Cette invention concerne des noyaux peptidiques cycliques de formule générale :
<EMI ID=1.1>
I
et leurs sels d'addition d'acides. Les noyaux et leurs sels
sont utilisables comme intermédiaires dans la préparation
d'agents antifongiques semi-synthétiques.
On prépare les noyaux en desacylant un antibiotique
peptidique cyclique de formule générale :
<EMI ID=2.1>
dans laquelle R est une chaîne latérale d'acide gras saturé
ou insaturé et R1, R , R et R sont des substituants définis ci-dessous.
On a découvert un procédé d'enlèvement enzymatique de
la chaîne latérale d'acide gras R, pour obtenir le noyau peptidique cyclique. Le procédé consiste à mettre l'antibiotique dans un milieu aqueux en contact avec une enzyme
produite par un microorganisme de la famille Actinoplanaceae jusqu'à désacylation substantielle.
Un procédé préféré selon cette invention consiste \ utiliser une enzyme produite par le microorganisme
Actinoplanes utahensis NRRL 12052 pour couper la chaine
latérale d'acides gras. La désacylation est généralement
effectuée en ajoutant l'antibiotique approprié à une culture
ae A. utahensis et en faisant incuber la culture jusqu'à ce
qu'on obtienne la désacylation. Les noyaux ainsi obtenus
sont séparés du bouillon de fermentation par des procédés
connus dans le domaine. Ces noyaux sont utiles en ce qu'on
peut les réacyler pour obtenir de nouvelles substances antibiotiques.
En particulier, l'invention fournit un noyau peptidique cyclique de formule
<EMI ID=3.1>
i
dans laquelle R est H ou OH et ;
<EMI ID=4.1> <EMI ID=5.1>
et
<EMI ID=6.1>
O
<EMI ID=7.1>
groupement -C-NH2 et R et R sont tous deux OH, et ses sels d'addition d'acides.
Dans un mode de réalisation des noyaux de cette inven-
<EMI ID=8.1>
de réalisation est connu comme noyau de A-30912A. On prépare le noyau de A-30912A en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II où R est un groupement linoléoyle,
<EMI ID=9.1>
dans le noyau de A-30912A.
Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'antibiotique est connu comme facteur A de A-30912, quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est connu comme facteur'A de A-30912-tétrahydrogén� et quand R est un groupement
<EMI ID=10.1>
Facteur A de A-30912
Le facteur A de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs B, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 et les différents facteurs A à G sont décrits dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.245. Le facteur A de A-30912 est identique à l'antibiotique A-22082 qui est décrit dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.246.
<EMI ID=11.1>
et 4.024.246, on a trouvé que le facteur A de A-30912 est identique à l'êchinocandine B antibiotique [Voir F. Benz et al., Helv. Chim. Acta 57, 2459-2477 (1974) et le brevet suisse N[deg.] 568.386J. L'antibiotique SL 7810/F a également été identifié comme étant l'échinocandine B [C. KellerJuslen, et al., Tetrahedron Letters 1976 (46), 4147-4150, et le brevet belge N[deg.] 834.289].
Keller-Juslen, et al. ont proposé la structure de
<EMI ID=12.1>
formule II où R est un groupement linoléoyle, R , R et R sont OH et R <2> est H pour le facteur A de l'antibiotique A-30912.
<EMI ID=13.1>
Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné (SL 7810/F tétrahydrogéné, tétrahydroéchinocandine B), qui est décrit dans le brevet belge N[deg.] 834.289 et par F. Benz et al., Helv.
Chim. Acta 57, 2459-2477 (1974), a la formule II dans
13 4 laquelle R est un groupement stéaroyle, R , R et R sont OH et R<2> est H. Pour des raisons de commodité, cette substance sera appelée ici têtrahydro-A-30912A.
Aculéacine A
L'aculéacine A est un composant du mélange aculéacine qui comprend un composant principal (aculéacine A) et six composants mineurs (aculéacines B, C, D, E, F et G). Les composants de l'aculéacine sont décrits dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 3.978.210. Ainsi qu'il est décrit dans le brevet belge N[deg.] 859.067, l'aculéacine A a vraisemblablement la même structure peptidique cyclique que tétrahydro-A-30912A mais la chaîne latérale stéaroyle est remplacée par une chaîne palmitoyle.
Noyau de A-30912A
Le nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur A de A-30912 (échinocandine B, SL 7810/F), du facteur A de A-30912 tétrahydrogéné, et de l'aculéacine A, a la formule I dans laquelle
<EMI ID=14.1>
Ce noyau (noyau de A-30912A) est un matériau amorphe blanc qui est soluble dans les solvants comme l'eau, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et' le méthanol et qui est insoluble dans des solvants comme le chloroforme, le toluène et l'éther diéthylique.
Le noyau de A-30912A a une formule brute de C34H51N7015 et un poids moléculaire de 797,83.
Le spectre d'absorption infrarouge du noyau de A-30912A en pastilles de KBr est indiqué sur la Figure I. On observe les maximas d'absorption suivants : 3340 large (OH, liaison hydrogène), 2970, 2930 et 2890 (étirement de CH, aliphatiques dans les groupements CH3, CH2, CH), 1660 et 1625 (plusieurs
<EMI ID=15.1>
"wagging" de CH), 1310-1340, 1230-1260, 1080, 835, 650 large
<EMI ID=16.1>
<EMI ID=17.1>
le diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence d'un
<EMI ID=18.1>
7,32).
On peut séparer le noyau de A-30912A par chromatographie liquide sous pression élevée (CLPE). Le noyau de A-30912A a un temps de rétention approximatif (k') de 11,52 minutes quand on le mesure par CLPE en utilisant les conditions suivantes :
<EMI ID=19.1>
Préparation du noyau de A-30912A
Préparation du substrat
Le noyau de A-30912A selon cette invention peut être préparé à partir du facteur A de A-30912, du facteur A de A-30912 tétrahydrogéné ou de l'aculéacine A. Ces substrats peuvent être utilisés sous forme de matériaux purifiés mais il n'est pas essentiel qu'il soit purifé. Ainsi, par exemple, le mélange A-30912 dont le facteur A de A-30912 est le composant principal, peut être utilisé comme substrat de préparation du noyau de A-30912A.
Facteur A de A-30912
Le facteur A de A-30912 peut être obtenu par fermenta-
<EMI ID=20.1>
1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ;
2) une souche de Aspergillus nidulans NRRL 8112 ;
3) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus
A-32204, NRRL 3860 ;
4) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039 ; ou
5) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus,
NRRL 11440.
Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire le facteur A de A-30912, on obtient <EMI ID=21.1>
est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355.
<EMI ID=22.1>
du mélange A-42355.
Tétrahydro-A-30912A
On prépare tétrahydro-A-30912A à partir du facteur A de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.
Aculéacine A
On prépare l'aculéacine A par fermentation d'une souche de Aspergillus aculeatus NRRL 8075 comme décrit dans le brevet des E.U.A N[deg.] 3.978.210 qui est incorporé ici par voie de référence.
Selon un autre mode de réalisation du noyau de cette
<EMI ID=23.1>
deux OH. Le noyau de ce mode de réalisation est connu comme noyau de A-30912B. On prépare le noyau de A-30912B en
<EMI ID=24.1>
dans laquelle R est un groupement linoléoyle ou stéaroyle
123
<EMI ID=25.1>
Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'antibiotique est connu comme facteur B de A-30912 et quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est connu sous le nom de facteur
B de A-30912 tétrahydrogéné.
Facteur B de A-30912
Le facteur B de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs A, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet dea E.U.A. N[deg.] 4.024.245.
On a trouvé que le facteur B de A-30912 est identique
à l'échinocandine C antibiotique [Voir R. Traber et al.,
<EMI ID=26.1>
SL 7810/F-ll (Brevet belge N[deg.] 834.289).
Traber et al. ont proposé la structure de formule II
12 3 dans laquelle R et R sont tous deux H, R et R sont tous
<EMI ID=27.1> <EMI ID=28.1>
antibiotique, Traber et al. proposent la formule II dans
<EMI ID=29.1>
OH et R est un groupement stéaroyle.
Facteur B de A-30912 tétrahydrogéné
Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL
7810/F-II ; tétrahydroéchinocandine C), qui est décrit dans le brevet belge N[deg.] 834.289 et par R. Traber et al., Helv.
Chim. Acta 62, 1252-1267 (1979), a la formule II dans
<EMI ID=30.1>
OH et R est un groupement stéaroyle. Pour des raisons de commodité, ce matériau sera appelé tétrahydro-A-30912B.
Noyau de A-30912B
Le. nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur B de A-30912 (échinocandine C, SL 7810/F-II) et de tétrahydro-A-30912B, a la structure représentée par la formule I, dans laquelle
<EMI ID=31.1>
et un poids moléculaire de 781,83.
Préparation du noyau de A-30912B
Préparation du substrat
On peut préparer le noyau de A-30912B à partir du facteur B de A-30912 ou de tétrahydro-A-30912B. Comme ce facteur B n'est pas le composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour enlever les autres facteurs coproduits avant de l'utiliser comme substrat.
