiste à traiter l'amino-acide approprié par un chlorure d'acide alcanoique dans la pyridine. Les acides alcanoSques ou acides alcénorques, leurs dérives activés et les amino-acides utilisés dans la préparation des produits de l'inventioln sont des composés connus ou bien ils peuvent être préparés par des procédés connus ou par modification de procédés connus, qui seront évidents pour l'homme de l'art.

Si un amino-acide particulier contient un groupement fonctionnel acylable autre que le groupement amino, l'homme de l'art verra qu'un tel groupement doit être protégé avant la réaction de l'amino-acide avec le réactif utilisé pour fixer le groupement alcanoyle ou alcénoyle. Des groupements protecteurs appropriés peuvent être un quelconque groupement connu dans le domaine comme utilisable pour la protection d'un groupement fonctionnel d'une chaîne latérale dans la synthèse des peptides. De-tels groupements sont bien connus, et le choix d'un groupement protecteur particulier et son procédé d'utilisation seront facilement connus de l'homme de l'art [voir par exemple "Protective Groups In Organic
Chemistry", M. McOmie, Editor, Plenum Press, N.Y., 1973.

On verra que certains amino-acides utilisés dans la synthèse des produits de cette invention peuvent exister sous formes optiquement actives, et l'on peut utiliser tant la configuration naturelle (configuration L) que l'autre configuration (configuration D) pour les substances de départ et l'on obtiendra des produits qui'font partie de la-présente invention.

Quand on les utilise de façon générale, la dose des composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection, et l'état physique du sujet que l'on traite. Lathérapie sera amorcée à de faibles doses, la dose étant augmentée jusqu'à ce que l'on obtienne l'effet antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire sous la forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle on peut ajouter, si on le désire, divers agents de conservation, tampons, de solubilisation ou de mise en suspension classiques acceptables sur le plan pharmaceutique. D'autres additifs, comme du sel ou du glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques.

Les proportions et la nature de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art.

Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang sic;niFicatiEs après administration orale (voir l'Exemple 40, Tableau 8) et peuvent être administrés de façon systémique par voie orale. Pour l'utilisation orale, de tels composés peuvent être administrés en combinaison avec des supports ou excipients acceptables sur le plan pharmaceutique sous forme de capsules, comprimés ou poudres.

La nature et la proportion de ces supports ou excipients sont bien connues de l'homme de l'art.

Quand on les utilise pour traiter les infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients classiques pharmaceutiquement acceptables convenant pour l'utilisation intravaginale. Les compositions conçues pour l'administration intravaginale sont bien connues de l'homme de l'art.

La préparation et l'utilisation des composés de la présente invention son: illustrées dans les exemples suivants
Préparation 1
Fermentation d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052
On prépare une culture mère d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052 et on l'entretient sur une culture inclinée de gélose.Le milieu utilisé pour préparer la culture inclinée est choisi parmi l'un des suivants
Milieu A Ingrédient Quantité
Farine d'avoine pour bébé 60,0 q
Levure . 2,5 q
K2HPO4 1,0 g
Solution minérale de Czapek' 5,0 ml
Gélose 25,0 g
Eau désionisée q.s.p. 1 litre le pH avant passage à l'autoclave est environ 5,9 ; on ajuste le pH à 7,2 par addition de NaOH ; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 6,7.

:: La solution minérale de Czapek a la composition suivante
Ingrédient Quantité
FeSO4.7H2O (dissous dans 2 ml
d'HCl concentré) 2 g
KC1 100 g
MgSO4.7H2O 100 g
Eau désionisée q.s.p. 1 litre
Milieu B
Ingrédient Quantité
Dextrine de pomme de terre 5,0 g
Extrait de levure 0,5 g
Hydrolysat enzymatique de caséine:: 3,0 g
Extrait de boeuf 0,5 g
Dextrose 12,5 g
Amidon de mais 5,0 g
Peptone de viande 5,0 g
Mélasse noire 2,5 g
MgSO4.7H2O 0,25 g
CaCO3 1,0 g
Solution minérale de Czapek 2,0 ml
Gélose 20,0 g
Eau désionisée q.s.p. 1 litre
N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, New
Jersey, U.S.A.

On inocule la culture inclinée avec Actinoplanes utahensis NRRL 12052, et on fait incuber la culture inoculée à 300C pendant environ 8 à 10 jours. On utilise à peu près la moitié de la culture pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante
Ingrédient Quantité
Farine d'avoine pour bébé 20,0 g
Saccharose 20,0 g
Levure 2,5 g
Grains séchés de distillation:: 5,0 g
K2HPO4 1,0 g
Solution minérale de Czapek 5,0 ml
Eau désionisée q.s.p. 1 litre ajuster à pH 7,4 avec NaOH ; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 6,8.

National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York,
New York, U.S.A.

On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à large encolure à 300C pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

On peut utiliser ce milieu végétatif incubé directement pour inoculer un milieu végétatif de second stade.

Ou bien et de préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieur en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A.

Dailey et C.E. Higgens, "Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10, 364-367 (1973) pour les détailsl. Les suspensions ainsi préparées sont conservées dans la phase vapeur de l'azote liquide.

On utilise une suspension conservée ( ml) ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de premier stade (ayant la composition décrite ci-avant). On fait incuber comme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé.

Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de second stade ayant la même composition que le milieu végétatif de premier stade. On fait incuber le milieu de second stade dans un flacon Erlenmeyer de 2 litres à large encolure à 30tC pendant environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer 100 1 d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants
Milieu I
Ingrédient Quantité (g/l)
Farine d'arachide 10,0
Peptone de viande soluble 5,0
Saccharose 20,0
KH2PO4 0,5
K2HPO4 1,2
MgSO4.7H2O 0,25
Eau du robinet q.s.p. 1 litre
Le pH du milieu est environ 6,9 après stérilisation par passage à l'autoclave à 1210C pendant 45 minutes sous une pression d'environ 1,1 à 1,24 bar.

Milieu II
Ingrédient Quantité (g/l)
Saccharose 30,0
Peptone 5,0
K2HP04 1,0
KC1 0r5
MgSO4.7H2O 0,5
FeSO4.7H2O 0,002
Eau désionisée q.s.p. 1 litre
On ajuste le pH à 7,0 avec HCl ; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 7,0.

Milieu III
Ingrédient Quantité (g/l)
Glucose 20,0
NH4C1 3,0
Na2SO4 2,0
ZnCl2 0,019
MgC12.6H2O 0,304
FeCl3.6H2O 0,062
MnC12.4H2O 0,035
CuCl2.2H2O 0,005
CaCO3 6,0
KH2PO4:: 0,67
Eau du robinet q.s.p. 1 litre
Sterilisé séparément et ajouté de façon aseptique
Le pH final est d'environ 6,6.

On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans une cuve de fermentation de 165 1 à une température d'environ 300C pendant environ 42 heures. On agite le milieu de fermentation avec des agitateurs classiques à environ 200 tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour maintenir le taux d'oxygène dissous supérieur à 30 % à la saturation par l'air à la pression atmosphérique.

Preparation 2
Préparation du mélange antibiotique A-42355
A. Fermentation en flacon agité
On prépare une culture d'Aspergillus nidulans var.

roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante
Ingredient Quantité
Glucose 5g
Extrait de levure 2 g
CaCO3 3g
Jus de légumes 200 ml
Gélose xx 20 g
Eau désionisée q.s.p. 1 litre (pH initial 6,1)
Jus V-8, Campbell Soup Co., Camden, N.J., U.S.A.

:::: Meer Corp.

La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la culture à 250C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile.

On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un flacon de 250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante
Ingrédient Quantité
Saccharose 25 g
Mélasse noire 36 q
Liqueur de macération de mais 6 g
Extrait de malt 10 g
K2HPO4 2g
Hydrolysat enzymatique
de caséine:: 10 g
Eau du robinet 1100 ml (pH initial 6,5-6,7)
N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J., U.S.A.

On fait incuber le milieu végétatif inocule à 250C pendant 48 heures, à 250 tours par minute, sur un agitateur de type rotatif. Après 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur (de type Waring), puis on le fait incuber à nouveau pendant les 24 heures restantes. Ou bien, on peut faire incuber le milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogéneiser pendant 15 secondes à faible vitesse.

Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure, Jn maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour cette conservation dans de nombreuses petites ampoules, comme suit
On mélange les cultures végétatives volume/volume avec une solution de suspension ayant la composition suivante
Ingrédient Quantité
Glycérol 20 ml
Lactose 10 g
Eau désionisée q.s.p. 100 ml
On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide.

On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux d'ensemencement liquides. On fait incuber les cultures inclinées à 250C à la lumière pendant 7 jours.

B. Fermentation en réservoir
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlenmeyer à large ouverture de deux litres, à 250C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

Le milieu de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants
Milieu IV
Ingrédient Quantité
ZnSO4.7H2O 0,00455 g/l
Peptone de viande soluble: 30,5 g/l
Farine de soja 15,5 g/l
Dextrine de tapioca:: 2,0 g/l
Mélasse noire 10,5 g/l
Hydrolysat enzymatique
de caséine:::::: 8,5 g/l
Na2HPO4 4,5 g/l
MgSO4.7H2O 5,5 g/l
FeSO4.7H2O 0,1 g/l
Huile de coton 40,0 ml
Antimoussant:::::::: 1,0 ml
Eau du robinet 1000,0 ml (pH initial 6,8-7,0)
Peptone, Amber Laboratories, Juneau Wisconsin, U.S.A.

Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, Illinois, U.S.A.

N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

U.S.A.

:::::::: P2000, Dow Corning, Midland, Michigan, U.S.A.

Milieu V
Ingrédient Quantité
Glucose 2,5 %
Amidon 1,0 %
Peptone de viande soluble:: 1,0 %
Mélasse noire 1,0 %
CaCO3 0,2 %
MgSO4.7H2O 0,05 %
Hydrolysat enzymatique
de caséinexx 0,4 %
Antimoussantxxx 0,02 %
Eau du robinet q.s.p. volume
O.M. Peptone
:::: N-Z-Amine A
:::^: Antifoam "A", Dow Corning
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 à une température de 250C pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile, en maintenant le niveau d'oxygène dissous supérieur à environ 50 % de la saturation en air.

