CN115074350B - 一种降低d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法 - Google Patents

一种降低d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶酶液酶活力损失的方法，属于制糖技术领域。将D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶酶液进行离心，离心后的去除上清液得发酵菌体，发酵菌体复溶后进行均质操作释放出胞内菌体，然后进一步离心，保留上清液，上清液中加入MgSO4或Na2CO3。本发明处理后的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶酶液仍具有较高的活性，并且酶活力下降到70%的时间延长了四倍，色值降低，电导降低，加入MgSO4或Na2CO3，显著地降低了酶活的损失，有利于D‑阿洛酮糖的后提纯工艺，并提高其制备D‑阿洛酮糖的生产效率。

Description

一种降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法
技术领域
本发明属于制糖技术领域，具体涉及一种降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法。
背景技术
随着经济水平的提高，居民的膳食结构发生变化，肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂等慢性病在全球范围内大流行，因此，人们在饮食中越来越注重糖分的“健康摄取”。D-阿洛酮糖为普遍公认安全食品 (Generally regarded as safe，GRAS)，并可作为食品或食品添加剂的组成成分。D-阿洛酮糖主要来源于少部分植物和少数细菌，其口感接近蔗糖，甜度相当于蔗糖70%，热量相当于蔗糖的 0.3%，可作为食品中蔗糖理想的替代品，与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应，可改变产品品质，又具有低热量、调节血糖、抑制癌变、抗炎等有益人体健康的特殊功能。被美国食品导航网评价为最具潜力的蔗糖替代品。
目前，D-阿洛酮糖的产业化制备方法主要是生物法，且就目前的报道来看利用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制备D-阿洛酮糖的转化率达到33%以上。但D-阿洛酮糖-3-差向异构酶液（发酵液）储存不稳定，易失活，且色值大、电导率高，增加了工业化生产的成本。因此，增加酶液储存稳定性，降低色值或电导就极有意义。
发明内容
针对现有技术中存在的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液储存不稳定，易失活，且色值大、电导率高的问题，本发明提供了一种降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法，处理后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液仍具有较高的活性，并且酶活力下降到70%的时间延长了四倍，色值降低，电导降低，有利于D-阿洛酮糖的后提纯工艺，并提高其生产效率。
本发明通过以下技术方案实现：
一种降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法，将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液进行离心，离心后得发酵菌体，发酵菌体复溶后进行均质操作释放出胞内菌体，然后进一步离心，上清液中加入MgSO4或Na2CO3；
所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液为枯草芽孢杆菌发酵后得到的酶液，枯草芽孢杆菌编号为blb-12-B，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24054。
进一步地，所述的MgSO4在上清液中的浓度为0.1mM，所述的Na2CO3在上清液中的浓度为100mM。
进一步地，所述的均质，运行温度为8-10℃，运行压力为800-900bar。
进一步地，所述的复溶采用HEPES溶液。
在本发明中，采用上述降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法处理D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液，处理后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶仍具有较高的活性，并且酶活力下降到70%的时间延长了四倍，色值降低，电导降低，加入MgSO4或Na2CO3，显著地降低了酶活的损失，有利于D-阿洛酮糖的后提纯工艺，并提高其生产效率。
有益效果
本发明通过对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液（发酵液）进行离心、复溶、均质、离心处理，二次离心后加入MgSO4或Na2CO3，处理后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶仍具有较高的活性，并且酶活力下降到70%的时间延长了四倍，色值降低，电导降低，加入MgSO4或Na2CO3，显著地降低了酶活的损失，有利于D-阿洛酮糖的后提纯工艺，并提高其生产效率。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述所述的枯草芽孢杆菌分离于山东保龄宝生物股份有限公司专用糖车间附近的土壤，并经过诱变（25W紫外线灯20cm照射120s，再进行亚硝基胍诱变处理）处理获得，编号为blb-12-B，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24054。
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活测定：以20mM HEPES，pH 7.5，0.1mM Co2+为缓冲液配置100g/L 的D-果糖作为底物溶液，取2ml底物溶液置于5mL EP管中，于60℃下预热10min，加入0.5ml用缓冲液适当稀释的酶液，混合均匀后准确反应10min，沸水浴10min终止反应。将样品离心后用0.22μm水系滤膜过滤，经高效液相色谱(HPLC)检测D-阿洛酮糖的含量。
酶活力单位定义：在pH 6.5，60℃下，每分钟产生1μmol的D-阿洛酮糖即为一个酶活力单位(U)。
实施例1
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液的制备：
（1）种子培养基：由以下重量百分比的成分组成，蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，余量水，pH6.8；
发酵培养基：由以下重量百分比的成分组成，蛋白胨2.5％，玉米浆粉1％，甘油1％，无水硫酸镁0.05％，磷酸氢二钠0.05％，磷酸二氢钠0.4％，余量为去离子水，pH6.8；
（2）取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）blb-12-B，接种于种子培养基中，在37℃的条件下，增殖培养 10h，制得种子液；