Facteur B de A-30912
Ce facteur peut être obtenu par fermentation aérobie de :
1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ;
2) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus
A-32204, NRRL 3860 ;
3) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039 ; ou
4) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus,
NRRL 11440.
Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire le facteur B de A-30912, on obtient un mélange de facteurs qui, pour des raisons de commodité, est appelé mélange antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont des facteurs mineurs du mélange A-42355.
Tétrahydro-A-30912B
On prépare tétrahydro-A-30912B à partir du facteur B de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.
Dans un autre mode de réalisation des noyaux de cette
1 2
invention, R , R , R et R sont tous des atomes d'hydrogène. Le noyau de ce mode de réalisation est appelé noyau de A-30912D. On prépare le noyau de A-30912D en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II où R est un groupement linoléoyle ou stéaroyle et R , 1 R , R et R sont comme dans le noyau de A-30912D.
Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'anti.biotique est appelé facteur D de A-30912 et quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est appelé facteur D de A-30912 tétrahydrogéné.
Facteur D de A-30912
Le facteur D de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs A, B, C, E, F et G. Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.245.
On a trouvé que le facteur D de A-30512 est identique à l'échinocandine D antibiotique [Voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta 62, 1252-1267 (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/F-III (Brevet belge N[deg.] 834.289).
Traber et al. ont proposé la structure de la formule
123
<EMI ID=32.1>
groupement linoléoyle pour l'échinocandine D antibiotique. Pour la tétrahydroéchinocandine D, Traber et al. ont proposé
1 2 la structure de formule II dans laquelle R , R , R et R sont chacun H et R est un groupement stéaroyle.
Pour des raisons de commodité, le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-III ; tétrahydro-échinocandine D) sera appelé tétrahydro-A-30912D..
Noyau de A-30912D
Le nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur D de A-30912 (échinocandine D, SL 7810/F-III) et de tétrahydro-A-30912D, a la structure représentée dans la formule I dans laquelle
12
R , R , R et R sont des atomes d'hydrogène.
<EMI ID=33.1>
et un poids moléculaire de 749,83.
Préparation du noyau de A-30912D Préparation du substrat
On peut préparer le noyau de A-30912D à partir du
<EMI ID=34.1>
facteur D de A-30912 n'est pas le composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour enlever les facteurs produits simultanément avant de l'utiliser comme substrat.
Facteur D de A-30912
Le facteur D de A-30912 peut être produit par fermentation aérobie en immersion de :
1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ;
2) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus
A 32204, NRRL 3860 ;
3) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039 ; ou
4) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus,
NRRL 11440.
Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour obtenir le facteur D de A-30912, on obtient un mélange de facteurs que l'on appelle pour des raisons de commodité mélange antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont des facteurs mineurs du mélange A-42355.
Tétrahydro-A-30912D
On prépare tétrahydro-A-30912D à partir du facteur D de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.
Dans encore un autre mode de réalisation des noyaux de cette invention, R et R sont tous deux OH, R est H et R
<EMI ID=35.1>
de réalisation sont appelés noyaux de type A-30912H. On prépare les noyaux de type A-30912H en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II dans laquelle R est un groupement linoléoyle ou stéaroule et R , R , R et R 4 sont comme dans les noyaux de type A-30912H.
Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle et R est un groupement méthoxy, l'antibiotique est appelé facteur H de A-30912 et, quand R est un groupement stéaroyle et R est un groupement méthoxy, l'antibiotique est appelé facteur H de A-30912 tétrahydrogéné.
Quand R, dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II, est un groupement linoléoyle et R est un groupement alkyloxy en C2-C6, les antibiotiques sont appelés homologues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 et quand R est un groupement stéaroyle et R est un groupement alkyloxy en C2-C6, les antibiotiques sont appelés homologues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 tétrahydrogéné.
Facteur H de A-30912
Le facteur H de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs A, B, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.245. Le facteur H de A-30912 est un facteur de A-30912 découvert par la suite. Le facteur H de A-30912
<EMI ID=36.1>
Homologues du facteur H de A-30912
Après la découverte de la structure du facteur H de A-30912, on a mis en valeur le fait que les homologues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 seraient des produits utiles. Avant ce moment, les dérivés alkyloxy que l'on avait préparés n'avaient pas été reconnus comme ayant une utilité et étaient préparés seulement comme outils de détermination de la structure. Les homologues à groupement alkyloxy en C2-C6 du facteur H de A-30912 sont préparés à partir du facteur A de A-30912.
Le facteur H de A-30912 peut être produit par fermen--ion de 1) une souche de Asperqillus rugulosus NRRL 8113 ;
<EMI ID=37.1>
A-32204, NRRL 3860 ;
4) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039 comme
décrit dans le brevet belge N[deg.] 834.289 ; ou
5) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus,
NRRL 11440.
Comme chaque noyau de A-30912H contient une partie amino, ils peuvent exister sous la forme de sels. Ces .sels sont également utilisables comme intermédiaires et pour des besoins de purification. Les sels pharmaceutiquement acceptables des noyaux de A-30912H sont particulièrement utiles parce qu'ils réduiront au minimum la purification des produits finals. Les sels "acceptables sur le plan pharmaceutique" désignent les sels dont la toxicité du produit en tant que tout vis-à-vis des animaux à sang chaud n'est pas accrue.
Les sels d'addition d'acides des noyaux de A-30912H peuvent être préparés par des modes opératoires de réaction classique avec un acide minéral ou organique. Des exemples des acides minéraux et organiques comprennent les acides chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, benzolque, sulfamique, tartrique, citrique, maléique, succinique, ascorbique, glycolique; lactique, fumarique, palmitique, cholique, pamolque, mucique,
<EMI ID=38.1>
stéarique, salicylique.- méthanesulfoniaue, benzènesulfonique, sorbique, picrique, cinnamique et d'autres acides appropriés.
Préparation des noyaux de A-30912H
Préparation du substrat
On peut préparer le noyau de A-30912H, c'est-à-dire le composé de formule I dans laquelle R1 et R4 sont tous deux
<EMI ID=39.1>
facteur H de A-30912 ou de tétrahydro-A-30912H. Comme le facteur H de A-30912 n'est pas un composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour enlever les autres facteurs antibiotiques <EMI ID=40.1>
un groupement alkyloxy en C2-C6 (homologues de A-30912H) par réaction du facteur A de A-30912 ou de tétrahydro-A-
30912A avec un alcool approprié pour préparer le dérivé à groupement alkyloxy en C2-C6 correspondant. Comme le facteur A de A-30912 est le composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, ce procédé est également une façon préférée de préparer le facteur H de A-30912 et tétrahydro-A-309l2H.
Facteur H de A-30912
On peut obtenir le facteur H de A-30912 par fermentation aérobie en immersion d'une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ou d'une souche de Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.
Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 1140 pour produire le facteur A-30912, on obtient un mélange de facteurs que l'on appelle pour des raisons de commodité mélange antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont les facteurs mineurs du mélange A-42355.
Homologues de A-30912H
On prépare les homologues de A-30912H en faisant réagir le facteur A de A-30912 ou tétrahydro-A-30912A avec l'alcool correspondant approprié pour former le dérivé à
<EMI ID=41.1>
R4 sont tous deux OH, R <2> est H et R <3> est un groupement alkyloxy en C2-C6. Ceci est un procédé préféré de préparation du facteurH de A-30912 et de tétrahydro-A-30912H. On peut préparer les homologues de A-30912H de formule II où R est un groupement s téaroyle et R un groupement alkyloxy en
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
groupement alkyloxy, ou b) en faisant réagir le facteur A de A-30912 avec l'alcool approprié pour former le dérivé à groupement alkyloxy puis en réduisant les doubles liaisons <EMI ID=44.1>
On prépare tétrahydro-A-30912A, tétrahydro-A-.30912H, et les composés de formule II où R est un groupement alkyloxy en C�-C� et R un groupement stéaroyle à partir des facteurs A et H de A-30912 et à partir des composés de
<EMI ID=45.1>
est un groupement linoléoyle, par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.
Dans encore un autre mode de réalisation des noyaux de
<EMI ID=46.1>
ment carboxamide. Le noyau de ce mode de réalisation est connu comme noyau de S 31794/F-l. On prépare le noyau de
S 31794/F-l en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II dans laquelle R est un groupement
1 2
myristoyle et R , R , R et R sont comme dans le noyau de S 31794/F-l.
<EMI ID=47.1>
On obtient le noyau de S 31794/F-l de cette invention en désacylant l'antibiotique peptidique cyclique S 31794/F-l.
