CN111748541B - 一种产mdp的酶制剂在维持肠道稳态中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明首次证实了一类蛋白具有水解肽聚糖产生MDP的酶功能，可用于制备产MDP的酶制剂；产MDP的酶制剂经证实具有以下至少一种功能：(a)改善肠稳态失调；(b)减轻肠道过度炎症反应；(c)减少肠屏障通透性；(d)改善肠道菌群失调；(e)治疗克罗恩病；(f)治疗溃疡性结肠炎；(g)治疗肠源性感染；(h)治疗伤寒沙门氏菌感染。因此，本发明的方案为全方位调节肠道稳态提供了新的思路，具有广阔的应用前景。

Description

一种产MDP的酶制剂在维持肠道稳态中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地涉及，一种产MDP的酶在维持肠道稳态中的用途。

背景技术

肠道稳态是指肠道菌群、肠上皮屏障和肠道免疫三者之间的平衡状态。在健康状态下，肠道菌群、肠上皮屏障和肠道免疫三者之间相互作用，共同维持肠道稳态以抵御外界因素的侵扰。受到遗传和环境因素的干扰时，机体可能会出现某些方面的缺陷，如遗传因素(NOD2基因突变)引起的肠道免疫功能损伤、环境因素(不合理饮食、吸烟、饮酒和心理应激等)引起的肠道菌群紊乱和肠道屏障功能受损。这些因素综合作用导致肠腔中的微生物抗原移位进入肠黏膜固有层，激活其中的免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞和T细胞)，引起强烈的免疫应答并产生大量炎症因子(例如TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β、IFN-γ和IL-12等)，触发严重的肠黏膜炎症反应，导致肠道稳态失衡。肠道稳态失衡参与了许多消化道疾病的发展，如克罗恩病(Cronh’s disease，CD)，溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)、肠源性感染(如伤寒沙门氏菌感染)。目前临床所用的激素、生物制剂(TNF-α单抗等)只能单纯针对异常免疫反应，难以从根本上改善肠道屏障、肠道菌群的失衡状态，存在初始应答率低、容易复发等缺点。可见，开发能从肠道屏障、肠道菌群、肠道免疫三方面全方位调节肠道稳态的新药物是有效治疗肠稳态失调相关疾病的迫切需求。

胞壁酰二肽(MuramylDipeptide,MDP)是分枝杆菌细胞骨架中具有免疫佐剂活性的最小结构单位，可以代替弗氏完全佐剂(FCA)中的整体分枝杆菌，促进机体对外源性抗原的特异性免疫反应。MDP的产生可以受细菌来源的肽聚糖水解酶的调控。

为此，本发明提供产MDP的酶及其调节肠道稳态中的用途。

发明内容

本发明的目的在于提供产MDP的酶及其调节肠道稳态的用途。

本发明所采取的技术方案是：

在一些技术方案中，蛋白或其变体在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途，其中，所述蛋白或其变体包括如下至少任意一种序列：

(a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

(c)SEQ ID NO:1去除信号肽的氨基酸序列；

(d)SEQ ID NO:5去除信号肽的氨基酸序列。

在一些技术方案中，前述(c)中，信号肽为SEQ ID NO:1所示序列的第1至29位氨基酸。

在一些技术方案中，前述(c)中，SEQ ID NO:1去除信号肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:2。

在一些技术方案中，前述(d)中，信号肽为SEQ ID NO:5所示序列的第1至25位氨基酸。

在一些技术方案中，前述(d)中，SEQ ID NO:5去除信号肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:6。

在一些技术方案中，编码前述(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体的核苷酸在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途。

在一些技术方案中，编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在一些技术方案中，编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些技术方案中，编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

在一些技术方案中，编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一些技术方案中，表达前述(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体的载体在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途。

在一些技术方案中，表达前述(a)-(d)任一项所述的蛋白或其变体的宿主细胞在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备以下至少任意一种制剂的用途：(a)改善肠稳态失调的制剂；(b)减轻肠道过度炎症反应的制剂；(c)减少肠屏障通透性的制剂；(d)改善肠道菌群失调的制剂；(e)治疗克罗恩病的制剂；(f)治疗溃疡性结肠炎的制剂；(g)治疗肠源性感染的制剂；(h)治疗伤寒沙门氏菌感染的制剂。

在一些技术方案中，一种获得胞壁酰二肽的方法，包括：(1)将前述(a)-(d)任一项所述的蛋白或其变体与肽聚糖作用；或将表达前述(a)-(d)任一项所述的蛋白或其变体的载体与肽聚糖作用；(2)获得胞壁酰二肽。

在一些技术方案中，前述获得的胞壁酰二肽用于制备以下至少任意一种制剂的用途：(a)改善肠稳态失调的制剂；(b)减轻肠道过度炎症反应的制剂；(c)减少肠屏障通透性的制剂；(d)改善肠道菌群失调的制剂；(e)治疗克罗恩病的制剂；(f)治疗溃疡性结肠炎的制剂；(g)治疗肠源性感染的制剂；(h)治疗伤寒沙门氏菌感染的制剂。

本发明的有益效果是：

本发明首次证实了一类蛋白可以水解肽聚糖产生MDP，可用于制备产MDP的酶制剂；产MDP的酶制剂经证实具有以下至少一种功能：(a)改善肠稳态失调；(b)减轻肠道过度炎症反应；(c)减少肠屏障通透性；(d)改善肠道菌群失调；(e)治疗克罗恩病；(f)治疗溃疡性结肠炎；(g)治疗肠源性感染；(h)治疗伤寒沙门氏菌感染。因此，本发明的方案为全方位调节肠道稳态提供了新的思路，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：PH3D表达载体的酶切鉴定和蛋白表达；(A)酶切鉴定结果；泳道1：DNAladder；泳道2：酶切条带；(B)PH3D诱导表达的结果；泳道1：蛋白Marker；泳道2：未加IPTG诱导；泳道3：加IPTG诱导表达；