C. Milieu végétatif de troisième stade
Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par 100 litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer le réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré a la composition suivante
Ingrédient Quantité
Saccharose 25 g
Mélasse noire 25 g
Liqueur de macération de mais 6 g
Hydrolysat enzymatique de
caséine:: 10 g
Extrait de malt 10 q
K2HPO4 2g
Eau du robinet 1000 ml (pH initial 6,1) ::N-Z-Case
Préparation 3
Séparation du mélange antibiotique A-42355
On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II, avec 4280 litres de méthanol pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Supercel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pH du filtrat à 4,0 par addition d'HCl 5 N. On extrait le filtrat acidifié deux fois avec des volumes égaux de chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques et on les concentre sous vide jusqu'à un volume de 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355.On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris.

Séparation et identification des facteurs de A-30912
Préparation 4
Séparation du facteur A de A-30912
On dissout 1 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 7 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur [Colonne de Chromatographie CLFPCE:: (chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées) Michel
Miller, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 083601 garnie de résine à phase inverse de gel de silice LP-I/Cl8 (10-20 microns), celui a été préparée comme décrit dans la Préparation 10, par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes.La colonne est garnie dans le système 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, à l'aide du mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11.

Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes (débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist
Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).

Préparation 5
Séparation du facteur B de A-30912
On sépare le mélange A-42355 comme décrit dans la
Preparation 3, mais on chromatographie les extraits chloroformiques concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice (150 1 de gel de silice Grace, qualité 62) à un débit de 2 l/minute. On lave la colonne avec 200 litres de chloroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrile, puis on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau à un débit de 1 l/minute. On recueille des fractions ayant un volume de 200 litres et on les analyse séparément pour déterminer leur activité biologique.L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida aibicans. On réunit les fractions 77 à 103 (1365 litres) et on les concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtration et l'on obtient 119 g de mélange A-42355 enrichi en facteur B. On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthanol. On ajoute la solution méthanolique à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B.

On sépare également ce précipité par filtration et on le sèche, et l'on obtient 24 g supplémentaires dc mlanc
A-42355 enrichi de facteur B sous forme d'une poudre grise.

Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu (1,0 g) est dissous dans 8 ml d'un mélange de 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (Colonne
Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes.

La colonne est garnie d'une résine à phase inversée de gel de silice LP-1/C18 (10-20 microns) préparée comme décrit dans la Préparation 10, à l'aide du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, comme décrit dans la Préparation 11.

Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 10 ml/ minute à environ 7 bars, en utilisant une pompe FMI à piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les minutes. On contrôle L'éluvion de l'antibiotique à 280 nm comme dans la
Préparation 15. On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mg du facteur B de A-30912.

Préparation 6
Isolement du facteur D de A-30912
On réunit et on chromatographie sur une colonne de gel de silice (Grace, qualité 62) les extraits chioroformiques concentrés de deux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus par le procédé décrit dans la Préparation 3. On lave la colonne avec du chloroforme puis on élue avec de l'acéto- nitrile et un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau. On recueille des fractions ayant un volume d'environ 200 1 et on les soumet à une analyse biologique sur disque de papier sur gélose ensemencée avec Candida aibicans. On réunit les fractions actives (850 1) et on les concentre sous vide. On ajoute la solution concentrée (0,7 1) à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur
D.On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise.

On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obtenu (1,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introcluit xur une colonne de el de silice (colonne Michel
Miller, 3,7 cm de diamètre intérieur x 30 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes.

La colonne a été garnie de résine à phase inversée de gel de silice LP-1/C18 (10-20 microns) préparée comme décrit dans la
Préparation 10. Le garnissage a été effectué dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, selon le mode opératoire de garnissage de la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 3,1 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les 2 minutes.

L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm comme décrit dans la Préparation 4. On réunit les fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D de A-30912.

Préparation 7
Séparation du facteur H de A-30912
On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 35 ml du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, on filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm (colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de résine à phase inversée de gel de silice LP-l/C18 (10-20 microns) (Préparation 10) dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans la Préparation 11.

Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 13 ml/ minute à environ 8,3 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes, et l'on recueille une fraction toutes les deux minutes On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similaire. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile.On dissout l'huile dans un petit volume de t-butadol et on lyophilise pour obtenir 173 mg du facteur H brut de
On dissout le facteur H brut de A-30912 (150 mg) dans 8 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile ; on filtre la solution résultante et on la réintroduit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 5,5 bars, et on recueille une fraction toutes les 3 minutes. On contrôle l'éluvion de l'antibiotique à 280 nm. On réunit les fractions 17 et 18 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur Il de A-30912.

Identification des facteurs de A-30912
Les différents facteurs de A-30912 peuvent être iclentifiveF par chromatographie sur couche mince (CCM). Les Rf des facteurs A à G de A-30912, en utilisant la CCM sur gel de silice (Merck, Darmstadt),un système solvant 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans sont indiqués dans le Tableau VII.

TABLEAU VII
Facteur de
A-30912 Rf
A 0,35
B 0,45
C 0,54
D 0,59
E 0,27
F 0,18
G 0,13
Les Rf approximatifs des facteurs A, B, C,D et H de
A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une
CCM sur gel de silice (plaques de gel de silice n0 60 de Merck
Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau VIII.

TABLEAU VIII
Facteur de A-30912 R f - Systèmes solvants
a b c d
Facteur A 0,28 0,14 0,28 0,43
Facteur B 0,39 0,21 0,42 0,47
Facteur C 0,46 0,31 0,51 0,58
Facteur D 0,50 0,38 0,57 0,61
Facteur I-i 0,42 0,27 0,36 0,53
Systèmes solvants
a : acétate d'éthyle:méthanol (3:2)
b : acétate d'éthyle:mêthanol (7:3)
c : acetonitrile:eau (95:5)
d : acetate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:0,25)
On peut également identifier les facteurs A, B, D et
H de A-30912, par chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevés (CLPFCE) analytique, dans les conditions suivantes
Colonne verre, 0,8 x 15,0 cm
Garnissage Nucleosil ]0-C18 (Machery Nagel
and Company) ; garni en utilisant
le mode opératoire de garnissage
en suspens ion de la Préparation
11
Solvant Mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau
et d'acétonitrile
Volume de
l'échantillon 8 vl
Dimension de
l'échantillon 8 pg
Température de la
colonne ambiante
Débit 1,8 ml/minute
Pression environ 14 bars
Détecteur UV à 222 nm (ISCO Model 1800
Variable Wavelength UV-visible
Absorbance Monitor)
Pompe LDC Duplex Minipump
Injection injection sur boucle
Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A,
B, D et H de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau IX.

TABLEAU IX
Facteur de A-30912 Temps de rétention (s)
A 792
B 870
il 990
D 1.140
Préparation 8
Préparation de l'antibiotique S31794/F-1
On produit l'antibiotique S31794/F-1 par culture en immersion d'Acrophialophora limonispora NRRL 8095, en agitant, remuant et/ou aérant à pH 3-8, de préférence 5-7, et à 15-300C, de préférence à 18-270C, pendant 48 à 360 heures, de préférence pendant 120 à 288 heures.

On isole l'antibiotique S31794/F-1 par traitement du bouillon de culture (90 L) avec un mélange 4:1 (90 L) d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et en homogénéisant pendant 30 minutes à la température ambiante. On sépare la phase organique et on l'évapore sous vide à environ 400C. On chromatographie le résidu ainsi obtenu sur environ dix fois sa quantité de gel de silice, en utilisant des mélange de chloroforme et de méthanol (95:5 à 60:40). On réunit les fractions qui ont une activité antifongique et on les chromatographie sur 100 fois leur quantité de "Sephadex
LH-20" avec du méthanol. Les fractions provenant de la colonne de Sephadex et qui ont une activité antifongique sont réunies et rechromatographiées sur 100 fois leur quantité de gel de silice (0,05-0,2 mm) avec un système solvant 71:25:4 de chloroforme, de méthanol et d'eau.Les fractions éluées qui ont une activité antifongique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut
S31794/F-1. On dissout ce produit dans de petites quantités de méthanol et on le précipite avec de l'éther diéthyliqXe pour obtenir S31794/F-1 sous forme d'une poudre amorphe blanche, p.f. i78-1800C (décomposition) après séchage sous vide poussé à 25-30"C. La cristallisation dans dix fois son volume de mélange 80:12:8 d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau donne S31794/F-1 cristallisé, p.f. 181-1830C avec décomposition après séchage sous vide poussé à 200C.

Préparation 9
Séparation de l'antibiotique S31794/F-1
On introduit l'antibiotique S31794/F-1 brut, obtenu comme décrit dans la Préparation 8 après chromatographie sur
Sephadex, sur une colonne de gel de silice (colonne Michel
Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. On utilise le mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. On déplace le solvant dans la colonne en utilisant une pompe FMI avec une conception de piston sans vannes. On contrôle l'dilution de l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à 280 nm comme dans la Préparation 22. On réunit les fractions ayant une activité antifongique et on les concentre sous vide pour obtenir l'antibiotique S31794/F-1.

S31794/F-1 a les R f suivants par chromatographie sur couche mince de gel de silice (Merck, 0,25 mm)
Système solvant Rf Chloroforme: méthanol : eau
(71:25:4) 0,17 - Chloroforme: méthanol: acide
acétique concentré (70:29:1) 0,19
Chloroforme:méthanol (2:1) 0,27 S31794/F-1 peut également être détecté par de la vapeur d'iode.

Préparation 10
Préparation de la résine à phase inversée de gel de silice/
C18
Etape 1 : Hydrolyse
On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (Quantum
Corp., maintenant Whatman) à un mélange de 1650 ml d'acide sulfurique concentré et de 1650 ml d'acide nitrique concentré dans un ballon à fond rond de 5 1 et on agite pour obtenir une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de vapeur pendant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant à refroidissement d'eau fixé sur le ballon.