L'antibiotique S 31794/F-l, qui est décrit dans la demande de brevet allemande publiée après examen
N[deg.] 2.628.965 et le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.173.629, est un composé antifongique produit par Acrophialophora limonispora nov. spec. Dreyfuss et Muller NRRL 8095. S 31794/F-l a les
<EMI ID=48.1>
(amorphe) ou 181-183[deg.]C. (décomposition) (cristallisé) ;
<EMI ID=49.1>
à l'état cristallisé) ; maxima d'absorption UV dans -le
<EMI ID=50.1>
deuterométhanol (190 mg dans 1,5 ml de deuterométhanol), le tétraméthylsilane étant utilisé comme étalon interne) avec les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé) :
<EMI ID=51.1>
une analyse élémentaire approximative (après séchage du matériau cristallin pendant deux heures sous vide poussé à
<EMI ID=52.1>
d'hydrogène, 10,5 - 10,8 % d'azote et 25,5 - 26,0 % d'oxygène. S 31794/F-l est facilement soluble dans le
<EMI ID=53.1>
est faiblement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, le benzène et l'hexane et a une activité antifongique, en particulier vis-à-vis de Candida Albicans.
On pense que l'antibiotique S 31794/F-l a la formule II dans laquelle R est un groupement myristoyle, R , R et R 4 sent OH et R <2> est un groupement carboxamide.
Noyau de S 31794/F-l
On pense que le nouveau noyau peptidique cyclique de cette invention, c'est-à-dire le noyau de l'antibiotique
S 31794/F-l, a la structure représentée par la formule 1
134
<EMI ID=54.1>
carboxamide.
Le noyau de S 31794/F-l a une formule brute de
<EMI ID=55.1>
Préparation du noyau de S 31794/F-l , Préparation du substrat
On prépare le noyau de S 31794/F-l de cette invention à partir de l'antibiotique S 31794/F-l.
On prépare l'antibiotique S 31794/F-l par culture aérobie en immersion d'Acrophialophora limonispora NRRL
8095. Ce microorganisme fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois
61604, où il est disponible au public sous le numéro NRRL indiqué.
Comme les noyaux contiennent chacun un groupement amino, ils peuvent exister sous forme de sels. Ces sels sont également utilisables comme intermédiaires et pour la purification. Les sels pharmaceutiquement acceptables des noyaux sont particulièrement utilisables car la purification des produits finals est minimisée. Les sels "pharmaceutiquement acceptables" désignent les sels dont la toxicité du produit en tant que tout vis-à-vis des animaux à sang chaud n'est pas accrue.
Les sels d'addition d'acides des noyaux peuvent être formés par des modes opératoires de réaction classique avec un acide minéral ou organique. Des acides minéraux et organiques types comprennent les acides chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, benzoïque, sulfamique, tartrique, citrique, maléique, succinique, ascorbique, glycolique, lactique, fumarique, palmitique, cholique, pamolque, mucique, D-glutamique, d-camphorique, glutarique, phtalique, laurique, stéarique, salicylique, méthanesulfonique, benzènesulfonique, sorbique, picrique, cinnamique, et d'autres acides appropriés.
La chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées (CLFPCE) à phase inversée utilisant
<EMI ID=56.1>
la purification finale des différents antibiotiques. Dans ce procédé, on place le mélange antibiotique brut dissous dans un solvant sur une colonne équilibrée avec le même solvant. Puis, on élue la colonne avec le solvant. Les fractions recueillies sont contrôlées par bioautographe par Candida albicans et/ou par UV (en se basant sur les durées de rétention relatives). On réunit les fractions contenant des facteurs antibiotiques identiques. Il est parfois nécessaire d'effectuer une séparation chromatographique supplémentaire pour obtenir les différents facteurs sous forme purifiée.
<EMI ID=57.1>
ou A-42355, par exemple, par extraction du bouillon entier ou des myceliums avec du méthanol ou du chloroforme. Le mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile est un système solvant préféré pour la chromatographie de ces antibiotiques.
L'antibiotique S 31794/F-l brut est obtenu par extraction du bouillon entier par un mélange 4:1 d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et chromatographie des extraits.
Les différents facteurs peuvent être identifiés par chromatographie sur couche mince (CCM). Le gel de silice est un adsorbant préféré.
Les Rf des facteurs A à G de A-30912, en utilisant une CCM sur gel de silice à teneur élevée en carbone, un système solvant 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe Candida albicans, sont donnés dans le Tableau I
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
Les Rf approximatifs des facteurs A, B, C, D et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une CCM sur gel de silice riche en carbone et bioautographe par. Candida albicans, sont donnés dans le Tableau II
TABLEAU II
<EMI ID=60.1>
Systèmes solvants :
a : acétate d'éthyle:méthanol (3:2) b : acétate d'éthyle:méthanol (7:3) c : acétonitrile:eau (95:5)
<EMI ID=61.1>
Les facteurs A, B, D et H de A-30912 peuvent également être identifiés par CLFPCE analytique en utilisant les conditions suivantes :
<EMI ID=62.1>
Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, B, D et H de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau III.
TABLEAU III
<EMI ID=63.1>
Préparation de l'enzyme
A. Microorganisme producteur
L'enzyme qui est utilisable pour la désacylation des antibiotiques de cette invention est produite par certains microorganismes de la famille Actinoplanaceae, de préférence
le microorganisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052.
L'enzyme peut être la même enzyme que celle que l'on
a utilisée pour désacyler les pénicillines. Ce travail a
été décrit dans le brevet des E.U.A N[deg.] 3.150.059. Bien
qu'un procédé préféré de culture de A. utahensis NRRL 12052 pour la production de cette enzyme soit décrit dans la préparation 1, l'homme de l'art verra que d'autres procédés peuvent être utilisés.
Les Actinoplanaceae sont une famille relativement
récente de microorganismes de l'ordre Actinomycetales.
Décrite pour la première fois par le Dr. John N. Couch, cette famille a été créée en 1955 [J. Elisha Mitchell Sci. Soc. 71,
148-155 (1955)]. Les caractéristiques de la famille et de nombreux genres distincts se trouvent dans : "Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology", 8th Ed., R.E. Buchanan and
N.E. Gibbons, Eds., The Williams & Wilkins Co., Baltimore,
Md., 1974, pages 706-723. Dix genres ont ainsi été distingués depuis :
I. Actinoplanes (c'est-à-dire le genre type et, de fait
le genre de loin le plus commun) ;
II. Spirillospora ;
III. Streptosporangium ;
IV. Amorphosporangium ;
V. Ampullariella ;
VI. Pilimelia VII. Planomonospora ; VIII. Planobispora ;
<EMI ID=64.1>
X. Kitasatoa.
Certaines des espèces et variétés qui ont été isolées et caractérisées jusqu'à présent sont : Actinoplanes
<EMI ID=65.1>
utahensis, et Actinoplanes missouriensis ; Spirillospora albida ; Streptosporangium roseum, Streptosporangium vulgare, Streptosporangium roseum var. hollandensis, Streptosporangium album, Streptosporangium viridialbum, Amorphosporangium auranticolor, Ampullariella regularis, Ampullariella campanulata, Ampullariella lobata, Ampullariella digitata, Pilimelia terevasa, Pilimelia anulata, Planomonospora parontospora, Planomonospora venezuelensis, Planobispora longispora, Planobispora rosea, Dactylosporangium aurantiacum, et Dactylosporangium thailandense.
Le genre Actinoplanes est une source préférée de l'enzyme qui est utilisable pour cette invention. Dans le genre Actinoplanes, l'espèce Actinoplanes utahensis est une source particulièrement préférée de l'enzyme.
Des cultures des espèces représentatives sont disponibles au public au Northern Regional Research Center, Voir ci-dessus, sous les numéros d'accès suivants :
<EMI ID=66.1>
A. utahensis NRRL 12052 a été obtenu à partir d'une culture mère qui a été déposée à la American - Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Md. 20852 (A. utahensis ATCC 14539). La culture de
A. utaherisis ATCC 14539 peut également être utilisée comme source de l'enzyme.
A. missouriensis NRRL 12053 a été obtenu à partir d'une culture qui est également déposée à l'ATCC (A. missouriehsis ATCC 14538) et qui est une autre source de l'enzyme.
L'efficacité d'une quelconque souche donnée de micro-organisme appartenant à la famille Actinoplariaceae pour la mise en oeuvre de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le microorganisme un milieu de culture approprié. On fait incuber la culture à environ 28[deg.]C pendant 2 ou 3 jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient le pH du milieu de fermentation à environ pH 6,5. On contrôle l'activité de la culture en utilisant un dosage par Candida albicans. Ce mode opératoire est décrit dans le paragraphe E. La perte de l'activité antibiotique est une indication que le microorganisme produit l'enzyme nécessaire pour la désacylation. Ceci doit cependant être vérifié en utilisant l'un des procédés suivants :
1) Analyse par CLPE pour déterminer la présence du noyau intact ; ou
2) Réacylation avec une chaîne latérale appropriée pour restaurer l'activité.
B. Conditions de production de l'enzyme
La production de l'enzyme s'effectue dans des conditions permettant la croissance d'Actinoplanaceae, c'est-àdire à une température comprise entre environ 25 et environ
30[deg.]C et à un pH compris entre environ 5,0 et environ 8,0, avec agitation et aération. Le milieu de culture doit contenir :
a) une source de carbone assimilable comme du saccharose, du glucose, du glycérol, etc .... ; b) une source d'azote comme la peptone, l'urée, le <EMI ID=67.1> c) une source de phosphate comme un phosphate soluble; et d) des sels minéraux qui se révèlent généralement être efficaces pour l'amélioration de la croissance des microorganismes.
