HU215232B - Eljárás lipopeptid-deaciláz előállítására - Google Patents

Eljárás lipopeptid-deaciláz előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215232B
HU215232B HU911897A HU189791A HU215232B HU 215232 B HU215232 B HU 215232B HU 911897 A HU911897 A HU 911897A HU 189791 A HU189791 A HU 189791A HU 215232 B HU215232 B HU 215232B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
deacylase
kcl
ala
activity
enzyme
Prior art date
Application number
HU911897A
Other languages
English (en)
Other versions
HU911897D0 (en
HUT61587A (en
Inventor
Adam Joseph Kreuzman
Wu-Kuang Yeh
Original Assignee
Eli Lilly And Co.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Co. filed Critical Eli Lilly And Co.
Publication of HU911897D0 publication Critical patent/HU911897D0/hu
Publication of HUT61587A publication Critical patent/HUT61587A/hu
Publication of HU215232B publication Critical patent/HU215232B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Macromonomer-Based Addition Polymer (AREA)
  • Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás echinőcandin B deaciláz enzim tisztításáraés az enzim alkalmazása. A találmány szerinti eljárás sőrán echinőcandin B deacilázt termelősejteket sókezelésnek vetik alá, a nyers, szőlűbilizált echinőcandin Bdeacilázt elválasztják és pH = 6,0 körüli ért ken melegítik, azextraktűmőt hidrőfób kölcsönhatásőkőn alapűló krőmatőgráfiáseljárásnak vetik alá 1,2 M KCl és 14% (NH4)2SO4 alkalmazásával, a 95%-nál több deaciláz-aktivitást tartalmazó e űátűmőt (NH4)2SO4alkalmazásával frakciőnálják, és a 10% és 36% (NH4)2SO4 közöttifrakciókat szeparálják, majd 0,8 M KCl-tartalmú pűfferban pH = 6,0,gélszűrésnek vetik alá, és a 90 deaciláz-aktivitással rendelkezőfrakciókat egyesítik 0,05 M KCl-tartalmú pűfferban, pH = 5,6,katiőncserélő krőmatőgráfiának vetik alá, majd a megkötött anyagőtűgyanebben a pűfferban lineáris KCl radienssel (0,05–0,5 M) elűálják,az elűátűm KCl kőncentrációját 0,05 M értékre állítják be, majd 0,05 MKH2PO4, pH = 6,0, és 0,05 M KCl jelenlétében dye-ligandkrőmatőgráfiának vetik alá, és a megtöltött anyagőt lineáris 0,05–2,5M KCl gradienssel (0,05–2,5 M) elűálják, az egyesített frakciókat 0,05M KH2PO4, pH = 6,0 és 0,05 M KCl jelenlétében gélszűrésnek vetik alá,és az elűátűm K l kőncentrációját 0,04 M-ra állítják be pH = 7,0értéken, majd 0,05 M KH2PO4, pH = 7,0, és 0,04 M KCl jelenlétébenkatiőncserélő krőmatőgráfiának vetik alá, és a tisztítőtt deacilázt0,04–0,5–2 M lépcsős KCl gradienssel elűálják. ŕ

Description

A találmány tárgya enzim-technológiai eljárás. Az eljárás az Actinoplanes utahensis által termelt lipopeptiddezaciláz tisztított formájának előállítására vonatkozik, mely az echinocandin B (ECB), az aculeacin, és az ECB-analóg antifungális metabolitok lipofil acil-oldalláncait dezacilezi.
Az echinocandin B, és az aculeacin jól ismert, linoleoil, illetve palmitoil oldalláncot tartalmazó ciklikus hexapeptidek. Boeck, L. D., és társai, 1989. J. Antibiot. (Tokyo), 41,1085-1092; Boeck, L. D., és társai, 1988. J. Antibiot. (Tokyo), 42,382-388; és Kimura, Y., és társai,
1987. Agri. Bioi. Chem. 51, 1617-1623; beszámolnak az ECB linoleoil csoportjának az Actinoplanes utahensis, és a Pseudomonas fajok teljes sejtjei által történő deacilezéséről. Takeshima, H., és társai, 1989. J. Biochem. 105, 606—610, az aculeacint dezacilező, Actinoplanes utahensis által termelt dezaciláz enzim tisztítását, és az enzim részleges jellemzését ismerteti.
A természetes eredetű antifungális anyagok szerkezeti módosítása rendkívül hatékony terápiás anyagokat eredményezett, így például a cilofungint, és a daptomicint. Debono, M., és társai, 1989. J. Antibiot. (Tokyo), 42, 389-397; Debono, M., és társai, 1988. Ann. N. Y. Acad. Sci., 544, 152-167; Gordee, R. S., és társai, Ann. N. Y. Acad. Sci., 544, 294—309; Boeck, L. D., és társai,
1988. J. Antibiot. (Tokyo), 41,1085-1092. így például az ECB-t a teljes A. utahensis sejtekkel dezacilezzük, amikor is a lipofil acil oldallánc lehasad, és így megkapjuk a ciklikus hexapeptid ECB-nukleuszt. A nukleusz kémiai úton történő újraacilezése eredményeként acil-ECB vegyület keletkezik, ilyen például a fokozott antifungális tulajdonságokkal rendelkező cilofungin.
A rendszeres gombás fertőződések kezelése miatt megnövekedett az igény a fokozott antifungális tulajdonságokkal rendelkező anyagok iránt, így ezek termelése rendkívül fontos. A vegyületek előállítása során különösen előnyösnek bizonyultak az enzimes eljárások, mivel ezek jóval egyszerűbbek és gazdaságosabbak, mint a hagyományos kémiai eljárások. Ennek megfelelően jóval előnyösebb a vegyületek ilyen módon történő átalakítása.
Az Actinoplanes utahensis által termelt lipopeptiddeacilázt a találmány szerint tisztított formában állítjuk elő. Az enzim az ECB linoleoil csoportjának, és az aculeacin palmitoil csoportjának a hasítását katalizálja. Az enzim egy 63 KD alegységből, és egy 18 KD alegységből álló heterodimer molekula, melynek optimális működési paraméterei pH = 6,0, és 60 °C. Az enzim sejt-asszociált, működését kofaktorok, kelátképző fémionok, illetve szulfhidril reagensek nem befolyásolják.
Az enzim ciklikus hexapeptid nukleoproteidek előállítására, valamint az A21978C antibiotikum ciklikus peptid nukleuszának előállítása során alkalmazható.
A találmány tárgya tehát eljárás a deaciláz enzim közel homogén, tisztított formájának előállítására, mely hidrofób kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiás, kation-cserén alapuló kromatográfiás, és festéses - úgynevezett „dye-ligand” - kromatográfiás (dye-ligand chromatographíe), eljárásokból, és gélszűrésből áll.
