CN102002097B

CN102002097B - 能与乳链菌肽结合的突变体蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102002097B
Application number: CN 200910092199
Authority: CN
Inventors: 钟瑾; 胡红梅; 孙志增; 刘家乐; 还连栋
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2009-09-03
Filing date: 2009-09-03
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2029-09-03
Also published as: CN102002097A

Abstract

本发明公开了一种能与乳链菌肽结合的突变体蛋白。本发明提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能结合乳链菌肽并且不降解乳链菌肽的由序列2衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。本发明工程菌中表达的NSRS236A通过结合nisin分子，降低了工程菌菌体表面的nisin浓度，增强了工程菌对nisin的抗性水平，从而使nisin的表达量得以提高。

Description

能与乳链菌肽结合的突变体蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及能与乳链菌肽结合的突变体蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

乳链菌肽(nisin)是某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的一个小肽，对引起食品腐败和对人体健康有害的葡萄球菌、链球菌、分支杆菌、李斯特氏菌等许多革兰氏阳性菌有强烈抑制作用，且对人体安全无毒，是一种被世界50多个国家和地区广泛应用于罐头食品、肉制品、乳制品等领域的高效天然食品防腐剂。同时，乳链菌肽在医药和轻工等领域也极具应用潜力。近年来，随着回归大自然的呼声日益高涨，用高效、无毒的天然防腐剂取代传统的化学合成防腐剂是保障人类健康的迫切需要，也是世界潮流所趋，因此乳链菌肽的生产和应用能同时产生良好的经济效益和社会效益。

为能更好地推动乳链菌肽的广泛应用，进一步提高乳链菌肽产生菌的发酵效价、提高乳链菌肽产量、降低成本等成为乳链菌肽研究者和生产者面临的重要课题。传统的菌种诱变筛选、发酵工艺改良等手段虽能在一定程度上提高产量，但存在过程繁琐、工作量大且成功率低等不足。而随着对乳链菌肽生物合成过程的逐步深入了解和乳酸菌基因工程手段的完善和提高，通过基因工程的手段来提高乳链菌肽的产量在近年来已逐步引起了研究者和生产者的关注。成熟的nisin分子由34个氨基酸组成，分子量约为3510Da。其生物合成基因簇包含结构基因(nisA)、成熟基因(nisBTCP)、免疫基因(nisI，nisFEG)及调控基因(nisRK)等，在核糖体上合成前乳链菌肽(prenisin)分子后，通过翻译后修饰产生羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸，并在切除前导肽后赋予nisin分子以抑菌活性。

在了解nisin生物合成过程的基础上，目前已有尝试通过基因工程手段提高其产量的报道。如Cheigh CI等尝试通过增加nisin生物合成中的结构基因nisZ、调控基因nisKR以及免疫基因nisFEG的拷贝数的方法来提高乳链菌肽产量，结果发现nisZ的增加没有效果，而nisKR及nisFEG拷贝数的增加虽在一定程度上提高了产量，但却影响了菌体的生长速度(Cheigh et al.Biotechnology Letters(2005)27：155-160)；Wu Z等利用Mu转座复合体突变技术筛选出影响nisin产量的12个突变体，但没有一个能提高产量且其中三个突变体的产量显著降低(Wu et al.Journalof Applied Microbiology(2009)106：41-48)；Kim W等利用转入包含免疫基因nisI的60kb大质粒，获得了一定的提高产量的结果(Kim W et al.Applied MicrobiologyBiotechnology(1998)50：429-433)。后期研究结果发现，NisI蛋白在体外与nisin结合能提高其活性(Koponen O et al.FEMS Microbiology Letters (2004)231：85-90)；定位于产生菌细胞膜上的NisI蛋白表达量的增加可结合更多的nisin分子，从而提高了产生菌自身抵抗nisin的能力，使得nisin产量也得以提高。由上可见，利用nisin产生菌中的免疫蛋白NisI与nisin分子结合的特性，在细胞表面阻止nisin对自身菌体的破坏，增强菌体对nisin的抗性，是提高nisin产量的一条可行途径。

