JP2547965B2 - 新規ストレプトコッカス属菌株およびそれを用いるヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents
新規ストレプトコッカス属菌株およびそれを用いるヒアルロン酸の製造方法Info
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- JP2547965B2 JP2547965B2 JP6077048A JP7704894A JP2547965B2 JP 2547965 B2 JP2547965 B2 JP 2547965B2 JP 6077048 A JP6077048 A JP 6077048A JP 7704894 A JP7704894 A JP 7704894A JP 2547965 B2 JP2547965 B2 JP 2547965B2
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は高分子量ヒアルロン酸(H
yaluronic acid＝ＨＡ)の産生可能な新規ストレプトコ
ッカス属菌株、これを用いた高分子量のヒアルロン酸の
産生方法およびこのヒアルロン酸を産生する菌株培養の
ための倍地に関するものである。
yaluronic acid＝ＨＡ)の産生可能な新規ストレプトコ
ッカス属菌株、これを用いた高分子量のヒアルロン酸の
産生方法およびこのヒアルロン酸を産生する菌株培養の
ための倍地に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒア
ルロン酸は分子量５万〜１,３００万ダルトンの直鎖の
多糖類で、無色透明な高粘度の溶液となり、繰返し単位
のグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンを交互にＢ
−１,３とＢ−１,４で直鎖状に結合したものとされてい
る。ヒアルロン酸およびその塩は、例えば、眼科手術時
の硝子体代替物、点眼製剤および化粧品の保湿剤のよう
な多様な用途を有する。一般的に、ヒアルロン酸は動物
の組織または特定の微生物の培養液から抽出することに
よって製造される。例えば、動物の組織からヒアルロン
酸を抽出する方法がバラズ(Balaz)の米国特許第４,１４
１,９７３号に記載されている。
ルロン酸は分子量５万〜１,３００万ダルトンの直鎖の
多糖類で、無色透明な高粘度の溶液となり、繰返し単位
のグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンを交互にＢ
−１,３とＢ−１,４で直鎖状に結合したものとされてい
る。ヒアルロン酸およびその塩は、例えば、眼科手術時
の硝子体代替物、点眼製剤および化粧品の保湿剤のよう
な多様な用途を有する。一般的に、ヒアルロン酸は動物
の組織または特定の微生物の培養液から抽出することに
よって製造される。例えば、動物の組織からヒアルロン
酸を抽出する方法がバラズ(Balaz)の米国特許第４,１４
１,９７３号に記載されている。
【０００３】動物の組織から抽出によりヒアルロン酸を
産生する方法では、組織内のコンドロイチン硫酸とグリ
コサミノグリカンなどの生体高分子不純物を除去するた
めの複雑な精製工程が必要であり非経済的であるという
欠点があるので、大量生産には適さない。これに対し
て、微生物を用いるヒアルロン酸の産生方法は相対的に
生産費が低く、比較的簡単な精製工程により高分子量の
ヒアルロン酸が高収率で得られることが知られている
(バラズの米国特許第４,１４１,９７３号、アカサカ(Ak
asaka)の日本国特開昭５８−０５６６９２号、ニムロド
(Nimrod)の米国特許公開第８６−０００６６号参照)。
産生する方法では、組織内のコンドロイチン硫酸とグリ
コサミノグリカンなどの生体高分子不純物を除去するた
めの複雑な精製工程が必要であり非経済的であるという
欠点があるので、大量生産には適さない。これに対し
て、微生物を用いるヒアルロン酸の産生方法は相対的に
生産費が低く、比較的簡単な精製工程により高分子量の
ヒアルロン酸が高収率で得られることが知られている
(バラズの米国特許第４,１４１,９７３号、アカサカ(Ak
asaka)の日本国特開昭５８−０５６６９２号、ニムロド
(Nimrod)の米国特許公開第８６−０００６６号参照)。
【０００４】これまで、ヒアルロン酸の産生可能な微生
物としてストレプトコッカス属菌株が知られている。ヒ
アルロン酸の産生に使用されてきたストレプトコッカス
属の菌株にはストレプトコッカス・ピオゲネス(S.pyoge
nes)、ストレプトコッカス・フェカーリス(S.faecali
s)、ストレプトコッカス・ディスガラクチエ(S.dysgala
ctiae)、ストレプトコッカス・ズウエピデミカス(S.zoo
epidemicus)、ストレプトコッカス・エクイ(S.equi)、
ストレプトコッカス・エクイシミリス(S.equisimilis)
等があり、これらはバギス便覧(Bergey's Manual)によ
ればランスフィールド血清群ＡまたはＣ型に分類されて
おり、一般的に、β溶血作用を有する連鎖状球菌である
と報告されている。日本国特開昭５８−５６６９２およ
び昭６０−５００９９７号、大韓民国特許公告第９２−
９４９４号および大韓民国特許公開第８７−１１２５２
号などには、ストレプトコッカス属の菌株を用いるヒア
ルロン酸の産生方法が開示されている。
物としてストレプトコッカス属菌株が知られている。ヒ
アルロン酸の産生に使用されてきたストレプトコッカス
属の菌株にはストレプトコッカス・ピオゲネス(S.pyoge
nes)、ストレプトコッカス・フェカーリス(S.faecali
s)、ストレプトコッカス・ディスガラクチエ(S.dysgala
ctiae)、ストレプトコッカス・ズウエピデミカス(S.zoo
epidemicus)、ストレプトコッカス・エクイ(S.equi)、
ストレプトコッカス・エクイシミリス(S.equisimilis)
等があり、これらはバギス便覧(Bergey's Manual)によ
ればランスフィールド血清群ＡまたはＣ型に分類されて
おり、一般的に、β溶血作用を有する連鎖状球菌である
と報告されている。日本国特開昭５８−５６６９２およ
び昭６０−５００９９７号、大韓民国特許公告第９２−
９４９４号および大韓民国特許公開第８７−１１２５２
号などには、ストレプトコッカス属の菌株を用いるヒア
ルロン酸の産生方法が開示されている。
【０００５】また、例えば、リン酸塩の濃度調節による
方法(大韓民国特許公告第９０−５７７４号)、ピルビン
酸塩、グルコサミンなどを用いる方法(日本国特開昭６
２−２５７９０１号)、少なくとも１種以上のヒドロキ
シラジカルを有する芳香族化合物を用いる方法(日本国
特開平１−２２５４９１号)、およびアルギニンおよび
グルタミン酸を使用する方法(日本国特開昭６３−１４
１５９４,および昭６２−２８９１９８)などのようにス
トレプトコッカス属菌株によるヒアルロン酸の産生を増
大させる方法も報告されている。
方法(大韓民国特許公告第９０−５７７４号)、ピルビン
酸塩、グルコサミンなどを用いる方法(日本国特開昭６
２−２５７９０１号)、少なくとも１種以上のヒドロキ
シラジカルを有する芳香族化合物を用いる方法(日本国
特開平１−２２５４９１号)、およびアルギニンおよび
グルタミン酸を使用する方法(日本国特開昭６３−１４
１５９４,および昭６２−２８９１９８)などのようにス
トレプトコッカス属菌株によるヒアルロン酸の産生を増
大させる方法も報告されている。
【０００６】しかしながら、前記の先行技術では、平均
分子量が３００〜２,５００キロダルトンの比較的低分
子量のヒアルロン酸が産生され、その収率も低いという
欠点がある。したがって、そのようにして得られた低分
子量のヒアルロン酸は化粧品用としては保湿作用が不充
分であるだけでなく眼科手術時の補助剤または関節炎治
療剤として使用するには品質が劣る。
分子量が３００〜２,５００キロダルトンの比較的低分
子量のヒアルロン酸が産生され、その収率も低いという
欠点がある。したがって、そのようにして得られた低分
子量のヒアルロン酸は化粧品用としては保湿作用が不充
分であるだけでなく眼科手術時の補助剤または関節炎治
療剤として使用するには品質が劣る。
【０００７】本発明者らはこのような課題を解決するた
めに研究を重ねた結果、ストレプトコッカス・ズウエピ
デミカスから得られた突然変異体が高分子量のヒアルロ
ン酸を大量生産し得ることを見出した。さらに、前記菌
株を含むストレプトコッカス属の菌株を培養してヒアル
ロン酸を産生する際、培地にウリジンを添加することに
よって高分子量のヒアルロン酸を大量生産できることも
見出した。
めに研究を重ねた結果、ストレプトコッカス・ズウエピ
デミカスから得られた突然変異体が高分子量のヒアルロ
ン酸を大量生産し得ることを見出した。さらに、前記菌
株を含むストレプトコッカス属の菌株を培養してヒアル
ロン酸を産生する際、培地にウリジンを添加することに
よって高分子量のヒアルロン酸を大量生産できることも
見出した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、高分子
量のヒアルロン酸を産生を可能とし、ヒアルロニダーゼ
活性および溶血性の全くないストレプトコッカス属の突
然変異菌株を提供することである。
量のヒアルロン酸を産生を可能とし、ヒアルロニダーゼ
活性および溶血性の全くないストレプトコッカス属の突
然変異菌株を提供することである。
【０００９】本発明の他の目的は、前記菌株を培養して
高分子量のヒアルロン酸を産生する方法を提供すること
である。
高分子量のヒアルロン酸を産生する方法を提供すること
である。
【００１０】本発明のもう一つの目的は、ヒアルロン酸
の分子量を増大させ、生産性を向上させるための前記菌
株の培養に適切な培地を提供することである。
の分子量を増大させ、生産性を向上させるための前記菌
株の培養に適切な培地を提供することである。
【００１１】本発明を詳細に説明すれば、次の通りであ
る。本発明は溶血性およびヒアルロニダーゼ活性を欠く
高分子量ヒアルロン酸高産生能を有するストレプトコッ
カス・ズウエピデミカス変異株に関するものであり、よ
り詳しくは、ストレプトコッカス・ズウエピデミカス(S
treptococcus zooepidemicus；ＡＴＣＣ ３５２４６)
にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
を加えて突然変異を誘発させる工程を３回以上繰り返
し、ついで溶血性およびヒアルロニダーゼ活性を欠く菌
株をスクリーニングすることを含む方法によって得られ
る、高分子量ヒアルロン酸高産生能を有するストレプト
コッカス・ズウエピデミカス変異株に関する。
る。本発明は溶血性およびヒアルロニダーゼ活性を欠く
高分子量ヒアルロン酸高産生能を有するストレプトコッ
カス・ズウエピデミカス変異株に関するものであり、よ
り詳しくは、ストレプトコッカス・ズウエピデミカス(S
treptococcus zooepidemicus；ＡＴＣＣ ３５２４６)
にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
を加えて突然変異を誘発させる工程を３回以上繰り返
し、ついで溶血性およびヒアルロニダーゼ活性を欠く菌
株をスクリーニングすることを含む方法によって得られ
る、高分子量ヒアルロン酸高産生能を有するストレプト
コッカス・ズウエピデミカス変異株に関する。
【００１２】上述のストレプトコッカス属突然変異株は
公知のストレプトコッカス・ズウエピデミカス(ＡＴＣ
Ｃ ３５２４６)の突然変異により得ることができる。
突然変異の誘発方法は少なくとも３回のＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ＮＴＧ)処理を
含み、例えば、本発明では１次ＮＴＧ処理後、溶血性の
ない菌株を選別した後、選別された菌株を２次ＮＴＧ処
理してヒアルロン酸分解酵素であるヒアルロニダーゼ活
性のない菌株を選別する。ついで、選別された菌株を再
び３次ＮＴＧ処理した後、平板培地の上で培養して、成
長が早く粘液性が高く大きいコロニーを選別してヒアル
ロン酸の生産性に優れた変異株を得た。
公知のストレプトコッカス・ズウエピデミカス(ＡＴＣ
Ｃ ３５２４６)の突然変異により得ることができる。
突然変異の誘発方法は少なくとも３回のＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ＮＴＧ)処理を
含み、例えば、本発明では１次ＮＴＧ処理後、溶血性の
ない菌株を選別した後、選別された菌株を２次ＮＴＧ処
理してヒアルロン酸分解酵素であるヒアルロニダーゼ活
性のない菌株を選別する。ついで、選別された菌株を再
び３次ＮＴＧ処理した後、平板培地の上で培養して、成
長が早く粘液性が高く大きいコロニーを選別してヒアル
ロン酸の生産性に優れた変異株を得た。
【００１３】こうして選別された突然変異株はヒアルロ
ニダーゼを生成せず、溶血作用を有しないだけでなく、
平均分子量３,５００キロダルトン以上の非常に高い分
子量を有するヒアルロン酸を産生する。前記変異株中の
一つは、細菌学的な特性に基づいて「ストレプトコッカ
ス・ズウエピデミカスＬＢＦ７０７」と命名され、１９
９３年１月２９日付でブダペスト条約下の国際寄託機関
である韓国遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)に受託番号ＫＣＴＣ
００７５ＢＰとして寄託された。
ニダーゼを生成せず、溶血作用を有しないだけでなく、
平均分子量３,５００キロダルトン以上の非常に高い分
子量を有するヒアルロン酸を産生する。前記変異株中の
一つは、細菌学的な特性に基づいて「ストレプトコッカ
ス・ズウエピデミカスＬＢＦ７０７」と命名され、１９
９３年１月２９日付でブダペスト条約下の国際寄託機関
である韓国遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)に受託番号ＫＣＴＣ
００７５ＢＰとして寄託された。
【００１４】一般的に、微生物の培養のための培地の成
分には炭素源、窒素源、無機塩類のような微量元素など
が含まれる。炭素源としては澱粉、グルコース、スクロ
ース、ガラクトース、フルクトースなど、好ましくは、
グルコースが挙げられる。窒素源としては硫酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、カサミノ
酸、酵母エキス、ペプトン、トリプトンなどを使用する
ことができる。また、場合によって、塩化ナトリウム、
第一リン酸または第二リン酸ナトリウム、硫酸第一鉄、
塩化カリウム、硫酸マグネシウムなどを使用し得る。
分には炭素源、窒素源、無機塩類のような微量元素など
が含まれる。炭素源としては澱粉、グルコース、スクロ
ース、ガラクトース、フルクトースなど、好ましくは、
グルコースが挙げられる。窒素源としては硫酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、カサミノ
酸、酵母エキス、ペプトン、トリプトンなどを使用する
ことができる。また、場合によって、塩化ナトリウム、
第一リン酸または第二リン酸ナトリウム、硫酸第一鉄、
塩化カリウム、硫酸マグネシウムなどを使用し得る。
【００１５】本発明では、前記成分の倍地にウリジンを
添加してストレプトコッカス属のヒアルロン酸産生可能
な菌株を培養することによってヒアルロン酸の産生収率
を高める。ウリジンは極めて少量であっても培地に含ま
れるならば効果を発揮するが、少量すぎる場合は効果が
微弱であり、過剰量の場合は非経済的なのでウリジンの
添加量は、好ましくは０.１〜５.０ｇ／ｌである。した
がって、本発明の培地は培養液１ｌ当り１０〜１００ｇ
のグルコース、０.５〜３.０ｇの硫酸マグネシウム、
１.０〜５.０ｇの第一リン酸カリウム、１.０〜１０.０
ｇの酵母エキス、１０.０〜２０.０ｇの酵母ペプトンお
よび０.１ｇ〜５.０ｇのウリジンを含むことができ、好
ましくは、培地の組成は培養液１ｌ当り５０〜７０ｇの
グルコース、０.７〜１.５ｇの硫酸マグネシウム、１.
５〜２.５ｇの第一リン酸カリウム、４.０〜６.０ｇの
酵母エキス、１３.０〜１７.０ｇの酵母ペプトンおよび
０.５〜１.０ｇのウリジンからなる。
添加してストレプトコッカス属のヒアルロン酸産生可能
な菌株を培養することによってヒアルロン酸の産生収率
を高める。ウリジンは極めて少量であっても培地に含ま
れるならば効果を発揮するが、少量すぎる場合は効果が
微弱であり、過剰量の場合は非経済的なのでウリジンの
添加量は、好ましくは０.１〜５.０ｇ／ｌである。した
がって、本発明の培地は培養液１ｌ当り１０〜１００ｇ
のグルコース、０.５〜３.０ｇの硫酸マグネシウム、
１.０〜５.０ｇの第一リン酸カリウム、１.０〜１０.０
ｇの酵母エキス、１０.０〜２０.０ｇの酵母ペプトンお
よび０.１ｇ〜５.０ｇのウリジンを含むことができ、好
ましくは、培地の組成は培養液１ｌ当り５０〜７０ｇの
グルコース、０.７〜１.５ｇの硫酸マグネシウム、１.
５〜２.５ｇの第一リン酸カリウム、４.０〜６.０ｇの
酵母エキス、１３.０〜１７.０ｇの酵母ペプトンおよび
０.５〜１.０ｇのウリジンからなる。
【００１６】なお、本発明のストレプトコッカス・ズウ
エピデミカスＬＢＦ７０７を含めてストレプトコッカス
属の菌株を前記組成の培地でヒアルロン酸の産生のため
の最適条件下に培養することによってヒアルロン酸の産
生収率および分子量を増大させることができる。例え
ば、培養液のｐＨを７.０〜７.５に調整し、３３℃〜３
８℃で０.１〜１.０ＶＶＭの通気速度を保持しながら好
気培養することが好ましい。培養後培地中に存在するヒ
アルロン酸は通常、塩、例えばナトリウム塩の形態を有
する。培養の終了後、培養液中に存在するヒアルロン酸
は、公知の多糖類分離精製法［アカサカヒノデド、 ジ
ャーナル・オブ・ソサイェティ・オブ・コスメティク・
ケミスト・ジャパン（J. Soc. Cosmet. Chem. Japa
n）、２２,９８８)］によって回収する。
エピデミカスＬＢＦ７０７を含めてストレプトコッカス
属の菌株を前記組成の培地でヒアルロン酸の産生のため
の最適条件下に培養することによってヒアルロン酸の産
生収率および分子量を増大させることができる。例え
ば、培養液のｐＨを７.０〜７.５に調整し、３３℃〜３
８℃で０.１〜１.０ＶＶＭの通気速度を保持しながら好
気培養することが好ましい。培養後培地中に存在するヒ
アルロン酸は通常、塩、例えばナトリウム塩の形態を有
する。培養の終了後、培養液中に存在するヒアルロン酸
は、公知の多糖類分離精製法［アカサカヒノデド、 ジ
ャーナル・オブ・ソサイェティ・オブ・コスメティク・
ケミスト・ジャパン（J. Soc. Cosmet. Chem. Japa
n）、２２,９８８)］によって回収する。
【００１７】本発明の突然変異株によるヒアルロン酸の
産生量は２.５〜６.０ｇ／ｌであり、平均分子量は３,
５００キロダルトン以上である。ヒアルロン酸の定量は
カルバゾール方法［Z. ジッシュ、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（ J. Biol. Chem.）、
１６７,１８９（１９４７）］によって行う。分子量の
測定は高速液体クロマトグラフィー法および粘度測定に
より実施する。高速液体クロマトグラフィー法はポリエ
チレンオキシドを標準物質として使用して標準曲線を求
めた後、同一条件でヒアルロン酸を溶出して分子量を確
認する［Ｐ.チャムブレク、クロマトグラフィア（Chrom
atographia、３０，２０１−２０４(１９９０)：ナルリ
ン・Ｂ.ビーティ、アナリティカル・バイオケミストリ
ー（Anal.Biochem.）、１４７，３８７−３９５(１９８
５)；ノリコ・モトハシ、ジャーナル・オブ・クロマト
グラフィ（Ｊ.Chromat.)、２９９，５０８−５１２（１
９８４)］。粘度測定法は順次希釈されたヒアルロン酸
溶液の固有粘度を粘度計で測定し、ヒアルロン酸の濃度
について曲線を作成する。ヒアルロン酸の濃度が０の時
の固有粘度を示す極限固有粘度を補外法によって求めた
後、ヒアルロン酸の分子量をナルリン［ナルリン、アナ
リティカル・ケミストリー（Analytical Biochemistr
y）、１４７,３４７−３９５(１９８５)］の関係式： 極限固有粘度(Limited Intrinsic Viscosity)＝０.００
０３５６ ｘ ＭＷ ｅｘｐ (１.０６９９)によって算
出する。
産生量は２.５〜６.０ｇ／ｌであり、平均分子量は３,
５００キロダルトン以上である。ヒアルロン酸の定量は
カルバゾール方法［Z. ジッシュ、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（ J. Biol. Chem.）、
１６７,１８９（１９４７）］によって行う。分子量の
測定は高速液体クロマトグラフィー法および粘度測定に
より実施する。高速液体クロマトグラフィー法はポリエ
チレンオキシドを標準物質として使用して標準曲線を求
めた後、同一条件でヒアルロン酸を溶出して分子量を確
認する［Ｐ.チャムブレク、クロマトグラフィア（Chrom
atographia、３０，２０１−２０４(１９９０)：ナルリ
ン・Ｂ.ビーティ、アナリティカル・バイオケミストリ
ー（Anal.Biochem.）、１４７，３８７−３９５(１９８
５)；ノリコ・モトハシ、ジャーナル・オブ・クロマト
グラフィ（Ｊ.Chromat.)、２９９，５０８−５１２（１
９８４)］。粘度測定法は順次希釈されたヒアルロン酸
溶液の固有粘度を粘度計で測定し、ヒアルロン酸の濃度
について曲線を作成する。ヒアルロン酸の濃度が０の時
の固有粘度を示す極限固有粘度を補外法によって求めた
後、ヒアルロン酸の分子量をナルリン［ナルリン、アナ
リティカル・ケミストリー（Analytical Biochemistr
y）、１４７,３４７−３９５(１９８５)］の関係式： 極限固有粘度(Limited Intrinsic Viscosity)＝０.００
０３５６ ｘ ＭＷ ｅｘｐ (１.０６９９)によって算
出する。
【００１８】
【実施例】下記実施例は、本発明を、より具体的に説明
するもので、本発明を限定するものではない。実施例１ ： 突然変異株のスクリーニング 工程１) 溶血性のない菌株の獲得 公知の菌株であるストレプトコッカス・ズウエピデミカ
ス(ＡＴＣＣ ３５２４６)を２５ｍｌのトッド・ヒュー
イット培地(Todd-Hewitt培地、Difco、USA、商品番号０
４９２−０５−０)に接種して、３７℃で１４時間振盪
培養した後、培養液２.５ｍｌを再び２５ｍｌのトッド
・ヒューイット培地に接種して、３７℃で指数増殖期に
達するまで振盪培養した。培養後、培養液１ｍｌ ４℃
で遠心分離(５,０００ｘｇ５分)し、沈殿した細胞を採
取し、これをトリス−マレイン酸塩緩衝液(１ｌ当りト
リス６ｇ、ｐＨ６.０、マレイン酸 ５.８ｇ、硫酸アン
モニウム１ｇ、硫酸第一鉄０.２５ｍｇ、硫酸マグネシ
ウム０.１ｇ、硝酸カルシウム０.００５ｇ)１ｍｌずつ
使用して２回洗浄した。洗浄した細胞を前記緩衝液１ｍ
ｌに懸濁した後、１００〜２００μｇ／ｌのＮＴＧを添
加し３７℃で２０〜３０分間振盪させるか、または６０
〜１２０分間静置させて突然変異を誘発させた。
するもので、本発明を限定するものではない。実施例１ ： 突然変異株のスクリーニング 工程１) 溶血性のない菌株の獲得 公知の菌株であるストレプトコッカス・ズウエピデミカ
ス(ＡＴＣＣ ３５２４６)を２５ｍｌのトッド・ヒュー
イット培地(Todd-Hewitt培地、Difco、USA、商品番号０
４９２−０５−０)に接種して、３７℃で１４時間振盪
培養した後、培養液２.５ｍｌを再び２５ｍｌのトッド
・ヒューイット培地に接種して、３７℃で指数増殖期に
達するまで振盪培養した。培養後、培養液１ｍｌ ４℃
で遠心分離(５,０００ｘｇ５分)し、沈殿した細胞を採
取し、これをトリス−マレイン酸塩緩衝液(１ｌ当りト
リス６ｇ、ｐＨ６.０、マレイン酸 ５.８ｇ、硫酸アン
モニウム１ｇ、硫酸第一鉄０.２５ｍｇ、硫酸マグネシ
ウム０.１ｇ、硝酸カルシウム０.００５ｇ)１ｍｌずつ
使用して２回洗浄した。洗浄した細胞を前記緩衝液１ｍ
ｌに懸濁した後、１００〜２００μｇ／ｌのＮＴＧを添
加し３７℃で２０〜３０分間振盪させるか、または６０
〜１２０分間静置させて突然変異を誘発させた。
【００１９】ＮＴＧで処理された細胞懸濁液を４℃(５,
０００ｘｇ ５分)で遠心分離し、沈澱した細胞を採取
し、前記緩衝液で数回洗浄して残留ＮＴＧを除去した。
細胞ペレットをさらに前記緩衝液１ｍｌに懸濁した後、
そのうちの１ｍｌを２５ｍｌのトッド・ヒューイット培
養液に接種し３７℃で１８時間振盪培養して生存可能な
突然変異細胞の数を増加させた。この時、得られた培養
液を生理食塩水で適当に希釈して５％血液を含むトッド
・ヒューイット寒天培地上に塗抹した後、３７℃で４８
時間培養した。溶血性のあるコロニーはその周囲に透明
域を形成するので、透明域のないコロニーを溶血性のな
い突然変異コロニーとして選別した。
０００ｘｇ ５分)で遠心分離し、沈澱した細胞を採取
し、前記緩衝液で数回洗浄して残留ＮＴＧを除去した。
細胞ペレットをさらに前記緩衝液１ｍｌに懸濁した後、
そのうちの１ｍｌを２５ｍｌのトッド・ヒューイット培
養液に接種し３７℃で１８時間振盪培養して生存可能な
突然変異細胞の数を増加させた。この時、得られた培養
液を生理食塩水で適当に希釈して５％血液を含むトッド
・ヒューイット寒天培地上に塗抹した後、３７℃で４８
時間培養した。溶血性のあるコロニーはその周囲に透明
域を形成するので、透明域のないコロニーを溶血性のな
い突然変異コロニーとして選別した。
【００２０】工程２) ヒアルロニダーゼを産生しない
菌株の獲得 前記工程１から得られた溶血性のない突然変異株を前記
工程１と同一な方法で突然変異を誘発させた後コロニー
を生理食塩水に懸濁させて培養液１ｍｌ当り４００μｇ
のヒアルロン酸と１％のアルブミン画分Ｖ(シグマ社
製、商品番号Ａ−２１５３)を含有するトッド・ヒュー
イット寒天培地上に塗抹した。この平板を３７℃の湿室
で２〜５日間静置培養した後、ここに約１０ｍｌの２Ｎ
酢酸塩溶液を加えて１０分間放置した。酢酸塩溶液中で
ヒアルロン酸とアルブミンが結合して沈澱物を形成し、
培地が不透明になる。ヒアルロニダーゼ−産生コロニー
の場合に、ヒアルロン酸の分解によってコロニー周囲に
透明な領域が形成される。したがって、不透明な周辺部
を有するコロニーをヒアルロニダーゼを産生しない突然
変異株として選別した。
菌株の獲得 前記工程１から得られた溶血性のない突然変異株を前記
工程１と同一な方法で突然変異を誘発させた後コロニー
を生理食塩水に懸濁させて培養液１ｍｌ当り４００μｇ
のヒアルロン酸と１％のアルブミン画分Ｖ(シグマ社
製、商品番号Ａ−２１５３)を含有するトッド・ヒュー
イット寒天培地上に塗抹した。この平板を３７℃の湿室
で２〜５日間静置培養した後、ここに約１０ｍｌの２Ｎ
酢酸塩溶液を加えて１０分間放置した。酢酸塩溶液中で
ヒアルロン酸とアルブミンが結合して沈澱物を形成し、
培地が不透明になる。ヒアルロニダーゼ−産生コロニー
の場合に、ヒアルロン酸の分解によってコロニー周囲に
透明な領域が形成される。したがって、不透明な周辺部
を有するコロニーをヒアルロニダーゼを産生しない突然
変異株として選別した。
【００２１】工程３) ヒアルロン酸の産生性に優れた
突然変異株の獲得 前記工程２から得られた突然変異株を前記工程１と同一
な方法で突然変異を誘発させた後、得られたコロニーを
生理食塩水で希釈してトッド・ヒューイット寒天培地上
に塗抹した後、３７℃の湿室で４８時間放置培養した。
この時、対照群としてストレプトコッカス・ズウエピデ
ミカス(ＡＴＣＣ ３５２４６)を使用した。対照群より
粘液性が高く、コロニーの大きさが大きいコロニーをヒ
アルロン酸の産生性に優れた突然変異株として選別し
た。
突然変異株の獲得 前記工程２から得られた突然変異株を前記工程１と同一
な方法で突然変異を誘発させた後、得られたコロニーを
生理食塩水で希釈してトッド・ヒューイット寒天培地上
に塗抹した後、３７℃の湿室で４８時間放置培養した。
この時、対照群としてストレプトコッカス・ズウエピデ
ミカス(ＡＴＣＣ ３５２４６)を使用した。対照群より
粘液性が高く、コロニーの大きさが大きいコロニーをヒ
アルロン酸の産生性に優れた突然変異株として選別し
た。
【００２２】工程４) 高分子量のヒアルロン酸産生菌
株の獲得 前記工程３から得られた突然変異株から高分子量のヒア
ルロン酸を産生する所期の菌株を選別するために次のよ
うなスクリーニング工程を行った。トッド・ヒューイッ
ト培地３ｇを１５０ｍｌの蒸留水に溶かして１２１℃で
１５分間殺菌した後、各変異株を接種し３７℃で１５時
間種培養した。主培養のために５１発酵槽に培養液１ｌ
当り６０ｇのグルコース、１.０ｇの硫酸マグネシウ
ム、２.０ｇの第一リン酸カリウム、５.０ｇの酵母エキ
ス、１５.０ｇの酵母ペプトンおよび０.７５ｇのウリジ
ンを含む培養液３ｌを注入した。前記培地を１２１℃で
２０分間高圧蒸気殺菌した後、ここに変異株種培養液１
５０ｍｌを加えてｐＨ７.１、温度３５℃、通気速度０.
５ｖｖｍを保持しながら２４時間好気培養した。培養液
を回収して０.４５μｍのフィルターを通して濾過した
後、濾液を高速液体クロマトグラフィーした後、もっと
も早く溶出されるヒアルロン酸を産生する菌株を選別し
ストレプトコッカス・ズウエピデミカス(ＡＴＣＣ ３
５２４６)により産生されたヒアルロン酸より高分子量
のヒアルロン酸を産生する突然変異菌株を得た。この突
然変異株によって産生されたヒアルロン酸は平均分子量
が３,５００キロダルトン以上で測定された。
株の獲得 前記工程３から得られた突然変異株から高分子量のヒア
ルロン酸を産生する所期の菌株を選別するために次のよ
うなスクリーニング工程を行った。トッド・ヒューイッ
ト培地３ｇを１５０ｍｌの蒸留水に溶かして１２１℃で
１５分間殺菌した後、各変異株を接種し３７℃で１５時
間種培養した。主培養のために５１発酵槽に培養液１ｌ
当り６０ｇのグルコース、１.０ｇの硫酸マグネシウ
ム、２.０ｇの第一リン酸カリウム、５.０ｇの酵母エキ
ス、１５.０ｇの酵母ペプトンおよび０.７５ｇのウリジ
ンを含む培養液３ｌを注入した。前記培地を１２１℃で
２０分間高圧蒸気殺菌した後、ここに変異株種培養液１
５０ｍｌを加えてｐＨ７.１、温度３５℃、通気速度０.
５ｖｖｍを保持しながら２４時間好気培養した。培養液
を回収して０.４５μｍのフィルターを通して濾過した
後、濾液を高速液体クロマトグラフィーした後、もっと
も早く溶出されるヒアルロン酸を産生する菌株を選別し
ストレプトコッカス・ズウエピデミカス(ＡＴＣＣ ３
５２４６)により産生されたヒアルロン酸より高分子量
のヒアルロン酸を産生する突然変異菌株を得た。この突
然変異株によって産生されたヒアルロン酸は平均分子量
が３,５００キロダルトン以上で測定された。
【００２３】段階５) 突然変異株の細菌学的特性 前記のような方法で得られた突然変異株は下記の細菌学
的特性を示した。 ・グラム染色 ：陽性 ・１０℃にての成長 ：陰性 ・４５℃にての成長 ：陰性 ・６.５％食塩水での成長 ：陰性 ・ｐＨ９.６での成長 ：陰性 ・４０％胆汁での成長 ：陰性 ・アルギニン分解性 ：陽性 ・馬尿酸塩分解性 ：陰性 ・エスクリン分解性 ：陰性 ・バシトラシン耐性 ：陰性 ・糖分解性 グルコース、マルトース、スクロース、ソ
ルビトール、ラクトース：陽性 マンニトール、グリセリン、トレハロース：陰性 前記の変異株は、溶血性とヒアルロニダーゼ活性の欠如
を除いて、細菌学のバーギス便覧［Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology １９７４］に示された
ストレプトコッカス・ズウエピデミカスと同一な特性を
有するので、前記の突然変異株を「ストレプトコッカス
・ズウエピデミカスＬＢＦ７０７」と命名した。
的特性を示した。 ・グラム染色 ：陽性 ・１０℃にての成長 ：陰性 ・４５℃にての成長 ：陰性 ・６.５％食塩水での成長 ：陰性 ・ｐＨ９.６での成長 ：陰性 ・４０％胆汁での成長 ：陰性 ・アルギニン分解性 ：陽性 ・馬尿酸塩分解性 ：陰性 ・エスクリン分解性 ：陰性 ・バシトラシン耐性 ：陰性 ・糖分解性 グルコース、マルトース、スクロース、ソ
ルビトール、ラクトース：陽性 マンニトール、グリセリン、トレハロース：陰性 前記の変異株は、溶血性とヒアルロニダーゼ活性の欠如
を除いて、細菌学のバーギス便覧［Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology １９７４］に示された
ストレプトコッカス・ズウエピデミカスと同一な特性を
有するので、前記の突然変異株を「ストレプトコッカス
・ズウエピデミカスＬＢＦ７０７」と命名した。
【００２４】比較例１ ヒアルロン酸収率の比較 前記実施例１の工程４から得られた突然変異株ストレプ
トコッカス・ズウエピデミカスＬＢＦ７０７とストレプ
トコッカス・ズウエピデミカス(ＡＴＣＣ ３５２４６)
によリ産生されたヒアルロン酸の収率を比較した(図
１)。前記突然変異株による発酵単位体積当りヒアルロ
ン酸の収率はストレプトコッカス・ズウエピデミカス
(ＡＴＣＣ ３５２４６)によるものよりも２０％程度増
加した。
トコッカス・ズウエピデミカスＬＢＦ７０７とストレプ
トコッカス・ズウエピデミカス(ＡＴＣＣ ３５２４６)
によリ産生されたヒアルロン酸の収率を比較した(図
１)。前記突然変異株による発酵単位体積当りヒアルロ
ン酸の収率はストレプトコッカス・ズウエピデミカス
(ＡＴＣＣ ３５２４６)によるものよりも２０％程度増
加した。
【００２５】比較例２ 分子量の比較 前記の突然変異株による発酵液と公知菌株のＡＴＣＣ
３５２４６による発酵液から単離されたヒアルロン酸の
分子量を高速液体クロマトグラフィー法によって動物の
組織から抽出された現在市販中のヒアルロン酸製品、例
えば、ヒルロン(ＨＥＡＬＯＮ)(Lot. No. RH41401、Pha
rmacia AB、Sweden)、アルツ(ＡＲＴＺ)(日本生化学工
業株式会社)の分子量と比較した。図２にみられるよう
に、本発明の突然変異株ストレプトコッカス・ズウエピ
デミカスＬＢＦ７０７により産生されたヒアルロン酸は
もっとも高い分子量を有する。また粘度計を用いてＬＢ
Ｆ７０７によって産生されたヒアルロン酸と動物の組織
から抽出された市販のヒアルロン酸製品であるヒルロン
およびアンビスク(AMVISC)(Jonnson & Johnson、USA)な
どの粘度を測定して比較した。図３にみられるように、
本発明の突然変異株によるヒアルロン酸の極限固有粘度
がもっとも高かった。各ヒアルロン酸製品の分子量はそ
れぞれの極限固有粘度からナルリン公式によって算出さ
れた。この結果、ストレプトコッカス・ズウエピデミカ
スＬＢＦ７０７によるヒアルロン酸の平均分子量は３,
８００キロダルトン、ヒルロンのものは３,７００キロ
ダルトンおよびアンビスクのものは３,１００キロダル
トンであった。
３５２４６による発酵液から単離されたヒアルロン酸の
分子量を高速液体クロマトグラフィー法によって動物の
組織から抽出された現在市販中のヒアルロン酸製品、例
えば、ヒルロン(ＨＥＡＬＯＮ)(Lot. No. RH41401、Pha
rmacia AB、Sweden)、アルツ(ＡＲＴＺ)(日本生化学工
業株式会社)の分子量と比較した。図２にみられるよう
に、本発明の突然変異株ストレプトコッカス・ズウエピ
デミカスＬＢＦ７０７により産生されたヒアルロン酸は
もっとも高い分子量を有する。また粘度計を用いてＬＢ
Ｆ７０７によって産生されたヒアルロン酸と動物の組織
から抽出された市販のヒアルロン酸製品であるヒルロン
およびアンビスク(AMVISC)(Jonnson & Johnson、USA)な
どの粘度を測定して比較した。図３にみられるように、
本発明の突然変異株によるヒアルロン酸の極限固有粘度
がもっとも高かった。各ヒアルロン酸製品の分子量はそ
れぞれの極限固有粘度からナルリン公式によって算出さ
れた。この結果、ストレプトコッカス・ズウエピデミカ
スＬＢＦ７０７によるヒアルロン酸の平均分子量は３,
８００キロダルトン、ヒルロンのものは３,７００キロ
ダルトンおよびアンビスクのものは３,１００キロダル
トンであった。
【００２６】実施例２ ウリジンを含む培地での菌株培
養 ５個の５ｌ発酵槽に下記組成の培養液をそれぞれ３ｌず
つ注入した。培養液の組成は培養液１ｌ当り６０ｇのグ
ルコース、１.０ｇの硫酸マグネシウム、２.０ｇの第一
リン酸カリウム、５.０ｇの酵母エキスおよび１５.０ｇ
の酵母ペプトンからなっている。ウリジンを培養液１ｌ
当り０、０.５、０.７５、１.０および２.０ｇの量で発
酵槽に添加した。前記培地を１２１℃で２０分間高圧蒸
気殺菌した後、ここにストレプトコッカス・ズウエピデ
ミカス(ＡＴＣＣ ３５２４６)の種培養液１５０ｍｌを
加えてｐＨは７.２,温度３５℃、通気速度０.５ｖｖｍ
を保持しながら２４時間好気培養した。培養の終了後各
培養液中に残存するヒアルロン酸の濃度を測定し、その
結果を表１に示した。下記表の結果から見られるよう
に、ウリジンを加えることによりヒアルロン酸の産生量
が増加した。
養 ５個の５ｌ発酵槽に下記組成の培養液をそれぞれ３ｌず
つ注入した。培養液の組成は培養液１ｌ当り６０ｇのグ
ルコース、１.０ｇの硫酸マグネシウム、２.０ｇの第一
リン酸カリウム、５.０ｇの酵母エキスおよび１５.０ｇ
の酵母ペプトンからなっている。ウリジンを培養液１ｌ
当り０、０.５、０.７５、１.０および２.０ｇの量で発
酵槽に添加した。前記培地を１２１℃で２０分間高圧蒸
気殺菌した後、ここにストレプトコッカス・ズウエピデ
ミカス(ＡＴＣＣ ３５２４６)の種培養液１５０ｍｌを
加えてｐＨは７.２,温度３５℃、通気速度０.５ｖｖｍ
を保持しながら２４時間好気培養した。培養の終了後各
培養液中に残存するヒアルロン酸の濃度を測定し、その
結果を表１に示した。下記表の結果から見られるよう
に、ウリジンを加えることによりヒアルロン酸の産生量
が増加した。
【表１】 表１.ウリジン濃度によるヒアルロン酸の産生量 培地中のウリジンの濃度 0 0.5 0.75 1.0 2.0 5.0 (ｇ／ｌ) (対照用) ヒアルロン酸の産生量 (ｇ／ｌ) 3.5 4.1 4.8 4.8 5.0
【００２７】比較例３ 培地中のウリジンの存在の有無
によるヒアルロン酸分子量の比較 ウリジン濃度を０.７５ｇ／ｌに固定する以外は培地組
成および培養条件を実施例２と同様にして培養を行っ
た。培養の終了後、培養液中のヒアルロン酸の濃度は約
４.８ｇ／ｌ程度であった。実施例２に対照用として用
いたヒアルロン酸と本比較例から得られたヒアルロン酸
の分子量を比較した。図４はウリジンの有無によって生
成されたヒアルロン酸の濃度による粘度の変化(および
極限固有粘度値)を示す。図４で、ＮＨ２−Ｃｔｒｌは
ウリジンが含まれていない培地を使用して得たヒアルロ
ン酸(実施例２、対照群)を意味し、ＮＨ２−Ｕｒｉｄは
ウリジンを含む培地を使用して得たヒアルロン酸(本比
較例、実験群)を意味する。対照群の極限固有粘度値は
約３０００ｍｌ／ｇであって、実験群の極限固有粘度値
は約３,４００ｍｌ／ｇである。この値を前述したナル
リンの式によって分子量を求めると対照群の分子量は約
３０００キロダルトンであって実験群の分子量は約３３
００キロダルトンであった。この結果から見られるよう
に、培地にウリジンを添加することによりヒアルロン酸
の分子量が増加した。
によるヒアルロン酸分子量の比較 ウリジン濃度を０.７５ｇ／ｌに固定する以外は培地組
成および培養条件を実施例２と同様にして培養を行っ
た。培養の終了後、培養液中のヒアルロン酸の濃度は約
４.８ｇ／ｌ程度であった。実施例２に対照用として用
いたヒアルロン酸と本比較例から得られたヒアルロン酸
の分子量を比較した。図４はウリジンの有無によって生
成されたヒアルロン酸の濃度による粘度の変化(および
極限固有粘度値)を示す。図４で、ＮＨ２−Ｃｔｒｌは
ウリジンが含まれていない培地を使用して得たヒアルロ
ン酸(実施例２、対照群)を意味し、ＮＨ２−Ｕｒｉｄは
ウリジンを含む培地を使用して得たヒアルロン酸(本比
較例、実験群)を意味する。対照群の極限固有粘度値は
約３０００ｍｌ／ｇであって、実験群の極限固有粘度値
は約３,４００ｍｌ／ｇである。この値を前述したナル
リンの式によって分子量を求めると対照群の分子量は約
３０００キロダルトンであって実験群の分子量は約３３
００キロダルトンであった。この結果から見られるよう
に、培地にウリジンを添加することによりヒアルロン酸
の分子量が増加した。
【００２８】実施例３ 菌株のバッチ培養 ５ｌ発酵槽に培養液１ｌ当り６０ｇのグルコース,１.０
ｇの硫酸マグネシウム、２.０ｇの第一リン酸カリウ
ム、５.０ｇの酵母エキス、１５.０ｇの酵母ペプトン、
および０.７５ｇのウリジンを含む培養液３ｌを注入し
た。前記培地を１２１℃で２０分間高圧蒸気殺菌した
後、ここに本発明のストレプトコッカス・ズウエピデミ
カスＬＢＦ７０７の種培養液１５０ｍｌを加えて、ｐＨ
７.１〜７.３、温度３５℃〜３８℃、通気速度０.１〜
１.０ｖｖｍを保持しながら２４時間培養した。培養の
終了後、培養液中に存在するヒアルロン酸の濃度は６.
０ｇ／ｌであって、平均分子量は約３,５００キロダル
トンであった。
ｇの硫酸マグネシウム、２.０ｇの第一リン酸カリウ
ム、５.０ｇの酵母エキス、１５.０ｇの酵母ペプトン、
および０.７５ｇのウリジンを含む培養液３ｌを注入し
た。前記培地を１２１℃で２０分間高圧蒸気殺菌した
後、ここに本発明のストレプトコッカス・ズウエピデミ
カスＬＢＦ７０７の種培養液１５０ｍｌを加えて、ｐＨ
７.１〜７.３、温度３５℃〜３８℃、通気速度０.１〜
１.０ｖｖｍを保持しながら２４時間培養した。培養の
終了後、培養液中に存在するヒアルロン酸の濃度は６.
０ｇ／ｌであって、平均分子量は約３,５００キロダル
トンであった。
【００２９】実施例４ 菌株の流加培養 グルコースの濃度が４０ｇ／ｌである以外は実施例３と
同じ培地組成および培養条件で培養を行った。１２〜１
８時間後、培養液中のグルコース濃度が１０ｇ／ｌ以下
に保持されるようにグルコースを添加する流加培養に転
換した。培養液中のヒアルロン酸の濃度がそれ以上増大
しなくなるまで２４〜３６時間培養した。培養終了後、
ヒアルロン酸の濃度は５.０ｇ／ｌであり、平均分子量
は約３,５００キロダルトンであった。
同じ培地組成および培養条件で培養を行った。１２〜１
８時間後、培養液中のグルコース濃度が１０ｇ／ｌ以下
に保持されるようにグルコースを添加する流加培養に転
換した。培養液中のヒアルロン酸の濃度がそれ以上増大
しなくなるまで２４〜３６時間培養した。培養終了後、
ヒアルロン酸の濃度は５.０ｇ／ｌであり、平均分子量
は約３,５００キロダルトンであった。
【００３０】
【発明の効果】本発明はストレプトコッカス・ズウエピ
デミカスから得られた突然変異株を用いて高分子量ヒア
ルロン酸の大量産生を可能とするものであり、このよう
な菌株を含むストレプトコッカス属の菌株をウリジンが
添加された培地で培養することによって分子量がより大
きいヒアルロン酸を大量産生することができる。
デミカスから得られた突然変異株を用いて高分子量ヒア
ルロン酸の大量産生を可能とするものであり、このよう
な菌株を含むストレプトコッカス属の菌株をウリジンが
添加された培地で培養することによって分子量がより大
きいヒアルロン酸を大量産生することができる。
【図１】 ストレプトコッカス・ズウエピデミカス(Ａ
ＴＣＣ ３５２４６)と本発明のストレプトコッカス・
ズウエピデミカスＬＢＦ７０７の発酵結果を比較して示
すグラフである。
ＴＣＣ ３５２４６)と本発明のストレプトコッカス・
ズウエピデミカスＬＢＦ７０７の発酵結果を比較して示
すグラフである。
【図２】 本発明によって産生されたヒアルロン酸の分
子量とストレプトコッカス・ズウエピデミカス(ＡＴＣ
Ｃ ３５２４６)によって産生されたヒアルロン酸およ
び市販品の分子量とを比較して示すグラフである。
子量とストレプトコッカス・ズウエピデミカス(ＡＴＣ
Ｃ ３５２４６)によって産生されたヒアルロン酸およ
び市販品の分子量とを比較して示すグラフである。
【図３】 本発明によって産生されたヒアルロン酸と先
行技術により産生されたヒアルロン酸の濃度による固有
粘度変化を比較して示したものである。
行技術により産生されたヒアルロン酸の濃度による固有
粘度変化を比較して示したものである。
【図４】 ヒアルロン酸の固有粘度に対するウリジンの
効果を示すグラフである。
効果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 カン・ホワング 大韓民国デジョン、ユソング、ドリョン ドン381−42番 ラッキー・アパートメ ント９−505 (56)参考文献 特開 昭62−257393（ＪＰ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】 ストレプトコッカス・ズウエピデミカス
（ＡＴＣＣ ３５２４６）をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いて突然変異を誘発させ
る工程を少なくとも３回繰り返して突然変異株を産生さ
せ、上記突然変異株から、溶血性およびヒアルロニダー
ゼ活性を欠き、ストレプトコッカス・ズウエピデミカス
（ＡＴＣＣ ３５２４６）によって形成されるコロニー
より、より高い粘度を有しより大きいコロニーを形成す
る菌株を選択することを含む方法によって得られる、平
均分子量３,５００キロダルトン以上のヒアルロン酸を
２.５〜６.０ｇ／培養培地ｌの産生収率で産生するスト
レプトコッカス・ズウエピデミカス変異株。 - 【請求項２】 ストレプトコッカス・ズウエピデミカス
ＬＢＦ７０７（ＫＣＴＣ ００７５ＢＰ)である、請求項
１記載の変異株。 - 【請求項３】 ストレプトコッカス・ズウエピデミカス
ＬＢＦ７０７（ＫＣＴＣ ００７５ＢＰ)を培養すること
を含むヒアルロン酸の製造方法。 - 【請求項４】 ウリジンを添加した倍地中でストレプト
コッカス属に属する微生物を培養することを含む、高収
率高分子量ヒアルロン酸の産生方法。 - 【請求項５】 上記変異株がストレプトコッカス・ズウ
エピデミカスＬＢＦ７０７（ＫＣＴＣ ００７５ＢＰ）
である、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 ウリジンの濃度が０.１〜５.０ｇ／ｌで
ある、請求項４または請求項５記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1993-6424 | 1993-04-16 | ||
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