A találmány szerinti, Actinoplanes utahensis által termelt deacilázra az alábbiakban kényelmi szempontokból mint ECB-deacilázra hivatkozunk. A gyakorlatilag sejtasszociált enzim tisztított formája az alábbi fizikai, katalitikus, és kinetikus tulajdonságokkal rendelkezik.
Az ECB-deaciláz 81 KD-os heterodimer molekula, mely egy 63 KD alegységből, és egy 18 KD alegységből áll. A nagyobb, és a kisebb alegységek amino-terminális szekvenciája az alábbi:
Ser-Asn-Ala-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ala-Gln-Ala-ThrV al-Asn-Gly-Ser-Gly-Met-V al-Leu-Ala-Asn-ProSis-Phe-Pro-(Trp)-Gln---Ala-Glu-(Arg)-Phe-Tyr
His-Asp-Gly-Gly-Tyr-Ala-Ala-Leu-Ile-Arg-Arg-AlaSer-Tyr-Gly-Val-(Pro)-His-Ile-Thr-Ala-Asp-Asp-Phe.
A fenti szekvenciákban a zárójelben levő aminosav gyökök a nem végleges, míg a „---” megjelölések a még nem azonosított gyököket jelölik.
A megtisztított enzim aminosav összetételét az 1. táblázat tartalmazza. Az összetételt Dotzlaf, J. E. és Yeh, W. K. [J. Bacteriol., 169, 1611-1618. (1987)] eljárásával határoztuk meg.
1. táblázat
Az Actinoplanes utahensis által termelt deaciláz aminosav összetétele
Aminosav A gyökök száma per 81.000 dalton
AsfH-Asn 74
Thr 51’
Ser 83’
Aminosav A gyökök száma per 81.000 dalton
Glu+Gln 45
Pro 42
Gly 85
Alá 79
Cys 10b
Val 48
Met 5
Ile 25
Leu 53
Tyr 20
Phe 24
HU 215 232 Β
1. táblázat (folytatás)
Aminosav A gyökök száma per 81.000 dalton
His 21
Lys 11
Arg 62
Trp 19c
3 A hidrolízis kezdeti időpontjára extrapolálva.
b Epesawal meghatározva.
c Tioglikolsav jelenlétében végbemenő hidrolízis során meghatározva.
Az ECB-deaciláz molekulatömege 46.000-nek bizonyult, a meghatározást gélszűréssel végeztük, Ultrogel AcA 44 alkalmazásával. Az említett alegységek molekulatömegét SDS-PAGE alkalmazásával határoztuk meg. A molekulatömeg gélszűréssel meghatározott értéke szignifikánsan alábecsült érték, ez a megállapítás az enzimnek a gélelúció során mutatott abnormális viselkedésének tulajdonítható. Az enzimnek a gélelúció során mutatott abnormális viselkedése, ami általában a makromolekulák erős hidrofóbicitásának tulajdonítható, jellemző a membránhoz kapcsolódó fehérjékre.
A ECB-deaciláz egyszerű enzim (bár két alegységből áll), aktivitásának kifejtéséhez nem igényel exogén foszfolipideket, kofaktorokat, fémionokat vagy redukálószereket. Továbbá az általánosan ismert kofaktorok, fémionok vagy redukálószerek nem stimulálják a deaciláz enzim működését. Meglepő módon az N-etilmaleimid (NEM) 6-7-szeresére fokozza az ECB ECBnukleusszá, és a tisztított deacilázzá történő lebontásának konverziós rátáját.
Fontos tulajdonsága a tisztított deaciláznak, hogy sókoncentráció jelenlétében aktivitása fokozódik. Számos, általánosan ismert, kétértékű fémsó jelenlétében fokozódik aktivitása az eredeti érték 2-3-szorosára. Ilyen stimuláló hatású só például a nátrium-klorid, a kálium-klorid, a magnézium-klorid, a kalcium-klorid, és a nátrium-, illetve a kálium-nitrát. Ezek közül előnyös a kálium-klorid alkalmazása. A sókoncentráció 0,1 és 3,0 mólnyi mennyiség között tűnik a leginkább előnyösnek. Alacsonyabb sókoncentrációk mellett fokozottabb aktivitás figyelhető meg.
A natív-PAGE eljárás során pH = 7-9 között nem tapasztalható a deaciláz feloldódása, eszerint az enzim izoelektromos pontja 9 felett van. A natív-PAGE eljárást Backshear, P., J. módszere szerint hajtottuk végre, (1984) Methods Enzymol. 104,237-255.
A kinetikai és katalitikus tulajdonságok tanulmányozása során szubsztrátként echinocandin B-t (ECB) alkalmaztunk. Az ECB vizes közegben alapjában véve oldhatatlan. Számos vízzel elegyedő oldószert vizsgáltunk meg abból a célból, hogy az ECB oldhatóságát vizes elegyben fokozzuk, ezek közül az alacsony koncentrációban alkalmazott dimetil-szulfoxid (DMSO) 15%-nyi, illetve még ennél is kisebb mennyiségben alkalmazva bizonyult a leginkább megfelelőnek a deaciláz által katalizált reakció, majd az azt követő, HPLC-vel végzett enzimaktivitás-vizsgálat céljára.
Az enzim aktivitása pH = 6,0 mellett, 60 °C-on, 0,05 M KH2PO4 jelenlétében optimális. Úgy találtuk, hogy az enzim aktivitása legalább kétszeresére fokozódik, ha a reakciót (az ECB ECB-nukleusszá alakítása) az enzimmel iniciáljuk a szubsztrát helyett.
A deaciláz echinocandin B-vel mutatott reakciójában Km értéke, amelyet Lineweaver-Burk eljárásával határoztunk meg, 50 μΜ volt.
Az echinocandin B-vel mutatott reakcióban Vmax értéke 10-11 pmol a peptidre (ECB-nukleusz) vonatkoztatva, amely percenként képződött mg proteinenként (pmol képződött protein/min/mg protein).
A reakció sztöchiometriai vizsgálata szerint a keletkező ECB-nukleusz mennyiségének, és az ECB mennyiség fogyásának aránya 52,4%. Az átalakulási arány alacsony értéke mellékreakciók előfordulásának, illetve némi degradációnak tulajdonítható.
Amint ezt már feljebb is említettük, az Actinoplanes utahensis által termelt deaciláz sejt-asszociált. így például az A. utahensis általános, 90 órás, húsleves táptalajon fenntartott tenyészetében, melyben az ECB-deaciláz összaktivitása magas, a deaciláz aktivitásnak több mint 90%-a sejt-asszociált. A sejtek 0,01 M KH2PO4-vel történő, 1 napig tartó kezelés hatására (pH = 6,0) a sejtasszociált deaciláz aktivitásnak 5% alatti mennyiségét bocsátották ki. Az alkalmazott puffer ionerősségének fokozása csak jelentéktelen mértékben befolyásolta a vízoldható deaciláz kihozatalát. Ugyanakkor sók, például kálium-, vagy nátrium-klorid, kálium-, vagy nátrium-nitrát és magnézium-, vagy kalcium-sók hatására a vízoldható deaciláz kihozatalát magasabbnak találtuk (60-80%). Az említett sókkal való kezelés hatását a 2. táblázatban foglaltuk össze.