On refroidit le mélange dans un bain de glace et on le filtre soigneusement en u-tilisant un entonnoir en verre fritté. On lave le gel de silice avec de l'eau désionisée jusqu'à pH neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 1000C pendant deux jours.

Etape 2 : Première silylation
Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1 de toluène. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octadécyltrichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique à 600C. On prend soin d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice.

On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à la température ambiante pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 1 d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit.

Etape 3 : Deuxième silylation
On répète le mode opératoire de la première silylation en utilisant 200 ml d'octadécyltrichlorosilane. On chauffe la suspension à reflux à 60"C pendant deux heures, tout en agitant soigneusement. On recueille le produit final par filtration, on lave avec 3 1 de toluène et 6 1 de méthanol, puis on le sèche sous vide à 500C pendant une nuit (16-20 heures).

Préparation 11
Mode opératoire de garnissage en suspension pour les colonnes Michel-Milier
Renseignements généraux
On utilise ce mode opératoire pour yarnir une colonne de résine à phase inversée de gel de silice/C18 comme celle préparée par le procédé de la Préparation 10.

En général, une pression inférieure à 14 bars et des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension ; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. La pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars ; c LÀ. , assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations.

Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. I1 est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe.

Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies) : 5795-04, 12 ml 5795-10, 110 ml ; 5795-16, 300 ml ; 5795-24, 635 ml ; et 579634, 34 ml.

Le temps nécessaire pour garnir une colonne~er verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience de l'opérateur.

Etapes 1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être deux fois celui de la colonne) . Placer les deux colonnes verticalement avec la colonne réservoir au-dessus.

2. Peser le matériau de garnissage (100 g pour 200 ml de colonne) 3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de garnissage ; utiliser un mélange de 70-80 % de méthanol et de 2030 % d'eau.

4. Bien agiter jusqu'à ce que toutes les- particules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complète des particules par le solvant. Décanter la liqueur surnageante.

5. Délayer la résine avec suffisamment de solvant pour remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réservoir. La colonne doit être préremplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension.

L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats ; cependant, ceci nécessite (a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage.

6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en-dessous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U.A.

NO 4.131.547, bouchon NO 3) ; relier à la pompe cet et commencer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace
Cat. No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute).

7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération (14 bars pour les colonnes importantes et 's bars pour les colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions inférieures à 14 bars seront suffisantes.

8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire le débit et la pression diminuera.

9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrêter la pompe ; laisser la pression tomber à zéro ; débrancher le réservoir ; remplacer le réservoir par une pré-colonne remplir la pre-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsorbant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général. Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe ; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage.

10. Supprimer la pression et débrancher soitJnetlsement la pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques millimètres (2-4) de garnissage au sommet de la colonne placer 1 ou 2 filtres au sommet de la colonne ; appuyer doucement jusqu'au sommet du matériau de garnissage, et placer un bouchon de Teflon au sommet de la colonne jusqu'à confirmation de l'étanchéité. Relier la colonne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée.

Préparation 12
Préparation du noyau de A-30912A
A. Désacylation du facteur A de l'antibiotique A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de culture inclinée A et le milieu de production I et en faisant incuber le milieu de production pendant environ 42 heures.

On ajoute au milieu de fermentation une quantité de facteur
A de A-30912 (340 g de substrat brut qui contient environ 19,7 g de facteur A de A-30912, dissous dans 1,5 1 d'éthanol). On contrôle la désacylation du facteur A dé A30912 par titrage vis-à-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à désacylation complète comme le montre la disparition de l'activité vis-à-vis de C.

albicans.

B. Séparation du noyau de A-30912A
On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et contenant le noyau provenant d'environ 20 g de facteur A de A-30912.

On rejette le gâteau' mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu (environ 93 1) sur une colonne contenant 4,5 1 de résine HP (polymère très poreux DIAION, HP-Series,
Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette-l'effluent ainsi obtenu.

Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes (volume de colonne) d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le 5 bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage.

Puis on éluc la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol (85 1) à un débit de 200-300 ml/minute.

On contrôle l'dilution en utilisant le mode opératoire suivant : on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une de ces parties jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont testés pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida aibicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acyle a une activité, la fraction contient le noyau dc
A-30912A. On concentre l'éluat contenant le noyau de
A-30912A, sous vide jusqu'à un petit volume, et on lyophilise pour obtenir environ 97 a du noyau brut.

C. Purification du noyau de A-30912A par chromatographie
liquide sur phase inversée
On dissout 25 g du noyau de A-30912A brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans 300 ml d'un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne d'acier inoxydable de 4 1 (8 cm x 80 cm) remplie de Lichroprep
RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing
Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal,91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumention
Specialties Co., 4700 Superior Ave. Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6). On recueille par minute des fractions ayant un volume d'environ 500 ml.

En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise, ce qui donne 2,6 g du noyau.

La quantité de solvant nécessaire pour achever ce mode opératoire de séparation chromatographique varie de 7 à ss 1.

D. Caractéristiques du noyau dc A-30912A
(a) formule brute : C34I151N7015'
(b) poids moléculaire : 797,83.

(c) solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le
diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le
méthanol ; insoluble dans le chloroforme, le
toluène et l'éther diéthylique.

(d) Spectre d'absorption infrarouge (pastille de
KBr) présente des maximas d'absorption à 3340 large (OH. liaison hydrogène) ; 2970, 2930 et 2890 (étirement de CH, groupements CI13, CH2, CH aliphatiques), 1660 et 1625 (plusieurs groupements carbonyle C=O) ; 15101550 ; 1430-1450 (déformation de CH "wag"), 1310-1340 ; 1230 -1 1260 ; 1080 ; 835, 650 large et 550 large, cm
(e) le titraae électrométrique dans le diméthyl
formamide aqueux à 66 % indique la présence
d'un groupement titrable avec un pKa d'environ
7,35 (pH initial 7,32).

(f) durée de rétention en chromatographie.liquide
sous pression élevée (K') : 11,52 minutes dans
les conditions suivantes
Colonne : 4 x 300 mm
Garniture : gel de silice/C18
Solvant : mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium,
d'acétonitrile et d'eau
Débit : 3 ml/minute
Pression : 172,5 bars
Détecteur : UV à longueur d'onde variable,
à 230 nm
Sensibilité : 0-0,4 A.U.F.S.

Préparation 13
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12, mais on utilise comme substrat
A-30912A tétrahydrogéné.

Préparation 14
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12 mais en utilisant comme substrat l'aculéacine A.

Préparation 15
Préparation du noyau de A-30912B
A. Désacylation du facteur B de l'antibiotique A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après incubation de la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur B de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

On contrôle la dêsacylation du facteur B de A30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

B. Séparation du noyau de A-30912B
On filtre le bouillon de fermentation ainsi obtenu comme decrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries
Limite, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.

Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'dilution selon le mode opératoire suivant : on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont titres pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912B.On concentre i'éluat contenant le noyau de A-30912B sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

C. Purification du noyau de A-30912B par chromatographie
liquide à phase inversée
On dissout le noyau de A-30912B brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de
Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B
Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 1618 rue du Canal, Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars7 donnant Un del, d'environ ho ml par minute, en utilisant le meme solvant.

On contrôle a séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle Wl (ISCO Absorption Monitor Model UA-5,
Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln,
Nebraska 68D04) avec une unit optique (ISCO Type 6).

En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de
A-30912B purifié.

Préparation 16
On prépare le noyau de A-30912B et on le purifie par le procédé de la Préparation 15, mais on utilise comme substrat A-30912B tétrahydrogéné.

Préparation 17
Préparation du noyau de A-30912D
A. Désacylation du facteur D de A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

On contrôle la désacylation du facteur D de
A-30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

B. Séparation du noyau de A-30912D
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le-paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine l-IP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries
Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.

Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée.

On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de
Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. L'éluat contenant le noyau de A-30912D est concentré sous vide jusqu'à un petit volume et lyophilisé pour obtenir le noyau brut.

C. Purification du noyau de A-30912D par chromatographie
liquide en phase inversée
On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de
A-30912D brut obtenu comme décrit dans le paragraphe C. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de
Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B
Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal, 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, ce qui donne un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant.On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model
UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave.,
Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6)
En se basant sur l'absorption à 280 nin, on combine les fractions contenant le noyau de A-30912D, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de
A-30912D purifié.

Préparation 18
On prépare le noyau de A-30912D et on le purifie par le procédé de la Préparation 17, mais on utilise comme substrat A-30912D tétrahydrogéné.

Préparation 19
Préparation du noyau de A-30912H
A. Désatylation du facteur H de l'antibiotique A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur H de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

On contrôle la désacylation du facteur H de
A-30912 par une analyse sur disque de papier vis-à-vis de
Candida albicans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

B. Séparation du noyau de A-30912H
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries
Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.

Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtre résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée.

On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote non traitée vis-à-vis de ï
Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acyle a une activité, la fraction contien-t le noyau de A-3091211. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-3091211 sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

C. Purification du noyau de A-30912H par chromatographie
liquide en phase inversée
On dissout le noyau de A-30912 brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de
Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B
Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner
la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant.

On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5,
Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln,
Nebraska 68504) équipé d'une unite optique (ISCO Type 6).

Préparation 20
On prepare le noyau de A-30912H et on le purifie par le procédé de la Préparation 19 mais on utilise comme substrat A-30912t1 tétrahydrogéne.

Préparation 21
Préparation du noyau S31794/F-1
A. Désacylation de l'antibiotique S31794/F-1
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après-avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S31794/F-1 dissous dans une petite quantité de méthanol.

On contrôle la désacylation de S31794/F-1 par analyse avec disque de papier vis-à-vis de Candida albicans.

On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à cc que désacylation soit complète comme le montre la (lislearition de l'activité.

B. Séparation du noyau de S31794/F-1
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien, on fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries
Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.