图2：PH3D、PH3D突变蛋白(PH-1D或PH-2D)及SagA体外水解肽聚糖的产物鉴定；(A-E)HPLC-MS/MS鉴定水解产物；F:ANTS鉴定水解产物；

图3：PH3D、MDP、Lactobacillus casei BL23调节肠道异常免疫反应的效果；

图4：PH3D、PH-1D调节肠道异常免疫反应的效果；

图5：PH3D、MDP、Lactobacillus casei BL23影响肠上皮屏障紧密连接蛋白occludin含量的组化结果；

图6：PH3D、PH-1D影响肠上皮屏障紧密连接蛋白occludin含量的组化结果；

图7：PH3D、PH-1D影响肠屏障通透性的结果；

图8：给药PH3D肠道菌群变化分析结果；

图9：PH3D治疗CD模型小鼠的效果；(A)给药模式图；(B)对CD小鼠体重变化的影响；(C)对CD小鼠结肠长度的影响；(D)对CD小鼠结肠组织病理评分的影响；

图10：PH3D治疗UC模型小鼠的效果；(A)对UC小鼠体重变化的影响；(B)对UC小鼠结肠长度的影响；(C)对UC小鼠结肠组织病理评分的影响；

图11：PH3D治疗伤寒沙门氏菌感染小鼠的效果；(A)对小鼠粪便伤寒沙门氏菌含量变化的影响；(B)对小鼠血液中伤寒沙门氏菌含量变化的影响；(C)对小鼠体重变化的影响；(D)对小鼠生存率的影响；

图12：PH3D-homo水解肽聚糖产生MDP的能力；(A)序列相似度比较；(B)ANTS鉴定水解肽聚糖的产物；(C)HPLC-MS/MS鉴定水解肽聚糖的产物；图中SEQ 1为SEQ ID NO:1；SEQ 5为SEQ ID NO:5；

图13：结肠组织(colon)、小肠组织(lleum)、粪便(fecal)及血清(serum)中MDP含量；

以上图中，con或control表示健康对照组；TNBS表示TNBS模型组；TNBS+PH3D表示对TNBS模型组给药PH3D；TNBS+MDP表示对TNBS模型组给药MDP；TNBS+L.casei BL23表示对TNBS模型组给药Lactobacillus casei BL23；TNBS+PH-1D表示对TNBS模型组给药PH-1D；DSS表示DSS建模组；DSS+PH3D表示对DSS建模组给药PH3D；infec表示感染伤寒沙门氏菌模型组；infec+PH3D表示感染伤寒沙门氏菌模型组给药PH3D；PG表示肽聚糖；以上图中，*为p值小于0.05，**为p值小于0.01。

具体实施方式

本发明发现一些蛋白具有水解肽聚糖产生MDP的酶功能，可以作为产MDP的酶制剂。在一些技术方案中，本发明提出蛋白或其变体在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途，其中，所述蛋白或其变体包括如下至少任意一种序列：

(a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

(c)SEQ ID NO:1去除信号肽的氨基酸序列；

(d)SEQ ID NO:5去除信号肽的氨基酸序列。

在一些技术方案中，前述(c)中，信号肽为SEQ ID NO:1所示序列的第1至29位氨基酸，其中，1-29aa为SEQ ID NO:1的胞内/跨膜区。

在一些技术方案中，前述(c)中，SEQ ID NO:1去除信号肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:2，其中，SEQ ID NO:2为SEQ ID NO:1所示蛋白的胞外段(30-344aa)。

在一些技术方案中，前述(d)中，信号肽为SEQ ID NO:5所示序列的第1至25位氨基酸，其中，1-29aa为SEQ ID NO:5的胞内/跨膜区。

在一些技术方案中，前述(d)中，SEQ ID NO:5去除信号肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:6，其中，SEQ ID NO:6为SEQ ID NO:5所示蛋白的胞外段(26-332aa)。

在一些技术方案中，编码前述(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体的核苷酸在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途。本领域技术人员应当可以理解，采用编码(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体的核苷酸，可以构建表达出(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体，并应用于制备产胞壁酰二肽的酶制剂。

在一些技术方案中，编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在一些技术方案中，编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些技术方案中，编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

在一些技术方案中，编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一些技术方案中，表达前述(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体的载体在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途。本领域技术人员应当可以理解，利用表达(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体的载体，可以构建至宿主细胞中，表达出(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体，并应用于制备产胞壁酰二肽的酶制剂。在一些技术方案中，载体例如为质粒、例如慢病毒载体，但不限于此。

在一些技术方案中，表达前述(a)-(d)任一项所述的蛋白或其变体的宿主细胞在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途；本领域技术人员应当可以理解，利用表达(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体的宿主细胞，可以表达分泌出(a)-(d)任一项所述蛋白或其变体，并应用于制备产胞壁酰二肽的酶制剂；在一些技术方案中，宿主细胞例如为大肠杆菌、例如为乳杆菌，但不限于此。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备以下至少任意一种制剂的用途：(a)改善肠稳态失调的制剂；(b)减轻肠道过度炎症反应的制剂；(c)减少肠屏障通透性的制剂；(d)改善肠道菌群失调的制剂；(e)治疗克罗恩病的制剂；(f)治疗溃疡性结肠炎的制剂；(g)治疗肠源性感染的制剂；(h)治疗伤寒沙门氏菌感染的制剂。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有改善肠稳态失调的作用，其中，改善肠稳态失调可以包括减轻肠道过度炎症反应、减少肠屏障通透性、改善肠道菌群失调等方面，但不限于此。