2. táblázat
Az Actinoplanes utahensis által termelt ECB-deaciláz oldhatósága
Sejt kezelése3 Aktivitás megoszlása (%) Fajlagos aktivitás (U/mg protein)
KC1/KH2PO4 és szonifikálás felülúszó 80 0,1
pellet frakció 20 -
KC1/KH2PO4 önmagában felülúszó 60-80 0,2-0,4
pellet frakció 20 -
KH2PO4 és szonifikálás felülúszó 80 0,1
pellet frakció 20
KH2PO4 és szonifikálás felülúszó 0
pellet frakció 100 -
HU 215 232 Β
Az A. utahensis sejteket 0,8 M KCl/0,05 M KH2PO4 elegyében, vagy csak 0,05 M KH2PO4 oldatban (pH = 6,0) felszuszpendáltuk, a jelzett esetekben egy percig folyamatosan szonifikáltuk, majd 48 000 g fordulatszámmal egy órán keresztül centrifugáltuk.
Az ECB-deacilázt aerob, süllyesztett fermentációs rendszerben termelte az Actinoplanes utahensis. A fermentációs eljárás és az alkalmazott fermentációs körülmények jól ismertek, Boeck, L. D., Fukuda, D. S., Abbott, B. J. és Debono, M., 1989. J. Antibiot. (Tokyo), 42, 382-388. A deaciláz termelése a tenyészet inokulálása után 90 órával vált maximálissá. Amint fent már említettük, és alább, az 1. példában ismertetjük, a nyers enzimet a teljes sejtek sókezelésével szolubilizáljuk, előnyösen kálium-klorid alkalmazásával.
A szolubilizált nyers enzimet a találmány szerinti eljárással - mely hidrofób kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiás, kation-cserélő kromatográfiás, és gélszűréses lépésekből áll - szinte a teljes homogenitás eléréséig tisztítjuk. Amint ezt már fentebb is említettük, az ECB-deaciláz a sejtekhez lazán kapcsolódó proteinként viselkedik, és szolubilizálódik az A. utahensis teljes sejtjeinek szervetlen sóval történő kezelése során. Előnyös a kálium-klorid alkalmazása. Az oldott enzim oldatát célszerű leszűrni, majd a szűrletet ultraszűréssel betöményíteni, ezáltal a következő lépésekhez jóval töményebb deaciláz-oldatot kapunk.
Az eljárás első lépésében a deacilázt termelő sejtek sókezelésével szolubilizált, majd elválasztott tömény sejtextraktumot egy órán keresztül melegítjük 60 °Con, majd még melegen 14%-os ammónium-szulfáttal, és 1,2 M-os kálium-kloriddal kezeljük. A hőkezelés hatására a 60 °C-on nem stabilis fehérjék kicsapódnak. Az ECB-deaciláz 60 °C-on stabilis, így az oldatban marad.
Ezután körülbelül 25 °C-on hidrofób kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiás eljárást alkalmazunk, hidrofób kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiás célra megfelelő anyagon, amilyen a lipiddel szubsztituált agaróz, például az általánosan alkalmazható Octyl Sepharose (Pharmacia). Az oszlopot pH = 6 eléréséig 0,05 M kálium-dihidrogén-foszfáttal vagy egyéb alkalmas pufferrel, 1,2 M kálium-kloriddal, és 14% ammónium-szulfáttal ekvilibráljuk. Az oszlopot célszerű ugyanezzel a pufferrel mosni, és egyidejűleg lineáris gradienssel - KC1 (1,2-0,1 M), és (NH4)2SO4 (14-0%), 0,05 M KH2PO4 oldatban, pH = 6,0 - eluálni a megkötött fehérjéket. Az ECB-deacilázt, mint egyedül álló, aszimmetrikus csúcsot eluáljuk.
A csúcsok alapján a 95% összes deacilázt tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd ammónium-szulfáttal frakcionáljuk. A 10-36% (NH4)2SO4-ot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és 0,8 M KCl-t tartalmazó pufferben, pH = 6,0, gélszűrjük. Az alkalmazott gél típusa változhat, célunknak megfelelő gél például a Sephacryl S-200 HR. Az enzim eluálásakor egy fő, és egy kisebb aktivitású csúcsot kapunk. A fő csúcsból a deaciláz-aktivitás 90%át tartalmazó csúcsfrakciókat egyesítjük, és a pH-t 0,05 M KC1 segítségével 5,6 értékre állítjuk be. Az egyesített frakciókat kationcserélő kromatográfiának vetjük alá, gyantának általánosan alkalmazott Trisacryl típusokat használhatunk, ilyen például a Trisacryl-CM (IBF Biotechnics). Az oszlopot 0,05 M KH2PO4 oldattal ekvilibráljuk, pH = 5,6, és 0,05 M KCl-el. Az oszlopot ugyanezzel a pufferrel mossuk, és a megkötött fehéijéket ugyanezzel a pufferrel, lineáris KC1 (1,2-0,1 M) gradienssel eluáljuk. A deaciláz enzimet két aktivitáscsúcs formájában eluáljuk.
A deaciláz-aktivitással rendelkező csúcsokat egyesítjük, 0,05 M KC1 oldattal beállítjuk, és festett, úgynevezett „dye-ligand” gélre, például Red-Sepharose (Pharmacia, Inc.), vagy Dyematrex Blue A (Amicon) gélre visszük. A gélt felhasználás előtt 0,05 M KH2PO4 oldattal, pH = 6,0, és 0,05 M KCl-el ekvilibráljuk. A megkötött fehéijéket a Red-Sepharose gélnél használt puffer alkalmazásával lépcsős KC1 gradienssel (0,05-2-3,3 M), vagy az Dyematrex Blue A gélnél használt puffer alkalmazásával lineáris KC1 gradienssel (0,05-2,5 M) megfelelően eluálhatjuk. A festett ligand gélen végzett kromatográfiás eljárás eredményeként egy széles, asszimmetrikus aktivitáscsúcsot kapunk.
A festett ligand gélről a 80% összes deacilázt tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd gélszűijük, az alkalmazott gél Ultrogel AcA 44 lehet (IBF Biotechnics), melyet előzőleg 0,05 M KH2PO4 oldattal, pH = 6,0, és 0,2 M KCl-el ekvilibráltunk. Az enzimet egyedül álló aktivitáscsúcs formájában eluáljuk, és az összes deacilázt tartalmazó csúcsfrakciót egyesítjük.
