JP2001514486A

JP2001514486A - エイチ．ピロリ抗原

Info

Publication number: JP2001514486A
Application number: JP53174398A
Authority: JP
Inventors: ダブリュー．クリップスアラン; リューリンクランシーロバート; マクシェインロイス; ジョンスミスクリストファー; ロバートタイアマンデイヴィッド; ホーバウ
Original assignee: コルテクス（ユーケイ）リミティッド
Priority date: 1997-01-24
Filing date: 1998-01-26
Publication date: 2001-09-11
Also published as: US20020051790A1; CN1244871A; AU5871598A; US20020187161A1; WO1998032768A1; EP0975663A1

Abstract

(57)【要約】エイチ．ピロリ(H．pylori)由来の新規な抗原が提供される。。エイチ．ピロリ感染の診断におけるその使用、該診断をする方法並びにその方法に使用するためのキットも開示される。さらに、この抗原の新規な抗原性断片が、この抗原の少なくとも一つかまたは抗原性断片の一つ以上を含むワクチンと共に開示される。

Description

【発明の詳細な説明】エイチ．ピロリ抗原本発明はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の新規な抗原又はその抗原性断片、ヘリコバクター・ピロリの検出におけるこの抗原又はその断片の使用、及びそれらを含むキットに関し、さらに抗原又はその断片を含むワクチン並びにこの抗原の単離法に関する。哺乳類、そして特にヒトにおける腸感染は、共通の粘液免疫系の活性化により唾液などの粘液分泌の免疫応答を刺激する。この応答は、一般にＩｇＡ抗体の存在を特徴とするけれども、初期においてはしばしば血清中での抗体応答と平行して起こる。しかしながら、分泌における免疫応答は、唾液を含め、身体からの抗原（例えば、細菌やウイルス）の消失の後に急速に減少する。従って、粘液分泌中に抗体が存在することは現在、すなわち、現時点で感染していることを反映する。例えば、微生物感染の場合には、粘液分泌物中の抗体は、以下には分泌性抗体と呼ぶか、腸管などにおける微生物の集落形成の現在の状況を反映する。従って、現時点での感染を監視するのに有用である。他方、血清の抗体は身体から微生物が消失した後も暫くの間残存する。従って、血清の抗体テストが陽性であるときは過去の抗原への曝露と現在の抗原への曝露の両方を反映しており、臨床医にとってあまり助けにならない。他方、分泌抗体テストが陽性であることは微生物による現在すなわち現時点での感染を示している。エイチ．ピロリの感染は、胃粘膜の生検についての、顕微鏡、微生物培養又はウレアーゼ検出によって、ウレア・ブレス・テストによって、又は血清ＥＬＩＳＡにおける特異的抗体の存在によって診断することができる。エイチ．ピロリの感染は、胃粘膜の感染であるか、胃の分泌におけるＩｇＡ抗体の応答を引き出すと予想されるかも知れない。しかしながら、粘液分泌物中のエイチ．ピロリ−特異的抗体はＩｇＧクラスのものであり、予想されてきたようなＩｇＡではないことが発見された。ＩｇＡ抗体は、あるとしても、ほとんど検出されなかった。そこで、ＡＵ−Ａ−９０６７６７６号はエイチ．ピロリ抗原に特異的な粘液分泌物中のＩｇＧ検出と取り組み、それによって哺乳類のその微生物による現在のすなわち、今の感染を監視する手段を提供する。対応する学術的出版物はウイットらによる、フロンティアズ・イン・ミュコサル・イミュノロジー，１，693-696(19 91)である。ヘリコバクター・ピロリ陽性患者の唾液中にＩｇＧ抗体が存在することはアメリカン・ガストロエンテロロジカル・アソシエーションの年次総会のプロシーディングズで一部注目を受けた。１９８９年のプロシーディングズでこのような抗体の存在についてジン(Czinn)らが発表した後、ラーセン（Larsen）らは、１９９１年５月のプロシーディングズで、唾液のＩｇＧレベルは抗生物質治療のコースの間の治療応答についての実用的、非侵襲的なマーカーであると結論した。１９９２年４月のプロシーディングズで、ランデス（Landes）らはそれまでの観察を確認し、そして唾液中のヘリコバクター・ピロリに対するＩｇＧの測定は、エイチ．ピロリ陽性患者、特に他のテスト法が実用的でない広範囲の又は小児科の母集団におけるピロリ陽性患者を検出するための、単純で、非−侵襲的テストであることを観察した。ＷＯ−Ａ−９３２２６８２号はエイチ．ピロリのための便利で信頼性の高いイン・ビトロテストを開示する。このテストは抗原調製物を利用して、テスト対象である哺乳類由来の粘液分泌物中のＩｇＧ抗体と反応させる。ＷＯ−Ａ−９６２５４３０号はエイチ．ピロリ感染の確認のための診断テストに使用することができるエイチ．ピロリ由来の新規な抗原を開示する。診断テストに使用することができるエイチ．ピロリ由来の新規な抗原を同定し、単離しそして提供する必要性が引き続き存在する。これらの抗原は特異的で、確かに精製可能であるべきであり、そしてこのようなテストに使用するとき、良好な特異性を持つことと偽陽性の結果を生じないことを特徴とすべきである。さらに、これらの抗原はエイチ．ピロリ感染の治療又は予防のいずれかに有用なワクチンの基礎とすることもできる。こうして、第１の側面では、本発明はエイチ．ピロリ抗原である一つのタンパク質であって、変性条件かつ還元条件下で測定するとき約４３ｋＤａから約５３ｋＤａの範囲の分子量を有するタンパク質を提供する。一つの好ましい態様では、この抗原タンパク質は、約４３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列を有するものである、ＭＤＬ？ＶＬＧＩＮＴＡ Met-Asp-Leu-？-Val-Leu-Gly-Ile-Asn-Thr-Ala。第２の好ましい態様では、この抗原タンパク質は、約４３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列を有するものである、ＭＲＶＰＫ（Ｓ）ＫＧＦＡＩＬＳＫ。本発明のこの側面の第３の好ましい態様では、この抗原タンパク質は約５３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列を有するものである、？？ＧＫＡＰＤＦＫＰＡ？-？-Gly-Lys-Ala-Pro-Asp-Phe-Lys-Pro-Ala。本発明の第２の側面はエイチ．ピロリ抗原である一つのタンパク質であって、下記の特性を有するタンパク質を提供する、ｉ）変性条件かつ還元条件下で測定するとき、約５４ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列を持つことＭＬＫ（Ｖ）Ｉ（Ｅ）Ｋ（Ｖ又はＳ）ＬＥ（Ｓ）Ｉ、 ii）自然（未変性）の条件下で測定するとき、約３７０ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列を持つこと、Ｍ（Ｋ）ＬＴＩ？ＬＥＶ（Ｅ）、 iii）自然（未変性）の条件下で測定するとき、約１４０ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列を持つこと、ＭＹＩＰＹＶＩＥ、 iv）自然（未変性）の条件下で測定するとき、約９０ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列を持つこと、ＭＮＬＤＣ（Ｓ）ＬＱＶ、ｖ）変性条件かつ還元条件の下で測定するとき、約１５．９から１６．９ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列を持つこと、ＧＫＩＧＩＦＦＧＴＤＳＧＮＡＥＡＩＡＥＫ、 vi）自然（未変性）の条件下で測定するとき、約３４４ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列を持つこと、ＭＬＶＴＫＬＡＰＤＦＬＡＰ？