On lave ensuite la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour chasser le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant on prélève deux parties aliquotes à partir de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu a un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie aliquote non traitée pour déterminer leur activité vis- -vis de Candida albicans.Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S31794/F-1. On concentre l'éluat contenant le noyau de S31794/F-1, sous vide jusqu'à un petit volume, et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

C. Purification du noyau de S31794/F-1 par chromatographie
liquide en phase inversée
On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de
S31794/F-1 brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B.

On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de
Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B
Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant.

On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (fSCO Absorption Monitor Model LiA-S,
Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave.,
Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO
Type 6).

En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de S31794/F-1, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de S31794/F-1 purifié.

Préparation 22
Préparation de A-30912A tétrahydroséné
On dissout le facteur A de A-30912 dans l'éthanol.

On réduit PtO2 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur A de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir
A-30912A tétrahydrogéné.

Préparation 23
Préparation de A-30912B tétrahydrogéné
On dissout dans l'éthanol le facteur B de A-30912.

On reduit PtO2 dans de l'éthanol absolu pour former du platine que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur B de A-30912 par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir
A-30912B tétrahydrogéné.

Préparation 24
Préparation de A-30912D tétrahydrogéné
On dissout dans de l'éthanol le facteur D de
A-30912. On réduit PtO2 dans l'éthanol absolu pour former
Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur D de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912D tétrahydrogéne.

Préparation 25
Préparation de A-30912H tétrahydrogéné
On dissout le facteur H de A-30912 dans de I'éthanol. On reduit PtO2 dans l'éthanol absolu pour former
Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique Ic facteur H de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir
A-30912H tétrahydrogéné.

Préparations 26-55
Le Tableau 1 ci-dessous donne la préparation de divers N-alcanoyl-amino-acides. Les composés décrits dans le
Tableau ] sont préparés selon le mode opératoire général suivant
On ajoute le chlorure d'acide alcanoique approprié goutte à goutte à l'amino-acide approprié (rapport molaire 1:1) dissous dans de la pyridine. La quantité de pyridine utilisée doit etre telle que l'on obtienne une concentration des réactifs entre 0,1 et 0,2 M. On agite la solution à la température ambiante pendant environ 3 à 6 heures, après quoi on la verse dans un grand volume d'eau. Le produit précipite de la solution et on le recueille par filtration et on le cristallise dans le méthanol.

TABLEAC 1
Préparation de N-alcanovl-amino-acides

<SEP> Chlorure <SEP> d'acide <SEP> alcanoique <SEP> Amino-acide <SEP> N-alcanoyl-amino-acide
<tb> Exemple
<tb> N <SEP> Fornule <SEP> Poids <SEP> Formule <SEP> poids <SEP> Formule <SEP> poids
<tb> <SEP> 26 <SEP> CH3(CH2)10CCCl <SEP> 3,00 <SEP> g <SEP> NH2CH(CH2C6H5)CO2H <SEP> 2,0 <SEP> g. <SEP> CH3(CH2)10CONHCH(C5H5)CO2H <SEP> 2,5 <SEP> g.
<tb>

TABLEAU 1 (suite)
Préparation de N-alcanovl-amino-acides

<SEP> Chlorure <SEP> d'acide <SEP> alcanoique <SEP> Amino-acide <SEP> N-alcanoyl-amino-acide
<tb> Exemple
<tb> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> Formule <SEP> poids <SEP> Formule <SEP> Poids
<tb> <SEP> 33 <SEP> CH3(CH2)10COCl <SEP> 2,17 <SEP> g. <SEP> # <SEP> 3,89 <SEP> g. <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 5,23 <SEP> g.
<tb>

TABLEAU 1 (suite)
Préparation de N-alcanoyl-amino-acides

<SEP> Chlorure <SEP> d'acide <SEP> alcanoique <SEP> Amino-acide <SEP> N-alcanoyl-amino-acide
<tb> Exemple
<tb> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> Formule <SEP> poids <SEP> Formule <SEP> Poids
<tb> <SEP> 39 <SEP> CH3(CH2)10COCl <SEP> 21,85 <SEP> g. <SEP> # <SEP> 19,4 <SEP> g. <SEP> # <SEP> 37,6 <SEP> g.
<tb>

TABLEAU 1 (suite)
Préparation de N-alcanoyl-amino-acides

<SEP> Chlorure <SEP> d'acide <SEP> alcanoique <SEP> Amino-acide <SEP> N-alcanoyl-amino-acide
<tb> Exemple
<tb> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> Formule <SEP> poids <SEP> Formule <SEP> Poids
<tb> <SEP> 47 <SEP> CH3(CH2)6COCl <SEP> 3,42 <SEP> g. <SEP> # <SEP> 3,43 <SEP> g. <SEP> # <SEP> 3,20 <SEP> g.
<tb>

TABLEAU 1 (suite)
Préparation de N-alcanoyl-amino-acides

<SEP> Chlorure <SEP> d'acide <SEP> alcanoique <SEP> Amino-acide <SEP> N-alcanoyl-amino-acide
<tb> Exemple
<tb> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> Formule <SEP> Poids
<tb> <SEP> 53 <SEP> CH3(CH2)6COCl <SEP> 3,42 <SEP> g. <SEP> # <SEP> 6,18 <SEP> g. <SEP> # <SEP> 4,26 <SEP> g.
<tb>

Exemples 56-85
Le Tableau 2 ci-dessous donne la préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques des N-alcanoyl-aminoacides décrits dans le Tableau 1. Les composés décrits dans le Tableau 2 sont préparés selon le mode opératoire général suivant
On dissout une mole de N-alcanoylamino-acide, 1,1 mole de 2,4,5-trichlorophéno1 et 1 mole de dicyclohexylcarbodiimide dans du chlorure de méthylène, de l'éther ou du tétrahydrofuranne. On agite la solution à la température ambiante pendant environ 16 à environ 20 heures, après quoi on la filtre. On amène le filtrat à siccité et on cristallise le produit dans un mélange d'acétonitrile et d'eau ou dans un mélange d'éther diéthylique et d'éther de pétrole.

TABLEAU 2
préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques

<SEP> N-Alcanovl-amino-acide <SEP> poids <SEP> d'ester <SEP> de <SEP> 2,4,5
Exemple <SEP> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> trichlorophénol
<tb> <SEP> 56 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH(CH2C6H5)CO2H <SEP> 333 <SEP> mg. <SEP> 500 <SEP> mg.
<tb>

TABLEAU 2 (suite)
préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques

<SEP> N-Alcanovl-amino-acide <SEP> poids <SEP> d'ester <SEP> de <SEP> 2,4,5
Exemple <SEP> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> trichlorophénol
<tb> <SEP> 64 <SEP> # <SEP> 3,04 <SEP> g. <SEP> 4,7 <SEP> g.
<tb>

TABLEAU 2 (suite)
Préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques

<SEP> N-Alcanovl-amino-acide <SEP> poids <SEP> d'ester <SEP> de <SEP> 2,4,5
Exemple <SEP> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> trichlorophénol
<tb> <SEP> 71 <SEP> CH3(CH2)5CONH(CH2)10CO2H <SEP> 4,8 <SEP> g. <SEP> 1,68 <SEP> g.
<tb>

<SEP> 77 <SEP> # <SEP> 2,08 <SEP> g. <SEP> 2,436 <SEP> g. <SEP> (700 <SEP> mg. <SEP> après
<tb> <SEP> recristallisation.)
<tb> TABLEAU 2 (suite)
Préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques

<SEP> N-Alcanovl-amino-acide <SEP> poids <SEP> d'ester <SEP> de <SEP> 2,4,5
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> trichlorophénol
<tb> <SEP> 78 <SEP> # <SEP> 2,65 <SEP> g. <SEP> 2,373 <SEP> g.
<tb>

TABLEAU 2 (suite)
Préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques

<SEP> N-Alcanoyl-amino-acide <SEP> roids <SEP> d'ester <SEP> de <SEP> 2,4,5
Exemple <SEP> N <SEP> Formule <SEP> Poids <SEP> trichlorophénol
<tb> <SEP> 83 <SEP> # <SEP> 4,19 <SEP> g. <SEP> 2,02 <SEP> g.
<tb>

EXEMPLES 1 à 30
Le Tableau 3 ci-dessous donne la préparation des dérivés du noyau A-30912A préparée à partir des esters de 2,4,5-trichlorophénliques de N-alcanoyl-amino-acides indiqués dans le Tableau 2. Les composés décrits dans le
Tableau 3 sont préparés en général selon le mode opératoire suivant
Au noyau 309l2A, dissous dans du diméthylformamide (DMF) on ajoute l'ester 2,4,5-trichlorophénylique du Nalcanoyl-amino-acide. On agite le mélange réactionnel pendant 15-18 heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec de l'éther éthylique et du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage.On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de gel de silice (Woelm 99-210 microns) en utilisant le système solvant susmentionné comme éluant. On contrôle les fractions provenant du chromatographe, par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 volume/ volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu.On peut analyser le produit par chromatographie liquide sous pression élevée à phase inversée comme suit : on injecte l'échantillon dissous dans un mélange 1:2:2 volume/volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile (1 mg/ml) dans une colonne en acier inoxydable de 0,63 cm x 30 cm garnie de résine C18 Micro
Bondapak (Waters Associates, Inc., Milford, Massachussets,
U.S.A.) et on élue la colonne avec un système solvant comprenant un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars avec un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse du papier de 0,5 cm/minute.On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm,
On peut également analyser les produits par spectrometrie de masse à désorption de champ (I,MS).