Az egyesített frakciók pH-ját 0,04 M KC1 oldattal 7,0 értékre állítjuk be, majd az anyagot ismételten kationcserélő kromatográfiának vetjük alá, negatív töltésű gyantán, ilyen például a Trisacryl-CM. A gyantát a felhasználás előtt 0,05 M KH2PO4 oldattal, pH = 7,0, és 0,04 M KCl-el ekvilibráljuk, és a megkötött fehéijéket ugyanezzel a pufferrel lépcsős KC1 gradiensben (0,04—0,5-2 M) eluáljuk. Az eljárás eredményeként egy széles aktivitáscsúcsot és egy hegyes, kisebb aktivitáscsúcsot kapunk. A megtisztított enzim két aktivitáscsúcsából nyert frakciókat a további felhasználásig -70 °Con tárolhatjuk.
A fent ismertetett, az ECB-deaciláz megtisztítására irányuló nyolclépéses eljárás során az enzimnek két nagyság szerinti, és két töltés szerinti formáját figyelhetjük meg. Az utolsó kationcserélő kromatográfiás lépés során kapott nagyobb csúcsot SDS-PAGE eljárással analizáltuk, mellyel két lassan együtthaladó sávot, és két gyorsan együtthaladó sávot kaptunk. A kationcserélő kromatográfiás lépés során kapott kisebb csúcs elemzésekor egy magányos, lassan haladó, és két gyorsan együtthaladó sávot kaptunk. A második lassan mozgó sáv hiánya azt sugallja, hogy ez a fehérje valószínűleg az első lassan mozgó sáv fehérjéjének degradációs terméke.
A találmány szerinti tisztítási eljárás eredményeként kapott tisztított ECB-deacilázt a lipo-ciklopeptidek deacilezésénél alkalmazzuk, melynek során ezek ciklopeptid nukleoproteidjét kapjuk meg. Az enzim elsősorban az echinocandin B, és az aculeacin ciklo-hexapeptideket deacilezi. A tisztított enzim hasítja még az A21978 ciklopeptid antibiotikus faktor - például a Daptomycin - zsírsav oldalláncait.
HU 215 232 Β
A találmány szerinti eljárásban az A vagy B általános képletű ciklopeptideket, ahol az A általános képletben R lineoil-, miristoil- vagy palmitoil-csoport, és a B általános képletben R’ dékánod-, 8-metil-dekanoil-, 10metil-undekanoil-, vagy 10-metil-dodekanoil-csoport, 25-75 °C közötti hőmérsékleten, vizes közegben, pH = 5-7, ECB-deacilázzal elegyítjük, így az A vagy B általános képletű vegyületet kapjuk, ahol R és R’ hidrogénatom.
Az eljárás kivitelezése előnyös esetben 25-75 °C közötti hőmérsékleten történik. A közeg pH-ját megfelelő pufferrel tartjuk fenn. Egyes, vizes közegben oldódó sók - mint az alkáli fémek kloridjai, például a KC1, vagy NaCl, vagy az alkáli fémek nitrátjai, például a KNO3 hatása előnyösnek tűnik az enzim aktivitására. Előnyös a KC1 alkalmazása, 0,05-3,0 M közötti mennyiségben.
Abban az esetben, amikor a szubsztrát a vízben nehezen oldódik, vízzel elegyedő oldószert adhatunk a közeghez. így például az echinocandin B vízzel nehezen elegyedik. Amennyiben dimetil-szulfoxidot (DMSO) adunk a reakcióelegyhez, az oldhatóság javul. A DMSO összefér a deacilázzal. Amint már fent említettük, 5%—15 tf.% DMSO-t adhatunk a rendszerhez az ECB és az aculeacin esetében.
Az eljárás kivitelezése során előnyös esetben pufferolt, vizes közegben állítjuk elő a szubsztrát oldatot, majd az elegyet a reakció hőfokára melegítjük, és hozzá adjuk az enzimet. Az enzim és a szubsztrát megfelelő kontaktusának kialakítása érdekében a reakcióelegyet keverjük és rázzuk. A reakció folyamán az elegyet kis aliquotok mérésével ellenőrizhetjük, az alábbiakban bemutatásra kerülő mérési eljárással. Egy másik megoldás szerint a pufferolt enzim oldathoz adjuk a szubsztrát oldatot. De általában jobb eredményt kaptunk, ha az enzimet adtuk a szubsztráthoz.
Amennyiben, amint azt a reakcióelegy ellenőrzése során megállapíthatjuk, a reakció lefolyása túlságosan lassú, vagy a reakció idő előtt befejeződik, a deacilezést friss enzim adagolásával tehetjük teljessé.
Az eljárás során immobilizált enzim alkalmazására is lehetőségünk van. Az enzimet ismert semleges támasztó gyantán kötjük meg, és ezt töltjük az oszlopba. Az oszlopot pufferral mossuk. A reakció teljes lejátszódásához szükséges lehet az anyag recirkuláltatása.
A találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezése során az echinocandin B (A általános képlet, R = linoleoil-csoport) echinocandin B nukleoproteiddé (A általános képlet, R = hidrogénatom) történő deacilezése megy végbe. A találmány szerinti eljárás másik előnyös kivitelezése során az aculeacinnak (A általános képlet, R = palmitoilcsoport) ugyanezzé a nukleoproteiddé történő deacilezése megy végbe.
A szubsztrát-specifítási vizsgálatok - melyeket a találmány szerinti tisztított enzimmel végeztünk el széleskörű specifitást mutattak az A általános képletű echinocandin B-vel, és a B általános képletű A21978 antibiotikummal szemben. Az A21978 szubsztrátjai jól ismert metabolitok, melyeket például a 4.537.717 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet. Úgy találtuk, hogy a deaciláz szubsztrátjai az ECB nukleoproteid bizonyos származékai, melyeket a nukleoproteid acilezésével állíthatunk elő. Példák az ilyen acil-származékokra az A általános képletű vegyület, ahol R 3-fenil-propionil-csoport, a para helyzetben C7H15O-csoporttal, (30%) vagy, C5H11O-csoporttal, (12%) helyettesítve; fenil-acetil-csoport, a para helyzetben C8H7O-csoporttal, (30%), vagy C11H23OC(O)NH-csoporttal (5%) helyettesítve; benzoilcsoport, a para helyzetben C11H23OC(0)NH-csoporttal helyettesítve; vagy cinnamoil-csoport, a para helyzetben C11H23OC(O)NH-csoporttal (15%) helyettesítve A zárójelekben megadott számok a deaciláz aktivitásnak magára az ECB-re vonatkozó százalékos arányát mutatják.
Az alábbi példák a találmány bemutatására szolgálnak, de nem kívánják korlátozni annak alkalmazását.