在一些技术方案中，肠稳态失调模型通过TNBS(三硝基苯磺酸)诱导构建。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有减轻肠道过度炎症反应的作用；在一些技术方案中，过度炎症反应体现为炎症因子增加和/或抗炎因子减少；在一些技术方案中，过度炎症反应包括降低的炎症因子TNF-α、IL-6和IFN-γ的水平、增加的抗炎因子IL-10的水平；在一些技术方案中，炎症因子或抗炎因子通过免疫学方法检测；在一些技术方案中，炎症因子或抗炎因子的水平通过结肠组织样品确定。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有减少肠屏障通透性的作用；在一些技术方案中，肠屏障通透性通过检测肠组织紧密连接蛋白(occludin)水平确定，occludin通过免疫学方法检测；在一些技术方案中，肠屏障通透性减少体现为occludin水平增加；在一些技术方案中，occludin根据肠组织样品确定；在一些技术方案中，肠屏障通透性通过FITC-dextran法确定；在一些技术方案中，肠屏障通透性减少体现为FITC-dextran水平减少；在一些技术方案中，FITC-dextran根据血清样品确定。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有改善肠道菌群失调的作用；在一些技术方案中，肠道菌群失调体现为特定菌群减少或增多；在一些技术方案中，肠道菌群失调体现为拟杆菌门细菌减少和/或变形菌门增多；在一些技术方案中，通过菌群分析确定肠道菌群失调情况；在一些技术方案中，肠道菌群失调情况根据粪便样品确定。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有治疗克罗恩病的作用；在一些技术方案中，克罗恩病模型通过TNBS(三硝基苯磺酸)诱导构建；在一些技术方案中，克罗恩病的严重程度评估指标包括体重变化、结肠长度、病理组织评分；在一些技术方案中，克罗恩病好转体现为缓解结肠组织变短、或缓解体重降低、或降低的病理组织评分。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有治疗溃疡性结肠炎的作用；在一些技术方案中，溃疡性结肠炎模型通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导构建；在一些技术方案中，溃疡性结肠炎的严重程度评估指标包括体重变化、结肠长度、病理组织评分；在一些技术方案中，，溃疡性结肠炎好转体现为缓解结肠组织变短、或缓解体重降低、或降低的病理组织评分。

在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂具有治疗肠源性感染的作用；在一些技术方案中，肠源性感染包括肠内致病菌和内毒素侵入肠外引起的感染；在一些技术方案中，肠源性感染包括伤寒沙门氏菌感染；在一些技术方案中，伤寒沙门氏菌感染情况通过检测粪便或血液样品确定载菌量。

在一些技术方案中，所述产胞壁酰二肽的酶制剂可口服；利用蛋白递送系统，口服产MDP的酶，既可以保证精准的疗效，又能消除活菌制品的安全隐患；相比直接补充MDP或补充能产生MDP的益生菌，有更好的应用效果。

在一些技术方案中，所述产胞壁酰二肽的酶制剂中还包括保护酶制剂免受胃酸消化的辅料；在一些技术方案中，保护酶制剂免受胃酸消化的辅料可以为果胶、玉米醇溶蛋白等，但不限于此；在一些技术方案中，产胞壁酰二肽的酶制剂中还可以包括一些赋形剂、调味剂等。

在一些技术方案中，一种获得胞壁酰二肽的方法，包括：(1)将前述(a)-(d)任一项所述的蛋白或其变体与肽聚糖作用；或将前述(a)-(d)任一项所述的蛋白或其变体的宿主细胞与肽聚糖作用；(2)获得胞壁酰二肽；在一些技术方案中，宿主细胞例如为大肠杆菌、例如为乳杆菌，但不限于此；宿主细胞可以直接分泌产MDP的酶直接与肽聚糖作用。

在一些技术方案中，前述获得的胞壁酰二肽用于制备以下至少任意一种制剂的用途：(a)改善肠稳态失调的制剂；(b)减轻肠道过度炎症反应的制剂；(c)减少肠屏障通透性的制剂；(d)改善肠道菌群失调的制剂；(e)治疗克罗恩病的制剂；(f)治疗溃疡性结肠炎的制剂；(g)治疗肠源性感染的制剂；(h)治疗伤寒沙门氏菌感染的制剂。

术语定义：产胞壁酰二肽的酶或酶制剂是指能水解肽聚糖产生胞壁酰二肽的酶或酶制剂。

下面结合具体实验，进一步阐述本发明思路，但本发明的保护范围但并不局限于此。本发明可以任选包括未通过实施例示出的实施方案。

具体实施方式中未详细描述的方法可参考本领域常规方法或厂家说明书；具体实施方式中未描述出处的试剂均可通过商业化渠道获得。

一、蛋白变体的构建与表达

发明人通过创造性的研究分析发现68种分泌蛋白，并对其结构域进行细致研究，最终意外地发现一种具有344aa、氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白具有水解肽聚糖产生MDP的功能；编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

MKKLLSTVLFSAVALSAVALSKPSHVSAATKNTETATVSAPASDKTEADVTYNGGATTVWTSPTAGQQVKRYVTTGEHVKFVNSKKVFAEIWYETEDHGWIPERYLSINTLQQLAPLTKKADAAAAPTQTTSPAEQAAQAATASANAQAASSAAAQSAAASAAAQSAAESAAAQSAAAESAASVQAAAESAANQQAQQQAAEQAQQAQQAQQQQVQQQQAQQAAAQQKQQQQVQQQAVSQPVAQTTQTSQPTQSATNKGTFKISFYDPAVLGSNMGYSGVAANLSVFPKGTVLRITMSNGQTLTRTVNDTGSFAAGNPNQLDVAMPSGQIPAAGILSATVEVLQ(SEQ ID NO:1)。