TABLEAU 3
Dérivés de N-alcanoylamino-acide du noyau de A-30912A

TABLEAU 3

<SEP> Rétention
<tb> Exemple <SEP> Produit <SEP> Ester <SEP> Noyau <SEP> de <SEP> en <SEP> CLPEX
<tb> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> formule <SEP> V <SEP> Exemple <SEP> Poids <SEP> (mg) <SEP> A30912A <SEP> Produit <SEP> (mg) <SEP> M+ <SEP> (cm)
<tb> <SEP> 1 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH(CH2C6H5)CO- <SEP> 31 <SEP> 141 <SEP> 250 <SEP> 158 <SEP> 1148(M+ <SEP> + <SEP> 22) <SEP> -
<SEP> 2 <SEP> CH3(CH2)10CONH(CH2)4-CO- <SEP> 32 <SEP> 795 <SEP> 250 <SEP> 132 <SEP> 1101(M+ <SEP> + <SEP> 22) <SEP> -
<SEP> 3 <SEP> CH3(CH2)10CONH(CH2)10-CO- <SEP> 33 <SEP> 462 <SEP> 400 <SEP> 327 <SEP> 1185(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 1,23
<tb> <SEP> 4 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> 34 <SEP> 515 <SEP> 400 <SEP> 247 <SEP> 1121(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> -
<SEP> 5 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 35 <SEP> 515 <SEP> 400 <SEP> 302 <SEP> 1120(M+ <SEP> + <SEP> 22) <SEP> -
<SEP> 6 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 36 <SEP> 515 <SEP> 400 <SEP> 354 <SEP> 1137(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 1,33
<tb> <SEP> 7 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 37 <SEP> 570 <SEP> 400 <SEP> 196 <SEP> 1197(M+ <SEP> + <SEP> 30) <SEP> 1,65
<tb> <SEP> 8 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 38 <SEP> 750 <SEP> 400 <SEP> 291 <SEP> -- <SEP> 1,20
<tb> TABLEAU 3 (suite)

<SEP> Rétention
<tb> Exemple <SEP> Produit <SEP> Ester <SEP> Noyau <SEP> de <SEP> en <SEP> CLP
<tb> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> formule <SEP> V <SEP> Exemple <SEP> Poids <SEP> (mg) <SEP> A30912A <SEP> Produit <SEP> (mg) <SEP> M+ <SEP> (cm)
<tb> <SEP> 9 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 39 <SEP> 512 <SEP> 400 <SEP> 182 <SEP> 1135(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> -
<SEP> 10 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 40 <SEP> 512 <SEP> 400 <SEP> 166 <SEP> 1143(M+ <SEP> + <SEP> 31) <SEP> 1,43
<tb> <SEP> 11 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 41 <SEP> 530 <SEP> 400 <SEP> 120 <SEP> 1151(M+ <SEP> + <SEP> 23 <SEP> -
<SEP> 12 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 42 <SEP> 497 <SEP> 400 <SEP> 452 <SEP> 1135(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 1,32
<tb> <SEP> 13 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 43 <SEP> 535 <SEP> 400 <SEP> 286 <SEP> 1148(M+ <SEP> + <SEP> 24) <SEP> 1,40
<tb> <SEP> 14 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 44 <SEP> 540 <SEP> 400 <SEP> 453 <SEP> 1170(M+ <SEP> + <SEP> 25) <SEP> 1,40
<tb> TABLEAU 3 (suite)

<SEP> Rétention
<tb> Exemple <SEP> Produit <SEP> Ester <SEP> Noyau <SEP> de <SEP> en <SEP> CLPEx
<tb> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> formule <SEP> V <SEP> Exemple <SEP> Poids <SEP> (mg) <SEP> A30912A <SEP> Produit <SEP> (mg) <SEP> M+ <SEP> (cm)
<tb> 15 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 45 <SEP> 492 <SEP> 400 <SEP> 277 <SEP> -- <SEP> -16 <SEP> CH3(CH2)3SCONH(CH2)10-CO- <SEP> 46 <SEP> 493 <SEP> 400 <SEP> 273 <SEP> 1115(M+ <SEP> + <SEP> 23 <SEP> 0,95
<tb> 17 <SEP> CH3CONH-#-CO- <SEP> 47 <SEP> 360 <SEP> 400 <SEP> 213 <SEP> 980(M+ <SEP> + <SEP> 22 <SEP> 1,75
<tb> 18 <SEP> CH3(CH2)5-CONH-#-CO- <SEP> 48 <SEP> 430 <SEP> 400 <SEP> 218 <SEP> -- <SEP> -19 <SEP> CH3(CH2)8CONH-#-CO- <SEP> 49 <SEP> 500 <SEP> 400 <SEP> 162 <SEP> 1093(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 0,90
<tb> 20 <SEP> CH3(CH2)12CONH-#-CO- <SEP> 50 <SEP> 527 <SEP> 400 <SEP> 234 <SEP> 1149(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 2,3
<tb> 21 <SEP> CH3(CH2)14CONH-#-CO- <SEP> 51 <SEP> 555 <SEP> 400 <SEP> 350 <SEP> 1177(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 3,2
<tb> 22 <SEP> # <SEP> 52 <SEP> 477 <SEP> 400 <SEP> 176 <SEP> 1099(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 0,7
<tb> TABLEAU 3 (suite)

<SEP> Rétention
<tb> Exemple <SEP> Produit <SEP> Ester <SEP> Noyau <SEP> de <SEP> en <SEP> CLPEx
<tb> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> formule <SEP> V <SEP> Exemple <SEP> Poids <SEP> (mg) <SEP> A30912A <SEP> Produit <SEP> (mg) <SEP> M+ <SEP> (cm)
<tb> <SEP> 23 <SEP> # <SEP> 53 <SEP> 533 <SEP> 400 <SEP> 127 <SEP> 1155(M+ <SEP> 23) <SEP> 2,3
<tb> <SEP> 24 <SEP> # <SEP> 54 <SEP> 477 <SEP> 400 <SEP> 319 <SEP> 1099(M+ <SEP> 23) <SEP> 1,0
<tb> <SEP> 25 <SEP> # <SEP> 55 <SEP> 533 <SEP> 400 <SEP> 214 <SEP> 1155(M+ <SEP> 23) <SEP> 3,1
<tb> <SEP> 26 <SEP> CH3(CH2)6CONII-# <SEP> 56 <SEP> 477 <SEP> 400 <SEP> 290 <SEP> 1,0
<tb> <SEP> 27 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 57 <SEP> 533 <SEP> 400 <SEP> 325 <SEP> 3,4
<tb> <SEP> 28 <SEP> # <SEP> 58 <SEP> 512 <SEP> 400 <SEP> 324 <SEP> 1,3
<tb> TABLEAU 3 (suite)

<SEP> Rétention
<tb> Exemple <SEP> Produit <SEP> Ester <SEP> Noyau <SEP> de <SEP> en <SEP> CLPEX
<tb> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> formule <SEP> V <SEP> Exemple <SEP> Poids <SEP> (mg) <SEP> A30912A <SEP> Produit <SEP> (mg) <SEP> M+ <SEP> (cm)
<tb> 29 <SEP> # <SEP> 59 <SEP> 540 <SEP> 400 <SEP> 281 <SEP> 1162(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 1,8
<tb> 30 <SEP> # <SEP> 60 <SEP> 596 <SEP> 400 <SEP> 269 <SEP> 1217(M+ <SEP> + <SEP> 23) <SEP> 7,7
<tb> CLPE : Chromatographie liquide sous pression élevée.

EXEMPLES 31-40
Les Exemples 31-40 illustrent la préparation à plus grande échelle des composés de formule III. Les composés particuliers préparés par) les modes opératoires indiqués cidessous sont les composés de formule III où R5 est un groupement N- (n-dodécanoyl)-p-aminobenzoyle.

EXEMPLE 31
A. Préparation de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque
On ajoute goutte à goutte 8,74 g (40 mmoles) de chlorure de n-dodécanoyle à une solution d'acide p-amino- benzoïque (5,5 g, 40 mmoles) dissous dans 100 ml de pyridine.

On agite le mélange pendant trois heures et oA le verse dans 3 1 d'eau. On filtre le précipité qui se forme et on le sèche sous vide pour obtenir l'acide N-(n-dodecanoyi)-p-amino- benzoïque (11,01 g).

B. Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide
N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque
On dissout dans 250 ml de chlorure de méthylène 11,01 g (34,5 mmoles) de N-(in-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque, 7,5 g (38 mmoles) de 2,4,5-trichlorophénol et 6,94 g (34,5 mmoles) de tricyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 3 heures et demie puis on le filtre. On évapore le filtrat sous vide pour obtenir un résidu qu'on cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau pour obtenir l'ester 2,4,5-trichlorophenylique de l'acide N- (n- dodécanoyl)-p-aminobenzolque (12,84 g).

C. Acylation du noyau de A-30912A
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide 8,16 g (10,2 mmoles) du noyau de A-30912A et 4,72 g (10,2 mmoles) de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N- (n-dodécanoyl) - p-aminobenzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500'' (Waters Associates, Inc., Milford, Mass.) en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 (Waters Associates, Inc.) comme phase stationnaire.La colonne est éluée de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. Les fractions sont analysées par CCM en utilisant des plaques de silice et le même système solvant.

Les fractions contenant le produit désiré sont réunies et lyophilisées pour obtenir le dérivé à groupement N-(n dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de A-30912A (3,5 g).

EXEMPLE 32
Acylation du nu de A-30912B
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide 10,2 mmoles du noyau de A-30912B et 10,2 mmoles de l'ester de 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N- (n-dodécanoyl)-p- aminobenzoique (préparé dans les Etapes A et B de l'Exemple 31). On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les produits de lavage.On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée en utilisant une unite "Prep LC/System 50011 (Waters Associates,
Inc., Milford, Massachussets) en utilisant une colonne Prep
Pak-500/C18 (Water Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars.

On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et le même système solvant. On réunit et on lyophilise les fractions contenant le produit désiré pour obtenir le derivé à groupement N-(n-dodécanoyl)p-aminobenzoyle du noyau de A-30912B.