1. példa
Az ECB-deaciláz előállítása és tisztítása
A) Az Actinoplanes utahensis fermentációja
Az Actinoplanes utahensis NRRL 12 052 150 literes fermentorban szaporodott, a fermentációs körülményeket leírták: Boeck, L. D., Fukuda, D. S., Abbott, B. J., és Debono, M. 1989. J. Antibiot. (Tokyo), 42, 382-388. A magas echinocandin B deaciláz aktivitással rendelkező sejteket (az inokulálás után 90 órával) centrifúgálással összegyűjtöttük; 0,05 M KH2PO4 segítségével, pH = 6,0, átmostuk, majd a kapott anyagot használtuk az enzim izolálás és tisztítás során.
B) Az enzim szolubilizálása és tisztítása
Az alábbi izolálási és tisztítási eljárásokat amennyiben másként nem jelöltük - megközelítőleg 0 °C-4 °C közötti hőmérsékleten végeztük.
A vizsgálatok szerint a 100 liter fermentlében 90 órás korban gyakorlatilag az összes deaciláz aktivitás sejt-asszociált állapotban volt. A vizsgálat során alkalmazott eljárásokat az alábbiakban ismertetjük.
Friss sejteket (nedves tömeg 7,9 kg) 0,05 M KH2PO4-ban, pH = 6,0, és 0,8 M KCl-ban 57 liter össztérfogatra reszuszpendáltattuk, és a szuszpenziót egy napig folyamatosan kevertük. A sejt-asszociált deaciláz legnagyobb része, az alkalmazott sókezeléstől függő mértékben, oldhatóvá vált.
Az oldott deacilázt Whatmann No. 1 szűrőpapíron átszűrtük, és a szűrletet Amicon YM 30 spirál ultraszűrő töltet segítségével 3,3 literre koncentráltuk. A koncentrált extraktumot egy órán keresztül 60 °C-on melegítettük.
A hőkezelt enzimet 14%-os (NH4)2SO4-el, és 1,2 Μοβ KCl-al kezeltük, majd Octyl-Sepharose oszlopra (5*36 cm) vittük fel, amelyet előzőleg 0,05 M KH2PO4al, pH = 6,0, 1,2 M KCl-al, és 14%-os (NH4)2SO4-al ekvilibráltunk. Az oszlopot ugyanennek a puffemek kétszeres töltettérfogatnyi mennyiségével átmostuk, és a megkötött fehérjéket egyidejű KC1 (1,2-0,1 M) és (NH4)2SO4 (14—0%) 0,05 M KH2PO4-al készült oldatával, pH = 6,0, ekvilibráltuk. Az ECB-deacilázt mint egyedülálló, aszimmetrikus csúcsot eluáltuk.
A 95% összaktivitást tartalmazó csúcsfrakciókat egyesítettük, és (NH4)2SO4-al ffakcionáltuk. A 10-36% (NH4)2SO4 frakciókat Sephacryl S-200 HR oszlopra
HU 215 232 Β (5x69 cm) vittük fel, amelyet előzőleg 0,05 M KH2PO4-al, pH = 6,0, és 0,8 M KCl-al (A puffer) ekvilibráltunk. A deacilázt mint egy fő, és egy kisebb aktivitáscsúcsot eluáltuk. A fő csúcs 90% enzimaktivitást tartalmazó frakcióit egyesítettük a pH-t 0,05 M KC1 segítségével 5,6-ra állítottuk, és az anyagot Trisacryl-CM oszlopra (2,5x33 cm) vittük fel, amelyet előzőleg 0,05 M KH2PO4-al, pH = 5,6, és 0,05 M KClal (B puffer) ekvilibráltunk. Az oszlopot a B puffer kétszeres töltettérfogatnyi mennyiségével átmostuk, és a megkötött fehéijéket KC1 B pufferrel készült oldatával, lineáris gradiensben (0,05-0,5 M) ekvilibráltuk. A deacilázt két aktivitáscsúcs formájában eluáltuk.
A két deciláz-aktivitást tartalmazó csúcs-frakciókat külön-külön egyesítettük. Az így kapott két frakciót 0,05 M KC1 koncentrációra állítottuk be, és az egyiket Red-Sepharose oszlopra (3,2x15,5 cm), a másikat Dyematrex Blue A oszlopra (2,2x22 cm) vittük fel. Előzőleg mindkét oszlopot 0,05 M KH2PO4-al, pH = 6,0, és 0,05 M KCl-al (C puffer) ekvilibráltuk. Miután mindkét oszlopot kétszeres töltettérfogatnyi C pufferrel mostuk, a megkötött fehérjéket a Red-Sepharose oszlopról a C pufferrel készült lépcsős KC1 gradienssel (0,05-2-3,3 M), míg a Blue A oszlopról a C pufferrel készült lineáris KC1 gradienssel (0,05-2,5 M) eluáltuk. A festett, úgynevezett „dye-ligand” kromatográfiás eljárások eredményeként mindkét esetben egy széles, aszimmetrikus aktivitáscsúcsot figyelhetünk meg.
A 80% összaktivitást tartalmazó csúcsfrakciókat, melyeket a Red-Sepharose oszlopon kaptunk, egyesítettük, és Ultrogel-Ac 44 oszlopra vittük (1x118 cm), melyet előzőleg 0,05 M KH2PO4-al, pH = 6,0, és 0,2 M KCl-al (D puffer) ekvilibráltunk. A deacilázt mint egyedülálló csúcsot eluáltuk.
Az összes deacilázt tartalmazó csúcsfrakciót egyesítettük, a pH-t 0,04 M KCl-al 7,0-ra állítottuk, és az anyagot Trisacryl CM oszlopra vittük fel (1 x34 cm), melyet előzőleg 0,05 M KH2PO4-al, pH = 7,0, és 0,04 M KCl-al (E puffer) ekvilibráltunk. Miután mindkét oszlopot kétszeres töltettérfogatnyi E pufferrel mostuk, a megkötött fehérjéket az E pufferrel készült lépcsős KC1 gradienssel (0,04-0,5-2 M) eluáltuk. Az eljárás eredményeképpen egy széles fő, és egy hegyes, kisebb aktivitáscsúcsot figyelhettünk meg. A két aktivitáscsúcsból származó frakciókat a szükséges időpontig -70 °C-on tároltuk.
A 3. táblázat az ECB-deaciláz izolálásának, és tisztításának előbb részletezett lépéseit és az eredményeket foglalja össze.