在一些不产生nisin却对nisin有天然抗性的菌株中，是不含有NisI免疫蛋白的，其对nisin的抗性是由nisin抗性基因(nisin resistance gene，nsr)编码的一个分子量约为35kDa的nisin抗性蛋白(nisin resistance protein，NSR)决定的。汤莎等从新鲜牛奶样品中分离得到一株不产nisin但具nisin抗性的乳酸乳球菌菌株L.lactis TS1640，经抗性检测、PCR扩增和DNA序列测定等证明其含有nisin抗性基因nsr，该基因编码318aa的NSR(汤莎等，微生物学报(2001)41：536~541)。NSR蛋白C末端存在一个保守的末端特异性蛋白酶结构域，体内体外研究结果表明NSR能行使蛋白酶功能，特异性地从nisin分子的C末端降解nisin，使其抑菌活性大大降低，从而行使乳链菌肽抗性功能(Sun Z et al.Antimicrobial Agents andChemotherapy(2009)53：1964-1973)

发明内容

本发明的目的是提供一种能与乳链菌肽结合的突变体蛋白。

本发明提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能结合乳链菌肽并且不降解乳链菌肽的由序列2衍生的蛋白质。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。

上述的编码基因，是如下1)或2)或3)的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1自5’端的第186位到第1139位所示的基因；

2)在严谨条件下与1)限定的基因杂交且编码上述的蛋白的基因；

3)与1)限定的基因具有90％以上的同源性且编码上述蛋白的基因。

上述编码基因可具体为序列表中序列1所示。

上述严谨条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述的编码基因的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体中的启动上述的编码基因转录的启动子是乳酸菌组成型强启动子；所述乳酸菌组成型强启动子为P59。

所述重组载体是将P59和上述的编码基因导入pHJ201的多克隆位点中，得到的重组表达载体。

上述P59的序列如序列1的自5’端第1-185位所示。

上述载体pHJ201构建方法：用EcoRI和HindIII酶切pMG36e质粒(购自荷兰NIZO研究所)，回收大片段，将nisZ前体基因(包含启动子，序列如序列表中序列4所示)的片段同样用EcoRI和HindIII酶切，与回收的pMG36e的大片段相连，得到载体pHJ201。

含有上述基因的重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

上述重组菌是将任一上述的重组载体导入乳酸菌中，得到重组乳酸菌；所述乳酸菌优选是L.lactis NZ9800。

本发明的另一目的在于提供一种生产乳链菌肽的方法，是将上述的重组菌经过发酵培养，获得乳链菌肽。

上述发酵培养的条件是以1∶100转接培养过夜的乳酸菌于含红霉素为5ug/ml的GM17(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，维生素C 0.05％，β-甘油磷酸钠1.9％，硫酸镁1mmol/L)培养基中于30℃静置培养。

本发明的原理是对乳链菌肽抗性蛋白NSR保守结构域的分析，其Ser236在所有末端特异性蛋白酶中均保守，是其可能的活性中心，因此将236位丝氨酸突变为丙氨酸能使其丧失对nisin的降解作用。将突变的乳链菌肽抗性基因nsrS236A克隆进表达nisin的乳酸菌表达载体，得到通过乳链菌肽抗性蛋白突变体NSRS236A的表达而提高nisin产量的乳酸菌工程菌。

实验结果表明，乳链菌肽抗性蛋白突变体NSRS236A可以结合nisin分子而不会对其行使降解功能；本发明工程菌中表达的NSRS236A通过结合nisin分子，降低了工程菌菌体表面的nisin浓度，增强了工程菌对nisin的抗性水平，从而使nisin的表达量得以提高。

附图说明

图1为NSR定点突变技术原理示意图。

图2为重组表达载体的构建示意图，其中，A为pHMRS236A构建示意图；B是pSZ321的构建示意图；C为pSZ551的图谱。

图3为重组菌L.lactis NZ9800/pHMRS236A转化子的酶切鉴定图。

图4为重组菌L.lactis NZ9800/pHMRS236A转化子的PCR鉴定图。

图5为乳链菌肽抗性蛋白突变体NSRS236A降解nisin功能的HPLC的分析图；

图6为工程菌L.lactis NZ9800/pHMRS236A及不表达NSRS236A对照菌株的发酵液上清对指示菌黄色微球菌NCIB8166的抑菌活性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、提高乳链菌肽产量的工程菌的构建及其检测

一、提高乳链菌肽产量的工程菌的构建

1、通过基因定点突变技术获得突变的乳链菌肽抗性基因nsrS236A

nsr的定点突变示意图见图1。每条引物中基因特异性的部分均用箭头表示，上游(F)和下游(R)引物分别标以灰色和黑色，而带斜线部分为长引物(F_T和R_T)中的5’适配尾巴(包含拟突变部位)。