EXEMPLE 33
On peut utiliser le procédé décrit dans l'Exemple 32, avec des modifications mineures, pour synthétiser d'autres dérivés du noyau de A-30912B. La substitution du chlorure d'acyle approprié et de l'acide amino approprié dans l'Etape A, la substitution du N-alcanoyl-amino-acide approprié (plus l'utilisation du tétrahydrofuranne comme solvant pour les acides N-alcanoyl-monochloro-aminobenzoïques) dans l'Etape B, et la substitution de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique approprié dans 1 'L'xemple 33 peut donner les dérives du noyau de A-30912B indiqué ci-dessous
Dérivés de N-alconoylamino-acide du noyan de A-30912B

R5
CH3 (CH2) 10CONHCH (CH2C6H5) CO-
CH3(CH2)10CONH(CH2)4-CO (CH3(CH2)10CONH(CH2)10-CO

EXEMPLE 34
Acylation du noyau de A-30912D
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide, 10,2 mmoles de noyau de A-30912D et 10,2 mmoles de l'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide N- (n-dodécanoyl) -p-amino- benzolque (préparé dans les Etapes A et B de l'Exemple 31).

On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée en utilisant une unité "Prep LC/System 590" (Waters Associates,
Inc., Milford, Massachussets) en utilisant une colonne Prep
Pak-500/C18 (Water Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et le même système solvant. On combine et on lyophilise les fractions contenant le produit désire pour obtenir le dérivé à groupement N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de A-30912D.

EXEMPLE 35
On peut utiliser le procédé décrit dans l'Exemple 34, avec de faibles modifications, poursynthétiser d'autres dérivés du noyau de A-30912D. L'utilisation du chlorure d'acyle et de l'amino-acide appropriés dans l'Etape A, l'utilisation du N-alcanoyl-amino-acide approprié (plus l'utilisation de tétrahydrofuranne comme solvant des acides
N-alcanoyl monochloro-aminobenzolques) dans l'Etape B, et l'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique approprié dans l'Exemple 34 permettent d'obtenir les dérivés du noyau de A-30912D indiqué ci-dessous où R5 est- tel que defini dans l'Exemple 33.

Dérivés de N-alcanoylamino-acide du noyau de A-30902D

EXEMPLE 36
Acylation du noyau de A-30912H
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide 10,2 mmoles du noyau de A-30912H et 10,2 mmoles de l'ester 2,4,5-trichlorophenylique de l'acide N-(n-dodécanyl)-p- aminobenzoîque (préparé dans les Etapes A et B de l'Exemple 31). On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates,
Inc.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 (Water
Associates, Inc.) comme phase fixe.On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et le même système solvant. On réunit les fractions contenant le produit désire et on les lyophilise pour obtenir le dérivé à groupement N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de
A-30912H.

EXEMPLE 37
Le procédé décrit dans l'Exemple 36 peut être utilisé avec de petites modifications pour synthétiser d'autres dérivés du noyau de A-30912H. L'utilisa-tion du chlorure d'acyle et de l'amino-acide appropriés dans l'Etape
A, l'utilisation du N-alcanoyl-amino-acide approprié (plus l'utilisation de tetrahydrofuranne comme solvant pour les acides N-alcanoyl monqchloro-aminobenzo1ques) dans l'Etape B, et l'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique approprié dans l'Exemple 36 permettent d'obtenir les dérivés du noyau de A-3091211 indiqués ci-dessous où R5 est tel que défini dans l'Exemple 33.

Dérivés de N-alcanoylamino-acide du noyau de A-30912H

EXEMPLE 38
Le mode opératoire suivant illustre la préparation du dérivé de N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de
A-30912H à partir du noyau de A-30912A.

On traite le noyau de A-30912A par le N-(ndodécanoyl)-p-aminobenzoate de 2,4,5-trichiorophényle selon le mode opératoire de l'Exemple 36. On méthyle le dérivé ainsi obtenu en traitant un échantillon (20 m) par 0,06 ml de 3 % d'HCl dans du méthanol dans le diméthylformamide. On laisse la solution reposer sous agitation pendant 16 heures, après quoi on chasse le solvant sous pression réduite et on obtient un résidu. On purifie le résidu par CLPE à phase inversée en utilisant une résine de gel de silice/C18.

EXEMPLE 39
Acylation du noyau de S31794/F-1
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide 10,2 mmoles du noyau de S31794/F-1 et 10,2 mmoles de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N- (n-dodécanoyl) -p- aminobenzoique (préparé dans les Etapes A et B de l'Exemple 31). On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique.

On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" (Waters
Associates, Inc.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/
C18 (Water Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et le même système solvant. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé à groupement N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de S31794/F-1.

EXEMPLE 40
On peut utiliser le procédé décrit dans l'Exemple 39 avec de petites modifications pour synthétiser d'autres dérivés du noyau de S31794/F-1. L'utilisation du chlorure d'acyle et de l'amino-acide approprié dans l'Etape A, l'utilisation du N-alcanoylamino-acide approprié (plus l'utilisation du tétrahydrofuranne comme solvant pour les acides N-alcanoyl-monochloro-aminobenzoiques) dans l'EtcXe
B et l'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique dans l'Exemple 39 permettent d'obtenir les dérivés du noyau de S31794/F-1 indiqués ci-dessous où R5 est tel que défini dans l'Exemple 33.

Dérivés de N-alcanoylamino-acide du noyau de S31794/F-1

EXEMPLE 41
On peut démontrer in vitro l'activité antifongique des composés de formule III dans des essais de diffusion sur disque et de dilution sur gélose classiques et dans des essais in vivo classiques sur des souris qui démontrent l'efficacité vis-à-vis d'une infection fongique systémique.

Les résultats des essais antifongiques de composés représentatifs de formule V (Exemples 1 à 30) sont indiqués dans les Tableaux 4, 5, 6 et 7.

Les Tableaux 4 et 5 donnent les résultats des essais in vitro des composés des Exemples 1 à 21 par les méthodes de diffusion sur disque sur plaque de gélose.

Dans le Tableau 4, l'activité est mesurée par la taille (diamètre en mm) de la zone d'inhibition du micro-organisme observée produite par le composé d'essai. Dans le Tableau 5, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) de la substance (lJg/disque) nécessaire pour inhiber la croissance de l'organisme d'essai. Le Tableau 6 donne les résultats de l'essai in vitro du dérivé à groupement N-(n-dodécanoyl)-E-aminobenzoy7e) du noyau de
A-30912A (formule III, R1 est un groupement N-(n-dodécanoyl p-aminobenzoyle) vis-à-vis de cinq souches de Candida aibicans, par la méthode de dilution sur gélose.Dans le
Tableau 6, l'activité est mesurée par la CIM de la substance (pg/ml) nécessaire pour inhiber l'organisme d'essai.

Les résultats des essais in vivo pour déterminer l'efficacité des composés des Exemples 1 à 21, 26 et 28 contre une infection provoquée par Candida albicans A-26 chez les souris sont donnés dans le Tableau 7, où l'activité est mesurée par la DE50 (dose en mg/kg nécessaire pour guérir 50 % des animaux d'essai). Quand on n'observe pas de DE50, l'activité est indiquée par la plus faible dose à laquelle on observe un effet antifongique significatif. Dans cet essai, on infecte par voie intraveineuse par Candida albicans
A-26 des groupes de souris albinos mâles (exemptes d'agents pathogènes particuliers) pesant de 18 à 20 g. On traite les animaux par rayons X 24 heures avant l'infection à environ 50 roentgens par minute pendant huit minutes (dose totale de 400) pour réduire les réponses immunologiques vis-à-vis de l'organisme infectieux.A 0, 4 et 24 heures après l'infection, on donne à chaque groupe de souris des doses progressives sous-cutanées du composé d'essai sous forme d'une suspension dans un mélange à 33 % de polyéthylCnegycol et d'eau. On note le jour de la mort pour chaque animal. Une comparaison statistique de l'essai "t" de Student du jour moyen de la mort est faite entre chaque groupe des animaux traités et infectés particuliers et d'un groupe de dix animaux infectés et non traités pour déterminer si le traitement prolonge de façon significative le temps de survie.

Le Tableau 8 donne les résultats de l'essai des composés pour l'absorption après administration par voie orale. Dans cet essai, des souris sont gavées à une dose de 416 mg/kg du composé d'essai en suspension dans un mélange à 33 % de PEG 400 dans l'eau. A des intervalles de temps, bn prélève des échantillons de sang du sinus orbital et on détermine lueur activité antibiotique comme suit : on place un disque de 7 mm contenant 20 Pl de sang entier sur de la gélose ensemencée avec Aspergillus montevidensis A35137. Après 40 heures d'incubation à 300C, on compare les zones d'inhibition provenant des échantillons sanguins à un étalon obtenu à partir du composé d'essai, et on calcule la quantité de composé dans l'échantillon de sang.

