RU2507252C2 - МУТАНТНЫЙ ШТАММ Glarea lozoyensis И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

МУТАНТНЫЙ ШТАММ Glarea lozoyensis И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
RU2507252C2
RU2507252C2 RU2012116032/10A RU2012116032A RU2507252C2 RU 2507252 C2 RU2507252 C2 RU 2507252C2 RU 2012116032/10 A RU2012116032/10 A RU 2012116032/10A RU 2012116032 A RU2012116032 A RU 2012116032A RU 2507252 C2 RU2507252 C2 RU 2507252C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
strain
formula
mutant strain
fermentation medium
present
Prior art date
Application number
RU2012116032/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2012116032A (ru
Inventor
Цзин Сюй
И Чэнь
Сяомин ЦЗИ
Сяолян ГАО
Шидун ЛЮ
Чжаоли ЧЖАН
Original Assignee
Шанхай Техвелл Биофармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Шанхай Техвелл Биофармасьютикал Ко., Лтд. filed Critical Шанхай Техвелл Биофармасьютикал Ко., Лтд.
Publication of RU2012116032A publication Critical patent/RU2012116032A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2507252C2 publication Critical patent/RU2507252C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается мутантного штамма Glarea lozoyensis и его применения. Мутантный штамм получен путем воздействия на штамм Glarea lozoyensis АТСС 20957 нитрозогуанидином и депонирован в CGMCC под №CGMCC 2933. Данный штамм гриба обладает стабильными генетическими и продуктивными свойствами, продуцирует мало примесей при ферментации и приемлем для получения антибиотика в промышленных масштабах. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Description

Область техники
Изобретение относится к получению антибиотиков, в частности оно относится к штамму, продуцирующему антибиотик с высоким выходом, способу его получения и применения.
Уровень техники
В последние несколько десятилетий как количество случаев, так и количество типов грибковых инфекций, причиняющих значительный вред здоровью людей, постепенно повышается, особенно в случае пациентов с ослабленным иммунитетом. В то же время клиническое применение некоторых широко используемых противогрибковых веществ, таких как амфотерицин, имидазолы и триазолы, широко применяемых клинически, ограничено из-за значительной нейротоксичности, устойчивости к лекарственным средствам и т.п. Эхинокандины как тип новых противогрибковых веществ представляют собой группу естественных продуктов, открытых в 1970-х. Структурно эхинокандины имеют сходный циклический полипептидный кор, но различные боковые цепи жирных кислот. Эхинокандины могут конкурентно ингибировать синтез β-D-глюкана в клеточных стенках грибов. Преимуществами эхинокандинов являются низкая токсичность, сильная фунгицидная активность, а также превосходные фармакокинетические свойства.
Семейство эхинокандинов включает следующие эхинокандины: цилофунгин, пневмокандины, акулеацины, мулундокандин и WF 11899A. Эхинокандины и пневмокандины активно исследуются и в настоящее время применяются клинически.
Каспофунгин представляет собой водорастворимое полусинтетическое производное пневмокандина. Merck разработал каспофунгин в качестве противогрибкового/ противопневмоцистного вещества с широким спектром. В фазе II клинического испытания с контрольными экспериментами было обнаружено, что в случае пациентов с ослабленным иммунитетом, страдающих от инвазивного легочного аспергиллеза, применение каспофунгина (внутривенная инъекция, 50-70 мг/д) показало хорошую эффективность, в то время как применение амфотерицина В и азолов, содержащих азот, не оказало какого-либо заметного воздействия. В случае 128 пациентов, инфицированных ВИЧ, эффективность каспофунгина при монилиальном эзофагите достигала 85%, в то время как эффективность амфотерицина В составила только 66,7%. Эти типы лекарственных средств могут быть применены для эффективного уничтожения грибов, устойчивых к азолам, содержащим азот, и амфотерицину В. Более того, эти типы лекарственных средств являются намного лучше, чем традиционные противогрибковые вещества из-за отсутствия гемолитической токсичности и меньшего лекарственного взаимодействия.