On obtient, en général, une quantité effective de
<EMI ID=68.1>
cycle de croissance et elle persiste pendant un certain temps après que l'on a atteint la croissance effective. La quantité d'enzyme produite varie d'une espèce d'organisme à une autre et en fonction de conditions de culture différentes.
Comme le verra l'homme de l'art, les microorganismes,
<EMI ID=69.1>
l'enzyme sont sujets à variations. Par exemple, on peut obtenir des variants et mutants artificiels de ces souches par traitement par divers mutagènes connus comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les ondes de fréquence élevées, les rayons radioactifs, et les produits chimiques. Tous les variants et mutants naturels et artificiels que l'on obtient à partir des Actinoplanaceae et qui produisent l'enzyme peuvent être utilisés dans cette invention.
C. Conditions de désacylation
Le substrat est de préférence ajouté à la culture d'Actinoplanaceae une fois que la culture a incubé pendant au moins environ 48 heures. La concentration du substrat dans le milieu de transformation peut varier de façon importante. Pour une utilisation maximale de l'enzyme et pour une désacylation pratiquement complète en 24 heures, la concentration du substrat sera cependant généralement comprise entre environ 0,5 et environ 1,0 mg/ml. On peut utiliser des concentrations inférieures mais elles ne permettent pas d'utiliser au maximum l'enzyme ; on peut également utiliser des concentrations supérieures, mais le substrat ne peut pas être totalement désacylé si l'on ne prolonge pas la durée de fermentation.
La transformation des substrats antibiotiques en noyaux correspondants de.cette invention se fait pour le mieux quand le pH du milieu de fermentation est maintenu
<EMI ID=70.1>
désacylation se fait lentement ; lorsque le pH monte audessus de 6,0, le substrat et le noyau qui se forme sont de moins en moins stables. Pour un maximum de stabilité, on préfère un pH de 6,0, mais à ce pH, la désacylation se fera moins rapidement (environ 30 à environ 36 heures). Pour une désacylation plus rapide (environ 24 heures) sans pertes importantes, on préfère un pH d'environ 6,5. Dans les fermenteurs agités, le pH peut être réglé par des appareils de détection et de commande. Quand ceci n'est pas pratique, <EMI ID=71.1>
en ajoutant du tampon phosphate 0,1 M au milieu avant addition du substrat.
Après addition du substrat, il faut poursuivre l'incubation de la culture pendant environ 24 heures ou plus. La pureté du substrat affectera la vitesse de désacylation.
Par exemple, un substrat ayant une pureté supérieure à 50 % est désacylé à un taux d'environ 0,8 environ 1,2 mg/ml d'antibiotique en 24 heures. Quand on utilise des substrats de pureté inférieure, la désacylation se fait moins rapidement.
Le substrat peut être introduit en plusieurs fois. Par exemple, dans de petits réservoirs, on peut introduire 0,3 à 0,5 mg/ml d'antibiotique à des intervalles de 12 heures pendant au moins cinq additions, et dans des réservoirs plus grands, on peut ajouter deux fois 0,7 mg/ml.
La désacylation peut être effectuée sur un large intervalle de températures, par exemple d'environ 20 à environ 45[deg.]C. Il est cependant préférable d'effectuer la
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
pour une désacylation et une stabilité optimales du substrat et du noyau.
D. Le substrat
Il est préférable d'utiliser comme substrats des antibiotiques purifiés. Les substrats antibiotiques ont une activité antifongique mais non antibactérienne. Ainsi, les substrats peuvent abriter des cellules bactérielles ou des spores qui pourraient se développer dans le milieu de fermentation de désacylation. De telles impuretés peuvent nuire
<EMI ID=74.1>
biotiques de départ ou des noyaux obtenus. Il est donc important que les substrat soient stériles. Comme le passage à l'autoclave détruit la majeure partie des substrants antibiotiques, il est préférable de stériliser les préparations par traitement par l'oxyde d'éthylène dans un système sous pression.
E. Contrôle de la désacylation
Les substances de départ sont des antibiotiques anti-fongiques qui sont particulièrement actifs vis-à-vis de Candida albicans. Pour cette raison, une analyse utilisant C. albicans est préférable pour déterminer les quantités de substrats présents. Les noyaux qui se forment sont solubles dans l'eau mais sont inactifs sur le plan biologique. Une diminution de l'activité biologique est donc un essai présomptif rapide de désacylation. 'Des échantillons de bouillons et des extraits alcooliques des solides de fermentation doivent tous deux être analysés car les substrats ne sont que légèrement solubles dans le bouillon.
F. Utilisation des cellules restantes
Un autre procédé de désacylation consiste à recueillir les cellules d'Actinoplanaceae du milieu de culture, à mettre à nouveau les cellules en suspension dans une solution tampon et à effectuer la désacylation comme décrit dans le paragraphe C. Quand on utilise ce procédé, les myceliums actifs sur le plan enzymatique peuvent être réutilisés. Par exemple, les myceliums de A. utahensis NRRL 12052 conservent une activité de désacylase après conservation pendant un mois ou plus sous réfrigération (4 - 8[deg.]C) ou à l'état congelé (-20[deg.]C). Une solution tampon préférée est le tampon phosphate 0,1 M.
G. Enzymes immobilisées
Un autre procédé de mise en oeuvre de la désacylation consiste à immobiliser l'enzyme par des procédés connus dans le domaine. (Voir, par exemple, "Biomédical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins", Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plenum Press, New York, 1977 ; Vol. 1). L'enzyme immobilisée peut ensuite être utilisée dans une colonne (ou tout autre type approprié de réacteur) pour effectuer la désacylation.
En outre, le microorganisme peut lui-même être immobilisé et utilisé pour catalyser la réaction de désacylation.
Utilité des noyaux
Les noyaux et leurs sels d'addition d'acides sont des intermédiaires utilisables pour la préparation de composés antifongiques synthétiques. Les composés antifongiques utilisables préparés à partir de ces noyaux sont décrits dans les demandes de brevets N[deg.] déposées le même jour que la présente demande de brevet.
Ces composés sont représentés par la formule.suivante
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
demandes correspondantes mentionnées page 23 , ligne 39 ci-dessus.
<EMI ID=77.1>
On prépare les composés de formule III en acylant le noyau approprié sur le groupement a-amino de la partie ornithine du noyau par la chaîne latérale acyle appropriée en utilisant des procédés connus dans le domaine pour former une liaison amide. L'acylation est généralement effectuée en faisant réagir le noyau avec un dérivé activé de l'acide correspondant à la chaîne latérale acyle désirée.
L'expression "Dérivé activé" désigne un dérivé qui rend la fonction carboxy de l'agent d'acylation réactif à la copulation avec le groupement amino primaire pour former la liaison amide qui lie la chaîne latérale acyle au noyau approprié. Les dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et leurs procédés d'utilisation comme agents d'acylation d'une amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivés activés préférés sont :
(a) un halogénure d'acide (par exemple un chlorure d'acide), (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride <EMI ID=78.1>
(c) un ester activé (par exemple un ester 2,4,5trichlorophénylique).
D'autres procédés d'activation de la fonction carboxy comprennent la réaction de l'acide carboxylique avec un carbonyldiimide (par exemple le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide ou le N,N'-diisopropylcarbodiimide) pour obtenir un intermédiaire réactif qui, en raison de son instabilité, n'est pas isolé, la réaction avec l'aminé primaire étant alors effectuée in situ.
Si un amino acide particulier contient un groupement
<EMI ID=79.1>
entendu pour l'homme de l'art qu'un tel groupement doit être protégé avant la réaction de l'amino acide avec le réactif utilisé peur fixer le groupement N-alcanoyle ou N-alcénoyle. Des groupements protecteurs appropriés peuvent être un quelconque groupement connu dans le domaine comme utilisable pour la protection d'un groupement fonctionnel de chaîne
latérale dans la synthèse des peptides. De tels groupements sont bien connus et le choix d'un groupement protecteur particulier et son procédé d'utilisation seront facilement appréciés de l'homme de l'art [Voir, par exemple, "Protective
<EMI ID=80.1>
Press, N.Y., 1973].
Les composés de formule III inhibent la croissance des champignons pathogènes et sont donc utilisables pour lutter contre la croissance des champignons sur des surfaces environnementales (en tant qu'antiseptique) ou dans le traitement d'infections provoquées par des champignons. Les composés sont, en particulier, actifs vis-â-vis de Candida albicans et sont donc particulièrement utiles pour traiter la candidose. L'activité des composés peut être déterminée par des modes opératoires d'essais microbiologiques classiques, comme in vitro par des essais de diffusion de disques sur plaque de gélose ou des essais de diffusion sur gélose, ou
<EMI ID=81.1>
albicans. Les composés sont également actifs vis-à-vis de trichophyton mentagrophytes (organisme dermatophyte), Saccharomyces pastorianus et Neurospora crassa.