Tableau 4
Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plague de gélose

<SEP> Composé <SEP> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> (mm) <SEP> (a)
<tb> Exemple <SEP> Saccharomyces <SEP> Neurospora <SEP> Trichophyton <SEP> Candida
<tb> N <SEP> R5 <SEP> de <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> pastorianus <SEP> X-52 <SEP> Crassa <SEP> 846 <SEP> mentagrophytes <SEP> A-23 <SEP> albicans <SEP> A-26
<tb> <SEP> 1 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH(CH2C6H5)-CO- <SEP> 18 <SEP> 42* <SEP> 55* <SEP> 25
<tb> <SEP> 2 <SEP> CH3(CH2)10CONH(CH2)4-CO- <SEP> 15 <SEP> 27* <SEP> 60* <SEP> 25
<tb> <SEP> 3 <SEP> CH3(CH2)10CONH(CH2)10-CO- <SEP> 15 <SEP> 28* <SEP> 55* <SEP> 24
<tb> <SEP> 18 <SEP> 35 <SEP> 63* <SEP> 25
<tb> <SEP> 15 <SEP> 28 <SEP> 56 <SEP> 24
<tb> <SEP> 4 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 21 <SEP> 33* <SEP> 55* <SEP> 23
<tb> <SEP> 17 <SEP> 35* <SEP> 56* <SEP> 19
<tb> <SEP> 5 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 17 <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 20
<tb> <SEP> 6 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 18 <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 23
<tb> <SEP> 7 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 19 <SEP> 35* <SEP> 44* <SEP> 27
<tb> Tableau 4 (suite)
Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

<SEP> Composé <SEP> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> (mm) <SEP> (a)
<tb> Exemple <SEP> Saccharomyces <SEP> Neurospora <SEP> Trichophyton <SEP> Candida
<tb> N <SEP> R5 <SEP> de <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> pastorianus <SEP> X-52 <SEP> Crassa <SEP> 846 <SEP> mentagrophytes <SEP> A-23 <SEP> albicans <SEP> A-26
<tb> <SEP> 8 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> 17 <SEP> 30* <SEP> 60 <SEP> 25
<tb> <SEP> 9 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 17 <SEP> 30* <SEP> -- <SEP> 16
<tb> <SEP> 10 <SEP> CH3(CH2)10CONH#-CO- <SEP> 19 <SEP> 25* <SEP> 45* <SEP> 26
<tb> <SEP> 11 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 10 <SEP> 32* <SEP> 50* <SEP> 20
<tb> <SEP> 12 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CH2-CO- <SEP> 20 <SEP> 30* <SEP> 55* <SEP> 19
<tb> <SEP> 13 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CH=CH-CO- <SEP> 17 <SEP> 29* <SEP> 24* <SEP> 60*
<tb> Tableau 4 (suite)
Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

<SEP> Composé <SEP> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> (mm) <SEP> (a)
<tb> Exemple <SEP> Saccharomyces <SEP> Neurospora <SEP> Trichophyton <SEP> Candida
<tb> N <SEP> R5 <SEP> de <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> pastorianus <SEP> X-52 <SEP> Crassa <SEP> 846 <SEP> mentagrophytes <SEP> A-23 <SEP> albicans <SEP> A-26
<tb> <SEP> 14 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CONHCH2- <SEP> 17 <SEP> 28* <SEP> -- <SEP> 15
<tb> <SEP> 15 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 14 <SEP> 30* <SEP> 54* <SEP> 25
<tb> <SEP> 16 <SEP> CH3(CH2)5CONH(CH2)10-CO- <SEP> -- <SEP> 20* <SEP> 35* <SEP> 10
<tb> <SEP> 17 <SEP> CH3CONH-#-CO- <SEP> 17 <SEP> 24* <SEP> 51* <SEP> 24
<tb> <SEP> 18 <SEP> CH3(CH2)5CONH-#-CO-2-CO- <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 14 <SEP> 45*
<tb> <SEP> 19 <SEP> CH3(CH2)8CONH-#-CO- <SEP> 17 <SEP> 30* <SEP> -- <SEP> 24
<tb> <SEP> 20 <SEP> CH3(CH2)12CONH-#-CO- <SEP> 17 <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 22
<tb> Tableau 4 (suite)
Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

<SEP> Composé <SEP> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> (mm) <SEP> (a)
<tb> Exemple <SEP> Saccharomyces <SEP> Neurospora <SEP> Trichophyton <SEP> Candida
<tb> N <SEP> R5 <SEP> de <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> pastorianus <SEP> X-52 <SEP> Crassa <SEP> 846 <SEP> mentagrophytes <SEP> A-23 <SEP> albicans <SEP> A-26
<tb> <SEP> 21 <SEP> CH3(CH2)14CONH-#-CO- <SEP> 24 <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 25
<tb> (a) Les composés sont testés sous forme d'une suspension dans le méthanol. Les composés sont testés à une concentration de 1 mg/ml en plongeant un disque de 7 mm dans la suspension et en le plaçant sur la surface de la gélose. Incubation : 24-48 heures à 25-37 C.

* Zone mesurable d'inhibition avec nouvelle croissance de l'organisme autour du disque.

Tableau 5
Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

<SEP> Composé <SEP> CIM <SEP> ( g/disque)*
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> de <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> A-26 <SEP> Trychophyton <SEP> mentagropphytes <SEP> &num;;6
<tb> <SEP> 1 <SEP> CH3(CH210CONHCH(CH2C6H5)-CO- <SEP> 0,625 <SEP> < 0,039
<tb> <SEP> 2 <SEP> CH3(CH2)10CONH(CH24-CO- <SEP> 1,25 <SEP> 0,078
<tb> <SEP> 3 <SEP> CH3(CH2)10CONH(CH2)10-CO- <SEP> 2,5 <SEP> 0,156
<tb> <SEP> 1,25 <SEP> 0,156
<tb> <SEP> 4 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> 0,625 <SEP> < 0,039
<tb> <SEP> 1,25 <SEP> 0,678
<tb> <SEP> 5 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 5,0 <SEP> < 0,039
<tb> <SEP> 6 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> 1,25 <SEP> < 0,039
<tb> <SEP> 7 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 0,625 <SEP> < 0,039
<tb> Tableau 5 (suite)
Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

<SEP> Composé <SEP> CIM <SEP> ( g/disque)*
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> de <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> A-26 <SEP> Trychophyton <SEP> mentagropphytes <SEP> &num;;6
<tb> <SEP> 8 <SEP> CH3(CH210CONH-CO- <SEP> 1,25 <SEP> 0,078
<tb> <SEP> 9 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> > 20 <SEP> < 0,039
<tb> <SEP> 10 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> 20 <SEP> < 0,039
<tb> <SEP> 11 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> -- <SEP> -
<SEP> 12 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CH2-CO- <SEP> 2,5 <SEP> 0,078
<tb> Tableau 5 (suite)
Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

<SEP> Composé <SEP> CIM <SEP> ( g/disque)*
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> de <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> A-26 <SEP> Trychophyton <SEP> mentagropphytes <SEP> &num;;6
<tb> <SEP> 13 <SEP> CH3(CH210CONH-#-CH=CH-CO- <SEP> 1,25 <SEP> < 0,039
<tb> <SEP> 14 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CONHCH2-CO- <SEP> 10 <SEP> 0,078
<tb> <SEP> 15 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 2,5 <SEP> 0,078
<tb> <SEP> 16 <SEP> CH3(CH2)5CONH(CH2)10-CO- <SEP> > 20;80 <SEP> 0,625
<tb> <SEP> 17 <SEP> CH3CONH-#-CO- <SEP> > 20;40 <SEP> 0,312
<tb> <SEP> 18 <SEP> CH3(CH2)5CONH-#-CO- <SEP> > 20;160 <SEP> 1,25
<tb> <SEP> 19 <SEP> CH3(CH2)ICONH-#-CO- <SEP> 0,625 <SEP> - Tableau 5 (suite)
Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

<SEP> Composé <SEP> CIM <SEP> ( g/disque)*
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> de <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> A-26 <SEP> Trychophyton <SEP> mentagropphytes <SEP> &num;;6
<tb> <SEP> 20 <SEP> CH3(CH210CONH-#-CO- <SEP> 1,25 <SEP> < 0,039
<tb> <SEP> 21 <SEP> CH3(CH2)14CONH-#-CO- <SEP> 0,312 <SEP> < 0,039
<tb> * Les composés sont en suspension dans une solution 0,01 M de borate de sodium, pH 7,5.

Les composés sont testés à 20 g/disque au niveau supérieur et à des doubles dilutions
jusqu'à ce que l'on atteigne des points finals. Incubation : 24 heures à 30 C.

** Zones mesurables d'inhibition avec nouvelle croissance de l'organisme autour du disque.

TABLEAU 6
Activité in vitro des dérivés à groupement N- (n dodécanoyl)-E-aminobenzoyle (Exemple 4) et à groupement
N-(n-dodécanoyl)-5-amino-n-pentanoyle (Exemple 2) du noyau de A-30912A vis-à-vis de cinq souches de Candida albicans par l'essai de dilution sur gélose.

CIM (pg/ml)
Composé A26 SBH 16 SBH31 SBH 28 SBH 29
Ex. 4 0,312 0,625 0,625 0,625 0,625
Ex. 2 1,25 2,5 2,5 2,5 2,5 Tableau 7
Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans A-26 chez @@@s souris*

<SEP> Composé <SEP> Dose <SEP> acti@@ <SEP> la
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> DE50 <SEP> (mg/kg)** <SEP> plus <SEP> faib@@
<tb> <SEP> 1 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH(CH2C8H5)-CO- <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 2 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH(CH2)4-CO- <SEP> 22 <SEP> 20
<tb> <SEP> 3 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH(CH2)10-CO- <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 4 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH-#-CO- <SEP> 15 <SEP> 10
<tb> <SEP> 15 <SEP> #5
<tb> <SEP> 5 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH-# <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 6 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH-#-CO- <SEP> > 40 <SEP> 40
<tb> <SEP> 7 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH-# <SEP> 14 <SEP> 10
<tb> Tableau 7 (suite)
Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans A-26 chez les souris*

<SEP> Composé <SEP> Dose <SEP> active <SEP> la
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> DE50 <SEP> (mg/kg)** <SEP> plus <SEP> faible
<tb> <SEP> 8 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH-#-CO- <SEP> > 40 <SEP> 40
<tb> <SEP> 9 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 10 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 11 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 12 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CH2-CO- <SEP> > 40 <SEP> 40
<tb> <SEP> 13 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CH=CH-CO- <SEP> 24 <SEP> 20
<tb> Tableau 7 (suite)
Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans A-26 chez les souris*

<SEP> Composé <SEP> Dose <SEP> active <SEP> la
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> DE50 <SEP> (mg/kg)** <SEP> plus <SEP> faible
<tb> <SEP> 14 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CONHCH2-CO- <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 15 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 16 <SEP> CH3(CH2)5CONH(CH2)10-CO- <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 17 <SEP> CH2CONH-#-CO- <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 18 <SEP> CH3(CH2)5CONH-#-CO- <SEP> > 40 <SEP> > 40
<tb> <SEP> 19 <SEP> CH3(CH2)5CONH-#-CO- <SEP> 26 <SEP> 5
<tb> Tableau 7 (suite)
Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans A-26 chez les souris*

<SEP> Composé <SEP> Dose <SEP> active
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> DE50 <SEP> (mg/kg)** <SEP> la <SEP> plus <SEP> faible
<tb> <SEP> 20 <SEP> CH3(CH2)12CONH-#-CO- <SEP> 11 <SEP> 2,5
<tb> <SEP> 21 <SEP> CH3(CH2)14CONH-#-CO- <SEP> 7 <SEP> 5
<tb> <SEP> 26 <SEP> CH3(CH2)6CONH-#-CO- <SEP> 29 <SEP> 10
<tb> <SEP> 28 <SEP> CH3(CH2)6CONH-# <SEP> > 40 <SEP> 20
<tb> * Programme des doses : 40, 20, 15 et 10 mg/kg. Les doses sont administrées 0, 4 et 24
heures après injection sous forme d'une suspension du composé d'essai dans un
mélange à 30 % de PEG dans l'eau. Nombre de souris recevant les composés d'essai pour
chaque taux de dose : 6 souris par groupe. Nombre de souris dans le groupe témoin (non
traitées) : 10 souris par groupe.