Figure 00000001
Структура каспофунгина
Пневмокандин представляет собой класс естественных противогрибковых лекарственных средств, продуцируемых Glarea lozoyensis. Они могут быть разделены преимущественно на три типа в соответствии с различными заместителями на пролине в их структуре: А0 (3-гидроксил-4-метилпролин), В0 (3-гидроксилпролин) и С0 (4-гидроксилпролин). Более того, в соответствии с различными заместителями на циклических полипептидах пневмокандин А0 может быть подразделен на 6 подтипов: А0, A1, А2, А3, А4 и А5; В0 может быть подразделен на 6 подтипов: В0, В1, В2, В3, В4, В5; где А0, А1, А3, А4 и В0 продуцируются штаммом АТСС 20868 дикого типа, при этом А0 является основным продуктом. Посредством НММ-мутагенеза (N-Нитрозо-N-метилмочевина) АТСС 20868 был получен мутантный штамм АТСС 20957, способный продуцировать одновременно А0 и В0. Однако АТСС 20957 обладает относительно низкой способностью продуцировать В0, а А0 продуцируется в виде примеси в довольно высоком количестве.
Таким образом, для удовлетворения требований промышленного производства необходимо найти высокопродуктивный штамм со стабильными генетическими свойствами, который может продуцировать больше В0 и меньше А0.
Краткое описание изобретения
Цель настоящего изобретения - предложить новый мутантный штамм на основе АТСС 20957.
Другая цель настоящего изобретения - предложить способ получения упомянутого нового штамма.
Еще одна цель настоящего изобретения - предложить применение упомянутого мутантного штамма.
Четвертая цель настоящего изобретения - предложить способ получения соединения формулы I при помощи упомянутого нового штамма.
В первом аспекте настоящего изобретения предложен мутированный штамм Glarea lozoyensis, депонированный в Китайском центре коллекции микробиологических культур под номером CGMCC 2933.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ получения мутированного штамма, упомянутого ранее, предусматривающий следующие этапы:
(a) смешивание посевной жидкости Glarea lozoyensis №АТСС 20957 с нитрозогуанидином для получения смеси А;
(b) смешивание упомянутой смеси А с ферментом, разрушающим клеточную стенку, для получения протопластов;
(c) регенерация упомянутых протопластов для получения единичных колоний;
(d) культивирование упомянутых единичных колоний для получения мутированного штамма.
В предпочтительном примере концентрация нитрозогуанидина на этапе (а) составляет 10-20 мкг/мл из расчета на общий объем упомянутой смеси А; и концентрация фермента, разрушающего клеточную стенку, на этапе (b) составляет 10-50 мг/мл из расчета на общий объем после смешивания упомянутой смеси А с ферментом, разрушающим клеточную стенку.
В другом предпочтительном воплощении упомянутый фермент, разрушающий стенку, содержит одно или более из следующих соединений: ливалзим, фермент улитки и целлюлозу.
В другом предпочтительном воплощении каждый фермент присутствует в концентрации 10-40 мг/мл.
В другом предпочтительном воплощении мицелий в посевной жидкости на этапе (а) находится в логарифмической фазе роста.
В другом предпочтительном воплощении сухая масса клеток составляет 5-10 г/л из расчета на общий объем упомянутой посевной жидкости на этапе (а).
В третьем аспекте настоящего изобретения предложено применение упомянутого мутированного штамма для получения соединения формулы I:
Figure 00000002
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения соединения формулы I, предусматривающий следующий этап:
Культивирование упомянутого мутантного штамма в ферментационной среде при температуре 15-35°С для получения соединения формулы I.
В другом предпочтительном воплощении упомянутая ферментационная среда содержит следующие компоненты из расчета на общий объем ферментационной среды: 15-50 г/л L-пролина, 6-20 г/л глутамата натрия, 6-20 г/л дрожжевого экстракта, 4-20 г/л фруктозы, 1,5-7 г/л неорганической соли и 10-50 г/л микроэлементов.
В другом предпочтительном воплощении упомянутая неорганическая соль выбрана из фосфата, или сульфата, или их комбинации.
В другом предпочтительном воплощении упомянутая ферментационная среда также содержит 10-100 г/л маннита в процессе культивирования.
В другом предпочтительном воплощении объем инокулята упомянутого мутантного штамма составляет 4-10 об.% из расчета на общий объем ферментационной среды.