Certains composés (Comme indiqué dans l'Exemple de Référence 19, Tableau VIII) donnent des taux significatifs dans le sang après administration par voie orale chez les souris.
Quand on administre à un chien par voie intraveineuse à une dose de 100 mg/kg par jour pendant 5 jours, le composé
<EMI ID=82.1>
benzoyle, on n'observe aucun signe extérieur de toxicité bien que l'on observe des taux temporairement accrus de transaminase glutamo-pyruvique sérique.
Quand on les utilise de façon systématique, la dose de composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection, et l'état physique du sujet que l'on traite. La thérapie doit être amorcée à de faibles doses, et la dose doit être accrue jusqu'à ce que l'on obtienne l'effet antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire par injection sous forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle
on peut ajouter, si on le désire, des agents classiques pharmaceutiquement acceptables comme des agents de conservation, des agents tampons, des agents de solubilisation ou
de mise en suspension. D'autres additifs, comme la solution saline ou le glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques. Les proportions et la nature de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art.
Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang significatifs après administration par voie orale
(Voir l'Exemple de référence 19, Tableau VIII) et peuvent être administrés de façon systématique par voie orale. Pour l'utilisation par voie orale, de tels composés peuvent être administrés en combinaison avec des supports ou excipients pharmaceutiquement acceptables sous forme de capsules, de comprimés ou de poudres. La nature et la proportion de ces supports ou excipients sont connus de l'homme de l'art.
Quand on les utilise pour traiter des infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients <EMI ID=83.1>
on donne les exemples suivants .
Préparation 1
<EMI ID=84.1>
inclinée est choisi parmi l'un des suivanLs :
Milieu A
<EMI ID=85.1>
le pli avant passade à l'autoclave est environ 5,9 ; on ajuste
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
Milieu B
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1>
Jersey, U.S.A.
On inocule la culture inclinée avec Actinoplanes
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
végétatif ayant la composition suivante :
<EMI ID=95.1>
<EMI ID=96.1>
New York, U.S.A.
On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans
<EMI ID=97.1>
pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.
<EMI ID=98.1>
<EMI ID=99.1>
ultérieur un maintenant la culture dans Ici phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit :
dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A.
<EMI ID=100.1>
préparée:: sont conservées dans la phase vapeur de l'azote <EMI ID=101.1>
stade (nyant la composition décrite ci-avant). un fait incuber comme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé.
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on
<EMI ID=102.1>
pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de second stade
<EMI ID=103.1>
stade. On fait incuber le milieu de second stade dans un
<EMI ID=104.1>
environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm
<EMI ID=105.1>
On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer
100 1 d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un
des suivants :
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
<EMI ID=108.1>
<EMI ID=109.1>
<EMI ID=110.1>
Milieu II
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
<EMI ID=113.1>
<EMI ID=114.1>
Milieu III
<EMI ID=115.1>
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
On laisse le milieu de production inoculé fermenter
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour
<EMI ID=121.1>
saturation par l'air à la pression atmosphérique.
Préparation 2
<EMI ID=122.1>
<EMI ID=123.1>
suivante :
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
<EMI ID=126.1>
<EMI ID=127.1>
la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse
stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile.
<EMI ID=128.1>
pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un flacon de
<EMI ID=129.1>
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
de type rotatif. Apres 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser pendant 15 secondes faible vitesse.
Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure, en'
<EMI ID=134.1> de nombreuses petites ampoules, comme suit :
On mélange les cultures végétatives volume/volume
<EMI ID=135.1>
<EMI ID=136.1>
<EMI ID=137.1>
ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide.
On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux <EMI ID=138.1> inclinées à 25[deg.]C à la lumière pendant 7 jours. B. Fermentation en réservoir
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance
<EMI ID=141.1>
25[deg.]C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.
<EMI ID=142.1>
comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un mi Lieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants :
Milieu IV
<EMI ID=143.1>
<EMI ID=144.1>
(pli initial 6,8-7,0)
<EMI ID=145.1>
<EMI ID=146.1>
Milieu V
<EMI ID=147.1>
<EMI ID=148.1>
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 à une température de 25[deg.]C pendant: 7 jours. On aère le milieu de Lion avec de
<EMI ID=149.1>
C. Milieu végétatif de troisième stade
Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par
100 litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer le réservoir
<EMI ID=150.1>
a la composition suivante :
<EMI ID=151.1>
<EMI ID=152.1>
Préparation 3
<EMI ID=153.1>
<EMI ID=154.1>
entier (4127 litres), obtenu par le procède- décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II, avec
4280 litres de méthanol pendant une heure, puis on filtre,
<EMI ID=155.1>
terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pli du filtrat à 4,0 par addition d'IICI 5 N. On extrait le
<EMI ID=156.1>
chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques et on les concentre sous vide jusqu'à un volume de 20 litres. On ajoute
<EMI ID=157.1>
précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par
<EMI ID=158.1>
forme d'une poudre blanc gris.
<EMI ID=159.1>
Préparation 4
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
<EMI ID=163.1>
filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
<EMI ID=166.1> <EMI ID=167.1>
de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11.
<EMI ID=168.1>
(débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le
<EMI ID=169.1>
dès fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution
<EMI ID=170.1>
appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Supcrior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé
d'une uni Lé optique (ISCO Type 6).
Préparation 5
<EMI ID=171.1>
Un sépare le mélange A-42355 comme décrit dans la Préparation 3, mais on chromatographie les extraits
<EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
pour déterminer leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier
<EMI ID=174.1> <EMI ID=175.1> concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres)
<EMI ID=176.1>
concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprie de méthanol. On ajoute la solution
<EMI ID=177.1>
précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare également ce précipité par filtration et on le
<EMI ID=178.1> <EMI ID=179.1>
et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (Colonne Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie d'une résine à phase inversée de gel de
<EMI ID=180.1>
Préparation 15. On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui
<EMI ID=181.1>
Préparation 6
Isolement, du facteur U de A-30912
<EMI ID=182.1>
gel de silice (Grace, qualité 62) les extraits chloroformiques concentrés de deux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus par le procédé décrit dans la Préparation 3. On lave la colonne avec du chloroforme puis on avec de l'ac6to-
<EMI ID=183.1>
pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D.. On enlève ce précipite par filtration et on le sèche, ce
<EMI ID=184.1>
forme d'une poudre grise.
<EMI ID=185.1>
l'introduit sur une colonne de gel de silice (colonne Michel- <EMI ID=186.1>
Prépara Lion 10. Le garnissage a été effectué dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétoniLrilc, !;elon le mode
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
sans vannes. On recueille une fraction toutes les 2 minutes.
<EMI ID=189.1>
décrit dans la Préparation 4. On réunit: les fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D de A-30912.
Préparation 7
Sépara Lion du facteur Il de A-30912
<EMI ID=190.1>
prépare comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 35 ml
<EMI ID=191.1>
filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm
(colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de
<EMI ID=192.1>
conception de piston sans vannes, et l'on recueille une fraction toutes les deux minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112-132 avec les
<EMI ID=193.1>
<EMI ID=194.1>
huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol
<EMI ID=195.1> <EMI ID=196.1>
<EMI ID=197.1>
intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se
<EMI ID=198.1>
et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans sont indiqués dons le Tableau VII.
<EMI ID=199.1>
<EMI ID=200.1>
<EMI ID=201.1>
<EMI ID=202.1>
<EMI ID=203.1>
sont donnés dans le Tableau VIII.
<EMI ID=204.1>
<EMI ID=205.1>
<EMI ID=206.1>
conditions suivantes :
<EMI ID=207.1>
Injection injection sur bouc: le
Les durée:; tic rétention approximatives pour les facteurs A,
<EMI ID=208.1>
<EMI ID=209.1>
TABLEAU IX
<EMI ID=210.1>
<EMI ID=211.1>
<EMI ID=212.1>
agitant, remuant et/ou aérant à pH 3-8, de préférence 5-7,
<EMI ID=213.1>
fractions qui ont une activité antifongique et on les
<EMI ID=214.1>
LII-20" avec du méthanol. Les fractions provenant, de la
<EMI ID=215.1>
<EMI ID=216.1>
71:25:4 de chloroforme, de méthanol et d'eau. Les fractions éluécs qui ont une activité antifongique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut
<EMI ID=217.1> <EMI ID=218.1>
décomposition après séchage sous vide poussé a 20[deg.]C.
Préparation 9
Séparation de l'antibiotique S31794/F-J
<EMI ID=219.1>
comme décrit dans la Préparation 8 après chromatographie sur Sephadex, sur une colonne de gel de silice (colonne MichelMiller) par l'intermédiaire d'une boucle J'aide d'un système à vanner. On utilise le mode opératoire de garnissage en
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1>
l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à
280 nm comme dans la Préparation 22. On réunit les fractions
<EMI ID=222.1>
<EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
d'iode.
Préparation 10
<EMI ID=225.1>
CI8
Etape 1 Hydrolyse
On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (Quantum
<EMI ID=226.1>
sulfuriquc concentre et de 1650 ml d'acide nitrique concentré
<EMI ID=227.1> 5 refroidissement d'eau fixé sur le ballon.