具体操作步骤如下：

1)构建pUC18-nsr质粒(汤莎等，微生物学报(2001)41：536～541)：将1947bP的含nsr基因的片段(序列表中序列3所示的核苷酸)连接于pUC18载体(pUC18购自Takara公司)。以pUC18-nsr质粒为模板，Nsr S236A F_T、Nsr S236A R_T、Nsr S236AF_S和Nsr S236A R_S为引物进行PCR扩增，其中，

Nsr S236A F_T是：5’-GGGCATCCGGCGAATTAACCGCTTTGTGCTTTAAGGGGA-3’；

Nsr S236A R_T是：5’-TAATTCGCCGGATGCCCCTGTATTATTATCTATTAATAC-3’；

Nsr S236A F_S是：5’-ACCGCTTTGTGCTTTAAGGGA-3’；

Nsr S236A R_S是：5’-TGTATTATTATCTATTAATAC-3’，

PCR反应体系包括：

10×Pyrobest Buffer 2.5μl

dNTP 2μl

pUC18-nsr(约1ng/μl) 1μl

Nsr S236A F_T(10μM) 2μl

Nsr S236A R_T(10μM) 2μl

Nsr S236A F_S(10μM) 2μl

Nsr S236A R_S(10μM) 2μl

Pyrobest 0.2μl

dH₂O 11.3μl

PCR反应的条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，42℃退火30sec，72℃延伸8min，进行25个循环后，72℃再延伸10min；

2)纯化PCR产物，溶解于44μl去离子水中，加入5μl 10×Buffer 4及1μl Dpn I酶，置37℃水浴中反应1h，以消化模板DNA(pUC18-nsr质粒)；

3)纯化酶切产物，溶解于20μl杂交缓冲液(100mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA(pH 8.0))中，94℃变性3min后，进行4个循环的退火杂交反应(65℃2min，25℃15min)；

4)取5μl反应产物转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含有Amp(100μg/ml)的LB平板上；

5)倒置于37℃温箱培养过夜；

6)挑取单菌落接种于含有Amp(100μg/ml)的LB培养基中，37℃震荡培养过夜；

7)提取质粒DNA，Sac I酶切鉴定(因突变位点正好处于Sac I识别序列中)；

8)测序验证，保存含有正确突变(对Sac I酶切不敏感)的质粒，命名为pUC18-nsrS236A。其中，nsrS236A的核苷酸序列具有序列表中序列1自5’端的第186位到第1139位所示，其编码序列表中序列2的第1位到第318位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2、重组载体的构建

载体构建示意图如图2A所示。

中间载体pSZ130的构建：P59(制备序列1的自5’端第1-185位所示的P59片段，并在该片段两端分别加上EcoRI和SacI酶切位点)插入pUC18的EcoRI和SacI酶切位点之间，得到中间载体pSZ130(图2A)。

从步骤1得到的pUC18-nsrS236A质粒上用SacI和PstI酶切下nsrS236A片段，中间载体pSZ130用相同的限制性内切酶进行酶切，用T4DNA连接酶在16℃下反应16小时，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100ug/mL氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，命名为pSZ132。

因设计的nsr下游引物带有EcoRI酶切位点，同时pSZ132上的启动子P59的上游也带有EcoRI酶切位点，因此用EcoRI限制性内切酶进行单切切下p59nsrS236A片段；载体pHJ201(陈秀珠等，遗传学报，2001，28(3)：285-290，图谱见图2A)(载体pHJ201构建方法：用EcoRI和HindIII酶切pMG36e质粒(购自荷兰NIZO研究所)，回收大片段，将nisZ前体基因(包含启动子，序列如序列表中序列4所示)的片段同样用EcoRI和HindIII酶切，与回收的pMG36e的大片段相连)也经EcoRI酶切，载体片段用碱性磷酸酶进行脱磷处理，外源片段和载体片段用T4连接酶连接，在16℃下反应16小时，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100ug/mL红霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，命名为pHMRS236A。用限制性内切酶EcoRI进行酶切鉴定，经单酶切能获得1157bp片段(p59nsrS236A)的质粒为阳性克隆。

根据p59nsrS236A设计如下的引物，对阳性克隆质粒进行PCR鉴定，得到1157bp片段，其中引物如下：

引物1：5’-CGGAATTCTAACCAAAGAAGCGCGTAATATC-3′；

引物2：5’-CGGAATTCCTTTATTTGAGATTTTATC-3′。(划线部分为酶切位点)