3. táblázat
Az ECB-deaciláz tisztítása
lépés protein (mg) aktivitás (U) faji. aktivitás (U/mg) kinyerés (%)
vízoldható extrakt 12,546 4,631 0,37 100
hőkezelt extrakt (60 °C, 1 óra) 7,325 3,606 0,49 78
lépés protein (mg) aktivitás (U) faji. aktivitás (U/mg) kinyerés (%)
Octyl-Sepharose eluálás 1,357 2,038 1,5 44
10-36% (NH4)2SO4 tart. frakció 1,077 1,513 1,41 33
Sephacryl S-200 HR eluátum 0,857 1,470 1,72 32
Trisacryl-CM eluátum pH = 5,6 (A) 0,078 0,293 3,76 6,3
Trisacryl-CM eluátum pH = 5,6 (B) 0,175 0,595 3,42 12,8
Red-Sepharose eluátum (Al) 0,0101 0,0584 5,78 1,3
Blue A eluátum (Bl) 0,113 0,368 3,53 7,9
Ultrogel AcA 44 eluátum (Ala) 0,008 1 0,0602 7,42 1,3
Trisacryl-CM eluátum pH = 7,0(Alal) 0,0055 0,0562 10,22 1,2
Trisacryl-CM eluátum pH = 7,0 (Ala2) 0,0012 0,0135 11,25 0,3
Amint már fent említettük, a Trisacryl-CM-en végzett kromatografálás után két aktivitáscsúcsot kaptunk. Mint bemutattuk, a kromatográfiás lépésből származó két csúcs (A és B) frakcióit összegyűjtöttük, és külön-külön elemeztük. Az egyesített A fiakciót Red-Sepharose dyeligand kromatográfiás eljárással kezeltük (Al), míg a második aktivitáscsúcsból származó B fiakciót Dyematrex Blue A dye-ligand kromatográfiás eljárással kezeltük (Bl). A dye-ligand kromatográfiás eljárások során az eluátumok fajlagos aktivitásának elemzése során megállapítottuk, hogy a Red-Sepharose-val való kezelés során a fajlagos aktivitás nőtt, míg a Blue A-val való kezelés során alig változott. Ennek megfelelően az adott esetben a Red-Sepharose oszlopot választjuk a további tisztítási lépésekhez - az Ultrogel szűréshez, és a Trisaciyl-CM alkalmazásával történő kationcserélő kromatográfiához. Amint az előző kationcserélő kromatográfiás lépésnél is tettük, ezúttal is külön-külön gyűjtöttük össze, és elemeztük a két aktivitáscsúcsot (enzim formák).
Az enzim aktivitásának mérése
A deaciláz aktivitásának meghatározásához, és méréséhez alkalmazott eljárás szubsztrátként echinocandin B-t használ. Az általánosan alkalmazott reakcióelegy 1 ml ECB-deaciláz mérése esetén 425 pmol ECB-t, és 0,000003-0,003 egység közötti mennyiségű enzimet tartalmaz, 0,05 M KH2PO4-t, pH = 6,0, 0,68 M KCl-t és 15% DMSO-t tartalmazó oldatban, mely utóbbi az ECB oldódására hat. Az enzimreakciót az enzim beadásával
HU 215 232 Β indíthatjuk el, 20 percig 60 °C-on folytatjuk, majd foszforsavat adva a reakcióelegyhez, leállítjuk a reakciót. A kicsapódott fehéijéket alacsony fordulatszámú centrifugával leválasztjuk az oldatból, és az ECB-nukleusz képződés felhasználásával, amit 225 nm-en HPLC alkalmazásával végzünk, meghatározzuk a deaciláz-aktívitást.
A HPLC az alábbiakból állt: IBM PS/2 Model 80 és Color Display (IBM, Armonk, Ν. Y.), egy Waters 715 Ultra WISP Sample Processor (Waters Associates, Mildford, MA.), és egy Beckman System Gold Programmable Solvent Modulé 126 és Scanning Detector Modulé 167 (Beckman, Fullerton, CA.).
Az ECB-nukleuszt Apex Octadecyl oszlopon (3 μ), (4,6*10 cm) (Jones Chromatography, Littleton, Co.) eluáltuk, 1 ml/min folyadékárammal, és mozgó fázissal, mely 3,9% CH3CN/0,l% trifluor-ecetsav elegyéből állt. A mérés során a nukleuszképződés az idő függvényében lineárisnak bizonyult. A párhuzamosan elvégzett HPLC elemzések között az eltérés 2-3% körül volt. Az enzimaktivitás egységét az alábbi módon definiáltuk: egy egység az az enzim mennyiség, amely az ECB-ből a fenti körülmények között percenként egy pmol ECBnukleuszt hoz létre.
A fajlagos aktivitást (3. táblázat), mint egység per mg proteint definiáltuk. A proteintartalmat Bradford eljárása szerint, szarvasmarha szérum albumin standard alkalmazásával határoztuk meg (Bradford, Μ. M., (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254).
2. példa
Az 1. példa szerint előállított enzimet alkalmaztuk az ECB peptid-molekula- és acil oldallánc-analógjainak enzimes deacilezésére. A reakciót az 1. példában, az enzim aktivitásának mérésénél megadott körülmények között végeztük. A deacilezés mértékét az előzőekben megadott HPLC-méréssel vizsgáltuk, mind a szubsztrát fogyása, mind a termékképződés szempontjából. A deacileződés mértékét a 4a táblázat mutatja. Látható, hogy az akuleacin, amely az ECB-től csak abban különbözik, hogy oldallánca linoleoil-csoport helyett palmitoilcsoport, hatékonyan hasítódott, míg például a cilofungin, az ECB ciklusos hexapeptidjének kémiailag újraacilezett terméke, nem változott. Ugyanakkor bizonyos mértékű deacileződést tapasztaltunk a cilofungin néhány oldallánc-analógja esetén.
Az A21978-C1, -C2 és -C3, melyek biológiai eredetűek, és a daptomicin, melyek az ECB oldallánc- és alapmolekula-analógjai. A fenti reakcióban a deaciláz e négy analóg hasadását katalizálta. Amennyiben az alkalmazott DMSO mennyiségét változtattuk, a deacilezés mértéke 1,4—3-szorosára nőtt, mely azt mutatja, hogy a DMSO az enzim hatását gátolta. Az eredmények a 4c táblázatban láthatók. A daptomicin másik négy, oldalláncban vagy magban kémiailag módosított származékánál deacilezés nem volt kimutatható. Ezenkívül nem mutattunk ki deacileződést penicillin N, penicillin G, penicillin V, ampicillin, dezacetoxicefalosporin C, dezacetil-cefalosporin C és cefalosporin C esetén.
A fenti reakciót különböző mennyiségű KCI jelenlétében végezve megállapítottuk, hogy annak jelenléte 0,3-1,0 M koncentrációintervallumban az enzimaktivitást mintegy 3-szorosára növelte. Ezt az 1. ábra szemlélteti.

