CN114907989A - 一种阿尼芬净前体棘白菌素b高产菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产棘白菌素B菌株高效诱变和快速筛选的方法。首先通过常压室温等离子体(ARTP)诱变,然后通过抑菌圈法筛选初筛、摇瓶发酵复筛和发酵优化试验后,获得了一株高产、稳定性强的菌株ARTP‑7,该菌株棘白菌素B产量达到1.8g/L,比诱变前提高了240%。将ARTP诱变和抑菌圈初筛结合使用,显著提高了菌株的筛选效率,结合发酵优化,实现了棘白菌素B突变菌株的快速筛选。
Description
技术领域
本发明涉及微生物育种技术领域,特别涉及ARTP诱变技术,是一种高产棘白菌素B菌株的诱变选育方法,尤其涉及通过上述方法筛选到的一种阿尼芬净前体棘白菌素B高产菌株及其应用。
背景技术
棘白菌素类药物是一种新型抗真菌药物,通过抑制β-1,3-葡聚糖合成酶活性来干扰真菌细胞壁的合成,哺乳动物细胞没有细胞壁,因此该类药物的毒副作用小,且安全性高,对念珠菌属、曲霉菌属及部分对唑类耐药的真菌类均有抗菌活性。现已获得批准上市的棘白菌素类药物包括卡泊芬净(2004年在美国上市)、米卡芬净(2005年在日本上市)和阿尼芬净(2006年在美国上市),它们都具有相似的非核糖体六元环肽类母核结构,差异仅在于侧链基团、氨基酸连接顺序和后修饰基团的不同。其中卡泊芬净和米卡芬净已在国内上市,阿尼芬净由于产量低,市场售价高,临床中的应用推广受到了一定的影响,具有广阔的市场前景。
阿尼芬净的工业生产包括三个过程,首先是由Aspergillus nidulans发酵合成前体化合物棘白菌素B,然后再经过犹他游动放线菌发酵水解掉脂肪链,最后通过化学方法加上一个人工合成的侧链获得阿尼芬净。其中,Aspergillus nidulans发酵合成阿尼芬净前体棘白菌素B是工业生产的第一步,也是整个工艺的关键核心。高性能的发酵菌株是控制生产成本的关键因素,也是限制该行业准入的技术门槛。目前,国内外学者提升棘白菌素B发酵水平的研究主要着眼于诱变育种、发酵优化与调控和代谢工程。但是,进一步的系统分析发现核心途径可供理性改造的靶点有限,相较于理性改造,诱变育种的随机性特点在菌株综合发酵性能改良时更能发挥出优势,尤其是对于相对复杂的多细胞微生物,所以目前工业生产使用的绝大多数放线菌和丝状真菌菌株都是通过诱变育种获得的。有效微生物育种方法的缺乏使棘白菌素B产量的进一步大幅度提高受到限制,为了适应工业化生产要求,需要通过合适的遗传育种手段快速提高棘白菌素B生产菌株的发酵水平。本发明通过ARTP诱变、抑菌圈法初筛、摇瓶发酵复筛和发酵优化后,获得了一株高产、稳定性强的菌株。
发明内容
本发明提供了一株高产棘白菌素B的菌株,所述菌株为构巢曲霉(Aspergillusnidulans)ARTP-7,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.40073,保藏日期为2022年1月29日,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,电话:010-64807355。
在一个实施方式中,本发明所述菌株的诱变条件输出功率100W,照射距离1mm,气体流速10L·min-1,样品量10μL,通入气体为氦气,处理时间60s-540s,最佳诱变时间180s。
另一方面,本发明还提供了一种菌剂,所述菌剂包括上述菌株。
在一个实施方式中,所述菌剂为液体制剂或固体制剂。
另一方面,本发明还提供了一种微生物培养方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:将上述菌株使用培养基进行培养,并收集含有上述菌株的培养物。
另一方面,本发明还提供了上述菌株或菌剂在生产棘白菌素B中的应用。
另一方面,本发明还提供了一种制备棘白菌素B的方法,所述方法包括对上述菌株进行发酵的步骤。
在一个实施方式中,上述发酵的温度为20℃-40℃,优选,25℃;上述发酵的时间为2d-20d,例如,10d-15d。
在一个实施方式中,所述培养基的成分包括甘露醇,花生油,甘油,黄豆饼粉,蛋白胨,FeSO4·7H2O,K2HPO4,MgSO4·7H2O,MnSO4·H2O,CuSO4·5H2O,CaCl2。
进一步的,所述制备棘白菌素B的方法还包括分离/纯化所述棘白菌素B的步骤。
另一方面,本发明还提供了一种制备阿尼芬净的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)利用本发明所述的菌株制备棘白菌素B;
(2)利用步骤(1)得到的棘白菌素B制备阿尼芬净。
在一个实施方式中,上述步骤(2)可通过以下方式实现:由棘白菌素B经过犹他游动放线菌发酵水解掉脂肪链,最后通过化学方法加上侧链获得阿尼芬净。
进一步的,上述制备阿尼芬净的方法还包括分离/纯化阿尼芬净的步骤。
本发明公开了一种应用ARTP诱变育种的技术筛选棘白菌素B高产菌株的选育方法。具体包括阿尼芬净前体棘白菌素B生产菌株高通量筛选方法的建立,通过ARTP诱变仪对出发菌株ATCC58397(AN01)进行诱变,利用白色念珠菌对诱变后菌株的棘白菌素B抑菌圈直径测定初筛,对初筛得到的60株诱变菌株进行发酵优化和萃取处理优化,得到一株高产棘白菌素B的菌株ARTP-7,高产菌株比对对照菌株提高了240%。本发明效果显著,可用于棘白菌素B优良菌株的筛选,改善现有的筛选方法,加快选育速度,提高发酵液的效价、发酵产量。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解,构成本申请的一部分,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1.阿尼芬净前体棘白菌素B生产菌株高通量筛选流程图。
图2.不同ARTP照射时间下的致死率曲线。
图3.不同诱变菌株抑菌圈直径,图中横线位置为野生型对照菌株抑菌圈直径。
图4.不同发酵菌株棘白菌素B产量,图中横线位置为野生型对照菌株棘白菌素B的产量。
图5.优化发酵条件后诱变菌株棘白菌素B产量,图中横线位置为野生型对照菌株的发酵产量。
图6.优化萃取处理后诱变菌株棘白菌素B产量,图中横线位置为野生型对照菌株的发酵产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法,未经特殊说明,均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法,均可通过商业渠道获得。
PDA固体培养基:39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品,产品目录号:633840),余量为去离子水,115℃高压灭菌30min,待冷却至约60℃制备平板。
软琼脂培养基:24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉(BD公司产品,产品目录号:7114771),5g/L琼脂粉,余量为去离子水,115℃高压灭菌30min后50℃保温。
种子培养基:5~30g/L棉籽饼粉,5~20g/L葡萄糖,5~10g/L甘油,余量为去离子水,用NaOH调节至pH 5.0~7.0,121℃高压灭菌20min。
发酵培养基:60~150g/L甘露醇,15~50g/L花生油,5~20g/L甘油,5~20g/L黄豆饼粉,5~20g/L蛋白胨,0.01~0.07g/L FeSO4·7H2O,5~10g/L K2HPO4,0.2~1g/L MgSO4·7H2O,0.1~0.8g/L MnSO4·H2O,0.3~0.8g/L CuSO4·5H2O,0.1~0.5g/L CaCl2,余量为去离子水,自然pH,121℃高压灭菌20min。
实施例1.阿尼芬净前体棘白菌素B生产菌株高通量筛选方法的建立
以野生菌株AN01为出发菌株,首先是从-80℃冰箱取出一冻存甘油管,稀释后涂布PDA平板,25℃倒置培养3~5d,待单菌落大小合适后用无菌牙签挑取点15cm~19cm PDA平板,25℃倒置培养3d,然后取8~14h处于对数生长期的白色念珠菌液,用无菌水将其稀释到OD600=0.6~1左右,取500μL于不烫手的软琼脂中混匀后覆盖平板,24h后即可测量抑菌圈的直径,且随着时间的延长抑菌圈直径不会发生改变(图1)。其中将单菌落挑取点板生长代替涂布平板后直接喷洒白色念珠菌会防止漏筛,因为单菌落在平板中分布均匀是一种理想状态,通常是很多单菌落连成一片;其次将白色念珠菌混匀到软琼脂中覆盖平板代替用喷壶直接喷洒白色念珠菌会减小误差、防止染菌,另外白色念珠菌是条件致病菌,覆盖代替喷洒会更安全。
实施例2.利用ARTP诱变仪对出发菌株AN01进行诱变
从-80℃冰箱取出一冻存甘油管,稀释后涂布PDA平板,25℃倒置培养6~8d,使菌株孢子处于成熟状态。取2~3mL无菌生理盐水于PDA平板中,用无菌小毛笔刷洗下孢子,将洗下的孢子用300~500目滤布过滤,收集孢子悬浮液并用无菌生理盐水洗涤2~3次,孢子计数仪计数并将其稀释至104~106CFU/mL的孢子悬浮液。
吸取10μL孢子悬浮液均匀涂在灭菌冷却后的载样片上,输出功率100W,照射距离1mm,气体流速10L·min-1,样品量10μL,通入气体为氦气,处理时间分别为0s、60s、120s、180s、240s、270s、300s、360s、420s、480s、540s。
对诱变后的载样片置于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中,用漩涡振荡仪进行振荡洗脱,制成孢子悬浮液,稀释到1×10-3梯度后,取100μL~200均匀涂布到PDA培养基表面,25℃培养3~4d进行平板计数,确定致死率随诱变时间的变化数值关系。如图2所示,在处理时间在180s时,致死率达到了87%,由现代育种理论可知,菌体致死率在90%~95%时正突变率最高,因此选择180s为最佳诱变时间。
实施例3.诱变后菌株的棘白菌素B抑菌圈直径测定初筛
利用ARTP诱变仪处理时间为180s进行诱变,将诱变处理过的载样片置于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中,用漩涡振荡仪进行振荡洗脱,制成孢子悬液,稀释到1×10-3梯度后,取100μL~200μL均匀涂到PDA培养基表面,25℃培养3~4d,用无菌牙签挑选单菌落点15cm的PDA平板,25℃培养3~4d,将对数生长期的白色念珠菌稀释到OD600=0.6~1,取OD600=0.6的白色念珠菌500μL于不烫手的软琼脂培养基中混匀后覆盖平板,25℃培养1~7d后检测诱变菌株抑菌圈直径。将抑菌圈直径提高10%的作为发酵复筛的菌株,图3结果表明通过6批次初筛可以得到60株诱变菌株的抑菌圈直径比出发菌株大10%。
实施例4.抑菌圈初筛棘白菌素B高产菌株发酵验证
将60株诱变菌株和对照菌株AN01接种于PDA固体平板上,25℃培养9~12d。取1~2mL无菌生理盐水于PDA平板中,用无菌小毛笔刷洗下孢子,将洗下的孢子用300~500目滤布过滤,收集孢子悬浮液并用孢子计数仪计数,取107CFU/mL的孢子悬浮液接种于50mL的种子培养基,25℃,220rpm,摇床培养2d。将上述培养的种子液取5mL~50mL的发酵培养基,25℃,220rpm,发酵培养10~12d,每个菌株设置3个平行。从每一瓶发酵液中取1mL,加入等体积的甲醇,漩涡震荡萃取1h,离心,取上清。用0.22μm的有机滤器过滤处理样品,并通过HPLC对处理后的样品进行分析。
HPLC分析方法为:液相色谱柱为Agilent C-18反向柱883975-902(4.6×150mm,5μm);流动相为A:0.05%(体积比)甲酸水溶液,流动相B:0.05%(体积比)甲酸乙腈溶液,流速为1mL/min,紫外检测波长:210nm,30℃,总洗脱时间为25min。梯度洗脱条件:0-5min,流动相B占流动相的体积由5%线性上升到40%,5-15min,流动相B占流动相的体积由40%线性上升到60%,15-20min,流动相B占流动相的体积由60%线性上升到100%。结果如图4所示,与出发菌株AN01相比,三批发酵棘白菌素B的产量比出发菌株高的有29株,最高的一株为A-7’,棘白菌素B产量为719.3mg/L。
实施例5.发酵优化后棘白菌素B高产菌株发酵验证
将以上29株诱变菌株和对照菌株AN01重新接种于PDA固体平板上,25℃培养9~12d。取1~2mL无菌生理盐水于PDA平板中,用无菌小毛笔刷洗下孢子,将洗下的孢子用300~500目滤布过滤,收集孢子悬浮液并用孢子计数仪计数,加大(108CFU/mL)孢子悬浮液接种量于50mL的种子培养基,25℃,220rpm,摇床培养2d。将上述培养的种子液取5mL到50mL的发酵培养基,25℃,220rpm,发酵培养延长到13d,每个菌株设置3个平行,整个发酵过程中为避免蒸发需要控制摇床湿度。从每一瓶发酵液中取1mL,加入等体积的甲醇,漩涡震荡萃取1h,离心,取上清。用0.22μm的有机滤器过滤处理样品,并通过HPLC对处理后的样品进行分析。
HPLC分析方法为:液相色谱柱为Agilent C-18反向柱883975-902(4.6×150mm,5μm);流动相为A:0.05%(体积比)甲酸水溶液,流动相B:0.05%(体积比)甲酸乙腈溶液,流速为1mL/min,紫外检测波长:210nm,30℃,总洗脱时间为25min。梯度洗脱条件:0-5min,流动相B占流动相的体积由5%线性上升到40%,5-15min,流动相B占流动相的体积由40%线性上升到60%,15-20min,流动相B占流动相的体积由60%线性上升到100%。结果如图5所示,与出发菌株AN01相比,两批发酵棘白菌素B的产量比出发菌株高的有12株,最高的一株为A-7’,棘白菌素B产量为1399.8mg/L。
实施例6.萃取处理优化后棘白菌素B高产菌株发酵验证
将以上12株诱变菌株和对照菌株AN01重新接种于PDA固体平板上,25℃培养9~12d。取1~2mL无菌生理盐水于PDA平板中,用无菌小毛笔刷洗下孢子,将洗下的孢子用300~500目滤布过滤,收集孢子悬浮液并用孢子计数仪计数,108CFU/mL孢子悬液接种量于50mL的种子培养基,25℃,220rpm,摇床培养2d。将上述培养的种子液取5mL~50mL的发酵培养基,25℃,220rpm,发酵培养13d,每个菌株设置3个平行,整个发酵过程中为避免蒸发需要控制摇床湿度。从每一瓶发酵液中取1mL,加入5~10倍体积的甲醇,漩涡震荡萃取1h,离心,取上清。用0.22μm的有机滤器过滤处理样品,并通过HPLC对处理后的样品进行分析。
HPLC分析方法为:液相色谱柱为Agilent C-18反向柱883975-902(4.6×150mm,5μm);流动相为A:0.05%(体积比)甲酸水溶液,流动相B:0.05%(体积比)甲酸乙腈溶液,流速为1mL/min,紫外检测波长:210nm,30℃,总洗脱时间为25min。梯度洗脱条件:0-5min,流动相B占流动相的体积由5%线性上升到40%,5-15min,流动相B占流动相的体积由40%线性上升到60%,15-20min,流动相B占流动相的体积由60%线性上升到100%。结果如图5所示,经过发酵条件和萃取处理条件的优化,与出发菌株AN01相比,10株突变菌棘白菌素B的产量比出发菌株高,最高的一株A-7’为1898.2mg/L,比出发菌株提高了240%。我们将其命名为ARTP-7,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.40073,保藏日期为2022年1月29日,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,电话:010-64807355。
Claims (9)
1.一株高产棘白菌素B的菌株,所述菌株为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ARTP-7,所述菌株保藏编号为CGMCC No.40073,所述菌株于2022年01月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种微生物菌剂,其特征在于,包含权利要求1所述的菌株。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂,其特征在于,所述菌剂的剂型为固体制剂或液体制剂。
4.一种微生物培养方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:将权利要求1所述菌株使用培养基进行培养,并收集含有权利要求1所述菌株的培养物。
5.如权利要求1所述菌株、权利要求2-3任一所述菌剂或权利要求4所述方法得到的培养物在生产棘白菌素B中的应用。
6.一种制备棘白菌素B的方法,所述方法包括对权利要求1所述菌株发酵的步骤。
7.一种制备阿尼芬净的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)利用权利要求1所述菌株发酵合成棘白菌素B;
(2)利用步骤(1)得到的棘白菌素B制备阿尼芬净。
8.权利要求1所述菌株、权利要求2-3任一所述菌剂或权利要求4所述方法得到的培养物在制备棘白菌素类药物中的应用。
9.权利要求1所述菌株、权利要求2-3任一所述菌剂或权利要求4所述方法得到的培养物在制备抗真菌药物中的应用。
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