Ｖ、又は vii）下記のＮ末端アミノ酸配列を有するスーパーオキシド・ディスムターゼ酵素であること、ＭＦＴＬＲＥＬＰＦＡＫＤＳＮＧＤＦＬＳＰ、ただし、上記の配列の中で、括弧を付したアミノ酸は、先行するアミノ酸の代替物を表す。本明細書に記載した全タンパク質のいずれかの部分又は断片はそれ自体抗原でありうる、従って、第３の側面では、本発明は本発明のタンパク質の抗原性断片を提供する。特に、本発明は下記の配列を有する抗原性断片を提供する、ＭＤＬ？ＶＬＧＩＮＴＡ Met-Asp-Leu-？-Val-Leu-Gly-Ile-Asn-Thr-Ala、？？ＧＫＡＰＤＦＫＰＡ？-？-Gly-Lys-Ala-Pro-Asp-Phe-Lys-Pro-Ala、ＭＬＫ（Ｖ）Ｉ（Ｅ）Ｋ（Ｖ又はＳ）ＬＥ（Ｓ）Ｉ、ＭＲＶＰＫ（Ｓ）ＫＧＦＡＩＬＳＫ、Ｍ（Ｋ）ＬＴＩ？ＬＥＶ（Ｅ）、ＭＹＩＰＹＶＩＥ、ＭＮＬＤＣ（Ｓ）ＬＱＶ、ＧＫＩＧＩＦＦＧＴＤＳＧＮＡＥＡＩＡＥＫ、ＭＬＶＴＫＬＡＰＤＦＬＡＰ？Ｖ、又はＭＦＴＬＲＥＬＰＦＡＫＤＳＮＧＤＦＬＳＰ、上記の配列の中で括弧の中の文字はその前の文字の代替アミノ酸を表す。本明細書に記載された抗原の分子量は、分子量測定法の限界のため、必然的に近似数値である。具体的に言及した分子量は自然（未変性）の条件又は変性条件のいずれかを用いて得られたものである。当技術分野の熟練者は別人の手によればあるいは同一人の場合であっても別の機会に行えば、多少異なる結果が得られ得ること、従って本明細書に引用した分子量の近似値が±５％あるいはさらに± １０％として読まれるべきであることか分かるであろう。熟練者は断片の配列がその抗原性をなお保持しなから一部変化し得ることを理解するであろう。断片及び／又はその変異体（variants）の抗原性をテストするには、熟練者に良く知られた方法が使用できる。このような変異体も本発明の一部を構成する。本発明の抗原性タンパク質又はその断片は精製され又は単離された調製物として単独で提供することも、あるいは他のエイチ．ピロリ抗原性タンパク質との混合物の一部として提供することもできる。従って、第４の側面では、本発明は本発明の一つ以上のタンパク質及び／又はその抗原性断片の一つ以上を含む抗原組成物を提供する。このような組成物はエイチ．ピロリの検出及び／又は診断に使用することができる。一つの態様では、この組成物は一つ以上の付加的な別のエイチ．ピロリ抗原又はその断片を含む。第５の側面では、本発明はエイチ．ピロリの検出法及び／又は診断法であって、（ａ）本発明の抗原性タンパク質、又はその抗原性断片、又は抗原組成物をテスト対象である試料と接触させる工程、及び（ｂ）エイチ．ピロリに対する抗体の存在を検出する工程、を含む方法を提供する。特に、本発明のタンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物はＩｇＧ抗体を検出するために使用することができる。テスト対象である試料は、生物試料、例えば、血液又は唾液の試料であることが好ましい。粘液分泌物の試料を用いるエイチ．ピロリ検出法の適当な１例としては、ＷＯ−Ａ−９３２２６８２号に記載された方法である。第６の側面では、本発明はエイチ．ピロリの検出及び／又は診断における本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原性組成物の使用を提供する。その検出及び／又は診断はイン・ビトロで行うことが好ましい。本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物はエイチ．ピロリのイン・ビトロ検出及び／又は診断に使用するためのキットの一部として提供することができる。こうして、第７の側面では本発明はエイチ．ピロリの検出及び／又は診断に使用するためのキットであって、本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物を含むキットを提供する。さらに、本発明の抗原性タンパク質又はその抗原性断片はエイチ．ピロリに対する免疫応答を誘発させるために使用することができる。こうして、さらなる側面において、本発明は本発明の抗原、その断片又は本発明の抗原性組成物の医薬における使用を提供する。一層さらなる側面では本発明は主体の免疫応答を引き出すことができる組成物であって、本発明の一つ以上のタンパク質及び／又はその抗原性断片の一つ以上を含む組成物を提供する。この組成物は必要に応じて一つ以上の適当なアジュバントを含むワクチン組成物であることが適当である。このようなワクチン組成物は予防的か又は治療的なワクチン組成物であり得る。本発明のワクチン組成物は一つ以上のアジュバントを含むことができる。当技術分野で良く知られたアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、又はフロイントの不完全アジュバントなどの油中水エマルションが挙げられる。他の有用なアジュバントも熟練者には良く知られている。一層さらなる側面では、本発明は、（ａ）免疫原組成物、好ましくはワクチンの調製における本発明のタンパク質又はその一つ以上の抗原性断片の使用、（ｂ）主体での免疫応答を誘発させる場合におけるこのような免疫原組成物の使用、及び（ｃ）主体におけるエイチ．ピロリ感染の治療法又は予防法であって、本発明のタンパク質、その抗原性断片の少なくとも一つ又は抗原組成物の有効量を、好ましくはワクチンとして、主体に投与する工程を含んで成る方法を提供する。本発明の各側面の好ましい特徴は必要な変更を加えて他の側面のそれぞれに対しても同様に適用される。本発明は、下記の実施例を参照して今から説明するが、これらの実施例は本発明を如何なる意味でも制限するものと解すべきでない。実施例では以下の図面を参照する。図１は、モノＱエイチアール５／５・アニオン交換カラム上での無細胞音波破砕物の溶出ブロフィルを示す。ウレアーゼを含む画分は影を付した部分によって示される。０〜１．０ＭのＮａＣｌ勾配も示してある。図２は、エイチ．ピロリ陽性患者と未感染主体の、ＥＬＩＳＡによる血清反応性を示すスペロース６溶出プロフィルを示す。図３は、研究したエイチ．ピロリの２株のスペロース６反応性画分の未変性ＰＡＧＥ 8−25％勾配を示す。図４は、スペロース６反応性画分の未変性ＰＡＧＥ8−25％勾配のウエスタン・ブロットを示す。図５は、（a）スペロース６反応性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 8−25％勾配及び( b)（a）のウエスタン・ブロットを示す。図６は、既知のエイチ．ピロリ状態を持つ患者のＥＬＩＳＡ反応性の頻度を示す。実施例１（ｉ）細菌の培養エイチ．ピロリの２株、ＮＣＴＣ 11637及び胃潰瘍の患者から1989年に単離された「トラウブ」と名付けられた野生型株（オーストレイリアン・インスティチュート・オブ・ミュコサル・イミュノロジー）を使用した。両方の株から同一のタンパク質か単離された。各株を培養し、同様にしてタンパク質を抽出した。ウオータージャケットを付けたインキュベーター中、３７℃で、１０％のＣＯ₂ 、６％のＯ₂及び８４％のＮ₂という微好気的雰囲気下で、細菌をチョコレート寒天（５％のウマの脱線維素血液を含むオキソイドＮｏ２ブロックアガー・ベース−ＣＭ２７１）上で生育させた。 (ii)音波処理９６時間培養の後、プレートからコロニーをこすり取ることによりＰＢＳを含む集菌チューブ中に菌を収穫した（トレース・マルチセル^TMコード50-201-PA）。遠心分離（室温、10,000ｇ、５分）により細胞を洗浄し、新鮮な緩衝液に再懸濁した。この洗浄工程を一度繰り返し、最後に細胞を0.1Ｍのトリス−塩酸ｐＨ8 .2中に再懸濁した後、音波処理により破砕した。音波処理は氷浴中に置いて冷却した音波処理チューブ中、６μ（ＭＳＥソニプレプ150超音波破砕器）で、9.5ｍｍプローブを用いて行った。１ミリリットル分の試料に対する音波処理は３０秒の音波処理と６０秒の休みにそれぞれ分割した５サイクルから成り、総音波処理時間は７．５分であった。