再经测序验证，发现nsrS236A的核苷酸序列如序列1的自5’端的第186位到1139位所示；p59的核苷酸序列如序列1的自5’端的第1位到第185位所示。

3、工程菌的构建

将步骤2中的经验证过的表达载体pHMRS236A转化乳酸乳球菌L.lactis NZ9800(购自荷兰NIZO研究所)，用含5μg/mL红霉素的SGM17抗性平板(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，蔗糖17.1％，维生素C 0.05％，β-甘油磷酸钠1.9％，硫酸镁1mmol/L)筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒。

用限制性内切酶EcoRI对重组质粒进行酶切鉴定，结果如图3(泳道1上的样品是质粒pHMRS236A，并没有酶切的，用它检测是否酶切完全的对照，泳道2为L.lactisNZ9800/pHMRS236A的EcoRI酶切图，3为marker)所示，经单酶切能获得1157bp片段(P59nsrS236A)。

对阳性转化子中的重组质粒进行PCR鉴定，以步骤2中提供的相应引物为引物，分别针对p59nsrS236A，结果如图4所示，其中泳道1为阴性对照(pHJ201作PCR模板)，2为阳性对照(pSZ132作PCR模板)，3为针对p59nsrS236A进行的PCR鉴定，5为marker，鉴定正确后，将得到的工程菌命名为L.lactis NZ9800/pHMRS236A。

按照获得工程菌L.lactis NZ9800/pHMRS236A的方法，将pHJ201转化乳酸乳球菌L.lactis NZ9800，得到对照菌，然后对照菌进行EcoRI酶切鉴定，结果如图3(泳道4-5为L.lactis NZ9800/pHJ201的EcoRI酶切图)所示，说明pHJ201已经成功转入乳酸乳球菌L.lactis NZ9800，鉴定正确的对照菌命名为L.lactis NZ9800/pHJ201。

二、检测分析

抑菌活性测定：以nisin标准品作为对照，国际上定义1ug nisin纯品(浙江银象生物工程有限公司提供)的活性为40IU，用0.02mol/L的盐酸溶解nisin标准品，做对指示菌黄色微球菌NCIB8166的抑菌活性实验，检测其抑菌圈直径，根据直径大小作标准曲线，再根据标准曲线公式计算出待测样品的活性。

用琼脂扩散法测定工程菌发酵液上清的抑菌活性及乳链菌肽的产量，指示菌为黄色微球菌NCIB8166(购自中国为生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，该指示菌用SI培养基(胰胨0.8％；酵母粉0.5％；葡萄糖0.5％；NaCl 0.5％；Na₂HPO₄0.2％，Tween-201ml；琼脂1％)划线培养。

将工程菌L.lactis NZ9800/pHMRS236A和对照菌L.lactis NZ9800/pHJ201按1∶1000的比例接到3ml的含红霉素为5ug/ml的GM17(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，维生素C 0.05％，β-甘油磷酸钠1.9％，硫酸镁1mmol/L)于30℃过夜静置培养，用新鲜的相同的培养基将两者的OD值调至相同，然后按1∶100的比例接种到100ml新鲜的GM17培养基中(5ug/ml红霉素)，发酵6小时后开始取样，以后每隔两个小时取样，共取5次，每次取样体积均为1ml。用12000rpm离心15分钟，取上清液。

挑取一环黄色微球菌NCIB8166于0.5ml生理盐水中悬浮混匀，加入融化的20mlSI固体培养基中混匀，倒入Φ90mm的培养皿，平放，待凝固，然后用直径7mm的打孔器在含黄色微球菌NCIB8166的平板上打孔，每孔加入上述的待测菌的发酵上清液30μl，于超净台中吹干，4℃冰箱放置2h后再于30℃培养16h，测定抑菌圈大小。重复三次取平均值。检测工程菌L.lactis NZ9800/pHMRS236A及对照菌株L.LactisNZ9800/pHJ201经不同发酵时间的发酵液上清对指示菌的抑菌活性及乳链菌肽的产量，结果如图6和表1所示，在发酵6h和8h时，表达NSRS236A的工程菌L.LactisNZ9800/pHMRS236A的抑菌活性分别达到对照菌株L.LactisNZ9800/pHJ201的3.58倍和2.70倍，表明在发酵6h时，表达NSRS236A的工程菌即可大幅度地提高nisin的产量，且发酵周期得以缩短。