（3）取步骤(1)制得的种子液，按体积比5％的比例接种于发酵培养基中，在33℃下发酵培养，在发酵过程中不断补充发酵培养基，发酵52h，即得D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液（发酵液）；进行酶活测定，测定D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活为680U/ml，色值1.04，电导20000us/cm。
实施例2
（1）取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液进行离心处理，运行转速为5000rpm，时间20min，去除上清液得发酵菌体；
（2）将步骤（1）中的发酵菌体用HEPES复溶，复溶后的体积与原D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液体积相等，随后用均质机进行均质释放出胞内菌体，均质机运行温度为8℃，运行压力为850bar；
（3）将步骤（2）的液体进一步的离心，运行转速为12000rpm，时间4min，保留上清液，向上清液中加入0.1mM CoCl2于4℃保存，每隔一段时间进行酶活、色值、电导测定，60天后，酶活为481U/ml，色值0.028，电导3030us/cm；
（4）另取实施例1制备的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液，直接加入0.1mM CoCl2，于4℃冰箱进行保存，每隔一段时间测定一次酶活，40天后，酶活为480U/ml。
实施例3
（1）取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液进行离心处理，运行转速为5000rpm，时间20min，去除上清液得发酵菌体；
（2）将步骤（1）中的发酵菌体用HEPES复溶，复溶后的体积与原D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液体积相等，随后用均质机进行均质释放出胞内菌体，均质机运行温度为8℃，运行压力为860 bar；
（3）将步骤（2）的液体进一步的离心，运行转速为12000rpm，时间4min，保留上清液，向上清液中加入0.1mM MnSO4•H2O于4℃保存，每隔一段时间进行酶活、色值、电导测定，55天后，酶活为481U/ml，色值0.026，电导3040us/cm；
（4）另取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液，直接加入0.1mM MnSO4•H2O，于4℃冰箱进行保存，每隔一段时间测定一次酶活，35天后，酶活为479U/ml。
实施例4
（1）取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液（发酵液）进行离心处理，运行转速为5000rpm，时间20min，去除上清液得发酵菌体；
（2）将步骤（1）中的发酵菌体用HEPES复溶，复溶后的体积与原D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液体积相等，随后用均质机进行均质释放出胞内菌体，均质机运行温度为9℃，运行压力为880bar；
（3）将步骤（2）的液体进一步的离心，运行转速为12000rpm，时间4min，保留上清液，向上清液中加入MgSO4•H2O使得MgSO4在上清液中的浓度为0.1mM，于4℃保存，每隔一段时间进行酶活、色值、电导测定，50天后，酶活为479U/ml，色值0.030，电导3050us/cm；
（4）另取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液，直接加入0.1mM MgSO4•H2O，于4℃冰箱进行保存，每隔一段时间测定一次酶活，35天后，酶活为478U/ml。
实施例5
（1）取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液进行离心处理，运行转速为5000rpm，时间20min，去除上清液得发酵菌体；
（2）将步骤（1）中的发酵菌体用HEPES复溶，复溶后的体积与原D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液体积相等，随后用均质机进行均质释放出胞内菌体，均质机运行温度为9℃，运行压力为880 bar；
（3）将步骤（2）的液体进一步的离心，运行转速为12000rpm，时间4min，保留上清液，向上清液中加入Na2CO3使得Na2CO3在上清液中的浓度为100mM，于4℃保存，每隔一段时间进行酶活、色值、电导测定，40天后，酶活为479U/ml，色值0.025，电导3220us/cm；
（4）另取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液，直接加入100mM Na2CO3，于4℃冰箱进行保存，每隔一段时间测定一次酶活，20天后，酶活为476U/ml。
对比例1
（1）取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液进行离心处理，运行转速为5000rpm，时间20min，去除上清液得发酵菌体；
（2）将步骤（1）中的发酵菌体用HEPES复溶，复溶后的体积与原D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液体积相等，随后用均质机进行均质释放出胞内菌体，均质机运行温度为9℃，运行压力为880 bar；
（3）将步骤（2）的液体进一步的离心，运行转速为12000rpm，时间4min，保留上清液，向上清液中加入100mM Na2CO3于4℃保存，每隔一段时间进行酶活、色值、电导测定，30天后，酶活为475U/ml，色值0.028，电导3000us/cm；
（4） 另取实施例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液，于4℃冰箱进行保存，每隔一段时间测定一次酶活，15天后，酶活为476U/ml，色值 1.04 ，电导20000us/cm。

Claims (4)

1.一种降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法，其特征在于，将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液进行离心，离心后得发酵菌体，发酵菌体复溶后进行均质操作，然后进一步离心，上清液中加入Na2CO3；
所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液为枯草芽孢杆菌发酵后得到的酶液，枯草芽孢杆菌编号为blb-12-B，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24054。
2.根据权利要求1所述的降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法，其特征在于，所述的Na2CO3在上清液中的浓度为100mM。
3.根据权利要求1所述的降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法，其特征在于，所述的均质，运行温度为8-10℃，运行压力为800-900bar。
4.根据权利要求1所述的降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法，所述的复溶采用HEPES溶液。
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