5’-ATGAAAAAGCTTTTAAGTACAGTATTATTCTCAGCAGTTGCACTGTCTGCCGTGGCATTGTCCAAGCCAAGTCACGTCAGCGCTGCTACGAAGAATACTGAAACCGCGACCGTCAGTGCACCAGCTAGCGACAAAACCGAAGCTGATGTTACCTACAACGGTGGTGCTACGACTGTTTGGACCTCACCGACAGCGGGTCAACAAGTTAAGCGTTATGTGACAACTGGTGAACACGTTAAATTTGTGAATAGTAAAAAAGTCTTCGCAGAAATTTGGTATGAAACTGAAGACCACGGTTGGATTCCAGAACGCTATCTGAGTATTAATACTTTGCAGCAGTTGGCACCATTGACGAAAAAGGCTGATGCGGCTGCCGCACCGACTCAGACAACGTCACCAGCCGAACAAGCTGCTCAGGCCGCAACTGCGTCAGCTAATGCGCAAGCAGCATCAAGCGCTGCTGCTCAGAGTGCCGCTGCGTCCGCAGCAGCGCAAAGCGCCGCTGAAAGTGCTGCCGCGCAAAGTGCTGCCGCTGAATCAGCTGCGTCAGTTCAAGCTGCTGCTGAATCGGCCGCTAACCAGCAAGCACAACAACAGGCTGCTGAACAGGCTCAACAAGCTCAGCAAGCACAACAGCAACAAGTTCAACAGCAACAGGCTCAGCAGGCAGCTGCGCAACAAAAGCAGCAACAACAAGTACAACAGCAGGCGGTTAGCCAACCAGTTGCTCAGACAACTCAGACGTCACAACCAACCCAAAGTGCAACTAACAAAGGCACCTTCAAGATCAGCTTCTATGATCCGGCTGTTCTAGGTAGCAACATGGGCTACAGTGGCGTTGCTGCTAATTTGAGCGTCTTCCCTAAAGGCACCGTATTACGTATCACCATGTCCAATGGTCAAACATTGACTCGGACAGTTAATGATACTGGTAGTTTTGCTGCAGGCAATCCTAATCAGTTAGATGTTGCAATGCCGAGTGGCCAGATTCCTGCAGCAGGGATCTTGTCCGCAACCGTTGAAGTACTTCAGTAA-3’(SEQ ID NO:3)。

经鉴定SEQ ID NO:1所示蛋白的信号肽为SEQ ID NO:1的第1至29位氨基酸，通过去除信号肽，保留第30-344位氨基酸，获得具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白，命名为PH3D，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

TKNTETATVSAPASDKTEADVTYNGGATTVWTSPTAGQQVKRYVTTGEHVKFVNSKKVFAEIWYETEDHGWIPERYLSINTLQQLAPLTKKADAAAAPTQTTSPAEQAAQAATASANAQAASSAAAQSAAASAAAQSAAESAAAQSAAAESAASVQAAAESAANQQAQQQAAEQAQQAQQAQQQQVQQQQAQQAAAQQKQQQQVQQQAVSQPVAQTTQTSQPTQSATNKGTFKISFYDPAVLGSNMGYSGVAANLSVFPKGTVLRITMSNGQTLTRTVNDTGSFAAGNPNQLDVAMPSGQIPAAGILSATVEVLQ(SEQ ID NO:2)。

5’-ACGAAGAATACTGAAACCGCGACCGTCAGTGCACCAGCTAGCGACAAAACCGAAGCTGATGTTACCTACAACGGTGGTGCTACGACTGTTTGGACCTCACCGACAGCGGGTCAACAAGTTAAGCGTTATGTGACAACTGGTGAACACGTTAAATTTGTGAATAGTAAAAAAGTCTTCGCAGAAATTTGGTATGAAACTGAAGACCACGGTTGGATTCCAGAACGCTATCTGAGTATTAATACTTTGCAGCAGTTGGCACCATTGACGAAAAAGGCTGATGCGGCTGCCGCACCGACTCAGACAACGTCACCAGCCGAACAAGCTGCTCAGGCCGCAACTGCGTCAGCTAATGCGCAAGCAGCATCAAGCGCTGCTGCTCAGAGTGCCGCTGCGTCCGCAGCAGCGCAAAGCGCCGCTGAAAGTGCTGCCGCGCAAAGTGCTGCCGCTGAATCAGCTGCGTCAGTTCAAGCTGCTGCTGAATCGGCCGCTAACCAGCAAGCACAACAACAGGCTGCTGAACAGGCTCAACAAGCTCAGCAAGCACAACAGCAACAAGTTCAACAGCAACAGGCTCAGCAGGCAGCTGCGCAACAAAAGCAGCAACAACAAGTACAACAGCAGGCGGTTAGCCAACCAGTTGCTCAGACAACTCAGACGTCACAACCAACCCAAAGTGCAACTAACAAAGGCACCTTCAAGATCAGCTTCTATGATCCGGCTGTTCTAGGTAGCAACATGGGCTACAGTGGCGTTGCTGCTAATTTGAGCGTCTTCCCTAAAGGCACCGTATTACGTATCACCATGTCCAATGGTCAAACATTGACTCGGACAGTTAATGATACTGGTAGTTTTGCTGCAGGCAATCCTAATCAGTTAGATGTTGCAATGCCGAGTGGCCAGATTCCTGCAGCAGGGATCTTGTCCGCAACCGTTGAAGTACTTCAGTAA-3’(SEQ ID NO:4)。

构建PH3D的重组质粒，引物如下：

正向引物：5’-ACGAAGAATACTGAAACCGCGACCG-3’；

反向引物：5’-TTACTGAAGTACTTCAACGGTTGC-3’。

PCR引物引入BamH I酶切位点，扩增正向引物加上EcoR I酶切位点，反向引物加上XhoI酶切位点。回收PCR产物，经BamH I、EcoRⅠ和Xho I酶切后连接入表达载体中，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆进行酶切鉴定、序列分析和蛋白的诱导表达和纯化，去除内毒素，保存备用，其中获得的载体命名为Pet-28a-PH3D。