В другом предпочтительном воплощении исходное значение pH упомянутой ферментационной среды составляет 5,3-6,0.
Резюмируя, настоящее изобретение предлагает высокопродуктивный штамм со стабильными генетическими свойствами, который может продуцировать больше В0 и меньше А0, для лучшего соответствия требованиям промышленного производства.
Описание чертежей
Фиг. 1 изображает схему производственного процесса для производства нового штамма CGMCC 2933, предложенного в настоящем изобретении.
Фиг. 2 изображает структуру пневмокандинов, где пневмокандин В0 представляет собой соединение формулы I по настоящему изобретению.
Способы выполнения изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно открыли высокопродуктивный мутантный штамм (№ CGMCC 2933), который может быть получен посредством мутирования штамма Glarea lozoyensis АТСС 20957 при помощи нитрозогуанидина (НТГ), при применении ливалзима для получения протопластов и последующего скрининга регенерировавших протопластов. Упомянутый мутантный штамм может продуцировать соединение формулы I с высоким выходом в процессе ферментации. Таким образом, авторы изобретения достигли целей настоящего изобретения.
Новый штамм
Настоящее изобретение предлагает новый штамм, продуцирующий соединение формулы I. Таксономически, упомянутый новый штамм относится к Glarea lozoyensis и депонирован в Китайском центре коллекции микробиологических культур под номером CGMCC 2933.
Способ получения нового штамма
Настоящее изобретение предлагает способ получения нового штамма № CGMCC 2933, и упомянутый способ может быть выполнен согласно следующей последовательности:
Изначальный штамм → посевная жидкость → мутагенез при помощи обработки НТГ → удаление клеточной стенки посредством ливалзима для получения протопластов → разбавление и посев протопластов на чашки → отбор единичной колонии и посев ее на скошенную среду → первичный скрининг во встряхиваемых колбах → селекция высокопродуктивного штамма → посев штамма на скошенную среду → вторичный скрининг во встряхиваемых колбах → селекция высокопродуктивного штамма, верификация в ферментационном чане и выполнение эксперимента по стабильности → консервирование штамма.
В частности, способ, предложенный в настоящем изобретении, предусматривает следующие этапы:
(a) смешивание посевной жидкости Glarea lozoyensis № АТСС 20957 с нитрозогуанидином для получения смеси А;
(b) смешивание упомянутой смеси А с ферментом, разрушающим клеточную стенку, для получения протопластов;
(c) регенерация упомянутых протопластов для получения единичных колоний;
(d) культивирование упомянутых единичных колоний для получения нового штамма.
В одном примере настоящего изобретения новый штамм может быть получен посредством следующей процедуры:
культивирования АТСС 20957 в течение 1-3 дней во встряхиваемых колбах для получения посевной жидкости (сухая клеточная масса, СКМ=5-10 г/л), добавления соответствующего количества НТГ к посевной жидкости, культивирования в течение еще 1-2 дней и последующего центрифугирования посевной жидкости, отмывания и ресуспендирования осадка и разрушения клеточных стенок при помощи ливалзима для получения протопластов; разбавления протопластов и последующего посева разбавленных протопластов на чашки с гипертонической PDA (картофельный агар с декстрозой), культивирования протопластов для получения единичных колоний рекомбинантных клеток для получения нового мутированного штамма.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ получения соединения формулы I посредством ферментации нового штамма, полученного при помощи мутагенеза.
В примере настоящего изобретения способ для получения нового штамма посредством мутагенеза и ферментации нового штамма для продукции соединения формулы I включает:
(1) Изначальный штамм: Glarea lozoyensis АТСС 20957.
(2) Посевную культуру изначального штамма.
Законсервированный в глицерине штамм АТСС 20957 размораживают, сеют в посевную среду (вносимое количество 50 мл/250 мл), культивируют на шейкере при 200-300 об/мин и температуре 25-30°С в течение от 1 до 3 дней до тех пор, пока сухая масса мицелия не достигнет приблизительно 5-10 г/л.