Or" refroidit le mélange dans un bain de glace et on
<EMI ID=228.1>
fritte. On lave le gel de silice avec de l'eau désionisée jusqu'à pli neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 100[deg.]C pendant deux jours.
Etape 2 : Première silylation
Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1 de toluène. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octadécyltrichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures)
<EMI ID=229.1>
d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice.
On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20
<EMI ID=230.1>
<EMI ID=231.1>
ambiante pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 1
-d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit.
Etape 3 : Deuxième silylation
On répète le mode opératoire de la première
<EMI ID=232.1>
chauffe la suspension à reflux à 60[deg.]C pendant deux heures, tout en agitant soigneusement. On recueille le produit final par filtration, on lave avec 3 1 de toluène et 6 1 de
<EMI ID=233.1>
(16-20 heures).
<EMI ID=234.1>
<EMI ID=235.1> <EMI ID=236.1>
celle préparée par le procédé de la Préparation 10.
<EMI ID=237.1>
des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension ; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. La pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars ; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations.
Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de
<EMI ID=238.1>
de la colonne. Il est donc important de laisser la. pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe.
Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies) : 5795-04, 12 ml ;
<EMI ID=239.1>
<EMI ID=240.1>
Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience de l'opérateur. Etapes :
1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être
deux fois celui de la colonne). Placer les deux colonnes verticalement avec la colonne réservoir au-dessus.
2. Peser le matériau dp garnissage (100 g pour 200 ml de colonne).
3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de garnissage utiliser un mélange de 70-80 % de méthanol et de 20-
30 5 d'eau.
<EMI ID=241.1> <EMI ID=242.1>
remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le
<EMI ID=243.1>
solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension. L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats ; cependant, ceci nécessite
(a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage.
<EMI ID=244.1>
dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute).
7. Continuer jusque ce que la colonne soit complètement remplie du l'adsorbant. La pression ne doit pns dépasser la
<EMI ID=245.1>
inférieures à 14 bars seront suffisantes.
8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire
<EMI ID=246.1>
<EMI ID=247.1>
remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité
<EMI ID=248.1>
la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire gênerai. Toujours
<EMI ID=249.1>
pompe ; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage.
<EMI ID=250.1>
pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques millimétrés (2-4) de garnissage au sommet de la colonne :
<EMI ID=251.1>
<EMI ID=252.1>
introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée.
Préparation 12
<EMI ID=253.1>
On dissout dans de l'éthanol le facteur A de A-30912.
On réduit Pt02 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire le facteur A de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-309l2A.
Préparation 13
Préparation de tétrahydro-A-30912B
On dissout dans de l'éthanol le facteur B de A-30912.
<EMI ID=254.1>
l'on utilise à son tour pour réduire le facteur B de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912B.
Préparation 14
<EMI ID=255.1>
On dissout dans de l'éthanol le facteur D de A-30912. On réduit Pt02 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire le facteur D de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans'une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912D.
Préparation 15
Préparation de tétrahydro-A-30912H
On dissout dans de l'éthanol le facteur H de A-30912. On réduit Pt02 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que
<EMI ID=256.1>
par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous
ftA.-pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures) . On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912H.
Exemple 1
A. Désacylation du facteur A de A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de culture inclina A et le milieu de production I et en faisant incuber le milieu de production pendant environ 42 heures.
On ajoute au milieu de fermentation le facteur A de A-30912
(340 g de substrat brut qui contiennent environ 19,7 g de facteur A de A-30912, dissous dans 1,5 1 d'éthanol).
On contrôle la désacylation du facteur A de A-30912 par analyse avec Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité vis-à--vis de C. albicans.
B. Séparation du noyau de A-30912A
On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et contenant le noyau d'environ 20 g de facteur A de A-30912. On rejette le gâteau mycéliens. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu (environ 93 litres) sur une colonne contenant 4,5 litres de résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette ce�te eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol (85 litres) à un débit de 200-300 ml/ minute.
On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant : On prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle, en utilisant un mode opératoire tel que celui décrit dans l'Exemple de Référence 1. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée) vis-à-vis de Candica albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912A. L'éluat contenant le noyau de A-30912A est concentré sous vide jusqu'à un petit volume et lyophilisé pour obtenir environ 97 grammes de noyau brut.
C. Purification du noyau de A-30912A par chromatographie
liquide en phase inversée
<EMI ID=257.1>
obtenu comme décrit dans le paragraphe B,dans 300 ml d'un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne en acier inoxydable de 4 litres (8 cm x 80 cm) garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns
(MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité chromatospac Prep 100
(Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Lor.gjumeau, France). Le colonne fonctionne à une pression de 6,2 - 6,9 bars, en donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Av., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique
(ISCO Type 6).
On recueille par minute des fractions ayant un volume d'environ 500 ml.
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir 2,6 grammes de noyau. La quantité de solvant nécessaire pour achever cette séparation chromatographique varie de 7 à 8 litres.
D. Caractéristiques du noyau de A-30912A <EMI ID=258.1>
(b) Poids moléculaire : 797,83.
(c) Solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le méthanol insoluble dans le chloroforme, le
tolèune et l'éther diéthylique.
(d) Spectre d'absorption infrarouge (Pastille de KBr).
Présente des maxima d'absorption à :
3340 large (OH, liaison hydrogène) ; 2970, 2930 et 2890 (étirement de CH, groupements CH3, CH2, CH aliphatiques),
1660 et 1624 (plusieurs groupements carbonyle C=O) ; 1510-
1550 ; 1430-1450 (déformation "wagging") ; 1310-1340 ;
<EMI ID=259.1>
(e) Le titrage électrométrique dans le diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence'd'un groupement titrable avec un pK a d'environ 7,35
(pH initial 7,32). <EMI ID=260.1> dans les conditions suivantes :
Colonne : 4 x 300 mm
<EMI ID=261.1>
Solvant : Mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium,
d'acétonitrile et d'eau
Débit : 3 ml/minute
Pression : 172,5 bars
Détecteur : UV à longueur d'onde variable a 230 nm Sensibilité : 0-0,4 A.U.F.S.
Exemple 2
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de l'Exemple 1, mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-30912A.
Exemple 3
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de l'Exemple 1, mais on utilise comme substrat l'aculéacine A.
Exemple 4
A. Désacylation du facteur B de A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur B de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.
On contrôle la désacylation du facteur B de A-30912 <EMI ID=262.1>
comme le montre la disparition de l'activité.
B. Séparation du noyau de A-30912B
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP 20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limiêed, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.
Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élut ion de la façon suivante : on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de <EMI ID=263.1> albicans de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée). Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912B. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912B sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de A-30912B par chromatographie
liquide en phase inversée
On dissout le noyau de A-30912B brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe B: dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On .chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 Rue du
<EMI ID=264.1>
colonne à une pression de 6,2 - 6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à280 nm en utilisant un appareil de <EMI ID=265.1>
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912B purifié.
Exemple 5
On prépare le noyau de A-30912B et on le purifie par le procédé de l'Exemple 4 mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-30912B.
Exemple 6
A. Désacylation du facteur D de A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la préparation I, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.
On contrôle la désacylation du facteur D de A-30912 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit terminée comme le montre la disparition de l'activité.
B. Séparation du noyau de A-30912D
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine HP-20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi- obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. On élue ensuite la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :
On prépare deux parties aliquotes de chaque fraction êluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le <EMI ID=266.1>
de Candida albicans de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée) . Si la partie aliquote non traitée
<EMI ID=267.1>
activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'éluat contenant le noyau de A-30912D et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.
C. Purification du noyau de A-30912D par chromatographie
liquide en phase inversée
On purifie le noyau de A-30912D brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B, en utilisant le mode opératoire du paragraphe C de l'Exemple 4.
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912D, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912D purifié.
Exemple 7
On prépare le noyau de A-30912D et on le purifie par le procédé de l'Exemple 6 mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-30912D.
Exemple 8
A. Désacylation du facteur H de A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation I, en utilisant le milieu de production I. Après fait incuber la culture pendant 48 heures, on ajoute au bouillon de fermentation du facteur H de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.
On contrôle la désacylation du facteur H de A-30912 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de N eurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit terminée comme l'indique la disparition de l'activité.
B. Séparation du noyau de A-30912H
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine HP-20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries <EMI ID=268.1>
<EMI ID=269.1>
<EMI ID=270.1>
contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :
On prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée.
On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée) vis-âvis de candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912H. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'êluat contenant le noyau de A-30912H et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.
C. Purification du noyau de A-30912H par chromatographie
liquide en phase inversée
On purifie le noyau de A-30912H brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe B, selon le procédé du paragraphe C de l'Exemple 4.
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on combine les fractions contenant le noyau de A-30912H, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912H purifié.