PH3D的蛋白表达结果如图1所示。

在SEQ ID NO:1序列基础上，同时去除信号肽和将第309位天门冬氨酸突变为丙氨酸，获得命名为PH3D-D309A的蛋白(简称PH-1D)；在SEQ ID NO:1序列基础上，同时去除信号肽和将第322位天门冬氨酸突变为丙氨酸，获得命名为PH3D-D322A的蛋白(简称PH-2D)；构建方法如下：

点突变采用如下引物构建：

PH-1D正向引物：5’-CTCGGACAGTTAATGCTACTGGTAGTTTTGC-3’；

PH-1D反向引物：5’-GCAAAACTACCAGTAGCATTAACTGTCCGAG-3’；

PH-2D正向引物：5’-ATCCTAATCAGTTAGCTGTTGCAATGCCGAG-3’；

PH-2D反向引物：5’-CTCGGCATTGCAACAGCTAACTGATTAGGAT-3’。

以含编码HM0539基因的质粒为模板，利用上述引物和高保真PFU酶进行PCR扩增。点突变PCR扩增反应体系如下：10X Reaction buffer:5μl、Quick solution:1μl、10μMDNTP:1μl、10μM primer F:0.5μl、10μM primer R:0.5μl、模板DNA:5μl、PUF酶:1μl、ddH2O:补充至50μl、Total:50μl，以95度变性30s，设置30循环的变性、退火和延伸程度，获得带有缺口的突变质粒。再用Dpn I消化掉模板质粒，获得突变质粒。转化大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆进行序列测定；测序正确的载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导蛋白表达并纯化，去除内毒素，保存备用。

二、产MDP性能测试

2.1肽聚糖水解实验

取100μg肽聚糖，分别与20μg PH3D或PH-1D或PH-2D或SagA(一种已知的肽聚糖水解酶，序列参见NCBI编号AFK60183.1，secreted antigen A[Enterococcus faecium DO])溶于PBS，37℃过夜，获得肽聚糖水解产物。

2.2凝胶酶谱鉴定水解产物

将2.1制备的肽聚糖水解产物或标准品溶液风干后，加入10μL ANTS反应液，37℃反应过夜。该ANTS反应液具体配置如下：(1)用3:17乙酸:水溶液溶解ANTS粉末，使其浓度达到0.2mol/L；(2)用DMSO溶解NaCNBH3粉末，使其浓度达到1mol/L；(3)将1与2所配置的溶液以1:1的体积混合，即制成ANTS反应液。上样至SDS-PAGE凝胶，120V电泳2-3小时，取下凝胶，蒸馏水清洗数次；置于0.9％氯化钠中，37℃孵育过夜；亚甲基蓝染色1-2小时，蒸馏水清洗数次，观察凝胶中是否存在肽聚糖水解印迹。

从图2F可见，PH3D肽聚糖水解产物在标准品MDP的位置出现一亮条带，说明其产物很可能含MDP，而突变蛋白PH3D-1D、PH3D-2D及SagA无MDP条带。

2.3高效液相色谱技术

将2.1制备的肽聚糖水解产物，经0.22微米滤膜过滤后，进行HPLC-MS/MS检测。色谱柱：Acclaim 120 C18 column(2.1μm,2.1_150mm)(Thermo ScientificT)；柱温：52℃；进样体积：15μL。流动相：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液；流动相流速：0.2ml/min。洗脱：0-30％线性浓度梯度的0.1％三氟乙酸(TFA)甲醇溶液，洗脱时间：60min。使用质谱仪Agilent1200 series LC/MSD TOF对产物进行质谱分析：正电模式，最终得到质核比在50至2000m/z之间的物质。

结果如图2A-D所示，PH3D的肽聚糖水解产物中包含MDP，而突变蛋白PH3D-1D、PH3D-2D及SagA无MDP。

综上所述，PH3D具有产MDP的酶功能，可用于制备产MDP的酶制剂。

三、调节肠稳态实验

3.1酶制剂的制备及给药

采用玉米醇溶蛋白-果胶负载技术制备PH3D及其突变蛋白的果胶颗粒。该剂型能保护蛋白免受胃酸消化，缓慢释放于结肠发挥保护功效。首先用蒸馏水分别制备6％(W/V)的果胶溶液和1％(W/V)的玉米醇溶蛋白溶液，其中玉米醇溶蛋白溶液含有85％乙醇溶液和0.5％(W/V)的氯化钙。将适量PH3D或者突变蛋白溶解于果胶溶液，充分混匀。室温环境下，将蛋白-果胶混合液用连有23号针头的注射器缓慢地逐滴加入玉米醇溶蛋白溶液中。此时在玉米醇溶蛋白溶液中将会形成圆形固体颗粒，待颗粒固形后取出，蒸馏水清洗数次；室温风干，保存于4℃备用。每2mm颗粒包裹约5微克蛋白。同时制备BSA-果胶颗粒作为对照。每只小鼠给药4天，每天5μg(换算成人体剂量约12.5mg)，以灌胃的方式给药。

3.2MDP及LactobalilluscaseiBL23菌株的给药

MDP(InvivoGen,San Diego,CA)及Lactobalilluscasei BL23(来自美国HuangShenghe教授)均以灌胃的方式给药，每只小鼠MDP给药剂量为100μg/天(换算成人体剂量约250mg)，持续4天；Lactobalilluscasei BL23给药剂量为1*10⁸cfu/天(换算成人体剂量约1*10¹²cfu)，持续4天。

3.3肠稳态失调模型建立

采用TNBS(三硝基苯磺酸)诱导肠炎主要机制为乙醇作为有机溶剂对肠黏膜屏障造成损伤，使具有半抗原特性的TNBS与结肠上皮的赖氨酸共价结合，成为抗原，诱发出一系列的肠道免疫应答紊乱，从而产生炎症，此外，该模型小鼠的肠道菌群也处于紊乱状态，这些特点适合用于观察PH3D调节肠稳态的作用效果。模型制备方法如下：适量8周龄C57BL/6雌性小鼠随机分组。小鼠称重记录原始体重，计算出对应TNBS/乙醇(150mg/kg,含50％乙醇)剂量。麻醉小鼠，使用灌胃针从小鼠肛门通入长度约4cm进行通肠操作；然后吸取相应体积的TNBS溶液，经肛门缓慢注入结肠内造模，其中对照组以等量生理盐水灌肠。造模操作持续7天。