** Egalement mesuré par augmentation de la durée de survie des animaux traités
par rapport aux témoins, calculé par la méthode de Reed V. Mueuch, American J. Hygiene.

Tableau 8
Taux dans le sang après administration chez les souris

<SEP> Composé
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> Taux <SEP> dans <SEP> le <SEP> sang* <SEP> ( g/ml)
<tb> <SEP> 1 <SEP> CH3(CH2)10CONHCH(CH2C6H5)-CO- <SEP> 0
<tb> <SEP> 2 <SEP> CH3(CH2)10CONH(CH2)4-CO- <SEP> 0
<tb> <SEP> 3 <SEP> CH3(CH2)10CONH(CH2)10-CO- <SEP> 0,40(0)
<tb> <SEP> 4 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> 0,83
<tb> <SEP> 5 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 0
<tb> <SEP> 6 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> 0
<tb> <SEP> 7 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 0,53
<tb> Tableau 8 (suite)
Taux dans le sang après administration chez les souris

<SEP> Composé
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> Taux <SEP> dans <SEP> le <SEP> sang* <SEP> ( g/ml)
<tb> <SEP> 8 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> - <SEP> 0,34
<tb> <SEP> 9 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 0
<tb> <SEP> 10 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CO- <SEP> 0
<tb> <SEP> 11 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> -
<SEP> 12 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CH2-CO- <SEP> 0,34
<tb> <SEP> 13 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CH=CH-CO- <SEP> 1,31
<tb> Tableau 8 (suite)
Taux dans le sang après administration chez les souris

<SEP> Composé
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> Taux <SEP> dans <SEP> le <SEP> sang* <SEP> ( g/ml)
<tb> <SEP> 14 <SEP> CH3(CH2)10CONH-#-CONHCH2-CO- <SEP> 0,64
<tb> <SEP> 15 <SEP> CH3(CH2)10CONH-# <SEP> 0
<tb> <SEP> 16 <SEP> CH3(CH2)5CONH(CH2)10-CO- <SEP> 0
<tb> <SEP> 17 <SEP> CH3CONH-#-CO- <SEP> 0
<tb> <SEP> 18 <SEP> CH3(CH2)5CONH-#-CO- <SEP> -
<SEP> 19 <SEP> CH3(CH2)8CONH-#-CO- <SEP> -
<SEP> 20 <SEP> CH3(CH2)12CONH-#-CO- <SEP> 6,5
<tb> Tableau 8 (suite)
Taux dans le sang après administration chez les souris

<SEP> Composé
<tb> Exemple <SEP> N <SEP> R5 <SEP> dans <SEP> la <SEP> formule <SEP> V <SEP> Taux <SEP> dans <SEP> le <SEP> sang* <SEP> ( g/ml)
<tb> <SEP> 21 <SEP> CH3(CH2)14CONH-#-CO- <SEP> 36
<tb> * Quatre heures après l'administration du composé d'essai à une dose de 416 mg/kg par gavage
sous forme de suspension du composé dans 33 % de PEG 400 dans l'eau. Composé déterminé par
essai biologique vis-à-vis d'Aspergillus montevidensis A-35137

Claims

où X est un atome d'hydrogène, de chlore, de brome ou d'iode ou un groupement nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alcoxy en C1-C3, mercapto, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1- C3

où R7 est un groupement hydroxyméthyle, hydroxyéthyle, mercaptométhyle, mercaptoéthéyle, méthylthioéthyle, 2-thiényle, 3-kindole-méthyle, phényle, benzyle, phényle substitué ou benzoyle substitué dont le noyau benzène est substitué par un radical chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C3 ;

où A est un groupement alkylène en C1-C10 ou cycloalkylène en C5-C6 ;;

W est un radical aminoacyle divalent de formule

dans laquelle

R5 est un groupement N-alcanoyl-amino-acyle de formule

-CO-NH2 et R3 et R@ sont tous deux OH

alkyloxy en C1-C6 et R4 est OH, ou bien R est

quand R est OH, R est H, R est OH ou un groupement

il ou tous deux OH, et

quand R1 est H, R2 est H et R3 et R4 sont tous deux

dans laquelle R1 est H ou OH et

REVENDICATIONS 1. Composé de formule

où X est un atome de chlore, de brome ou d'iode ;;

C17.

et R6 est un groupement alkyle en Cl-C17 ou alcényle en C2

où B est un radical divalent de formule -(CH2)n- où n est un entier de 1 à 3 -CH=CH -CH=CH-CH2- ; ou
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R5 est un groupement

où A est un groupement alkylène en C1-C10 et R6 est un groupement alkyle en C1-C17 à chaine droite.
3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R5 est un groupement N-(n-dodécanoyl)-5-amino-n- pentanoyle, N-(n-dodécanoyl)-ll-amino-n-hendécanoyl ou N (n-heptanoyl)-11-amino-n-hendécanoyle.
4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R5 est

où X est un atome d'hydrogène et R6 est un groupement alkyle en Cl-C17 à chaîne droite.
5. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que R5 est un groupement N-(n-dodécanoyl)-p-amino- benzoyle, N-(n-dodécanoyl)-m-aminobenzoyle,N-(acétyl)-paminobenzoyle, N-(n-heptanoyl)-p-aminobenzoyle, N-(ndécanoyl)-p-aminobenzoyle, N-(n-tétradécanoyl)-p-aminobenzoyle ou N-(n-hexadécanoyl)-p-aminobenzoyle.
6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R5 est

dans laquelle X est un radical chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alcoxy en C1-C3, mercapto, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C3, et R6 est un groupement alkyle en- C1-C17 à chaine droite.
7. Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que R > est un groupement N (-n-do(lecanoyl) -4-amino-2- hydroxybenzoyle, N-(n-dodécanoyl)-3-amino-4-méthylbenzoyle,

N-(n-dodécanoly)-4-amino-3méthylbenzoyle ou N-(n-dodécanoyl) 3-amino-4-méthoxybenzoyle.
8. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R5 est un groupement N-(n-dodécanoyl)-3-amino-2,5dichlorobenzoyle, N-(n-dodécanoyl)-4-amino-3,5-diiodobenzoyle,

N-(n-dodécanoyl)-p-aminophénylacétyle, N-(n-dodécanoyl)-paminocainnamoyle, N-(n-dodécanoyl)-p-aminohippuryle, N-(ndodécanoyl)-2-aminonicotinyle ou N-(n-dodécanoyl)-phénylalanyle.
9. Procédé de préparation d'un composé de formule

III, caractérisé en ce qu'il consiste à acyler avec un Nalcanoylamino-acide, un noyau peptidique -cyclique de formule

et R3 et R4 sont tous deux 011.

groupement alkyloxy en C1-C6 et R4 est OH, ou R' est

quand R est OH, R est H, R est OH ou un

H ou tous deux OH, et

quand R est H, R est H et R et R4 sont tous deux

N-(n-do

II dans laquelle R est H ou OH et
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que R5 est un groupement N-alcanoyl-amino-acyle, dérivé de 1'acide correspondant, de formule

où W et R6 sont tels que définis dans la revendication 1.
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que R5 est

où A est un groupement alkylène en Cl-C10 et R6 un groupement alkyle en C1-C17 à chaîne droite.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que R5 est un groupement N-(n-dodécanoyl)-5-amino-n- pentanoyle, N-(n-dodécanoYL)-11-amino-n-hendécanoyle ou N- (nheptanoyl)-11-amino-n-hendécanoyle.
13. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que R5 est

dans laquelle X est un atome d'hydrogène et R6 est un groupement alkyle en C1-C17 à chaine droite.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que R5 est un groupement N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoyle, N-(n-dodécanoyl)-m-aminobenzoyle, N-(acétyl)-paminobenzoyle, N-(n-heptanoyl)-p-aminobenzoyle, N-(n décanoyl) -p-aminobenzoyle, N- (n-tétradécanoyl) -p-amino- benzoyle ou N-(n-hexadécanoyl)-E-aminobenzoyle.
15. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que R5 est

dans laquelle X est'un radical chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alcoxy en C1-C4, mercapto, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C3, et R6 est un groupement alkyle en C1-C17 à chaîne droite.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que R5 est un groupement N-(n-dodécanoyl)-4-amino-2hydroxybenzoyle, N- (n-dodécanoyl) -3-amino-4-méthylbenzoyle,

N-(n-dodécanoyl)-4-amino-3-méthylbenzoyle ou N-(n-dodécanoyl) 3-amino-4-méthoxybenzoyle
17. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que R5 est un groupement N-(n-dodécanoyl)-3-amino-2,5dichlorobenzoyle, N-(n-dodécanoyl)-4-amino-3,5-diiodobenzyle,

N-(n-dodécanoyl)-p-aminophénylacétyle, N-(n-dodécanoyl)-paminocinnamoyle, N-(n-dodécanoyl)-p-aminohippuryle, N-(ndodécanoyl)-2-aminonicotinyle ou N-(n-dédécanoyl)-phénylalanyle.
18. Composition antifongique contenant comme ingrédient actif un composé selon l'une quelconque des revendications de 1 à 8.