Claims (10)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás echinocandin B deaciláz enzim tisztítására, mely 81 kilodaltonos heterodimer, az 1. táblázat szerinti összetétellel; fajlagos aktivitásának értéke 10 U/mg és 11,25 U/mg közötti; 63 kilodaltonos alegységének aminoterminális összetétele az alábbi:
    Ser-Asn—Ala-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ala-Gln—Alá—ThrVal-Asn-Gly-Ser-Gly-Met-Val-Leu-Ala-Asn-ProSis-Phe-Pro-(Trp)-Gln---Ala-Glu-(Arg)-Phe-Tyr, és 18 kilodaltonos alegységének amino-terminális 45 összetétele az alábbi:
    His-Asp-Gly-Gly-Tyr-Ala-Ala-Leu-Ile-Arg-Arg-AlaSer-Tyr-Gly-Val-(Pro)-His-Ile-Thr-Ala-Asp-Asp-Phe;
    az echinocandin B deacilezés során 0,05 M KH2PO4 pufferban, pH = 6,0 körül, 60 °C körüli hőmérsékleten optimális katalitikus aktivitású, azzal jellemezve, hogy
    1) echinocandin B deacilázt termelő sejteket sókezelésnek vetünk alá,
  2. 2) a nyers, szolubilizált echinocandin B deacilázt elválasztjuk,
  3. 3) a nyers deacilázt körülbelül 1 órán át 60 °C körüli hőmérsékleten, pH = 6,0 körüli értéken melegítjük,
  4. 4) a hőkezelt, pH = 6,0-ra beállított extraktumot hidrofób kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiás eljárásnak vetjük alá, 1,2 M KCI és 14% (NH4)2SO4 alkalmazásával,
    55
  5. 5) a 95%-nál több deaciláz-aktivitást tartalmazó eluátumot a 4) lépés során kapott anyagból (NH4)2SO4 alkalmazásával frakcionáljuk, és a 10% és 36% (NH4)2SO4 közötti frakciókat szeparáljuk,
  6. 6) az említett (NH4)2SO4 frakciót 0,8 M KCl-tartalmú
    60 pufferban, pH = 6,0, gélszűrésnek vetjük alá, és a
    HU 215 232 Β
    90% deaciláz-aktivitással rendelkező frakciókat egyesítjük,
  7. 7) az egyesített frakciókat 0,05 M KCl-tartalmú pufferban, pH = 5,6, kationcserélő kromatográfiának vetjük alá, majd a megkötött anyagot ugyanebben a pufferban lineáris KC1 gradienssel (0,05-0,5 M) eluáljuk,
  8. 8) a 7) lépés eredményeként kapott, deacilázt tartalmazó eluátum KC1 koncentrációját 0,05 M értékre állítjuk be, majd 0,05 M KH2PO4, pH = 6,0, és 0,05 M KC1 jelenlétében dye-ligand kromatográfiának vetjük alá, és a megkötött anyagot lineáris 0,05-2,5 M KC1 gradienssel (0,05-2,5 M) eluáljuk,
  9. 9) a 8) lépésből nyert, a deaciláz-aktivitás 80%-át tartalmazó egyesített frakciókat 0,05 M KH2PO4, pH = 6,0, és 0,2 M KC1 jelenlétében gélszűrésnek vetjük alá, és
  10. 10) az eluátum KC1 koncentrációját 0,04 M-ra állítjuk be pH = 7,0 értéken, majd 0,05 M KH2PO4, pH = 7,0, és 0,04 M KC1 jelenlétében kationcserélő kromatográfiának vetjük alá, és a tisztított deacilázt 0,04-0,5-2 M lépcsős KC1 gradienssel eluáljuk.
    2. Eljárás az A vagy B általános képletű ciklopeptid deacilezésére, azzal jellemezve, hogy az említett ciklopeptidet 25-75 °C közötti hőmérsékleten - kívánt esetben szervetlen sókat tartalmazó - vizes közegben, pH = 5,0-7,0 között, az 1. igénypont szerinti tisztított deacilázzal elegyítjük, ahol az A általános képletben R lineoil-, mirisztoil- vagy palmitoil-csoport, és a B általános képletben R’ dekanoil-, 8-metil-dekanoil-, 10-metil-undekanoil- vagy 10-metil-dodekanoil-csoport, és a keletkező A vagy B általános képletű vegyületet, ahol R és R’ hidrogénatom, a reakcióelegyből kinyerjük.
    3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hőmérsékletet 55 °C és 65 °C közötti értéken tartjuk.
    4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes közegben alkálifém-kloridot vagy alkálifém-nitrátot oldunk.
    5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes közegben szervetlen sóként kálium-kloridot oldunk 0,1-3,0 M közötti koncentrációban.
    6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan A általános képletű vegyületből indulunk ki, ahol R linoleoil-csoport.
    7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan A általános képletű vegyületből indulunk ki, ahol R palmitoil-csoport.
    8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan B általános képletű vegyületből indulunk ki, ahol R’ dekanoil-csoport.
    9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5-15% közötti mennyiségű dimetil-szulfoxidot tartalmazó vizes közeget alkalmazunk.