四、肠道稳态指标检测

4.1肠道免疫稳态评价

取结肠组织50mg，加入0.5ml生理盐水，冰上充分匀浆，4℃离心取上清。按ELISA试剂盒说明书检测上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10的水平。

结果如图3所示，给药PH3D能调节肠道异常免疫反应，包括降低炎症因子TNF-α、IL-6和IFN-γ的水平，增加抗炎因子IL-10的水平；且效果比MDP用药及产MDP微生物(如Lactobalilluscasei BL23)用药更为显著；可见，PH3D可用于制备减轻肠道过度炎症反应的制剂。

图4结果显示，给药PH-1D并不能减轻肠道过度炎症反应，可见产MDP酶功能介导PH3D减轻肠道过度炎症反应。

4.2肠道屏障功能评价

肠道屏障功能的评价主要包括检测肠组织紧密连接蛋白(occludin)的表达水平和肠道屏障的通透性，方法如下：

4.2.1肠组织紧密连接蛋白的表达：采用免疫荧光染色检测occludin的表达和分布。结肠组织切片常规抗原修复，用5％BSA室温下孵育30分钟以消除非特异性背景。然后将切片分别与occludin一抗在4℃下孵育过夜，再用FITC标记的鬼笔环肽室温下染色1小时。经相应荧光素标记的二抗孵育后，DAPI染核，在激光共聚焦显微镜下观察蛋白表达和定位情况。

图5组化结果显示，给药PH3D能显著增加occludin含量，且效果比MDP用药及产MDP微生物(如Lactobalilluscasei BL23)用药更为显著。图6组化结果则显示，给药PH3D能显著增加occludin含量，而给药PH-1D则没有增加occludin含量。

4.2.2肠道通透性的检测：小鼠造模完毕后，灌胃100mg/kg体重的FITC-dextran(分子量4000)。4小时后行安乐死。打开胸腔，常规心脏采血后收集血清。将血清适当稀释后加入黑色不透光96孔板中；设置倍比稀释的FITC-dextran为标准曲线。以485nm激发光和535nm发射光为检测条件，在荧光分光光度计下检测荧光强度，绘制标准曲线计算小鼠血清中FITC-dextran水平表示肠道屏障的通透性。

结果如图7所示，给药PH3D能减少肠屏障通透性，而给药PH-1D则没有减少肠屏障通透性，可见产MDP酶功能介导PH3D减少肠屏障通透性。

4.2结果综合可见，PH3D可用于制备减少肠屏障通透性的制剂。

4.3肠道菌群检测

收集小鼠粪便，提取细菌全基因组。对细菌16S rRNA V3-V4高变区进行扩增：使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。将扩增产物在IlluminaMiSeq PE300 platform/NovaSeqPE250平台(Illumina,San Diego,USA)进行双末端测序，下机后得到reads数据，经fastpversion 0.20.0去除低质量reads后使用拼接软件F LASH version 1.2.7将其拼接为Tags。拼接的Tags经过优化后，使用UPARSEversion7.1在97％相似度下将其聚类为物种分类的分类操作单元。使用RDPClassifierversion 2.2对上分类操作单元进行16S rRNA数据库进行搜库和物种注释，置信阈值设置为0.7。

结果如图8所示，相较于健康对照组(control)，TNBS处理后小鼠呈现明显的肠道菌群失调，主要表现为拟杆菌门细菌减少，变形菌门增多，可见，PH3D可以用于制备改善肠道菌群失调的制剂。

五、肠稳态失调相关疾病改善效果评价

5.1CD造模

5.1.1CD造模：利用TNBS构建克罗恩病小鼠模型，方法同上述肠稳态失调模型建立。

5.1.2肠炎严重程度的评价方法

CD严重程度评估指标包括体重变化、疾病活动度(DAI)评分、结肠长度、病理组织评分，如下：

每日测量小鼠体重并记录。造模结束后麻醉小鼠，取出结肠组织，测量并记录其长度。另取结肠组织于10％甲醛溶液中固定24小时，包埋至蜡块，再用切片机切片(5μm)。经脱蜡及水化常规HE染色。HE切片由两个独立的病理专家(不知晓处理情况)进行肠黏膜损伤及肠道炎症评分。所有评分采用优化的复合评分系统进行，包括炎症程度(0～3分)、肠隐窝损伤程度(0～4分)、炎症浸润面积(0～4分)和炎症浸润深度(0～3分)。黏膜层和固有层厚度用Image J软件分析。

结果如图9所示，PH3D能显著缓解TNBS引起的小鼠结肠组织变短、体重降低，及减轻肠黏膜损伤及肠道炎症的组织评分，可见PH3D可用于制备治疗克罗恩病的制剂。

5.2UC造模及评价

UC造模方法：采用适量8周龄C57BL/6雌性小鼠随机分组，UC造模(DDS造模)利用葡聚糖硫酸钠(DSS)构建动物溃疡性结肠炎模型，DSS造模组饮用水为2.5％DSS溶液，造模持续7天，造模第7天处死小鼠。评价指标同CD(5.1.2)。

结果如图10所示，PH3D能显著缓解DSS引起的小鼠结肠组织变短、体重降低，及减轻组织病理评分，可见PH3D可用于制备治疗溃疡性结肠炎的制剂。

5.3伤寒沙门氏菌感染的造模及评价

每只小鼠灌胃100μL伤寒沙门氏菌(10⁷cfu/ml)，灌胃后，每天记录小鼠生长情况和体重变化；并收集小鼠粪便，检测小鼠粪便载菌量；20天后处死全部小鼠，取血清，检测小鼠血液载菌量。

结果如图11所示，PH3D能显著降低小鼠血液伤寒沙门氏菌载菌量，但不影响粪便载菌量；能显著缓解伤寒沙门氏菌感染引起的小鼠体重降低，增加小鼠生存率，可见PH3D可用于制备治疗肠源性感染(如伤寒沙门氏菌感染)的制剂。

六、PH3D同源序列的产MDP酶制剂功能验证

发明人还发现SEQ ID NO:5所示蛋白与SEQ ID NO:1所示蛋白具有82.57％的同源性，SEQ ID NO:5的信号肽为其第1至第25位氨基酸，通过去除信号肽1-25aa，表达其26-332aa的胞外段序列如SEQ ID NO:6所示(命名为PH3D-homo)，其中编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；蛋白构建方法参考PH3D。

实验验证方法同第二部分所述，结果如图12所示，发现PH3D-homo也具有产MDP酶性能，因此，可以确定PH3D-homo也具有与PH3D类似的功能，即具有制备以下制剂的用途：(a)改善肠稳态失调的制剂；(b)减轻肠道过度炎症反应的制剂；(c)减少肠屏障通透性的制剂；(d)改善肠道菌群失调的制剂；(e)治疗克罗恩病的制剂；(f)治疗溃疡性结肠炎的制剂；(g)治疗肠源性感染的制剂；(h)治疗伤寒沙门氏菌感染的制剂。

MKKLLSTVLFSAVALSAVALSKPGHVNAATKDTDTTVSAPASDKTEADVTYNGGATTVWTSPTVGQQVKRYVATGEHLKFINSKKVYAEIWYETSDHGWVPERYLSINTLQQLSSLTKKADATAAPTQTTSTAEQVAQTSTDNNQAASDAAAQSAAASNAAASSAAASSAAASSVAASNAAASSAAQAAAQQQAQQQAQQQAAAQQQAQQQAAAQQQAQQQAAASQAAVQQQQAPATQTTQTSTNKGTFKISFYDPSVLGSNMGYEGVAANLSVFPKGTKLRITMSNGQVLERTVNDTGSFAYSNPRQLDVAMPNSAIPSAGVLSATVEVIN(SEQ ID NO:5)。

VNAATKDTDTTVSAPASDKTEADVTYNGGATTVWTSPTVGQQVKRYVATGEHLKFINSKKVYAEIWYETSDHGWVPERYLSINTLQQLSSLTKKADATAAPTQTTSTAEQVAQTSTDNNQAASDAAAQSAAASNAAASSAAASSAAASSVAASNAAASSAAQAAAQQQAQQQAQQQAAAQQQAQQQAAAQQQAQQQAAASQAAVQQQQAPATQTTQTSTNKGTFKISFYDPSVLGSNMGYEGVAANLSVFPKGTKLRITMSNGQVLERTVNDTGSFAYSNPRQLDVAMPNSAIPSAGVLSATVEVIN(SEQ ID NO:6)。

5’-TTAGTTGATCACTTCAACGGTTGCAGAAAGCACTCCGGCTGATGGAATGGCACTATTTGGCATTGCAACGTCAAGCTGGCGCGGGTTGCTATATGCAAATGAGCCAGTATCATTAACGGTTCGTTCTAACACTTGTCCGTTAGACATGGTGATTCGCAGCTTAGTACCTTTAGGGAAGACGCTCAGGTTTGCAGCCACACCTTCGTAACCCATGTTGCTACCTAAAACAGACGGGTCATAGAAACTAATTTTAAAAGTGCCCTTATTAGTTGATGTTTGGGTCGTCTGGGTTGCTGGTGCTTGCTGTTGTTGAACAGCAGCCTGAGATGCAGCTGCCTGCTGCTGTGCTTGTTGCTGAGCAGCGGCTTGCTGTTGTGCCTGTTGTTGAGCCGCAGCCTGTTGCTGAGCTTGTTGTTGCGCCTGCTGTTGAGCAGCAGCCTGAGCCGCGCTGGAAGCAGCAGCGTTGGATGCCGCAACACTGGAAGCTGCAGCGCTTGATGCAGCGGCGCTAGAGGCAGCCGCATTAGAAGCTGCAGCACTTTGAGCAGCAGCATCGGATGCAGCCTGATTATTATCTGTGGATGTTTGCGCAACCTGTTCCGCAGTCGAGGTTGTCTGAGTTGGCGCAGCAGTGGCATCAGCCTTCTTGGTCAATGATGATAATTGCTGCAAGGTGTTGATGCTCAAATAACGTTCTGGAACCCAACCATGGTCAGATGTTTCGTACCAGATTTCTGCGTAAACTTTTTTACTATTAATAAATTTAAGGTGTTCACCGGTTGCTACATAACGCTTAACTTGCTGTCCCACAGTCGGTGAGGTCCAAACGGTTGTTGCACCGCCATTATAAGTGACATCAGCTTCAGTCTTATCACTGGCTGGTGCGCTGACGGTGGTGTCAGTATCTTTCGTTGCCGCGTTAACGTGACCTGGTTTTGACAAGGCAACGGCAGATAAAGCAACGGCTGAGAATAATACTGTACTTAAGAGCTTTTTCAT-3’(SEQ ID NO:7)。