表1工程菌L.LactisNZ9800/pHMRS236A与对照菌L.Lactis NZ9800/pHJ201中nisin产量的比较

三、机理分析

1、表达NSRS236A的乳酸菌L.lactis MG1363降解nisin活性的测定

以不产生nisin的菌株(L.lactis MG1363)为实验菌株，将重组载体pSZ551按照步骤一提供的方法转化L.lactis MG1363，经过酶切鉴定和PCR鉴定，将正确的重组菌命名为L.lactis MG1363/pSZ551。

其中，pSZ551的构建方法如下：在步骤一构建pHMRS236中，只要将出发载体pHJ201换成pMG36e(pMG36e购自荷兰NIZO研究所)，其余步骤完全相同，就能构建出pSZ551(图2C)。

按照Stein等人的肽释放实验方法(Stein，T.，Heinzmann，S.，Solovieva，I.，and Entian，K.D.2003，Function of Lactococcus lactis nisin immunity genesnisI and nisFEG after coordinated expression in the surrogate host Bacillussubtilis.J Biol Chem 278，89-94)进行降解nisin活性的测定。

具体操作步骤如下：

(1)以1∶100转接培养过夜的乳酸菌L.lactis MG1363和表达NSRS236A的乳酸菌L.lactis MG1363/pSZ551的发酵液至50ml新鲜配制的GM17(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，维生素C 0.05％，β-甘油磷酸钠1.9％，硫酸镁1mmol/L)中(各试剂为分析纯试剂)，在红霉素Em抗性的L.lactis MG1363重组菌中加入5μg/ml Em；

2)将步骤1)的两种菌株在30℃下静置培养至OD₆₀₀达0.6；4℃，4000g，离心10min，收集沉淀(菌体)；

3)菌体沉淀用细胞洗涤液(50mM Tris-HCl pH 6.0)洗涤两次，重悬于1ml活性定缓冲液中(50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)，1MNaCl，1g/100ml的葡萄糖)。

4)往步骤3)得到的重悬浮缓冲液中，加入100μg nisin Z纯品(浙江银象生物工程有限公司提供)，30℃，120rpm，水平摇床中保温30min，然后在4℃下12000g，离心10min，收集上清和沉淀(菌体)，至此，得到L.lactis MG1363与nisin混合培养后的上清和沉淀；也得到L.lactis MG1363/pSZ551与nisin混合培养后的上清和沉淀；

5)将步骤4)中的L.lactis MG1363/pSZ551与nisin混合培养后的菌体沉淀用活性测定缓冲液洗涤一次，重悬于1ml肽洗脱液中(20％ACN，0.1％TFA)，然后30℃，120rpm，水平摇床中保温5min，用肽洗脱液洗脱结合在细胞上的肽，得到含细胞上的肽的洗脱液；

6)将步骤5)中的含细胞上的肽的洗脱液，在4℃下、12000g离心10min，收集上清，至此，得到L.lactis MG1363/pSZ551与nisin混合培养后的细胞组分。

取步骤4)和6)中的上清各200μl进行HPLC检测，其中HPLC的条件是：Waters600HPLC系统和C-18SinoChrom ODS-BP 5μm 4.6mm×250mm RP-HPLC柱(大连以利特)进行分离。分离条件：10-50％(ACN+0.1％TFA)梯度洗脱15min后，再用90％(ACN+0.1％TFA)洗脱5min。流速为1ml/min，在220nm光吸收条件下检测洗脱物。

结果见图5(A是L.lactis MG1363与nisin混合培养后的上清；B是L.lactisMG1363/pSZ551与nisin混合培养后的上清；C是L.lactis MG1363/pSZ551与nisin混合培养后的细胞组分)。从图中可以看出，表达的NSR突变体NSRS236A的细胞没有降解nisin的功能。

2、表面等离子共振技术检测NSRS236A对底物nisin的结合能力

为了增加蛋白NSRS236A的表达量，本实验将重新构建含有nsrS236A的重组表达载体，并转化大肠杆菌，进行诱导表达。

1)NSRS236A蛋白的表达与纯化

以上述pSZ132质粒为模板，Nsr EcoR I 5’和Nsr Xho I 3’为引物进行PCR扩增：

Nsr EcoR I 5’：5’-CGGAATTCAAATTCAACATATATTTAGTAC-3’；

Nsr Xho I 3’：5’-CCGCTCGAGTTACTTTATTTGAGATTTTAT-3’。

PCR扩增出971bp的片段，将该片段插入pGEX-6P-1质粒(GE Healthcare)的EcoR I和Xho I酶切位点之间，构建成的重组质粒命名为pSZ321(图2B)，经测序验证，证明pSZ321的序列和结构正确。氯化钙法将验证过的pSZ321转化大肠杆菌E.coli BL21，鉴定得到正确的转化子。