Композиция посевной среды: 10-20 г/л сахарозы, 4-10 г/л дрожжевого экстракта, 10-20 г/л соевого триптона, 1,5-2 г/л КН2РО4, 0,4-1 г/л MgSO4·7Н2О, 10-50 г/л микроэлементов, исходный pH 5,3-6,0. Среду стерилизуют при 121°С в течение 20 минут. Микроэлементы: 10-20 г/л FeSO4·7H2O, 10-20 г/л MnSO4·H2O, 2-10 г/л ZnSO4·7H2O, 0,7-2,0 г/л СаСl2, 0,56-2,0 г/л Н3ВO3, 0,25-2,0 г/л СuСl2·2Н2O, 0,19-2,0 г/л (NH4)6Мо7O24·7Н2O, концентрированная соляная кислота 500 мл/л.
(3) Отбор единичных колоний
В начале посевную жидкость изначального штамма подвергают мутагенезу при помощи НТГ и затем обрабатывают при помощи ливалзима для разрушения клеточной стенки. Полученные в результате протопласты регенерируют для получения мутантного штамма.
(4) Скрининг мутированного штамма
Протопласты сеют на гипертоническую среду PDA. Единичные колонии, выращенные в течение 10-12 дней, сеют на скошенную среду для дальнейшего культивирования, соответственно. После 8-10 дней посевную среду инокулируют (вносимое количество 25 мл/250 мл) при помощи газона, выращенного на скошенной среде, и культивируют на шейкере при 280 об/мин и температуре 25-30°С в течение 6-10 дней. Посевную среду сеют в ферментационную среду (вносимое количество 25 мл/250 мл) и культивируют на шейкере при 200-300 об/мин и температуре 25-30°С в течение 6-12 дней. После завершения культивирования ферментационную жидкость экстрагируют метанолом и содержание соединения формулы I в ферментационной жидкости измеряют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Композиции соответствующей среды могут быть найдены в «Pneumocandins from Zalerion arboricola», Journal of antibiotics, T.45, H.12, Декабрь 1992, С.1867-1874.
Гипертоническая среда PDA для чашек Петри состоит из 300 г/л картофеля, 20 г/л глюкозы, 15 г/л агара, 273, 6 г/л сахарозы и стерилизована при 121°С в течение 20 мин.
Содержание соединения формулы I в ферментационной жидкости измеряют высокоэффективной жидкостной хроматографией:
хроматографическая колонка: Phenomex С18 (4,6 мм × 250 мм, 5 мкм),
мобильная фаза: ацетонитрил:вода = 50:50,
температура колонки: 35°С,
градиентное элюирование, скорость потока: 1,0 мл/мин,
объем вводимой пробы: 5 мкл, длина волны детектирования: 210 нм.
(5) Ферментация мутированного штамма
Соответствующие технические решения описаны в литературе. Более детально см. Biotechnology and Bioengineering, Т. 78, Н.3, 5 Май, 2002; и Journal of industrial microbiology, 11 (1993), 95-103.
Характеристики настоящего изобретения, упомянутые выше, или характеристики, упомянутые в примерах, при желании, могут быть объединены. Любые характеристики, раскрытые в настоящем описании, могут быть применены в сочетании с любыми другими характеристиками, и каждая характеристика, раскрытая в описании, может быть заменена альтернативной характеристикой, которая может послужить идентичной, эквивалентной или сходной цели. Таким образом, характеристики, раскрытые в данном документе, представляют собой только общие иллюстративные примеры эквивалентных или сходных характеристик, исключая случаи, когда указано иное.
Главные преимущества настоящего изобретения включают следующее.
1. Получение нового высокопродуктивного мутированного штамма со стабильными генетическими свойствами.
2. Высокая генетическая стабильность и низкая контаминация продукции нового штамма, способствующие отделению продукта и его очистке в процессе получения соединения формулы I, а также масштабирование производства, что делает новый штамм приемлемым для промышленного производства.
3. Выход соединения формулы I может достигать 5 г/л в оптимизированных ферментационных условиях.
Настоящее изобретение в дальнейшем будет проиллюстрировано ниже при помощи ссылки на конкретные примеры. Следует понимать, что эти примеры являются только иллюстративными для настоящего изобретения и не огранивают его объем. Экспериментальные способы, описанные в следующих примерах без указания условий, обычно выполняют при общепринятых условиях или согласно инструкции производителя. Если не указано иное, все проценты, отношения, пропорции или части вычислены по массе.
Единица измерения, выраженная в процентном отношении массы к объему, примененная в настоящем изобретении, хорошо известна специалистам в области техники, например, она относится к массе раствора в 100 миллилитрах раствора.
Если не определено иное, все технические и научные термины, примененные в настоящем описании, имеют значения, обыкновенно понимаемые специалистами в области техники. Кроме того, все способы и материалы, которые сходны или эквивалентны содержанию, раскрытому в данном документе, могут быть применены в настоящих способах. Предпочтительные методы и материалы для выполнения настоящих способов, раскрытых в данном документе, приведены только в качестве примеров.
В примерах по настоящему изобретению предложены следующие условия высокоэффективной жидкостной хроматографии, применяемые для измерения содержания соединения формулы I в ферментационной жидкости:
хроматографическая колонка: Phenomex С18 (4,6 мм × 250 мм, 5 мкм),
мобильная фаза: ацетонитрил: вода=50:50,
температура колонки: 35°С,
градиентное элюирование, скорость потока: 1,0 мл/мин,
объем вносимой пробы: 5 мкл, длина волны детектирования: 210 нм.
Пример 1
Мутагенез с целью получения нового штамма CGMCC 2933
1. Мутагенез
Законсервированный в глицероле штамм АТСС 20957 размораживали, сеяли в посевную среду при помощи инокулята в количестве 4% (вносимое количество 50 мл/250 мл), затем культивировали на шейкере при 280 об/мин и температуре 25°С в течение 2 дней до тех пор, пока сухая масса мицелия не составит приблизительно 5-10 г/л. Мутаген НТГ добавляли к посевной жидкости в концентрации 10 мкг/мл, и посевную жидкость культивировали в течение еще одного дня. Затем брали 10 мл посевной жидкости, содержащей НТГ, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут, полученный осадок промывали два раза при помощи двух объемов 0,6 М NaCl для удаления среды и НТГ.
Посевная среда: 10 г/л сахарозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л соевого триптона, 1,5 г/л КН2РО4, 0,4 г/л MgSO4·7H2O, 10 г/л микроэлементов, исходный pH 5,3. Посевную среду стерилизовали при 121°С в течение 20 мин.
Микроэлементы: 10 г/л FeSO4·7H2O, 10 г/л MnSO4·H2O, 2 г/л ZnSO4·7H2O, 0,7 г/л СаСl2, 0,56 г/л Н3ВO3, 0,25 г/л СuСl2·2Н2O, 0,19 г/л (NH4)6Мо7O24·7Н2O, концентрированная соляная кислота - 500 мл/л.
2. Приготовление протопластов и отбор единичных колоний
К отмытому мицелию добавляли 10 мл ферментной смеси (в буфере, содержащем двузамещенный фосфат натрия и лимонную кислоту (pH 6,0) с 0,5 М NaCl), которая содержит 20 мг/мл ливалзима (2000 единиц/мг), 10 мг/мл фермента улитки (5 единиц/мг) и 10 мг/мл целлюлозы (15 единиц/мг). Полученную в результате смесь встряхивали при 80 об/мин и 30°С в течение 5 ч для ферментного лизиса. Энзимолитическую реакционную смесь фильтровали при помощи хлопка для удаления мицелия и получения одноклеточной суспензии, содержащей только протопласты. Один миллилитр этого раствора брали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин. Осадок растворяли в 1 мл буфера (pH 6,0), содержащем двузамещенный фосфат натрия, лимонную кислоту и 0,5 М NaCl. Затем делали серию разведений этого раствора с различными концентрациями, равномерно сеяли на гипертоническую среду PDA с 0,8 М сахарозой и культивировали при 25°С в течение 8-10 дней для получения единичных колоний.
3. Процесс скрининга высокопродуктивного штамма CGMCC 2933
После культивирования в течение 10 дней отбирали единичные колонии и сеяли на скошенную среду для дальнейшего культивирования. После 8 дней собирали газонную культуру площадью 0,5-1 см2, сеяли в посевную среду (вносимый объем 25 мл / 250 мл) и культивировали на шейкере при 280 об/мин и 25°С в течение 8 дней. Посевную жидкость сеяли в ферментационную среду при помощи инокулята объемом 4% (вносимый объем 25 мл / 250 мл), культивировали на шейкере при 280 об/мин и 25°С в течение 14 дней (на 7-й день культивирования добавляли 5% маннит и 0,5% пролин).
Пример 2
Получение соединения формулы I при помощи нового штамма CGMCC 2933
Новый штамм CGMCC 2933, полученный в примере 1 в посевной среде, сеяли в ферментационную среду при помощи инокулята в количестве 4% и культивировали во встряхиваемых колбах при температуре 25°С. После культивирования в течение 14 дней выход соединения формулы I достигал 5 г/л (на 7-й день культивирования добавляли 5% маннит и 0,5% пролин).
Ферментационная среда: 15 г/л L-пролина, 6 г/л глутамата натрия, 6 г/л дрожжевого экстракта (полученного от компании Oxiod), 4 г/л фруктозы, 1,5 г/л КН2РO4, 0,4 г/л MgSO4·7H2O, 50 г/л маннита, 10 мл/л микроэлементов, исходный pH 5,3. Ферментационную среду стерилизовали при 121°С в течение 20 мин.
Микроэлементы: 10 г/л FeSO4·7H2O, 10 г/л MnSO4·H2O, 2 г/л ZnSO4·7H2O, 0,7 г/л СаСl2, 0,56 г/л Н3ВO3, 0,25 г/л СuСl2·2Н2O, 0,19 г/л (NH4)6Мо7O24·7Н2O, концентрированная соляная кислота 500 мл/л.
Сравнительный пример
Способность изначального штамма АТСС 20957 продуцировать соединение формулы I сравнивали с таковой у мутантного штамма CGMCC 2933 при помощи следующих способов: изначальный штамм и мутантный штамм культивировали при помощи способа культивирования, описанного в примере 2, соответственно. После завершения культивирования ферментационную жидкость экстрагировали двумя объемами метанола, и содержание соединения формулы I в ферментационной жидкости измеряли высокоэффективной жидкостной хроматографией. Результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1
Номер штамма Выход соединения формулы I (г·л-1)
АТСС 20957 1,1
CGMCC 2933 5,2
Примененные среды приведены ниже.
Среда для скрининга состоит из 300 г/л картофеля, 20 г/л глюкозы, 15 г/л агара, 273,6 г/л сахарозы и стерилизована при 121°С в течение 20 мин.
Скошенная среда состоит из 300 г/л картофеля, 20 г/л глюкозы, 15 г/л агара и стерилизована при 121°С в течение 20 мин.
Посевная среда состоит из 10 г/л сахарозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л соевого триптона, 1,5 г/л КН2РО4, 0,4 г/л MgSO4·7H2O, 10 г/л микроэлементов, исходный pH 5,3 и стерилизована при 121°С в течение 20 мин.
Ферментационная среда состоит из 15 г/л L-пролина, 6 г/л глутамата натрия, 6 г/л дрожжевого экстракта (полученного от компании Oxiod), 4 г/л фруктозы, 1,5 г/л КН2РO4, 0,4 г/л MgSO4·7H2O, 50 г/л маннита, 10 мл/л микроэлементов, исходный pH=5,3, и стерилизована при 121°С в течение 20 мин.
Микроэлементы: 10 г/л FeSO4·7H2O, 10 г/л MnSO4·H2O, 2 г/л ZnSO4·7H2O, 0,7 г/л СаСl2, 0,56 г/л Н3ВO3, 0,25 г/л CuCl2·2H2O, 0,19 г/л (NH4)6Mo7O24·7Н2O, концентрированная соляная кислота 500 мл/л.
Пример 3
Стабильность нового штамма CGMCC 2933
Субкультивирование выполняли при помощи той же питательной среды и условий культивирования, как и в примере 2.
Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
Стабильность нового штамма при пассажах
Номер пассажа F1 F2 F6
Выход соединений формулы I (г/л) 5,2 5,0 5,3
Результаты показывают, что новый штамм обладает превосходной стабильностью.
Вышеприведенное описание представляет собой лишь предпочтительные примеры настоящего изобретения и не предназначено для ограничения объема смыслового технического содержания настоящего изобретения. Смысловое техническое содержание настоящего изобретения широко определено в объеме формулы изобретения, прилагаемой к настоящему изобретению. Любой технический объект или способ, выполненный по-другому, должен считаться относящимся к объему формулы настоящего изобретения, если объект или способ полностью идентичны таковым, определенным в формуле изобретения настоящей заявки, или их эквивалентным изменениям или модификациям.

Claims (6)

1. Мутантный штамм Glarea lozoyensis для получения соединения формулы I
Figure 00000003

депонированный в Китайском центре коллекции микробиологических культур под № CGMCC 2933.
2. Применение мутантного штамма по п.1 для получения соединения формулы I.
3. Способ получения соединения формулы I, включающий следующий этап:
(1) культивирование мутантного штамма по п.1 в ферментационной среде при температуре 15-35 °С для получения соединения формулы I, где ферментационная среда включает следующие компоненты из расчета на общий объем ферментационной среды: 15-50 г/л L-пролина, 6-20 г/л глутамата натрия, 6-20 г/л дрожжевого экстракта, 4-20 г/л фруктозы, 1,5-7 г/л неорганической соли и 10-50 г/л микроэлементов, и исходное значение рН ферментационной среды составляет 5,3-6,0.
4. Способ получения по п.3, где неорганическая соль выбрана из фосфата или сульфата или их комбинации.
5. Способ получения по п.3, где ферментационная среда дополнительно содержит 10-100 г/л маннита в процессе культивирования.
6. Способ получения по п.3, где объем инокулята мутантного штамма по п.1 составляет 4-10 об.% из расчета на общий объем ферментационной среды.
RU2012116032/10A 2009-09-24 2009-09-28 МУТАНТНЫЙ ШТАММ Glarea lozoyensis И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ RU2507252C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910196286.4 2009-09-24
CN2009101962864A CN101928670B (zh) 2009-09-24 2009-09-24 一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途
PCT/CN2009/074271 WO2011035492A1 (zh) 2009-09-24 2009-09-28 一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012116032A RU2012116032A (ru) 2013-10-27
RU2507252C2 true RU2507252C2 (ru) 2014-02-20

Family

ID=43368101

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012116032/10A RU2507252C2 (ru) 2009-09-24 2009-09-28 МУТАНТНЫЙ ШТАММ Glarea lozoyensis И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8431383B2 (ru)
EP (1) EP2481792B1 (ru)
KR (1) KR101222233B1 (ru)
CN (1) CN101928670B (ru)
AU (1) AU2009353301B2 (ru)
CA (1) CA2775465C (ru)
RU (1) RU2507252C2 (ru)
WO (1) WO2011035492A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2634033C1 (ru) * 2016-05-24 2017-10-23 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России) Способ моделирования болезни Гиршпрунга в эксперименте

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140349345A1 (en) * 2012-01-13 2014-11-27 Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. Cyclopeptide fermentation at increased metal ion concentration
BR112015013013A2 (pt) 2012-12-06 2017-09-12 Synthetic Genomics Inc mutantes de algas tendo um fenótipo aclimatado em luz alta locked-in
CN103087928B (zh) * 2013-01-25 2014-09-17 杭州华东医药集团新药研究院有限公司 真菌Glarea lozoyensis及其在调控微生物代谢物纽莫康定B0中的应用
CN103695415A (zh) * 2013-12-30 2014-04-02 祁文瑾 新型假丝酵母菌rna提取试剂及其使用方法
CN104531535B (zh) * 2014-10-17 2017-08-04 南京工业大学 一种生产纽莫康定b 0的基因重组菌株及选育方法和应用
US10221398B2 (en) 2014-12-16 2019-03-05 C3J Therapeutics, Inc. Compositions of and methods for in vitro viral genome engineering