CTGGCGCGGGTTGCTATATGCAAATGAGCCAGTATCATTAACGGTTCGTTCTAACACTTGTCCGTTAGACATGGTGATTCGCAGCTTAGTACCTTTAGGGAAGACGCTCAGGTTTGCAGCCACACCTTCGTAACCCATGTTGCTACCTAAAACAGACGGGTCATAGAAACTAATTTTAAAAGTGCCCTTATTAGTTGATGTTTGGGTCGTCTGGGTTGCTGGTGCTTGCTGTTGTTGAACAGCAGCCTGAGATGCAGCTGCCTGCTGCTGTGCTTGTTGCTGAGCAGCGGCTTGCTGTTGTGCCTGTTGTTGAGCCGCAGCCTGTTGCTGAGCTTGTTGTTGCGCCTGCTGTTGAGCAGCAGCCTGAGCCGCGCTGGAAGCAGCAGCGTTGGATGCCGCAACACTGGAAGCTGCAGCGCTTGATGCAGCGGCGCTAGAGGCAGCCGCATTAGAAGCTGCAGCACTTTGAGCAGCAGCATCGGATGCAGCCTGATTATTATCTGTGGATGTTTGCGCAACCTGTTCCGCAGTCGAGGTTGTCTGAGTTGGCGCAGCAGTGGCATCAGCCTTCTTGGTCAATGATGATAATTGCTGCAAGGTGTTGATGCTCAAATAACGTTCTGGAACCCAACCATGGTCAGATGTTTCGTACCAGATTTCTGCGTAAACTTTTTTACTATTAATAAATTTAAGGTGTTCACCGGTTGCTACATAACGCTTAACTTGCTGTCCCACAGTCGGTGAGGTCCAAACGGTTGTTGCACCGCCATTATAAGTGACATCAGCTTCAGTCTTATCACTGGCTGGTGCGCTGACGGTGGTGTCAGTATCTTTCGTTGCCGCGTTAACGTGACCTGGTTTTGACAAGGCAACGGCAGATAAAGCAACGGCTGAGAATAATACTGTACTTAAGAGCTTTTTCAT(SEQ ID NO:8)。

七、组织、血清和粪便MDP检测

7.1组织、血清和粪便预处理

组织样品预处理方法：称取50mg结肠组织，加入500μL PBS，冰上充分匀浆。取组织匀浆于1.5mL离心管，15000rpm速度离心10min；吸取上清，过0.22μm滤器，保存4摄氏度冰箱备用。

血液样品预处理方法：取出的血液样品在室温中静置2小时，然后3000rpm速度离心10min；吸取上清，过0.22μm滤器，保存4摄氏度冰箱备用。

粪便样品预处理方法：称取50mg粪便样品，加入500μL PBS，用涡旋振荡器充分振荡混匀。样品在室温下静止1小时，然后15000rpm速度离心10min；吸取上清，过0.22μm滤器，保存4摄氏度冰箱备用。

7.2组织、血清和粪便MDP的检测

采用HEK-Blue^TMhNOD2细胞报告基因方法:HEK-Blue^TMhNOD2细胞购于InvivoGenUSA，细胞用DMEM培养基+10％热灭活胎牛血清+1％青-链霉素，在5％CO₂培养箱培养。HEK-Blue^TMhNOD2细胞接种于T75细胞培养瓶，培养至汇合度>90％可开始实验。取96孔板，设置MDP标准曲线组，然后分别取标准组MDP和上述预处理的组织、血清和粪便样品20μL加入96孔板中，置于CO₂培养箱静置20分钟。用细胞刮将HEK-Blue^TMhNOD2细胞刮下于HEK-Blue^TM检测培养基中，用血球计数板计数细胞个数并调整细胞浓度至140000/ml。立即往96孔板中加入180μL/孔的HEK-Blue^TMhNOD2细胞，每孔约25000个细胞。96孔板置于CO2培养箱培养6-16小时，最后用分光光度计，于620-655nm下检测每孔吸光度值。

对TNBS建模的小鼠(方法同3.3)，分别灌胃给药不同浓度的PH3D(0、20μg/mL、50μg/mL、10μg/mL)，检测结肠组织、小肠组织、粪便及血清中MDP含量，结果如图13所示，与健康对照组相比，PH3D能特异性增加肠道中MDP含量，而不影响血浆中MDP含量。说明PH3D无诱发全身免疫反应的风险。而TNBS建模的小鼠血清MDP升高，说明小鼠肠屏障受损，MDP从肠道进入血液，而PH3D作为产MDP酶制剂可修复肠屏障，使得血清MDP回复正常水平。

以上仅为本发明的示例性说明，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替代，都应涵盖在本发明保护范围之内。

Claims (21)

1.蛋白在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途，其中，所述蛋白选自如下至少任意一种序列：

(a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

(c)SEQ ID NO:1去除信号肽的氨基酸序列；

(d)SEQ ID NO:5去除信号肽的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，(c)中，信号肽为SEQ ID NO:1所示序列的第1至29位氨基酸。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，(c)中，SEQ ID NO:1去除信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，(d)中，信号肽为SEQ ID NO:5所示序列的第1至25位氨基酸。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，(d)中，SEQ ID NO:5去除信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

6.编码权利要求1-5任一项所述的蛋白的核苷酸在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途。

7.根据权利要求6的用途，其特征在于，编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

8.根据权利要求6的用途，其特征在于，编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

9.根据权利要求6的用途，其特征在于，编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

10.根据权利要求6的用途，其特征在于，编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

11.表达权利要求1-5任一项所述的蛋白的载体在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途。

12.表达权利要求1-5任一项所述的蛋白的宿主细胞在制备产胞壁酰二肽的酶制剂中的用途。

13.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备改善肠稳态失调的制剂的用途。

14.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备减轻肠道过度炎症反应的制剂的用途。

15.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备减少肠屏障通透性的制剂的用途。

16.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备改善肠道菌群失调的制剂的用途。

17.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备治疗克罗恩病的制剂的用途。

18.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备治疗溃疡性结肠炎的制剂的用途。

19.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备治疗肠源性感染的制剂的用途。

20.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于，产胞壁酰二肽的酶制剂具有制备治疗伤寒沙门氏菌感染的制剂的用途。

21.一种获得胞壁酰二肽的方法，包括：(1)将权利要求1-5任一项所述的蛋白与肽聚糖作用；或将表达权利要求1-5任一项所述的蛋白的宿主细胞与肽聚糖作用；(2)获得胞壁酰二肽。

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