以1∶100转接培养过夜的E.coli BL21/pSZ321发酵液至1L新鲜LB(Amp，100μg/ml)中，37℃，220rpm震荡培养；当菌液浓度至600nm波长的吸光值为0.6-0.8(对数生长中期)时，加入IPTG至终浓度为0.6mM；16℃，160rpm，继续培养6h。12000g，离心5min收集菌体；用PBS洗涤菌体沉淀一次，将沉淀重悬于1/20体积的PBS中；超声破碎菌体，12000g，离心5min，收集上清，用等体积的PBS重悬沉淀；上清和沉淀经SDS-PAGE分离。

吸取1.33ml GSH Sepharose 4B凝胶珠悬浮液，加入空层析柱(BioRad)；向柱中加入10倍柱床体积(10ml)的冷PBS，平衡介质。将制备好的菌体超声物加入平衡好的层析柱中，加入10ml冷PBS，冲洗层析柱，层析柱中加入10ml PreScission酶切缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.0)，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇(Dithiotheitol，DTT))，平衡介质；取920μl酶切缓冲液，加入80μl PreScission蛋白酶，将PreScission蛋白酶混合液加入层析柱中，4℃，放置过夜；再向层析柱中加入2ml PreScission酶切缓冲液，收集流出液体，即为NSR S236A。将Superdex^TM7510/300GL预装层析柱(GE Healthcare)安装在AKTA FPLC蛋白纯化仪(AmershamBiosciences)上，用2倍柱体积的去离子水冲洗层析柱后，再用2倍柱体积的凝胶过滤层析流动相(50mM Tris-HCl(pH 7.0)，150mM NaCl，1mM EDTA)平衡层析柱。将处理后的NSRS236A蛋白样品经0.5ml样品环上样。流动相流速设定为0.3ml/min，流出物检测波长设定为280nm，自动收集流出物。SDS-PAGE检测流出物中的各个信号峰所对应的产物，将含有NSRS236A单体分子的各管收集物合并后，超滤浓缩，得到纯化的NSRS236A蛋白。

采用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance technology，SPR)检测NSR变体蛋白NSRS236A与乳链菌肽分子nisin之间的相互作用，使用的是BIACRO3000(GE Healthcare)蛋白互作仪。底物nisin纯品购自浙江银象生物工程有限公司(浙江，天台)，溶于HBS-EP Buffer(0.1M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％Twteen 20)中至终浓度为100μM；纯化的NSRS236A蛋白样品则用HBS-EPBuffer稀释为三个浓度2μM、5μM、10μM。

通过SPR亲和反应测定获取NSRS236A蛋白样品与底物nisin的结合速率常数(Ka)和解离速率常数(Kd)动力学参数。结果如表2所示，NSR236A与nisin的解离常数Kd值为7.27e^-6，而一般Kd值在10^-4至10^-5时表明两者就有结合作用，而解离常数越小，说明两个蛋白的结合能力越强。因此解离常数Kd值为7.27e^-6说明NSRS236A和nisin分子有较强的结合能力。

表2.通过SPR亲和反应测定获取待测样品与底物nisin的结合速率常数(K_a)和解离速率常数(K_d)动力学参数

	Ka(1/M)	Kd(M)	Rmax	n	Chi2
						NSRS236A	1.38e⁵	7.27e^-6	79	6.08
Req vs.Conc				1

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>能与乳链菌肽结合的突变体蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARL92516