CN107201316B (zh) * 2017-07-14 2020-04-07 海正药业(杭州)有限公司 一种曲霉菌及其生产肺念菌素b0的方法
CN113564057B (zh) * 2021-08-17 2023-06-20 湖北省农业科学院植保土肥研究所 一株解毒抑菌生防菌及其应用
CN116355777A (zh) * 2021-12-21 2023-06-30 山东鲁抗医药股份有限公司 高产多杀菌素菌株及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2245271A (en) * 1990-06-18 1992-01-02 Merck & Co Inc Process for production of an antibiotic polypeptide
US5426038A (en) * 1990-03-12 1995-06-20 Merck & Co, Inc. Process for production of an antibiotic compound with Zalerion arboricola
WO2000008197A1 (en) * 1998-08-07 2000-02-17 Merck & Co., Inc. Method for the production of an antibiotic agent

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2833596B1 (fr) 2001-12-14 2005-02-18 Aventis Pharma Sa Procede de preparation de derives d'echinocandine
CN1176205C (zh) 2002-06-08 2004-11-17 江南大学 一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸
CN100467590C (zh) * 2006-05-17 2009-03-11 天津大学 产核黄素的工程菌株及其构建方法
CN101177696B (zh) * 2007-11-05 2011-06-08 大庆沃太斯化工有限公司 一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5426038A (en) * 1990-03-12 1995-06-20 Merck & Co, Inc. Process for production of an antibiotic compound with Zalerion arboricola
GB2245271A (en) * 1990-06-18 1992-01-02 Merck & Co Inc Process for production of an antibiotic polypeptide
WO2000008197A1 (en) * 1998-08-07 2000-02-17 Merck & Co., Inc. Method for the production of an antibiotic agent

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GB, 2245271 A, 02.01.1992. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2634033C1 (ru) * 2016-05-24 2017-10-23 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России) Способ моделирования болезни Гиршпрунга в эксперименте

Also Published As

Publication number Publication date
CA2775465C (en) 2016-11-22
AU2009353301A1 (en) 2012-05-17
AU2009353301B2 (en) 2013-11-14
RU2012116032A (ru) 2013-10-27
EP2481792A4 (en) 2013-03-06
CA2775465A1 (en) 2011-03-31
KR20120056299A (ko) 2012-06-01
US8431383B2 (en) 2013-04-30
US20120258498A1 (en) 2012-10-11
CN101928670A (zh) 2010-12-29
KR101222233B1 (ko) 2013-01-16
EP2481792A1 (en) 2012-08-01
CN101928670B (zh) 2012-02-22
EP2481792B1 (en) 2014-06-25
WO2011035492A1 (zh) 2011-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2507252C2 (ru) МУТАНТНЫЙ ШТАММ Glarea lozoyensis И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
EP2753181B1 (en) Use of a copper resistant, fengycin-producing bacillus mojavensis strain for controlling vegetable pathogens
RU2560258C2 (ru) Штамм, продуцирующий пептидные антибиотики с высоким выходом, способ его получения и применение
El-Mehalawy et al. Influence of maize root colonization by the rhizosphere actinomycetes and yeast fungi on plant growth and on the biological control of late wilt disease
WO2021135544A1 (zh) 一种普洱茶树叶片内生芽孢杆菌及其应用
CN108277186B (zh) 一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌及其应用
CA2257254C (en) Antibiotic producing microbe
JP5818915B2 (ja) 環状リポペプチド化合物の製造方法
CN112641032B (zh) 基于隐球酵母y3胞内酶降解赭曲霉毒素a的用途
CN102586147A (zh) 一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法
CN102876611A (zh) 一种杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌及其制备方法与应用
CN105733956B (zh) 薄芝糖肽生产菌及其应用
CN104450538B (zh) 一种用于圆锥掘氏梅里霉的培养基和培养方法
CN105541848A (zh) 一种杀菌化合物及其制备方法
Lee et al. Nutritional requirements and mass production of nematode-trapping fungus, Arthrobotrys oligospora
CN114907989A (zh) 一种阿尼芬净前体棘白菌素b高产菌株及其应用
CN117701432A (zh) 一株耐酸性短小芽孢杆菌及其应用
CN117757658A (zh) 一株来自家蚕肠道的戊糖片球菌及其应用
RO127523B1 (ro) Tulpină de saccharomyces cerevisiae cu activitate antagonistă şi fermentativă

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160929