音波処理の後、細胞破砕物を遠心分離（12,000ｇ、10 分間、室温）により除去し、懸濁液をまず0.45μｍフィルターを通して濾過し、ついで0.2μｍのフィルターを通して、無細胞タンパク質懸濁液を得た。（iii）タンパク質測定総タンパク質濃度はバイオラド・クーマシーブルー・プロテイン測定キットを用いて測定した。 (iv)クロマトグラフィー（ａ）イオン交換トリス−塩酸緩衝液500μｌ中のタンパク質10〜15mgからなる試料をＦＰＬＣシステムに連結したモノＱカラム（ファルマシア・バイオテク・エルティーディー、エイチアール５／５）に適用することにより無細胞懸濁液を分画した。溶出は０．１Ｍのトリス−塩酸緩衝液中の０〜１ＭのＮａＣｌからなる勾配で行った。タンパク質の溶出は２８０ｎｍでモニターし、溶出された物質はすべて０．５ｍｌ画分として集めた。この緩衝液の伝導率は勾配の精度を確保するため操作の全体にわたってモニターした。個々の画分については、基質として尿素を利用する能力を測ることによりウレアーゼ活性をテストした。簡単に述べると、ミクロタイタープレートを用い、ウエルの列に、３ｍＭのリン酸水素ニナトリウムプラス１．５％ｗ／ｖ尿素及び４ μｇ／１００ｍｌのフェノールレッド（基質溶液）か又は尿素を除いた同様の溶液（ブランク緩衝液）からなる溶液の９０μｌを交互に分注した。次に、各画分の試料（１０μｌ）を対になっているウエルに、１試料を基質溶液にそして１試料をブランク緩衝液に、添加し、直ちにこのプレートを密閉シールした。２．５分後に各ウエルの吸光度を５４０ｎｍで測定した。対のウエルそれぞれについて、対照の価（ブランク緩衝液）をテストの価（基質溶液）から差し引き、そしてその結果得られた価を画分番号に対してプロットした。（ｂ）ゲル濾過クロマトグラフィーウレアーゼ活性を含むことが示されたモノＱ画分を集めて３個のプールとした。各プールを抗原活性についてテストした。第１のプールは抗原を含むことが示されたので、このプールを総タンパク質含量が約３０−５０ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。プール１の部分標本（２００μｌ）をスペロース６カラム（ファルマシア）のゲル濾過クロマトグラフィーに付した。溶出はトリス−塩酸、０．１Ｍ、ｐＨ７．２を溶出緩衝液として用いて行った。画分（０．５ｍｌ）を集めた。溶出は操作の間２８０ｎｍで溶出液の光学密度を測定し、続いてウレアーゼ活性とタンパク質含量を測定することにより監視した。（ｃ）反応性画分の選択画分について、試料を１ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝化食塩水で１０倍に希釈し、これらの希釈試料をウエル当たり１００μｌ用いてＥＬＩＳＡミクロタイタープレートのウエル（ヌンク・マクシソルブ）を被覆することにより抗原をテストした。ウエルを３時間放置し、ついで、０．１５ＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液で洗浄した。被覆されたプレートを次に既知のエイチ．ピロリ状態の患者から採った一群の血清試料を用いてスクリーニングした。血清試料はリン酸緩衝化食塩水で２００倍に希釈し、上記の被覆されたウエル中で１時間インキュベートした後、ウエルを洗浄しそして水気をとって乾燥させた。特異的抗体の結合はヤギ抗−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼを用い、３０分間インキュベートし、ついで洗浄した後、増強されたＴＭＢ基質（ケンブリッジ・ライフ・サイエンシーズ）を添加することにより検出された。反応は１５分後に１Ｍ硫酸で停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。画分はすべてＰＡＧＥ及びウエスタン・ブロッティング分析に付してそれらのタンパク質含量の相違を明らかにした。（ｖ）ＰＡＧＥ未変性ゲル電気泳動はファルマシア・マルチホアIIシステムを用いて行った。５％ゲルをこの目的のために特に調製した。試料５０μｌに０．２５％ブロモフェノール・ブルーの１０μｌを添加し、混合した後２０μｌの試料をゲルに移し、そして電気泳動を行った（６００ワット、３０分間）。画分の部分標本は１ｍｇ／ｍｌ及び４０μｌのＳＤＳ試料緩衝液（０．５ＭのＨＣｌ、ｐＨ６．８〔１．０ｍｌ〕グリセロール〔０．８ｍｌ〕１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ〔１．６ｍｌ〕、０．８ＭのＤＴＴ〔０．４ｍｌ〕、１％ブロモフェノール・ブルー〔０．２ｍｌ〕及び水〔０．４ｍｌ〕）で調製した。試料はバイオラド・ミニ・プロテアンIIシステムを用い、予め調製した１０％ゲル（バイオラド）中で泳動させた。泳動緩衝液はＳＤＳを含むトリス−グリシンｐＨ８．３（５リットルの蒸留水中、トリス１５ｇ、グリシン７２ｇ、ＳＤＳ５ｇ）であった。泳動の完了後、ゲルを、メタノール／酢酸／水（４０／１０／５０％）中のクーマシー・ブル−Ｒ−２５０（０．１％）で染色し、そしてメタノール／酢酸／水（４０／１０／５０％）で脱染色した。使用した分子量マーカーは、ミオシン２１１，０００、β−ガラクトシダーゼ１１７，０００、ウシ血清アルブミン８１，０００、オボアルブミン４９，１００、カルボニック・アンヒドラーゼ３１，４００、大豆トリプシン・インヒビター２６，１００、リゾチーム１８，９００からなるバイオラドのＳＤＳ−ＰＡＧＥプリステンドスタンダード、広範囲用であった。 (vi)ウエスタン・ブロッティングウエスタン・ブロッティング分析はどのペプチドがエイチ．ピロリ陽性患者由来の血清とのみ反応したかを決定するために使用された。血清試料のそれぞれにたいして、別のゲル及び別のブロットが行われた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは上述のように行われ、そしてミニ・プロテアンIIトランス・ブロット・セル（バイオラド）を用い、製造者の説明書通りＳＤＳを含まないトウビン（Towbin）緩衝液でニトロセルロース膜に移送させた。未変性ゲル移送はファルマシア・マルチホアIIを用い、セミ−ドライ・ブロッティング手順（ＲＥＦ）で、不連続バッファーシステムを用いて行った。タンパク質移送後に、このニトロセルロース膜を２０ｍＭトリス−塩酸プラス５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）中で１０分間洗浄し、ついでＴＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間ブロックした。この膜を次に０．０５％のトゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＴＢＳ）中で洗浄し、そしてこの膜を１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳで６０倍に希釈した血清試料でプローブした。インキュベーションは室温で一晩行った。ついで、ニトロセルロースをＴＴＢＳで洗浄し、抗−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼを添加した。３時間のインキュベーションの後、ＴＢＳ中で洗浄し、その後、基質溶液（４−クロロナフトール）を添加した。この基質はメタノール２０ｍｌ中の４−クロロナフトール６０ｍｇを、混合直前に６０μｌの氷冷３０％Ｈ₂Ｏ₂を添加した１００ｍｌのＴＢＳと混合することにより使用直前に新たに調製した。インキュベーションはこの基質溶液が黒化し始めるまで進行させ、ここで新鮮な基質溶液と交換した。インキュベーションの使用最大時間は３０分であった。膜を蒸留水に移すことにより反応を停止させ、蒸留水を数回変えて洗浄した。この検定に使用した血清試料はウレア・ブレス・テスト（ＵＢＴ）陽性又は陰性として知られ、血清の状態はＥＬＩＳＡによって確認された。（vii）アミノ酸配列決定関心のある５個のユニークなタンパク質のバンドのＮ末端領域の１４個のアミノ酸を固相分析によって決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとブロッティングはウエスタン分析に対して先に述べたように行ったが、修正点としては、タンパク質の移送はニトロセルロースの代わりにＰＤＶＦ膜に対して行われた。この移送ＰＤＶＦ膜は染色しなかった。ついで、分析はフェイズシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ）を用い、その固相から行われた。 (viii)患者の血清試料及び唾液試料のテスト症候的胃障害のために研究されていた患者２２人を胃腸病クリニックから集めた（平均年齢５８．９年、男性１２、女性１０）。組織学的研究により１１人がエイチ．ピロリに対して陽性であることが分かった。試験時に集めた血清（２２）及び唾液（１３）をＥＬＩＳＡによりテストした。唾液のドット・ブロット分析は２２人の患者すべてについて行った。 (ix)ＥＬＩＳＡテスト（ａ）ＥＬＩＳＡ用ミクロタイタープレートの精製抗原を用いての被覆スペロース６カラムからの画分を含む選択された、精製された抗原をプールし、この抽出液を１８．５ｍＭのトリス−塩酸プラス１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５で、１〜２μｇタンパク質／ｍｌまで希釈した。後者の部分標本（１００μｌ）を用いてＥＬＩＳＡミクロタイタープレートのウエル（ヌンク・マクシソーブ）を被覆（周囲温度で１６時間）した。被覆後に、このウエルを０．１５ＭのＮａＣｌと０．０１％（ｗ／ｖ）のチオメルサル（Thiomersal）、ｐＨ７．２を含む５ｍＭリン酸緩衝液（３５０μｌ／ウエル）で３回洗浄し、そしてついでこのウエルを蒸留水に溶かした１％（ｗ／ｖ）のバイコ（Byco）Ａ（３５０μｌ／ウエル）を用いてブロック（周囲温度で蒸留水中９０分）した。２回続けて洗浄（先の洗浄用緩衝液）した後、プレートを直ちに使用するか又は乾燥（３７℃で１６時間）し、そしてシールした。（ｂ）血清試料のテストテスト対象である血清を０．０７％（ｕ／ｖ）トゥイーン８０、０．１６％（ｗ／ｖ）ブロモフェノール・ブルー、０．２５％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．１４ＭのＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）のＮ−メチルイソチアゾロン／ＨＣｌ及び０．１％（ｗ／ｖ）のオキシプリオン（Oxyprion）、ｐＨ７．２を含む５０ｍＭリン酸緩衝液で２００倍に希釈した。部分標本（１００μｌ）を抗原で被覆されたミクロタイタープレート（上記の（ａ）を見よ）の適当なウエルに添加し、周囲温度で４５分間インキュベートし、ついで、このウエルを０．１５ＭのＮａＣ１、０．０５％（ｕ／ｖ）トゥイーン８０、０．００１％（ｗ／ｖ）のＮ−メチルイソチアゾロン／ＨＣｌ及び０．０１％（ｗ／ｖ）のオキシプリオン（Oxypri on）、ｐＨ７．８を含む１０ｍＭのトリス−塩酸（３５０μｌ／ウエル）で５回洗浄した。特異的抗原の結合は、（２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）のチオメルサル、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ画分Ｖ及び０．０５％（ｗ／ｖ）の８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、ｐＨ７．２で）適当に希釈したウサギ抗−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ複合体（１００μｌ／ウエル）を用い、周囲温度で１５分間インキュベーションすることにより検出した。５回続けて洗浄（前述のように）した後、ＴＭＢ基質を呈色反応のために使用し（１００μｌ／ウエル）、反応は周囲温度で１５分後にウエル当たり５０ μ１の２５％（ｗ／ｖ）のリン酸を添加することにより停止させ、そして各検定ウエルの吸光度を４５０ｎｍで記録した。（ｃ）唾液試料のテストテスト対象である唾液は１パートのオムニザルＹＧバッファー（ｐＨ７．２、リン酸系の緩衝液）で希釈し、その部分標本（１００μｌ）を抗原で被覆されたミクロタイタープレート（上記の（ａ）を見よ）の適当なウエルに添加した。周囲温度で３０分間インキュベートした後、そのウエルを（血清試料の場合と同様に緩衝液で）５回洗浄し、ついで特異的抗体の結合を周囲温度でビオチン−アビジン結合検定により検出した。簡単に述べると、Ｒｂ抗−ヒトＩｇＧビオチン（５ｍＭリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｕ／ｖ）トゥイーン８０、２．５％（ｗ／ｖ）アノロンシー(Anoronthy)、１％（ｕ／ｖ）の熱不活性化正常ウサギ血清、０．０１％（ｗ／ｖ）チオメルサル及び２．５％（ｗ／ｖ）ゼラチン、ｐＨ７．５で適当に希釈されたもの）を各ウエルに添加（１００μｌ）し、３０分間インキュベートした。５回続けて洗浄（前と同様に）した後、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体（５ｍＭリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、２％（ｕ／ｖ）の熱不活性化正常ウサギ血清、０．０１％（ｗ／ｖ）チオメルサル及び０．０５％（ｗ／ｖ）の８−アミノ−ナフタレン−１−スルホン酸、ｐＨ７．２で適当に希釈されたもの）を適当なウエルに添加（１００μｌ）し、１５分間インキュベートし、ついでこのウエルを前と同様に５回洗浄した。発色させるためにＴＭＢ基質を用い（１００μｌ／ウエル）、ウエル当たり５０μｌの２５％（ｗ／ｖ）リン酸を添加して１５分後に反応を停止させ、そして各検定の吸光度を４５０ｎｍて記録した。（ｘ）ドット・ブロット検定１個の血清試料に対する個々の画分とプールされた画分をテストするため、テスト対象である材料をニトロセルロースのシート上にスポットし、ついで詳述したウエスタン・ブロットの手順と同様に処理した。主として、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む画分又は画分のプールを調製した。ニトロセルロース（バイオラド、８．４×７ｃｍ、カタログＮｏ．１６２−０１４５）のシートに、そのニトロセルロースにいかなるタンパク質も移さないように注意しなから、鉛筆と定規を使って２４個の小さな四角の印を付けた。２μｇのタンパク質を含む各画分又はプールの部分標本（２μｌ）を、ニトロセルロース膜の印を付けた四角のそれぞれの中に注意してスポット（三連で）した。このスポットを大気条件下で乾燥させた後、膜のそれぞれをブロック用溶液（２０ｍＭトリス−塩酸、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に溶解した１％ｗ／ｖＢＳＡ）中で室温で１時間インキュベートした。このブロック用溶液は続いてデカントし、膜をトゥイーン−トリス緩衝化食塩水（２０ｍＭトリス−塩酸、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖトゥイーン−２０、ｐＨ７．５）で３回洗浄し、ついでそれぞれの膜を３種のヒト血清型（トゥイーン−トリス緩衝化食塩水中の１％ＢＳＡで６０倍ｖ／ｖに希釈したもの）の中の一つと共に室温で一晩インキュベートした。この３種のヒト血清型はヘリサル・イライザ（HELISA L ELISA）(コルテクス)テストにより同定され、臨床テストによりエイチ．ピロリ陽性、境界、陰性と確認されたものであった。一晩インキュベートした後、膜をトゥイーン−トリス緩衝化食塩水中で２回洗浄し、ついで複合体溶液（ウサギ抗−ヒトＩｇＧ−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体〔ダコ、カタログＮｏ．Ｐ−４０６〕をトゥイーン−トリス緩衝化食塩水中の１％ＢＳＡで５００倍ｖ／ｖ希釈したもの）中で室温で３時間インキュベートした。続いて膜をトゥイーン−トリス緩衝化食塩水中で２回、トリス緩衝化食塩水（２０ｍＭトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で１回洗浄し、ついで４−クロロ−１ −ナフトール溶液（２０ｍｌメタノール中６０ｍｇ、１００ｍｌトリス緩衝化食塩水及び６０μｌの３０％Ｈ₂Ｏ₂）中で２〜３０分間発色させた。発色は水中で洗浄することにより停止させた。ＥＬＩＳＡのカットオフ値は、組織病理学により決定された既知のエイチ．ピロリ状態を患う患者の頻度をＥＬＩＳＡ反応性に対してプロットすることによる、別の研究で決定された。結果モノＱエイチアール５／５カラムでの無細胞音波処理物の溶出プロフィルは図１に示すとおりである。ウレアーゼ活性を含む画分は１２ｍｌと１８ｍｌの間の溶出容積の中に位置した。モノＱエイチアール５／５カラムからのプールのスペロース６カラム上での溶出プロフィルでは、１０ｍｌと１９ｍｌの間の溶出容積の位置にウレアーゼを含む画分が得られた。抗原反応性画分はスペロース６溶出液のイライザグラム（ＥＬＩＳＡｇｒａｍ）及びウエスタン・ブロットにより決定された。エイチ．ピロリに感染していることが知られている患者由来の血清は未感染の主体と比べて異なるイライザグラムのパターンを示した。スペロース６溶出液のＥＬＩＳＡ反応性の典型的なプロフィルは図２に示すものである。感染主体と未感染主体の間で最大の相違を与えた抗原調製物が以下の診断検定の開発のために選択された。この抗原画分は幾らかウレアーゼの存在が検出されたが、ウレアーゼの主ピークの右側にあるものが選択された。反応性画分の未変性ＰＡＧＥにより、研究した２株由来の１６個の検出可能なタンパク質バンドであって、７００〜４０ｋＤａの範囲の分子量を持つバンドが示された（表１、図３）。表１スペロース６カラムからの反応性画分の未変性ＰＡＧＥ。検出されたタンパク質バンドの分子量バンドが観察されたゲル泳動の数（総数１０）。記された数値は平均値±ＳＥＭである。イミュノブロット分析により、これらのタンパク質バンドの中の９個が免疫反応性であることを明らかにした（表２、図４）。表２スペロース６カラムからの反応性画分の未変性ＰＡＧＥのウエスタン・ブロット分析により検出されたタンパク質バンドの分子量 ¹バンドが観察されたブロット分析の数（総数２６）。² このバンドはウレアーゼ活性を示した。³ この強く染色された領域は通常１個の区別できない領域として現れた（分子量の範囲は２４０〜３３０ｋＤａ）。示した数値は平均値±ＳＥＭである。未変性ＰＡＧＥ上で観察された５個の主要な領域のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、各領域に対して７〜９個の副成分が検出された（表３）。表３未変性ＰＡＧＥ上で観察された５個の主要な領域のサブユニット分析 ¹バンドが観察されたゲル泳動の数。^* ウレアーゼ陽性^** 強いブロット示した数値は平均値±ＳＥＭである。この反応性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３２個の検出可能なサブユニット成分が明らかになり、そのうちの１８個は陽性の血清と免疫反応性であった（表４、図５）。表４スペロース６カラムからの反応性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥのウエスタン・ブロット分析により検出されたサブユニット成分の分子量示した数値は平均値±標準偏差である。ｎ¹は２９回の泳動のうちバンドが検出された分析の数である。このゲルの分析の慎重な検討により、それぞれユニークであるように見えた１０個のサブユニット成分が同定された。これらのうち６個は主要なバンドであった（表５）。これらのタンパク質のうちの５個のＮ末端アミノ酸配列決定により、１はＷＯ−Ａ−９６２５４３０号で開示された抗原に相当したが、他の２個は新規であった（データ・バンクに記述された対応する配列はなかった）。一方、残りの２個は既知のＮ末端配列と正確な対応を示した（表６）。表５ゲル分析により反応性画分中に確認されたユニークなサブユニット成分表６反応性抗原画分中に確認された５個のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列新規な抗原を含むこれらの反応性画分のＥＬＩＳＡ診断における有用性をテストした。カットオフは唾液に対しては０．７ＥＬＩＳＡユニット、血清に対しては２．５ＥＬＩＳＡユニットと決定した（図６）。表７は組織学によるエイチ．ピロリ感染の検出に対する血清及び唾液のＥＬＩＳＡ及びドット・ブロット検定の能力を示す。この結果によれば、血清及び唾液の両方共高い感受性を示し、素晴らしい陽性及び陰性の予想値が得られた。唾液のドットブロット分析は唾液又は血清のＥＬＩＳＡ程に高くはないが許容され得る尺度としての能力を示した。表７組織学（幽門洞生検）的検出に対するＥＬＩＳＡ又はドットブロットにより決定された唾液及び血清抗体の比較実施例２（ａ）エイチ．ピロリの培養は適当な条件の下で生育させ、その細胞はリン酸緩衝化食塩水中に収穫した。続いて、細胞破砕物及び他の混合物、例えば寒天、を除去するため繰り返し遠心分離し、そして新鮮なＰＢＳを３回添加して洗浄細胞ペレットを得た。（ｂ）この洗浄細胞をイオン交換クロマトグラフィーの工程で使用するため、０．１Ｍのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．２に再懸濁した。次に、細胞懸濁液を細胞の破砕が保証される程に十分な強度及び時間の音波処理（１００寒天プレートからの細胞を含む１０ｍｌの試料に対して、６μで３０秒間処理、６０秒切断、を２５回繰り返す）に付した。（ｃ）この懸濁液を次に遠心分離にかけて細胞破砕物を除去し、可溶性細胞タンパク質を含む上清を得た。マシア）などの強アニオン交換樹脂を用い、予め定めた方法で溶出緩衝液を０から１．０Ｍの塩化ナトリウム濃度の増加に基づく勾配溶出を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより分画した。この画分を次にウレアーゼの存在について検定した。（ｅ）ウレアーゼを含む画分を次にプールし、球状タンパク質に対し５×１０³ 〜５×１０⁶Ｄａのカットオフ範囲を持つ樹脂を用いるゲル浸透クロマトグラフィーに付した。（ｆ）適当なピークを以下の工程により選択した。 (i) 全ての画分についてウレアーゼ検定を行いそしてウレアーゼ活性を含むタンパク質ピークを同定する工程、 (ii) ウレアーゼ陽性であることが分かった画分の全て及びこのウレアーゼピークの直ぐ隣のタンパク質ピークであって、未変性タンパク質のウエスタン・ブロット分析によりより低い（見かけの）分子量を持つものおよび変性（ＳＤＳ）処理により生成したそれらの断片の画分を、エイチ．ピロリ陽性の個体から集めたヒト血清から調製されたプール由来のＩｇＧを用いて分析する工程、及び (iii) 上記のようにして電気泳動的に分離された後にエイチ．ピロリ陽性の血清プール由来のヒトＩｇＧとは反応するが、エイチ．ピロリ陰性の血清から調製された同様の血清プールとは反応しないことが示されたタンパク質のバンドを選択する工程。こうして同定されたバンドはそれぞれ、Ｎ末端アミノ酸分析に付し、そしてその配列を利用可能なコンピュータ・データベースからの既知のタンパク質の配列と比較した。

【手続補正書】【提出日】平成１１年９月１４日（１９９９．９．１４）【補正内容】明細書エイチ．ピロリ抗原本発明はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の新規な抗原又はその抗原性断片、ヘリコバクター・ピロリの検出におけるこの抗原又はその断片の使用、及びそれらを含むキットに関し、さらに抗原又はその断片を含むワクチン並びにこの抗原の単離法に関する。哺乳類、そして特にヒトにおける腸感染は、共通の粘液免疫系の活性化により唾液などの粘液分泌の免疫応答を刺激する。この応答は、一般にＩｇＡ抗体の存在を特徴とするけれども、初期においてはしばしば血清中での抗体応答と平行して起こる。しかしながら、分泌における免疫応答は、唾液を含め、身体からの抗原（例えば、細菌やウイルス）の消失の後に急速に減少する。従って、粘液分泌中に抗体が存在することは現在、すなわち、現時点で感染していることを反映する。例えば、微生物感染の場合には、粘液分泌物中の抗体は、以下には分泌性抗体と呼ぶが、腸管などにおける微生物の集落形成の現在の状況を反映する。従って、現時点での感染を監視するのに有用である。他方、血清の抗体は身体から微生物が消失した後も暫くの間残存する。従って、血清の抗体テストが陽性であるときは過去の抗原への曝露と現在の抗原への曝露の両方を反映しており、臨床医にとってあまり助けにならない。他方、分泌抗体テストが陽性であることは微生物による現在すなわち現時点での感染を示している。エイチ．ピロリの感染は、胃粘膜の生検についての、顕微鏡、微生物培養又はウレアーゼ検出によって、ウレア・ブレス・テストによって、又は血清ＥＬＩＳＡにおける特異的抗体の存在によって診断することができる。エイチ．ピロリの感染は、胃粘膜の感染であるが、胃の分泌におけるＩｇＡ抗体の応答を引き出すと予想されるかも知れない。しかしながら、粘液分泌物中のエイチ．ピロリ−特異的抗体はＩｇＧクラスのものであり、予想されてきたようなＩｇＡではないことが発見された。ＩｇＡ抗体は、あるとしても、ほとんど検出されなかった。そこで、ＡＵ−Ａ−９０６７６７６号はエイチ．ピロリ抗原に特異的な粘液分泌物中のＩｇＧ検出と取り組み、それによって哺乳類のその微生物による現在のすなわち、今の感染を監視する手段を提供する。対応する学術的出版物はウイットらによる、フロンティアズ・イン・ミュコサル・イミュノロジー，１，693-696(19 91)である。ヘリコバクター・ピロリ陽性患者の唾液中にＩｇＧ抗体が存在することはアメリカン・ガストロエンテロロジカル・アソシエーションの年次総会のプロシーディングズで一部注目を受けた。１９８９年のプロシーディングズでこのような抗体の存在についてジン(Czinn)らが発表した後、ラーセン（Larsen）らは、１９９１年５月のプロシーディングズで、唾液のＩｇＧレベルは抗生物質治療のコースの間の治療応答についての実用的、非侵襲的なマーカーであると結論した。１９９２年４月のプロシーディングズで、ランデス（Landes）らはそれまでの観察を確認し、そして唾液中のヘリコバクター・ピロリに対するＩｇＧの測定は、エイチ．ピロリ陽性患者、特に他のテスト法が実用的でない広範囲の又は小児科の母集団におけるピロリ陽性患者を検出するための、単純で、非−侵襲的テストであることを観察した。ＷＯ−Ａ−９３２２６８２号はエイチ．ピロリのための便利で信頼性の高いイン・ビトロテストを開示する。このテストは抗原調製物を利用して、テスト対象である哺乳類由来の粘液分泌物中のＩｇＧ抗体と反応させる。ＷＯ−Ａ−９６２５４３０号はエイチ．ピロリ感染の確認のための診断テストに使用することができるエイチ．ピロリ由来の新規な抗原を開示する。診断テストに使用することができるエイチ．ピロリ由来の新規な抗原を同定し、単離しそして提供する必要性が引き続き存在する。これらの抗原は特異的で、確かに精製可能であるべきであり、そしてこのようなテストに使用するとき、良好な特異性を持っことと偽陽性の結果を生じないことを特徴とすべきである。さらに、これらの抗原はエイチ．ピロリ感染の治療又は予防のいずれかに有用なワクチンの基礎とすることもできる。こうして、第１の側面では、本発明はエイチ．ピロリ抗原である一つのタンパク質であって、変性条件かつ還元条件下で測定するとき約４３ｋＤａから約５３ｋＤａの範囲の分子量を有するタンパク質を提供する。一つの好ましい態様では、この抗原タンパク質は、約４３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列（配列番号：１）を有するものである、ＭＤＬ？ＶＬＧＩＮＴＡ Met-Asp-Leu-？-Val-Leu-Gly-Ile-Asn-Thr-Ala。第２の好ましい態様では、この抗原タンパク質は、約４３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列（配列番号：２）を有するものである、ＭＲＶＰＫ（Ｓ）ＫＧＦＡＩＬＳＫ。本発明のこの側面の第３の好ましい態様では、この抗原タンパク質は約５３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列（配列番号：３）を有するものである、？？ＧＫＡＰＤＦＫＰＡ？-？-Gly-Lys-Ala-Pro-Asp-Phe-Lys-Pro-Ala。本発明の第２の側面はエイチ．ピロリ抗原である一つのタンパク質であって、下記の特性を有するタンパク質を提供する、ｉ）変性条件かつ還元条件下で測定するとき、約５４ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：４）を持つこと、ＭＬＫ（Ｖ）Ｉ（Ｅ）Ｋ（Ｖ又はＳ）ＬＥ（Ｓ）Ｉ、 ii）自然（非変性）の条件下で測定するとき、約３７０ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：５）を持つこと、Ｍ（Ｋ）ＬＴＩ？ＬＥＶ（Ｅ）、 iii）自然（非変性）の条件下で測定するとき、約１４０ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：６）を持つこと、ＭＹＩＰＹＶＩＥ、 iv）自然（非変性）の条件下で測定するとき、約９０ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：７）を持つこと、ＭＮＬＤＣ（Ｓ）ＬＱＶ、ｖ）変性条件かつ還元条件の下で測定するとき、約１５．９から１６．９ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：８）を持つこと、ＧＫＩＧＩＦＦＧＴＤＳＧＮＡＥＡＩＡＥＫ、 vi）自然（非変性）の条件下で測定するとき、約３４４ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：９）を持つこと、ＭＬＶＴＫＬＡＰＤＦＬＡＰ？Ｖ、又は vii）下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：１０）を有するスーパーオキシド・ディスムターゼ酵素であること、ＭＦＴＬＲＥＬＰＦＡＫＤＳＮＧＤＦＬＳＰ、上記の配列において、括弧内のアミノ酸はその前のアミノ酸の代替アミノ酸を表す。本明細書に記載した全タンパク質のいずれかの部分又は断片はそれ自体抗原でありうる、従って、第３の側面では、本発明は本発明のタンパク質の抗原性断片を提供する。特に、本発明は下記の配列を有する抗原性断片を提供する、配列番号：１に記載のＭＤＬ？ＶＬＧＩＮＴＡ Met-Asp-Leu-？-Val-Leu-Gly-Ile-Asn-Thr-Ala、配列番号：３に記載の？？ＧＫＡＰＤＦＫＰＡ？-？-Gly-Lys-Ala-Pro-Asp-Phe-Lys-Pro-Ala、配列番号：４に記載のＭＬＫ（Ｖ）Ｉ（Ｅ）Ｋ（Ｖ又はＳ）ＬＥ（Ｓ）Ｉ、配列番号：２に記載のＭＲＶＰＫ（Ｓ）ＫＧＦＡＩＬＳＫ、配列番号：５に記載のＭ（Ｋ）ＬＴＩ？ＬＥＶ（Ｅ）、配列番号：６に記載のＭＹＩＰＹＶＩＥ、配列番号：７に記載のＭＮＬＤＣ（Ｓ）ＬＱＶ、配列番号：８に記載のＧＫＩＧＩＦＦＧＴＤＳＧＮＡＥＡＩＡＥＫ、配列番号：９に記載のＭＬＶＴＫＬＡＰＤＦＬＡＰ？Ｖ、又は配列番号：１０に記載のＭＦＴＬＲＥＬＰＦＡＫＤＳＮＧＤＦＬＳＰ、上記の配列中、括弧内の文字はそれに先行するアミノ酸の代替アミノ酸を表す。本明細書に記載された抗原の分子量は、分子量測定法の限界のため、必然的に近似数値である。具体的に言及した分子量は自然（未変性）の条件又は変性条件のいずれかを用いて得られたものである。当技術分野の熟練者は別人の手によればあるいは同一人の場合であっても別の機会に行えば、多少異なる結果が得られ得ること、従って本明細書に引用した分子量の近似値が±５％あるいはさらに± １０％として読まれるべきであることが分かるであろう。熟練者は断片の配列がその抗原性をなお保持しながら一部変化し得ることを理解するであろう。断片及び／又はその変異体（variants）の抗原性をテストするには、熟練者に良く知られた方法が使用できる。このような変異体も本発明の一部を構成する。本発明の抗原性タンパク質又はその断片は精製され又は単離された調製物として単独で提供することも、あるいは他のエイチ．ピロリ抗原性タンパク質との混合物の一部として提供することもできる。従って、第４の側面では、本発明は本発明の一つ以上のタンパク質及び／又はその抗原性断片の一つ以上を含む抗原組成物を提供する。このような組成物はエイチ．ピロリの検出及び／又は診断に使用することができる。一つの態様では、この組成物は一つ以上の付加的な別のエイチ．ピロリ抗原又はその断片を含む。第５の側面では、本発明はエイチ．ピロリの検出法及び／又は診断法であって、（ａ）本発明の抗原性タンパク質、又はその抗原性断片、又は抗原組成物をテスト対象である試料と接触させる工程、及び（ｂ）エイチ．ピロリに対する抗体の存在を検出する工程、を含む方法を提供する。特に、本発明のタンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物はＩｇＧ抗体を検出するために使用することができる。テスト対象である試料は、生物試料、例えば、血液又は唾液の試料であることが好ましい。粘液分泌物の試料を用いるエイチ．ピロリ検出法の適当な１例としては、ＷＯ−Ａ−９３２２６８２号に記載された方法である。第６の側面では、本発明はエイチ．ピロリの検出及び／又は診断における本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原性組成物の使用を提供する。その検出及び／又は診断はイン・ビトロで行うことが好ましい。本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物はエイチ．ピロリのイン・ビトロ検出及び／又は診断に使用するためのキットの一部として提供することができる。こうして、第７の側面では本発明はエイチ．ピロリの検出及び／又は診断に使用するためのキットであって、本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物を含むキットを提供する。さらに、本発明の抗原性タンパク質又はその抗原性断片はエイチ．ピロリに対する免疫応答を誘発させるために使用することができる。こうして、さらなる側面において、本発明は本発明の抗原、その断片又は本発明の抗原性組成物の医薬における使用を提供する。一層さらなる側面では本発明は主体の免疫応答を引き出すことかできる組成物であって、本発明の一つ以上のタンパク質及び／又はその抗原性断片の一つ以上を含む組成物を提供する。この組成物は必要に応じて一つ以上の適当なアジュバントを含むワクチン組成物であることが適当である。このようなワクチン組成物は予防的か又は治療的なワクチン組成物であり得る。本発明のワクチン組成物は一つ以上のアジュバントを含むことができる。当技術分野で良く知られたアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、又はフロイントの不完全アジュバントなどの油中水エマルションが挙げられる。他の有用なアジュバントも熟練者には良く知られている。一層さらなる側面では、本発明は、（ａ）免疫原組成物、好ましくはワクチンの調製における本発明のタンパク質又はその一つ以上の抗原性断片の使用、（ｂ）主体での免疫応答を誘発させる場合におけるこのような免疫原組成物の使用、及び（ｃ）主体におけるエイチ．ピロリ感染の治療法又は予防法であって、本発明のタンパク質、その抗原性断片の少なくとも一つ又は抗原組成物の有効量を、好ましくはワクチンとして、主体に投与する工程を含んで成る方法を提供する。本発明の各側面の好ましい特徴は必要な変更を加えて他の側面のそれぞれに対しても同様に適用される。本発明は、下記の実施例を参照して今から説明するが、これらの実施例は本発明を如何なる意味でも制限するものと解すべきでない。実施例では以下の図面を参照する。図１は、モノＱエイチアール５／５・アニオン交換カラム上での無細胞音波破砕物の溶出プロフィルを示す。ウレアーゼを含む画分は影を付した部分によって示される。０〜１．０ＭのＮａＣｌ勾配も示してある。図２は、エイチ．ピロリ陽性患者と未感染主体の、ＥＬＩＳＡによる血清反応性を示すスペロース６溶出プロフィルを示す。図３は、研究したエイチ．ピロリの２株のスペロース６反応性画分の未変性ＰＡＧＥ８−25％勾配を示す。図４は、スペロース６反応性画分の未変性ＰＡＧＥ 8−25％勾配のウエスタン・ブロットを示す。図５は、（a）スペロース６反応性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 8−25％勾配及び( b)（a）のウエスタン・ブロットを示す。図６は、既知のエイチ．ピロリ状態を持つ患者のＥＬＩＳＡ反応性の頻度を示す。実施例１（ｉ）細菌の培養エイチ．ピロリの２株、ＮＣＴＣ 11637及び胃潰瘍の患者から1989年に単離された「トラウブ」と名付けられた野生型株（オーストレイリアン・インスティチュート・オブ・ミュコサル・イミュノロジー）を使用した。両方の株から同一のタンパク質が単離された。各株を培養し、同様にしてタンパク質を抽出した。ウオータージャケットを付けたインキュベーター中、３７℃で、１０％のＣＯ₂ 、６％のＯ₂及び８４％のＮ₂という微好気的雰囲気下で、細菌をチョコレート寒天（５％のウマの脱線維素血液を含むオキソイドＮｏ２ブロックアガー・ベース−ＣＭ２７１）上で生育させた。 (ii)音波処理９６時間培養の後、プレートからコロニーをこすり取ることによりＰＢＳを含む集菌チューブ中に菌を収穫した（トレース・マルチセル^TMコード50-201-PA）。遠心分離（室温、10,000g、５分）により細胞を洗浄し、新鮮な緩衝液に再懸濁した。この洗浄工程を一度繰り返し、最後に細胞を0.1Ｍのトリス−塩酸ｐＨ8 .2中に再懸濁した後、音波処理により破砕した。音波処理は氷浴中に置いて冷却した音波処理チューブ中、６μ（ＭＳＥソニプレプ150超音波破砕器）で、9.5ｍｍプローブを用いて行った。１ミリリットル分の試料に対する音波処理は３０秒の音波処理と６０秒の休みにそれぞれ分割した５サイクルから成り、総音波処理時間は７．５分であった。音波処理の後、細胞破砕物を遠心分離（12,000ｇ、10 分間、室温）により除去し、懸濁液をまず0.45μｍフィルターを通して濾過し、ついで0.2μｍのフィルターを通して、無細胞タンパク質懸濁液を得た。（iii）タンパク質測定総タンパク質濃度はバイオラド・クーマシーブルー・プロテイン測定キットを用いて測定した。 (iv)クロマトグラフィー（ａ）イオン交換トリス−塩酸緩衝液500μｌ中のタンパク質10〜15ｍｇからなる試料をＦＰＬＣシステムに連結したモノＱカラム（ファルマシア・バイオテク・エルティーディー、エイチアール５／５）に適用することにより無細胞懸濁液を分画した。溶出は０．１Ｍのトリス一塩酸緩衝液中の０〜１ＭのＮａＣｌからなる勾配で行った。タンパク質の溶出は２８０ｎｍでモニターし、溶出された物質はすべて０．５ｍｌ画分として集めた。この緩衝液の伝導率は勾配の精度を確保するため操作の全体にわたってモニターした。個々の画分にっいては、基質として尿素を利用する能力を測ることによりウレアーゼ活性をテストした。簡単に述べると、ミクロタイタープレートを用い、ウエルの列に、３ｍＭのリン酸水素二ナトリウムプラス１．５％ｗ／ｖ尿素及び４ μｇ／１００ｍｌのフェノールレッド（基質溶液）か又は尿素を除いた同様の溶液（ブランク緩衝液）からなる溶液の９０μｌを交互に分注した。次に、各画分の試料（１０μｌ）を対になっているウエルに、１試料を基質溶液にそして１試料をブランク緩衝液に、添加し、直ちにこのプレートを密閉シールした。２．５分後に各ウエルの吸光度を５４０ｎｍで測定した。対のウエルそれぞれについて、対照の価（ブランク緩衝液）をテストの価（基質溶液）から差し引き、そしてその結果得られた価を画分番号に対してプロットした。（ｂ）ゲル濾過クロマトグラフィーウレアーゼ活性を含むことが示されたモノＱ画分を集めて３個のプールとした。