Exemple 9
On prépare le noyau de A-30912H et on le purifie par le procédé de l'Exemple 8, mais on utilise comme substrat
<EMI ID=271.1>
Exemple 10
On prépare et on purifie le noyau de A-30912H par le procédé de l'Exemple 8, mais on prépare le facteur H de A-30912 à partir du facteur A de A-30912 selon le mode opératoire suivant :
On dissout 19,6 mg de facteur A de l'antibiotique A-30912 dans 1 ml de diméthylformamide. On ajoute à cette solution du méthanol acide (3 % de HC1, 0,06 ml) . On agite la solution résultante à la température ambiante pendant une nuit puis on l'évapore à siccité sous vide. On chromatographie le résidu obtenu par CLPECE comme décrit dans la Préparation 7, en utilisant du gel de silice à phase inversée
<EMI ID=272.1>
solvant d'élution et l'on obtient 1,4 mg du facteur H de A-30912 (le composé de formule II où R et R 4 sont tous deux OH, R2 est l'hydrogène, R3 est un groupement méthoxy et R est un groupement linoléoyle).
Exemple 11
On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H de formule 1 où R est un groupement éthoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R est un groupement méthoxy et R est un groupement linoléoyle. On prépare le substrat par le mode opératoire utilisé dans l'Exemple 10.
Exemple 12
On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8
<EMI ID=273.1>
groupement n-propoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R est un groupement n-propoxy et R est un groupement linoléoyle. On prépare le substrat comme décrit dans l'Exemple 10.
Exemple 13
On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de A-30912H ayant la formule I où R<3> est un groupement isobutoxy, mais on uitlise comme substrat le composé de formule II où R est un groupement isobutoxy et R est un groupement linoléoyle.
Exemple 14
On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de A-30912H de formule I où R est un groupement n-pentyloxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R est un groupement n-pentyloxy et R un groupement linoléoyle.
Exemple 15
On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H de formule I où R est un groupement n-hexyloxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R est un groupement n-hexyloxy et R un groupement linoléoyle.
Exemple 16
On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8
<EMI ID=274.1>
ment éthoxy, mais on utilise comme substrat le composé de
<EMI ID=275.1>
stéaroyle.
Exemple 17
On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8
<EMI ID=276.1>
ment 2-éthyl-l-butoxy, mais on utilise comme substrat le
<EMI ID=277.1>
butoxy et R un groupement linoléoyle.
Exemple 18
On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H ayant la formule I où R est un groupement 3-méthyl-1-butoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R est un groupement 3-méthyl-lbutoxy et R un groupement linoléoyle.
Exemple 19
A. Désacylation de l'antibiotique S 31794/F-l
On effectue la fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S 31794/F-l, dissous dans une petite quantité de méthanol.
On contrôle la désacylation de S 31794/F-l par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la dësacylation soit terminée comme le montre la disparition de l'activité. B. Séparation du noyau de S 31794/F-l
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau
<EMI ID=278.1>
colonne contenant une résine HP-20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée
à pH 6,5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant : On prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre à un petit volume l'une des parties aliquotes et on la
<EMI ID=279.1>
myristoyle. Ce produit et l'autre partie aliquote non traitée sont analysés pour leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S-31704/F-1. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'éluat contenant le noyau de
S 31794/F-l et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de S 31794/F-l par chromatographie
liquide en phase inversée
On purifie selon le mode opératoire du paragraphe C de l'Exemple 4 le noyau de S 31704/F-l brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B ci-dessus.
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de S 31794/F-l, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de
S 31794/F-l purifié.
Préparation d'un premier groupe de dérivés
Le mode opératoire suivant illustre la préparation de composés de formule III par la méthode utilisant un "ester actif". Les composés particuliers préparés par ce mode
<EMI ID=280.1>
<EMI ID=281.1>
<EMI ID=282.1>
définis dans les noyaux correspondants.
Préparation de Référence 1
Préparation du tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 12,5 g d'acide n-tridécanoique (Sigma Chemical Co) , de 11, 5 g de 2,4,5-trichlorophénol et de 12, 0 g de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide dans 650 ml de chlorure de méthylène. Puis on filtre le mélange réactionnel et on le sèche sous vide pour obtenir 22 g de tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle: On purifie ce matériau par chromatographie sur colonne de gel de silice (Woelm) en utilisant du toluène comme éluant. On contrôle les fractions par CCM en utilisant une lumière ultraviolette à courte longueur d'ondes pour la détection . On réunit les fractions contenant le produit purifé et on les concentre sous vide à siccité.
Exemple de Référence 1
Acylation du noyau de A-30912A par le n-tridécanoate de
<EMI ID=283.1>
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 6,0 g de tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle et de 4,5 g de noyau de A-30912A dans 600 ml de diméthylformamide (DMF). L'élimination du solvant sous vide laisse un résidu (12 g). On délaie le résidu avec
500 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec 500 ml de méthanol. On filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut (5,0 g).
On purifie le produit brut par CIP E à phase inversée comme suit :
On injecte un échantillon du produit brut (1 g), dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable de 2,5 x 80 cm garnie de résine LP-1/C18 (Voir Préparations 10 et 11). On élue la colonne avec un système solvant comprenant un mélange 3:3:3 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de
69 à 103,5 bars avec un débit de 11 - 12 ml/minute en utilisant une pompe duplex LDC (Milton-Roy). On contrôle l'effluent avec un détecteur à ultraviolets (ISCO-UA-5) à
280 nm. On recueille des fractions toutes les deux minutes
(21 - 24 ml). On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide. On obtient 550 mg de produit. On répète la chromatographie susmentionnée quatre fois pour obtenir des échantillons purifiés supplémentaires du produit comme suit : 620 mg, 520 mg, 670 mg et 490 mg, soit un poids total de 2,8 g.
En suivant le mode opératoire précédent, on fait réagir <EMI ID=284.1>
trichlorophényle et l'on obtient 2,6 g du produit cité en titre purifié. On réunit les substances des deux prépara-
<EMI ID=285.1>
<EMI ID=286.1>
(C18 Micro Bondapak, Waters Co.) avec comme éluant le système 2:1:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile n'indique qu'un seul pic.
Exemple de Référence 2
Acylation du noyau de A-30912B par le n-tridécanoate de
<EMI ID=287.1>
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5trichlorophényle et de 1 mmole de noyau.de A-30912B dans
200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide fournit un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec
300 ml de méthanol et on filtre l'extrait mêthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir un produit brut.
On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée
comme suit :
On injecte un échantillon du produit brut (1 g) dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable
<EMI ID=288.1>
10 et 11). On élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 3:3:4 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 69 - 103,5.
<EMI ID=289.1>
<EMI ID=290.1>
tions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide pour obtenir le produit cité en titre. On analyse le produit
<EMI ID=291.1>
<EMI ID=292.1>
1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Après développement, on observe les plaques sous la lumière UV pour détecter le produit.
<EMI ID=293.1>
Acylation du noyau de A-30912D avec le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle
<EMI ID=294.1>
une solution de .3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5trichlorophényle et de 1 mmole de noyau de A-30912D dans
200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec
300 ml de méthanol, on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut.
On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme décrit dans l'Exemple de Référence 2.
Exemple de Référence 4
Acylation du noyau de A-30912H par le n-tridécanoate de
<EMI ID=295.1>
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5-
<EMI ID=296.1>
200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec
300 ml de méthanol, on filtre l'extrait et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut.
On purifie le produit brut par CLPE en phase inversée comme décrit dans l'Exemple de Référence 2.
<EMI ID=297.1>
selon le mode opératoire de l'Exemple de Référence 4, mais en utilisant comme substance de départ le composé de formule I où R est un groupement n-propoxy (préparé par le procédé de l'Exemple 12).
Exemple de référence 6
<EMI ID=298.1>
2,4,5-trichlorophênyle
On agite à la température ambiante pendant 16 heures <EMI ID=299.1>
200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes, et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec
300 ml de méthanol, on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut.
On purifie le produit brut par CLPE en phase inversée comme décrit dans l'Exemple de Référence 2.
Préparation d'un second groupe de dérivés
Le mode opératoire suivant qui donne la préparation
<EMI ID=300.1>
illustre le procédé de préparation d'un second groupe de composés de formule III.
<EMI ID=301.1>
<EMI ID=302.1>
chlorure de n-dodécanoyle à une solution de 5,5 g (40 mmoles) d'acide p-aminobenzoïque dissous dans 100 ml de pyridine. On agite le mélange pendant 3 heures et on le verse dans 3 litres d'eau. On filtre le précipité qui se forme et on le sèche sous vide et l'on obtient 11,01 g d'acide N-(n-
<EMI ID=303.1>
Préparation de référence 3
Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide
<EMI ID=304.1>
mélange à la température ambiante pendant 3 heures et demi, puis on le filtre. On évapore le filtrat sous vide pour obtenir un résidu qu'on cristallise dans un mélange acétonitrile/eau et l'on obtient 12,84 g de l'ester 2,4,5-
<EMI ID=305.1>
Exemple de Référence 7
<EMI ID=306.1>
On dissout 8,16 g (10,2 mmoles) de noyau de A-30912A et 4,72 g (10,2 mmoles) de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoique dans 100 ml de DMF. On agite la solution à la température ambiante pendant
15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" (Waters
<EMI ID=307.1>
(Waters Associates, Ine.,) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile comme système solvant. On réunit
les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoylé du noyau de A-30912� (3,5 g).
Exemple de Référence 8
Acylation du noyau de A-30912B
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide (10,2 mmoles) du noyau.de A-30912B et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodêcanoyl)-p-aminobenzolque. On agite la solution à la température amiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther <EMI ID=308.1> le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System
500" unit (Waters Associates, Inc.), en utilisant une colonne
<EMI ID=309.1>
On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange
25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à
34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acéto- <EMI ID=310.1>
<EMI ID=311.1>
dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de A-30912B.
Exemple de Référence 9
Acylation dn noyau de A-30912D
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide (10,2 mmoles) du noyau de A-30912D et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodêcanoyl)-p-aminobenzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System
500' unit (Waters Associates, Inc.), en utilisant une colonne
<EMI ID=312.1>
On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange
25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à
34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système solvant un
<EMI ID=313.1>
nitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(ndodécanoyl)-p-aminobenzyle du noyau de A-30912D.
Exemple de Référence 10
Acylation du noyau de A-30912H
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide, 10,2mmoles du noyau de A-30912H et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5-trichloro-
<EMI ID=314.1>
agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" unit (Waters Associates,
<EMI ID=315.1>
(Water Associates, Inc.), comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système solvant un mélange 25:65:10
en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoylé du noyau de A-30912H.
Exemple de Référence 11
<EMI ID=316.1>
<EMI ID=317.1>
selon le mode opératoire de l'Exemple de Référence 9, mais en utilisant comme substance de départ le composé de formule I où R<3> est un groupement isobutoxy (préparé par le procédé de l'Exemple 13).
Exemple de Référence 12
Acylation du noyau de S 31794/F-l
<EMI ID=318.1>
du noyau de S 31794/F-l et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System
500" unit (Waters Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange de
25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à
34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système.solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile.
On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)p-aminobenzoyle du noyau de S 31794/F-1.
Préparation d'un troisième groupe de dérivés
Le mode opératoire suivant qui donne la préparation <EMI ID=319.1>
illustre le procédé de préparation d'un troisième groupe de composés de formule III.
Préparation de référence 4
<EMI ID=320.1>
On ajoute une solution de 19,2 g (150 mmoles) d'acide p-hydroxybenzoique dans 120 ml d'hydroxyde de sodium aqueux à 10 % à 480 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) préalablement chauffés à 80[deg.]C. On ajoute goutte à goutte à la solution
28,95 g (150 mmoles) de bromure de n-octyle. On agite le mélange réactionnel pendant 4 heures à la température ambiante, après quoi on le verse dans 1200 ml d'eau glacée. On ajoute 30 ml d'acide chlorhydrique concentré et on laisse le mélange reposer jusqu'à ce que la précipitation soit terminée. On recueille le précipité, on le sèche et on le cristallise dans un mélange acétonitrile/eau, p.f. 97-99[deg.]C.
<EMI ID=321.1>
Préparation de référence 5
Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide
<EMI ID=322.1>
de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 18 heures puis on le filtre. On évapore le filtrat pour obtenir une huile, qu'on cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau pour obtenir l'ester
<EMI ID=323.1>
7,23 (s, 1H), 7,3 (s, 1H), 8,08 (d, 1H, J = 4 Hz).
Exemple de Référence 13
Acylation du noyau de A-30912A i
On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 14,2 g
(17,8 mmoles) de noyau de A-30912A et 15,32 g (35,7 mmoles)
d'ester 2,4,5-trichlorophénylique d'acide p-(n-octyloxy)-
benzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16 - 20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:2 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants de 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les
<EMI ID=324.1>
comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions exemptes
<EMI ID=325.1>
dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912A ;
<EMI ID=326.1>
Exemple de Référence 14
Acylation du noyau de A-30912B
On dissout dans 150 ml de DMF 17,8 mmoles de noyau de A-30912B et 35,7 mmoles d'ester 2,4,5-trichlorophénylique d'acide p-(n-octyloxy)benzolque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16 - 20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice
(Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant.
On réunit les fractions exemptes.de noyau de A-30912B et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912B.
Exemple de Référence 15
Acylation du noyau de A-30912D
On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles de noyau de A-30912D et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzolque. On <EMI ID=327.1>
heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage.
On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912D et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de
A-30912D.
Exemple de Référence 16
Acylation du noyau de A-30912H
On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles de noyau de A-30912H et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5-
<EMI ID=328.1>
agite la solution à la température ambiante pendant 16 - 20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage.
On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912H et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912H.
Exemple de référence 17
On prépare le composé de formule III où R est un
<EMI ID=329.1> utilisant le mode opératoire de l'Exemple de Référence 16,
<EMI ID=330.1>
<EMI ID=331.1>
le procédé de l'Exemple 15).
Exemple de Référence 18
Acylation du noyau de S 31794/F-1
On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8mmoles de noyau de S 31794/F-l et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzolque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16- 20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant.
On réunit les fractions exemptes de noyau de S 31794/F-l et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de S 31794/F-l.
Exemple de Référence 19
L'activité antifongique des composés de formule III peut être démontrée in vitro par des essais de diffusion de disques et des essais de dilution sur gélose et in vivo par des essais classiques sur des souris qui montrent l'efficacité vis-à-vis d'une infection fongique systémique. Les résultats des essais antifongiques des composés types de formule III sont donnés dans les Tableaux IV à VIII.
Les Tableaux IV et V donnent les résultats de l'essai in vitro des composés des Exemples de Référence 1, 7 et 13 par des procédés de diffusion de disques sur plaques de gélose. L'activité dans le Tableau IV est mesurée par la dimension (diamètre en mm) de la zone d'inhibition du microorganisme observéeque produit le composé d'essai. Dans le Tableau V, l'activité est mesurée par la concentration <EMI ID=332.1>
cinq souches de Candida albicans par le procédé de dilution sur gélose. Dans le Tableau VI, l'activité est mesurée par la CIM de la substance (mg/ml) nécessaire pour inhiber l'organisme d'essai.
Les résultats d'essais in vivo pour déterminer l'efficacité des dérivés vis-à-vis d'une infection provoquée par Candida albicans A-26 chez des souris sont donnés dans le Tableau VII. Dans ces essais, l'activité est mesurée par
<EMI ID=333.1>
50 % des animaux d'essai ). Quand on n'obtient pas de DE$0, l'activité est indiquée par la plus faible dose à laquelle on observe un effet antifongique significatif. Dans ces essais, on infecte par voie intraveineuse avec Candida albicans A-26 des groupes de souris albinos mâles (exemptes de pathogènes particuliers) pesant 18à 20 grammes. On traite les animaux par rayons X 24 heures avant l'infection à environ 50 roentgens par minute pendant minutes (dose
<EMI ID=334.1>
tion, on donne à chaque groupe de souris des doses progressives par voie sous-cutanée du composé d'essai sous forme d'une suspension dans 33 % de polyéthylène glycol (PEG)
dans de l'eau. On note le jour de la mort de chaque animal. Une comparaison statistique par l'essai "t" de Student du jour moyen de la mort est effectuée entre chaque groupe d'animaux infectés-traités à une dose particulière et un groupe de 10 animaux infectés-non traités pour déterminer si le traitement prolonge de façon significative la durée de survie.
Le Tableau VIII donne les résultats de l'essai des composés des Exemples de Référence 1, 7 et 13 pour déterminer leur absorption après administration par voie orale. Dans ces essais, on gave des souris avec une dose de 416 mg/kg de composé d'essai en suspension dans un mélange de 33 % de
PEG 400 et d'eau. A des intervalles de temps, on prélève <EMI ID=335.1>
leur activité antibiotique comme suit : on place un disque de 7 non contenant 20 ml de sang entier sur de la gélose
<EMI ID=336.1>
40 heures d'incubation à 30[deg.]C, on compare les zones d'inhibition des échantillons de sang à un témoin obtenu à partir du composé d'essau, et on calcule la quantité du composé dans l'échantillon de sang.
<EMI ID=337.1>
<EMI ID=338.1>
<EMI ID=339.1>
<EMI ID=340.1>
<EMI ID=341.1>
<EMI ID=342.1>
TABLEAU VI
Activité in vitro du dérivé du noyau de A-30912A
<EMI ID=343.1>
de Candida albicans
<EMI ID=344.1>
<EMI ID=345.1>
<EMI ID=346.1>
<EMI ID=347.1>
<EMI ID=348.1>
<EMI ID=349.1>
<EMI ID=350.1>
REVENDICATIONS
1. Noyau peptidique cyclique de formule :
<EMI ID=351.1>
dans laquelle R est H ou OH et ;
<EMI ID=352.1>
ou tous deux OH,
et
quand R est OH, R est H, R est OH ou un groupement
<EMI ID=353.1>
0
<EMI ID=354.1>
-C-NH2 et R et R sont tous deux OH, et ses sels d'addition d'acides.