HU911897A 1990-06-07 1991-06-06 Eljárás lipopeptid-deaciláz előállítására HU215232B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53439490A 1990-06-07 1990-06-07

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU911897D0 HU911897D0 (en) 1991-12-30
HUT61587A HUT61587A (en) 1993-01-28
HU215232B true HU215232B (hu) 1998-11-30

Family

ID=24129856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU911897A HU215232B (hu) 1990-06-07 1991-06-06 Eljárás lipopeptid-deaciláz előállítására

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5573936A (hu)
EP (1) EP0460882B1 (hu)
JP (1) JP2994486B2 (hu)
KR (1) KR0169994B1 (hu)
AT (1) ATE140728T1 (hu)
CA (1) CA2043762C (hu)
DE (1) DE69121018T2 (hu)
DK (1) DK0460882T3 (hu)
ES (1) ES2089133T3 (hu)
GR (1) GR3021292T3 (hu)
HU (1) HU215232B (hu)
IE (1) IE75885B1 (hu)
IL (1) IL98349A (hu)
TW (1) TW197471B (hu)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6743777B1 (en) 1992-03-19 2004-06-01 Eli Lilly And Company Cyclic peptide antifungal agents and process for preparation thereof
EP1854877B1 (en) 1996-03-08 2012-02-08 Astellas Pharma Inc. Process for the deacylation of cyclic lipopeptides
EP1666587A1 (en) * 1996-06-13 2006-06-07 Astellas Pharma Inc. Cyclic lipopeptide acylase
US6153410A (en) * 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US6361988B1 (en) 1997-03-25 2002-03-26 California Institute Of Technology ECB deacylase mutants
US5936074A (en) * 1997-04-17 1999-08-10 Eli Lilly And Company Teicoplanin deacylation process and product
US6323176B1 (en) 1998-02-25 2001-11-27 Eli Lilly And Company Cyclic peptide antifungal agents
WO2000034315A2 (en) 1998-12-09 2000-06-15 Eli Lilly And Company Purification of echinocandin cyclopeptide compounds
EP1155034B1 (en) 1999-03-03 2006-08-30 Eli Lilly And Company Formation and anion-exchange of inner crystalline echinocandin b ammonium salts
BR0008713A (pt) 1999-03-03 2001-12-26 Lilly Co Eli Processos para preparar formulações ecomposições farmacêuticas orais com ecb
ES2433678T3 (es) 1999-03-03 2013-12-12 Eli Lilly & Company Formulaciones farmacéuticas de equinocandina que contienen tensioactivos formadores de micelas
AU772633B2 (en) 1999-03-03 2004-05-06 Eli Lilly And Company Echinocandin/carbohydrate complexes
WO2001005815A1 (en) * 1999-07-15 2001-01-25 Eli Lilly And Company Process for deacylation of lipodepsipeptides
EP1246838A1 (en) * 1999-12-15 2002-10-09 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Lipopeptides as antibacterial agents
BR0017026A (pt) 1999-12-15 2003-01-07 Cubist Pharm Inc Lipeptìdeos como agentes antibacterianos
WO2001044271A2 (en) * 1999-12-15 2001-06-21 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Daptomycin analogs and their use as antibacterial agents
US6696412B1 (en) 2000-01-20 2004-02-24 Cubist Pharmaceuticals, Inc. High purity lipopeptides, Lipopeptide micelles and processes for preparing same
US20060014674A1 (en) * 2000-12-18 2006-01-19 Dennis Keith Methods for preparing purified lipopeptides
NZ531493A (en) * 2001-08-06 2006-03-31 Cubist Pharm Inc Novel depsipeptides and process for preparing same, useful in the treatment of bacterial infection
US6991800B2 (en) 2002-06-13 2006-01-31 Vicuron Pharmaceuticals Inc. Antifungal parenteral products
DE102004060750A1 (de) 2004-12-15 2006-07-13 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Deacylierung von Lipopeptiden
RS53152B (en) * 2008-12-22 2014-06-30 Cubist Pharmaceuticals Inc. NEW ANTIBACTERIAL AGENTS FOR TREATMENT OF Gram POSITIVE INFECTIONS
US9394340B2 (en) * 2009-03-24 2016-07-19 Cadila Healthcare Limited Purification process for lipopeptides
EP2897971B1 (en) 2012-09-24 2017-05-31 DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. Method for producing a cyclic peptide
KR101425108B1 (ko) * 2012-09-25 2014-07-31 동국제약 주식회사 탈아실화된 환상 리포펩티드의 제조방법
CN108410929B (zh) * 2018-05-30 2024-01-26 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 阿尼芬净前体的制备方法
CN109593809A (zh) * 2018-12-07 2019-04-09 成都雅途生物技术有限公司 一种固定化微生物酶转化棘白菌素b的方法
CN113215185B (zh) * 2021-04-22 2022-04-29 浙江工业大学 一种用于重组表达棘白菌素b脱酰基酶的重组基因序列

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1159450A (en) * 1979-12-13 1983-12-27 Manuel Debono Process for the preparation of derivatives of cyclic peptide nuclei

Also Published As

Publication number Publication date
IL98349A0 (en) 1992-07-15
HU911897D0 (en) 1991-12-30
CA2043762C (en) 2001-05-29
EP0460882B1 (en) 1996-07-24
JPH04228072A (ja) 1992-08-18
CA2043762A1 (en) 1991-12-08
KR920000919A (ko) 1992-01-29
ES2089133T3 (es) 1996-10-01
GR3021292T3 (en) 1997-01-31
US5573936A (en) 1996-11-12
EP0460882A2 (en) 1991-12-11
IL98349A (en) 1995-05-26
TW197471B (hu) 1993-01-01
DE69121018D1 (de) 1996-08-29
HUT61587A (en) 1993-01-28
DK0460882T3 (da) 1996-08-26
ATE140728T1 (de) 1996-08-15
JP2994486B2 (ja) 1999-12-27
EP0460882A3 (en) 1992-04-22
KR0169994B1 (ko) 1999-02-01
DE69121018T2 (de) 1996-12-19
IE75885B1 (en) 1997-09-24
IE911939A1 (en) 1991-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU215232B (hu) Eljárás lipopeptid-deaciláz előállítására
Umezawa et al. A bleomycin-inactivating enzyme in mouse liver
Nagamatsu et al. A toxic fragment from the entomocidal crystal protein of Bacillus thuringiensis
FI102843B (fi) Menetelmä oleellisesti puhdistettujen insuliinijohdannaisten valmistam iseksi
Suzuki et al. Isolation and structure of bacterial sex pheromone, cPD1
Liao Bovine pancreatic deoxyribonuclease D
Musliner et al. Activation of lipoprotein lipase by native and acylated peptides of apolipoprotein C-II
Huang et al. On the specificity of human gastricsin and pepsin
Jun et al. Extracellular calmodulin-binding proteins in plants: purification of a 21-kDa calmodulin-binding protein
Mori et al. Isolation and structure of the Streptococcus faecalis sex pheromone, cAM373
CA1338415C (en) C-terminal amidating enzyme composition, process for preparing, and use of the same
Shiozawa et al. Isolation and Characterization of the Polypeptide Components from Light‐Harvesting Pigment‐Protein Complex B800–850 of Rhodopseudomonas capsulata
Tadros et al. Orientation of the B800-850, B870, and reaction center polypeptides on the cytoplasmic and periplasmic surfaces of Rhodobacter capsulata membranes
AU618035B2 (en) A method for the selective cleavage of fusion proteins
JP2641742B2 (ja) 新規ペプチド及び抗菌剤
JP2641744B2 (ja) 新規ペプチド及び抗菌剤
JPH03255095A (ja) カゼインペプチド
JP3004788B2 (ja) アルギニンデイミナーゼ発現ベクター、形質転換微生物およびアルギニンデイミナーゼの製造法
DE69827486T2 (de) Aminopeptidase, welche von bacillus licheniformis abstammt und verfahren zur herstellung von proteinen des natürlichen typs
JPH0215192B2 (hu)
Kageyama et al. Monkey pepsinogens and pepsins: III. Carbohydrate moiety of Japanese monkey pepsinogens and the amino acid sequence around the site of its attachment to protein
JP2551399B2 (ja) Ｃ末端アミド化に関与する酵素並びにその製造方法及びその使用
Diedrich et al. Apparent extracellular glycoprotein turnover product from Candida albicans
Kempe et al. Enzymatic synthesis of dipeptide units of the d‐d‐configuration in aqueous media
KR0132003B1 (ko) 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee