TW434313B - Process for producing hyaluronic acid using a mutant strain of streptococcus zooepidemicus capable of producing hyaluronic acid at high yield - Google Patents

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A7 B7 五、發明說明（1) 本發明係有關一種能夠製造高分子量玻璃酸之新的微 生物’一種利用該微生物製備該玻璃酸的方法，及一種適 合培養該微生物以製造該玻璃酸的培養基。 如習知技藝所熟知，玻璃酸是具有交替的沒-(1,4)葡 糖醛酸及泠-(1,3)-N-乙醯基葡糖胺鍵結之不分支鏈，高分 子量自50 kda至13,000 kda之無色透明及高黏度的直鏈多 糖。玻璃酸及其鹽類具有多種用途，如，作為眼部手術之 玻璃質取代物及眼藥水的配方，及作為化粧品配方之濕潤 劑。一般而言，玻璃酸是自動物組織萃取或培養特定的微 生物而製備。 例如，美國專利第4，141，973號（Balaz)描述了藉由纯化 或除去如組織t的硫酸軟骨素及葡糖胺基糖之生物聚合物 雜質而自動物組織萃取玻璃酸的方法；因其高成本及低效 率，一般不被認為適用於大量生產之用。 因此，曾提議了許多利用微生物，特別是那些屬於鏈 球菌屬（SY/e/jfococcw)的微生物，製造玻璃酸的方法。曾 被用來製造玻璃酸的微生物實例包括（51· 、糞鏈 球菌'停乳鏈球菌（5*.办從、耿疲鍵球 菌（5*. 、馬鏈球菌（义e叫j)、似馬鏈球菌（5*. 叫如加///·?)等，而他們在伯捷氏手冊（Bergey’s Mannual)中 被分類成Lansfield血清組A或C。其據報導為具有点溶血 作用之溶血鍵形成的球菌。使用屬於鍵球菌屬的微生物製 造玻璃酸的方法公開於日本專利早期公開案第56692/1983 及50097/1985號’韓國專利公開案第92-9494號及韓國專 本紙張尺度適用中國园家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填离本頁)

J 裝·-------訂--------•線{ 經濟部智慧財產局員Η消费合作社印製 4 經濟部智慧財1局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（） 利早期公開案第87-Π252號。 此外，曾發展出各種增進利用鏈球菌屬微生物之玻璃 酸的生產力之方法：例如，藉由調節磷酸鹽濃度而增加玻 璃酸的生產力的方法（韓國專利公開案第90-5774號）；使用 丙酮酸鹽及葡糖胺等的方法（日本專利早期公開案第 257901號/1987);使用含有一或多個羥基游離基之芳香化 合物的方法（日本專利早期公開案第225491號/1989);及使 用4基酸的方法（日本專利早期公開案第141594號/1988及 第 289198號/1987)。 然而’這些方法的缺點是所製造的玻璃酸具有較低之 分子量，即自300 kda至3,000 kda，及產量低。結果，依此 製造出的玻璃酸使用於諸如化粧品時，濕潤效果不足，及 使用於諸如眼睛手術或作為關節炎的治療劑時，品質較 差。 因此’本發明的首要目的是提供能高產量地製造高分 子量玻璃酸的新的突變微生物。 本發明的另一個目的是提供利用該微生物製造高分子 量玻璃酸的一種方法。 本發明更進一步的目標是提供適合培養微生物的一種 培養基，使能以增加的生產力製造高分子量的玻璃酸。 依據本發明之一態樣，提供了一種屬於鏈球菌屬的新 的微生物，其缺乏玻璃酸酶及溶血活性，及其能生產高分 子量的玻璃酸。 依據本發明之另一部分，提供了一種適合自鏈球菌屬 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 297公釐） ----------— I— - I I I t I I I >111——— — · <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 434313 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 五、發明說明（ 的一種微生物得到高產量高分子量玻璃酸之培養基其中 該培養其包含尿核苷。 本發明上述及其他目的及特性將藉由下列較佳實施例 /1的f述及所附囷式而變得清楚，其中： ΪΠΑ及1B囷分別說明本發明之獸瘟鏈球菌（ATCC 352 及欺盘鍵球菌LBF707之發酵期程； 第2圈顧示依據本發明所製得的玻璃酸之分子量和其 他利用獸盘鍵球菌（ATCC 35246)所製造之玻璃酸及商品化 產品之比較； 第3圖敘述利用本發明方法製備的玻璃酸之特性黏度 相對於濃度之變化’和以其他習知技藝方法製備的玻璃酸 比較； 第4圊顯示尿核苷對玻璃酸之特性黏度之影響。 依據本發明，藉由突變已知的獸瘟鏈球菌（ATCC 35246) 種而得一種屬於鏈球菌属，缺乏玻璃酸酶活性及溶血活 性，及生產高分子量玻璃酸的新的微生物。突變方法包括 以N-甲基-Ν'-硝基-N-亞硝基胍（"MNNG”）處理該母系微生 物至少3次：亦即，依據本發明，缺乏溶血能力的變異株 在該已知微生物之第一次MNNG處理後得到及篩選，接著 第2次MNNG處理以篩選缺乏會將玻璃酸分解的玻璃酸酶 的菌株。之後，如此選得的菌株再經第3次MNNG處理， 及然後培養在固體基質上以收集具有較佳的玻璃酸生產力 的菌株之快速成長、高黏性的大菌落。 依據上述方法選擇的變異株缺乏玻璃酸酶及溶血能 本紙張尺度適用中國固家標準（CNS)A4規格（210 X 297公；g ) ----.---r-----~iic---- {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂----- 6 經濟部智慧財1·局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（4) 力’及能生產具有平均分子量高於諸如3,500 kda之高分子 量玻璃酸。該變異株之一被命名為“獸瘟鏈球菌LBF 707 “及在1993年1月29曰以寄存號碼KCTC 0075 BP寄存於韓 國菌種保存中心（Korean Collection for Type Culture (KCTC), 依照有關為了專利程序目的之微生物寄存之國際認定之布 達佩斯條約之規定。 一般而言，培養屬於鏈球菌屬的微生物之培養基包含 碳源、氮源、微量元素如無機鹽類等。在碳源方面，可使 用澱粉、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖等；而較佳為葡萄 糖。在氮源方面’可使用硫酸鞍、硝酸敍、硝酸鈉、氨基 酸、酵母抽出物、蛋白疎、胰化腺等。此外，若有需要， 可加入氣化鈉、二氪磷酸鈉、氩磷酸二鈉、硫酸亞鐵、氣 化鉀、硫酸鎂等。 依據本發明，發現在培養生產玻璃酸的微生物，即上 所提及的新的微生物，之培養基中加入尿核苷時，玻璃酸 的產量及分子量都增加。 因此，較佳地，本發明之基質在每升的基質中包含10 至100克的葡萄糖、0.5至3.0克的琉酸鎂、1.0至5.0克的二 氫磷酸鉀、1.0至10,0克的酵母抽出物' 1〇.〇至20,0克的酵 母腺及0.1至5.0克的的尿核苷；及更佳為50至70克的葡萄 糖、0.7至1.5克的硫酸鎂、1.5至2.5克的二氫磷酸鉀、4.0 至6.0克的酵母抽出物、13.0至17,0克的酵母煉及0.5至1·〇 克的屎核苷。 此外，較佳是在33eC至38eC的溫度，調整該培養基之 本紙張尺度適用中國固家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------.裝------II訂.--------線 <請先閱讀背面之注意事項再填笃本頁) A：

經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 五、發明說明（5) pH值至7.0至7.5及將反應速率維持在0.1至1.0VVM下進行 該微生物之有氧培養。 在培養該微生物後存於培養基之玻璃酸一般具有鹽之 形式，如其鈉鹽形式。 在該微生物之培養完成時’可依分離及純化多糖類之 已知方法（Akasaka Hinodedo, 乂 CAezr?· /砂扣，22, 35-42 (1988))回收存於該培養基之玻璃酸。 依據本發明之突變微生物生產之玻璃酸的量達到2.5 至6.0克/升；而其平均分子量為3,500 kda。玻璃酸之定量 是依據咔唑法（Z. Dische，/, CAejJ?·, 167，189(1947)) 進行。破璃酸的分子量是用高性能液相層析法（HPLC)及 黏度測定法測定的。在使用HPLC法時，以洗生作為標準 物質之聚乙烯而得到一標準曲線，然後在相同條件下洗出 玻璃酸，而得其參照該標準曲線之分子量（P· Chabreck, Chromatographia, 30, 201-204 (1990); Narlin B. Beaty, Anal. Biochem., 147, 387-395 (1985);Noriko Motohashi, /, Chrom., 299，508-512 (1984))。在使用黏度測定法時，用黏度計測 定連續稀釋的玻璃酸之特性黏度，及將其相對於玻璃酸濃 度繪圖。有限特性黏度，當玻璃酸濃度為零時之溶液之特 性黏度，以外插法而得：以及，隨後依下列Narlin等式（乂刀沒/. 如/π.,147,387-395,（1985))計算出玻璃酸的分子量： 有限特性黏度= 0.000356xMw exp (1.0699) 下列的實例只作為說明之用而並非用來限制發明之範 圍0 本紙張尺度適用中0國家標準（〇^5)八4規格（21〇>« 297公釐> ------I------(裝--------訂--I----線 j' I (請先閱讀背面之江意事項再填寫本頁> A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印絮 五、發明說明（6) 詈例1 :篩選變異株 第1)步驟製備缺乏溶血能力的菌株 獸症鍵球菌（ATCC 35246)培養於25ml Todd-Hewiti液 艟培養基（Difco ，美國，型錄號碼0492-05-0)及在37 °C搖 晃培養14小時。然後，將2.5ml所產生的培養物再度培養 在25ml Todd-Hewitt基質及在37°C搖晃培養直到達到指數 成長時期。之後，在4eC離心（5000xg，5分鐘）lml的培養物* 收集沈澱物及分別用lml的三羥甲基氨基甲烷-馬來酸鹽緩 衝液（每升含三羥甲基氨基曱烷6克，pH值6,0，馬來酸5.8 克，硫酸銨1克，硫酸亞鐵0.25毫克；硫酸鎂〇_1克，硝酸 鈣0.005克）沖洗二次。將洗過的沈澱懸浮在1 ml之上述 缓衝溶液申，然後藉由添加N-甲基-N、硝基-N-亞硝基胍 (MNNG)至濃度達1 〇〇至200微克/升及接著在37。0搖晃20 至30分鐘或靜置60至120分鐘而進行突變。 所產生受過MNNG處理的懸浮液在4°C離心（5000xg，5 分鐘），收集沈澱及用上述之缓衝溶液清洗數次以除去殘 餘的MNMG。將產生的細胞丸狀物重新懸浮於lml之上述 緩衝溶液中。將所產生的1 ml之懸浮液培養在25ml Todd-Hewitt基質，然後在37°C搖晃培養18小時以增加存活的變 異細胞的數目。 所產生的培養物用生理生鹽水稀釋；將稀釋的溶液塗 復在含5%血液之T〇dd-Hewitt瓊脂基質及在37°C培養48小 時。因為具有溶血能力的菌落會在其周固形成澄清的區 域’而不具澄清區域之菌落即選為缺乏溶血能力之變異 -------------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中固固家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公轚） -9 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 43^313 A7 _____B7___ 五、發明說明（7) 株。 第2)步驟製備不製造玻璃酸酶的菌株 重複上述第1)步驟的相同方法以突變上述第丨）步驟所 得的缺乏溶血能力之變異菌落。將菌落懸浮於及用生理食 鹽水溶液稀釋及塗覆在含有400微克玻璃酸及1%蛋白素 第V部分（Sigma Co.，型錄號碼A-2153)之Todd-Hewitt瓊脂基 質》該培養皿置於濕室在37°C 2至5天後，加入約10ml的 2N己酸鹽溶液，然後讓該培養皿靜置1〇分鐘。玻璃酸和 蛋白素在乙酸鹽溶液中結合而形成沈澱，而使基質變成不 透明的》就製造玻璃酸酶的菌落而言，玻璃酸之分解會形 成透明之周圍區域。因此’選擇具有不透明之周圍區域之 菌落作為無法製造玻璃酸酶之變異菌株β 第3)步驟：製備具有較高的玻璃酸生產力的變異菌株 重複上述第1)步驟之相同方法以突變上述第2)步驟所 得的變異菌落》將該菌落以生理食鹽水溶液稀釋及塗覆在 Todd-Hewitt瓊脂基質。將該培養皿置於濕室在37-C48小 時。在此第3)步驟中，使用獸瘟鏈球菌（ATC{： 35246)作為對 照組。選擇和對照組比起來具有較高黏度及較大的菌落作 為具有較高玻璃酸生產力的變異株。 第4)步驟：製備生產高分子量玻璃酸之菌株 進行下列之篩選方法以自上述第3)步驟所得之變異菌 落中選擇所要的製造高分子量玻璃酸的菌株。 將3克的Todd-Hewitt基質溶於i50ml蒸餾水中，及在 121°C下殺菌該溶液5分鐘。將每個變異菌落分別接種到上 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ----I---,-----一 ---------訂---------線7 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -10 - 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 A7 ___B7_ 五、發明說明（8) 述殺菌過的基質，及在37°C培養15小時作為種源培養物。 在5升的發酵器中加入3升的培養基質，每1升基質含有60 克葡萄糖、1.0克硫酸鎂、2_0克二氩磷酸鉀、5.0克酵母抽 出物' 15.0克酵母疎及0.75克的尿核苷，將該基質在121°C 下蒸氣殺菌20分鐘*然後，加入150ml之上述種源培養物， 及在維持pH值7·1，溫度35°C，通氣速率0.5vvm下培養24 小時。 將培養物過遽通過0.45私m的過濾、器。將濾液經高性 能液相色層分析法處理，藉由選擇菌株其所製造之玻璃酸 流出較快，而得其製造之玻璃酸比獸瘟鏈球菌所生產之玻 璃酸之分子量高許多之變異株。測得本變異株所製造之玻 璃酸之平均分子量為大於3,500 kda。 第5)步驟：該變異株之細菌性質 本發明所得變異株顯示下列之細菌性質： •革蘭氏染色：陽性 •在10°C之生長：無 •在45°C之生長：無 •在6.5%食鹽水中之生長：無 •在pH值9.6中之生長：無 •在40%膽汁中之生長：無 *氨胍戊酸分解性：有 •馬尿酸鹽分解性：無 •七葉樹苷分解性：無 •枯草桿菌素抗性：無 本紙張尺度適用中0國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -11 - 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 3 4-3» 3 A7 ______B7_______ 五、發明說明（9 ) •糖類分解性 •葡萄糖、麥芽糖、蔗糠、山梨醇、乳糖：有 *甘露醇、甘油、繭密菌藻糖：無 如上所見，除了缺乏溶血能力及玻璃酸酶之製造外， 該新的變異株具有描述於伯捷氏檢索細菌學手冊(Berge/s Manual of Determinative Bacteriology)(1974)之默痕鍵球菌 的相同性質，及命名獸瘟鏈球菌LBF 707。 第1比較例：比較玻璃酸之產量 比較實例1第4)步驟所得之獸瘟鏈球菌LBF 707和揪瘟 鏈球菌（ATCC 35246)之玻璃酸產量。如第1圈可見，測得 新的變異微生物之每單位發酵體積之玻璃酸產量比獸瘟鏈 球菌（ATCC 35246)高 20% D 第2比較例：分子量之比較 利用高性能液相相色層分析法比較自上述變異微生物 和獸瘟鏈球菌（ATCC 35246)培養中所得之玻璃酸，及自動 物組織抽出之商品化玻璃酸產品如HEALON (Pharmacia AB，瑞典，批號RH41401)及ARTZ (Biochemical Industry Inc.， 曰本）之分子量。如第2圊所示，本發明變異株獸瘟鏈球 菌LBF707所製造之玻璃酸之分子量最大。 此外，利用黏度測定量測量獸瘟鏈球菌所生產之玻璃 酸和自動物組織抽出之商品化玻璃酸產品如HEAL0N及 AMVISC(Johnson & Johnson，美國）之黏度。如第3囷所示， 本發明之變異株所生產之玻璃酸具有最高的有限特性黏 度。再利用Narlin方程式自有限特性黏度分別計算每個玻 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚> !---.--^------1」.^·!----- 訂---------線 f . <請先閱讀背面之注意事項再填駕本頁> 12 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 • · 1 * A7 _;_______ 五、發明說明（1()) 璃酸產物之分子量。結果，獸瘟鏈球菌LBF 707所製造之 玻璃酸的平均分子量為3,800 kda，HEALON為3,700 kda， 而 AMVISC為 3，100 kda " 實例2 ··在包含尿核苷的基質中之微生物的培養 在每個5升的發酵器中加入3升的培養基質，每升基質 含有60克葡萄糖、1.0克的硫酸鎂、2.0克二氩硫酸鉀、5.0克 的酵母抽出物及15.0克的酵母疎。分別以每升基質0、0.5、 0.75、1.0及2.0克的量將尿核苷加入到發酵器中。將基質 在121 °C蒸氣殺菌20分鐘；然後加入150ml之獸瘟鏈球菌 ATCC 35246之種源培養物，並在pH值維持於7.2，溫度35 °C及通氣速率0.5vvm之下培養24小時。之後，測量每個培 養基質中之玻璃酸濃度；結果示於下表1中。 表1.依據尿核苷濃度之玻璃酸產量 尿核苷在培養基 中之濃度（克/升） 0 (對照組） 0.5 0.75 1.0 2.0 玻璃酸之產量 (克/升） 3.5 4.1 4.8 4.8 5.0 如上表1所示，尿核苷之添加增加了玻璃酸之製造。 第3比較例:比較在含有及不含尿核苷之基質中製造之玻 璃酸的分子量 除了尿核苷的濃度固定在0.75克/升之外’使用相同的 基質組成及培養條件重複實例2所述之相同的培養方法。 當培養完成時，測得培養基質中的玻璃酸濃度約為4.8克/ 升。 本紙張尺度適用中囷國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 434313 A7 B7 五、發明說明（11) 比較本比較例所得之玻璃酸分子量和實例2中作為對 照組之玻璃酸之分子量。第4囷顯示在含有及不含有尿核 苷之基質中製得的玻璃酸之濃度和特性黏度（及有限特性 黏度）之變化。在第4圖中，NH2-Ctrl代表在不含尿核苷之 基質中所得之玻璃酸（實例2，對照組）及NH2-Urid代表在 含有尿核苷之基質中製得之玻璃酸（本比較例，實驗組）。 該對照組之有限特性黏度之數值约為3,000 ml/g，實驗組 的約為3,400 mg/g❶對照組及實驗組的分子量是由將上述 之有限特性黏度數值代入前述之Marlin方程式而計算得， 對照組約為3,000 kda及實驗組3,300 kda。結果顯示在培養 基質中添加尿核苷會增加玻璃酸之分子量。 實例3 :新的玻璃酸之分批培養 在5升的培養器中加入3升的培養基質，每升基質含有 60克葡萄糖、1.〇克硫酸鎂、2.0克二氫磷酸鉀、5.0克酵母 抽出物、15.0克酵母腺及0.75克尿核苷。 該基質在121°C下蒸氣殺菌20分鐘，然後加入150ml之 獸瘟鏈球菌LBF 707種源培養溶液，然後在pH值維持在7.1 至7_3 ’溫度35至38°C，及通氣速率〇,1至1.0 vvm下培養24 小時°當培養完成時，培養基質中玻璃酸濃度為6.0克/升， 而玻璃酸之平均分子量為3,500 kda。 實例4 :新的微生物之添加一分批培養 除了 f]每糖》農度為4 0克/升外，最初以和第3例相同 之基質組成及條件培養。在12至18小時後，轉換成添加一 分批培養’其中加入葡萄糖使得培養中葡萄糖的濃度維持 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 广 填 · 寫裝 頁 訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 14 A7 B7 五、發明說明（12) 在10克/升以下。培養24至36小時直到玻璃酸的濃度不再 增加為止。當培養完成時，培養溶液中玻璃酸的濃度發現 為5.0克/升及玻璃酸之平均分子量約為3,5〇〇 kda。 當以上述特定實施例來招述本發明時，應了解，對熟 習本技藝者而言，非常清楚地可作各種修改及變化，而其 仍在本發明範圍之内如下列申請專利範圍所界定。 k 獸瘟鏈球菌LBF707係以CCRC 910017之寄存蝙號，而 在1994年10月26日被寄存於食品工業發展研究所（中華民 國台灣新竹市）之菌種保存及研究中心（CCRC)中。 -----1 -------裝· ---I---訂-------I * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

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Claims (1)

1. AS R8 : 擎..· 一 i «ΙΓ* y' W \ f丨 ' Γ 1 斧寿^4圍 —Ψ~H R 補充 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第083 103358號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：90年1月 I. 一種用以製備一能生成具有大於3,500 kDa之平均分 子量的玻璃酸之獸疫谜球囷（Sirepiococcw·!· 變異株的方法，該方法包括： 以N-甲基硝基-N-亞硝基胍來突變獸疫鏈球 菌（ATCC 35246)至少3次而製備出變異株；以及 從其中選出具有下列i學特徵之變異株：缺乏溶 血能力與玻璃酸酶活性，且會形成一個較獸疫鏈球菌 ATCC 35246所形成之菌落平均上具有更高黏度與更 大尺寸之g落a 如申請專利範圍第1項之方法*其中該變異株係為獸 疫鏈球菌LBF 707 (寄存編號為CCRC 910017)。 一種製造玻璃酸的方法，其包括培養藉由申請專利範 圍第1或第2項之方法所製得的變異株。 一種以高產量來生產具有高分子量之玻璃酸的方法， 其包括在一含有尿核苷的培養基中培養獸疫鏈球菌 LBF 707 (寄存編號為 CCRC 9100Π)。 5.如申請專利範圍第4項之方法*其中尿核苷之濃度係 為Ό.1至2.0克/升。 I. 3. 度 尺 張 紙 本 適用中國國家標準（CNSU4規格（210 X ‘297公釐） (.請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線· 1 ? 3 δ Ο 1 ΰ 3 3 5 8

   年 Μ 第1圖 第1Α圖 hB·貨質内容 〇·Γ)·，ΗΛ DG，葡萄糖

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   流出時間（分鐘) 4 3 4 31 3 第3圖 (!>0/1曰)鹚锔劫您

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   AS R8 : 擎..· 一 i «ΙΓ* y' W \ f丨 ' Γ 1 斧寿^4圍 —Ψ~H R 補充 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第083 103358號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：90年1月 I. 一種用以製備一能生成具有大於3,500 kDa之平均分 子量的玻璃酸之獸疫谜球囷（Sirepiococcw·!· 變異株的方法，該方法包括： 以N-甲基硝基-N-亞硝基胍來突變獸疫鏈球 菌（ATCC 35246)至少3次而製備出變異株；以及 從其中選出具有下列i學特徵之變異株：缺乏溶 血能力與玻璃酸酶活性，且會形成一個較獸疫鏈球菌 ATCC 35246所形成之菌落平均上具有更高黏度與更 大尺寸之g落a 如申請專利範圍第1項之方法*其中該變異株係為獸 疫鏈球菌LBF 707 (寄存編號為CCRC 910017)。 一種製造玻璃酸的方法，其包括培養藉由申請專利範 圍第1或第2項之方法所製得的變異株。 一種以高產量來生產具有高分子量之玻璃酸的方法， 其包括在一含有尿核苷的培養基中培養獸疫鏈球菌 LBF 707 (寄存編號為 CCRC 9100Π)。 5.如申請專利範圍第4項之方法*其中尿核苷之濃度係 為Ό.1至2.0克/升。 I. 3. 度 尺 張 紙 本 適用中國國家標準（CNSU4規格（210 X ‘297公釐） (.請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線· 1 ? 3 δ Ο 1 ΰ 3 3 5 8

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