<160>4

<210>1

<211>1139

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

taaccaaaga agcgcgtaat atcagggttt aagagacaat aagaaaaaga gattgaaaaa 60

gtgacattaa attcttgaca gggagagata ggtttgatag aatataatag ttgtcgcgag 120

agacgagcgt tgaagcgcga taaactagac cattgaaaac tgaataaaga aggagaatat 180

ttaatatgaa aataggtaag cgaattttat taggtttagt gtcagtatgt gctttatttt 240

taggaattat ctatttttgg gggtataaat tcaacatata tttagtacca ccctcccctc 300

agaagtatgt tcgagttgcc ttaaaaaata tggatgaact tgggctattt actgattcaa 360

aagaatgggt agaaactaaa aaaaagacga tagaagaaac atcacatgct aaaaactatg 420

cagaaacaat ccctttttta caaaaagcga ttaaagttgc aggaggaaag cattctttta 480

ttgaacatga agaagacata tcaaaaagaa gcattacaaa atatataaaa ccaaaggcag 540

aaatcgaagg caacacttta atattaacta ttcctgaatt tactggaaat gatagtcaag 600

catctgatta cgctaatttt ttagaatctt cattgcataa aaacaactat aatggggtaa 660

ttgttgattt gagggggaat agaggtggag acttatctcc tatggtatta ggattatccc 720

ccctattgcc tgatggaact ctatttactt atgttgataa aagtagtcat tctaaacctg 780

ttgaactaca aaatggagaa ataaatagtg gcgggtcatc aacaaaaata agtgataata 840

aaaaaattaa aaaagctcct attgctgtat taatagataa taatacaggg gcatccggcg 900

aattaaccgc tttgtgcttt aagggaatac ctaatgttaa atttttgggt tctgattcag 960

caggttatac ttctgctaat caaaccgtct atttatatga tggctcaaca ttacaaataa 1020

cttctgcttt tgtaaaagac agaacaaata atatttataa aaattttcct attagtccgg 1080

acattcaaac aaataatgct aaacgttctg caatagaatg gataaaatct caaataaag 1139

<210>2

<211>318

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

Met Lys Ile Gly Lys Arg Ile Leu Leu Gly Leu Val Ser Val Cys Ala

1 5 10 15

Leu Phe Leu Gly Ile Ile Tyr Phe Trp Gly Tyr Lys Phe Asn Ile Tyr

20 25 30

Leu Val Pro Pro Ser Pro Gln Lys Tyr Val Arg Val Ala Leu Lys Asn

35 40 45

Met Asp Glu Leu Gly Leu Phe Thr Asp Ser Lys Glu Trp Val Glu Thr

50 55 60

Lys Lys Lys Thr Ile Glu Glu Thr Ser His Ala Lys Asn Tyr Ala Glu

65 70 75 80

Thr Ile Pro Phe Leu Gln Lys Ala Ile Lys Val Ala Gly Gly Lys His

85 90 95

Ser Phe Ile Glu His Glu Glu Asp Ile Ser Lys Arg Ser Ile Thr Lys

100 105 110

Tyr Ile Lys Pro Lys Ala Glu Ile Glu Gly Asn Thr Leu Ile Leu Thr

115 120 125

Ile Pro Glu Phe Thr Gly Asn Asp Ser Gln Ala Ser Asp Tyr Ala Asn

130 135 140

Phe Leu Glu Ser Ser Leu His Lys Asn Asn Tyr Asn Gly Val Ile Val

145 150 155 160

Asp Leu Arg Gly Asn Arg Gly Gly Asp Leu Ser Pro Met Val Leu Gly

165 170 175

Leu Ser Pro Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu Phe Thr Tyr Val Asp Lys

180 185 190

Ser Ser His Ser Lys Pro Val Glu Leu Gln Asn Gly Glu Ile Asn Ser

195 200 205

Gly Gly Ser Ser Thr Lys Ile Ser Asp Asn Lys Lys Ile Lys Lys Ala

210 215 220

Pro Ile Ala Val Leu Ile Asp Asn Asn Thr Gly Ala Ser Gly Glu Leu

225 230 235 240

Thr Ala Leu Cys Phe Lys Gly Ile Pro Asn Val Lys Phe Leu Gly Ser

245 250 255

Asp Ser Ala Gly Tyr Thr Ser Ala Asn Gln Thr Val Tyr Leu Tyr Asp

260 265 270

Gly Ser Thr Leu Gln Ile Thr Ser Ala Phe Val Lys Asp Arg Thr Asn

275 280 285

Asn Ile Tyr Lys Asn Phe Pro Ile Ser Pro Asp Ile Gln Thr Asn Asn

290 295 300

Ala Lys Arg Ser Ala Ile Glu Trp Ile Lys Ser Gln Ile Lys

305 310 315

<210>3

<211>1948

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>3

gaattcgtca tttttacggt atttcacaaa acgcagaaat caaagaaaca gacaactggt 60

atcaacccat gcttaagtta gagcaaaaag tagcgaaaga ccaaacgctg tatccagtcg 120

cacgattaca tcatttgata tttaaaaaaa actaaggaga atatttaata tgaaaatagg 180

taagcgaatt ttattaggtt tagtgtcagt atgtgcttta tttttaggaa ttatctattt 240

ttgggggtat aaattcaaca tatatttagt accaccctcc cctcagaagt atgttcgagt 300

tgccttaaaa aatatggatg aacttgggct atttactgat tcaaaagaat gggtagaaac 360

taaaaaaaag acgatagaag aaacatcaca tgctaaaaac tatgcagaaa caatcccttt 420

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ttttttagaa tcttcattgc ataaaaacaa ctataatggg gtaattgttg atttgagggg 660

gaatagaggt ggagacttat ctcctatggt attaggatta tcccccctat tgcctgatgg 720

aactctattt acttatgttg ataaaagtag tcattctaaa cctgttgaac tacaaaatgg 780

agaaataaat agtggcgggt catcaacaaa aataagtgat aataaaaaaa ttaaaaaagc 840

tcctattgct gtattaatag ataataatac agggagctcc ggcgaattaa ccgctttgtg 900

ctttaaggga atacctaatg ttaaattttt gggttctgat tcagcaggtt atacttctgc 960

taatcaaacc gtctatttat atgatggctc aacattacaa ataacttctg cttttgtaaa 1020

agacagaaca aataatattt ataaaaattt tcctattagt ccggacattc aaacaaataa 1080

tgctaaacgt tctgcaatag aatggataaa atctcaaata aagtaaagca aaaagacttg 1140

ccaagaaaaa catatggtaa gtcttttttg ctagtcaaaa cttaacgtta tttactatga 1200

tataccgaaa gcaagtacca atgcaggtaa aatgttgttt aaaaagtgta tagctatact 1260

aacttctaat cgtcttgtct taaagtaagc tatagcacag gtcaatccaa ttaaaccata 1320

aataagaaaa ctgatgatgt ttgttgggga gtgcatcaac ccaaaaagca cactacttac 1380

aataattcca acaactggaa ggtctttaaa taaatagccg acaattcctc ctctaaatac 1440

gatttcttcc attattggag ctgcaatccc aataagtaag ataattaata atgggttttc 1500

acctgtaaaa agttgtccta tcgtttcatc atttgccgtc tgtgtgactc ctgtggcatt 1560

aagcaataat gtaccaccaa ttccggcagt ccgagcaatt agggtaccca ctaagatgta 1620

tataatgttt ttcttagtga ggaaatcttt gcttggcgtt aaaaagccta actttttacc 1680

taaatacatt aataagtaga tattccccac aataaatata attagaatga gtacagctag 1740

taaggataac ttgtgtgcac cggtttctaa agaaaaacct tttgctcctc cataaacagc 1800

catccctatt tgactgagta ttgcaagacc caatacaata aaaaatttct taatataatt 1860

caaaattctt ttccaacttt cattaataga ttaaatttag ggtactggaa atttttataa 1920

cagaaccctt tttattcttt ttgaattc 1948

<210>4

<211>411

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>4

gatataggtt tattgagtct tagacatact tgaatgacct agtcttataa ctatactgac 60

aatagaaaca ttaacaaatc taaaacagtc ttaattctat cttgagaaag tattggtaat 120

aatattattg tcgataacgc gagcataata aacggctctg attaaattct gaagtttgtt 180

agatacaatg atttcgttcg aaggaactac aaaataaatt ataaggaggc actcaaaatg 240

agtacaaaag attttaactt ggatttggta tctgtttcga agaaagattc aggtgcatca 300

ccacgcatta caagtatttc gctatgtaca cccggttgta aaacaggagc tctgatgggt 360

tgtaacatga aaacagcaac ttgtaattgt agtattcacg taagcaaata a 411

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因是序列表中序列1自5’端的第186位到第1139位所示的基因。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体中，启动权利要求2或3所述的编码基因转录的启动子是乳酸菌组成型强启动子；所述乳酸菌组成型强启动子为P59。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将P59和权利要求2或3所述的编码基因导入pHJ201的多克隆位点中，得到的重组表达载体。

7.根据权利要求5或6所述的重组载体，其特征在于：所述P59的序列如序列1的自5’端第1-185位所示。

8.含有权利要求2或3所述基因的重组菌或转基因细胞系。

9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求4-7任一所述的重组载体导入乳酸菌中得到的重组乳酸菌；所述乳酸菌是L.lactis NZ9800。

10.一种生产乳链菌肽的方法，是将权利要求8或9所述的重组菌经过发酵培养，获得乳链菌肽。