各プールを抗原活性についてテストした。第１のプールは抗原を含むことが示されたので、このプールを総タンパク質含量が約３０−５０ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。プール１の部分標本（２００μｌ）をスペロース６カラム（ファルマシア）のゲル濾過クロマトグラフィーに付した。溶出はトリス−塩酸、０．１Ｍ、ｐＨ７．２を溶出緩衝液として用いて行った。画分（０．５ｍｌ）を集めた。溶出は操作の間２８０ｎｍで溶出液の光学密度を測定し、続いてウレアーゼ活性とタンパク質含量を測定することにより監視した。（ｃ）反応性画分の選択画分について、試料を１ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝化食塩水で１０倍に希釈し、これらの希釈試料をウエル当たり１００μｌ用いてＥＬＩＳＡミクロタイタープレートのウエル（ヌンク・マクシソルブ）を被覆することにより抗原をテストした。ウエルを３時間放置し、ついで、０．１５ＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液で洗浄した。被覆されたプレートを次に既知のエイチ．ピロリ状態の患者から採った一群の血清試料を用いてスクリーニングした。血清試料はリン酸緩衝化食塩水で２００倍に希釈し、上記の被覆されたウエル中で１時間インキュベートした後、ウエルを洗浄しそして水気をとって乾燥させた。特異的抗体の結合はヤギ抗−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼを用い、３０分間インキュベートし、ついで洗浄した後、増強されたＴＭＢ基質（ケンブリッジ・ライフ・サイエンシーズ）を添加することにより検出された。反応は１５分後に１Ｍ硫酸で停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。画分はすべてＰＡＧＥ及びウエスタン・ブロッティング分析に付してそれらのタンパク質含量の相違を明らかにした。（ｖ）ＰＡＧＥ未変性ゲル電気泳動はファルマシア・マルチホアIIシステムを用いて行った。５％ゲルをこの目的のために特に調製した。試料５０μｌに０．２５％ブロモフェノール・ブルーの１０μｌを添加し、混合した後２０μｌの試料をゲルに移し、そして電気泳動を行った（６００ワット、３０分間）。画分の部分標本は１ｍｇ／ｍｌ及び４０μｌのＳＤＳ試料緩衝液（０．５ＭのＨＣｌ、ｐＨ６．８〔１．０ｍｌ〕、グリセロール〔０．８ｍｌ〕１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ〔１．６ｍｌ〕、０．８ＭのＤＴＴ〔０．４ｍｌ〕、１％ブロモフェノール・ブルー〔０．２ｍｌ〕及び水〔０．４ｍｌ〕）で調製した。試料はバイオラド・ミニ・プロテアンIIシステムを用い、予め調製した１０％ゲル（バイオラド）中で泳動させた。泳動緩衝液はＳＤＳを含むトリス−グリシンｐＨ８．３（５リットルの蒸留水中、トリス１５ｇ、グリシン７２ｇ、ＳＤＳ５ｇ）であった。泳動の完了後、ゲルを、メタノール／酢酸／水（４０／１０／５０％）中のクーマシー・ブル−Ｒ−２５０（０．１％）で染色し、そしてメタノール／酢酸／水（４０／１０／５０％）で脱染色した。使用した分子量マーカーは、ミオシン２１１，０００、β−ガラクトシダーゼ１１７，０００、ウシ血清アルブミン８１，０００、オボアルブミン４９，１００、カルボニック・アンヒドラーゼ３１，４００、大豆トリプシン・インヒビター２６，１００、リゾチーム１８，９００からなるバイオラドのＳＤＳ−ＰＡＧＥプリステンドスタンダード、広範囲用であった。 (vi)ウエスタン・ブロッティングウエスタン・ブロッティング分析はどのぺプチドがエイチ．ピロリ陽性患者由来の血清とのみ反応したかを決定するために使用された。血清試料のそれぞれにたいして、別のゲル及び別のブロットが行われた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは上述のように行われ、そしてミニ・プロテアンIIトランス・ブロット・セル（バイオラド）を用い、製造者の説明書通りＳＤＳを含まないトウビン（Towbin）緩衝液でニトロセルロース膜に移送させた。未変性ゲル移送はファルマシア・マルチホアIIを用い、セミードライ・ブロッティング手順（ＲＥＦ）で、不連続バッファーシステムを用いて行った。タンパク質移送後に、このニトロセルロース膜を２０ｍＭトリス−塩酸プラス５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）中で１０分間洗浄し、ついでＴＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間ブロックした。この膜を次に０．０５％のトゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＴＢＳ）中で洗浄し、そしてこの膜を１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳで６０倍に希釈した血清試料でプローブした。インキュベーションは室温で一晩行った。ついで、ニトロセルロースをＴＴＢＳで洗浄し、抗−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼを添加した。３時間のインキュベーションの後、ＴＢＳ中で洗浄し、その後、基質溶液（４−クロロナフトール）を添加した。この基質はメタノール２０ｍｌ中の４−クロロナフトール６０ｍｇを、混合直前に６０μｌの氷冷３０％Ｈ₂Ｏ₂を添加した１００ｍｌのＴＢＳと混合することにより使用直前に新たに調製した。インキュベーションはこの基質溶液が黒化し始めるまで進行させ、ここで新鮮な基質溶液と交換した。インキュベーションの使用最大時間は３０分であった。膜を蒸留水に移すことにより反応を停止させ、蒸留水を数回変えて洗浄した。この検定に使用した血清試料はウレア・ブレス・テスト（ＵＢＴ）陽性又は陰性として知られ、血清の状態はＥＬＩＳＡによって確認された。（vii）アミノ酸配列決定関心のある５個のユニークなタンパク質のバンドのＮ末端領域の１４個のアミノ酸を固相分析によって決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとブロッティングはウエスタン分析に対して先に述べたように行ったが、修正点としては、タンパク質の移送はニトロセルロースの代わりにＰＤＶＦ膜に対して行われた。この移送ＰＤＶＦ膜は染色しなかった。ついで、分析はフェイズシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ）を用い、その固相から行われた。 (viii)患者の血清試料及び唾液試料のテスト症候的胃障害のために研究されていた患者２２人を胃腸病クリニックから集めた（平均年齢５８．９年、男性１２、女性１０）。組織学的研究により１１人がエイチ．ピロリに対して陽性であることが分かった。試験時に集めた血清（２２）及び唾液（１３）をＥＬＩＳＡによりテストした。唾液のドット・ブロット分析は２２人の患者すべてについて行った。 (ix)ＥＬＩＳＡテスト（ａ）ＥＬＩＳＡ用ミクロタイタープレートの精製抗原を用いての被覆スペロース６カラムからの画分を含む選択された、精製された抗原をプールし、この抽出液を１８．５ｍＭのトリス−塩酸プラス１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５で、１〜２μｇタンパク質／ｍｌまで希釈した。後者の部分標本（１００μｌ）を用いてＥＬＩＳＡミクロタイタープレートのウエル（ヌンク・マクシソーブ）を被覆（周囲温度で１６時間）した。被覆後に、このウエルを０．１５ＭのＮａＣｌと０．０１％（ｗ／ｖ）のチオメルサル（Thiomersal）、ｐＨ７．２を含む５ｍＭリン酸緩衝液（３５０μｌ／ウエル）で３回洗浄し、そしてついでこのウエルを蒸留水に溶かした１％（ｗ／ｖ）のバイコ（Byco）Ａ（３５０μｌ／ウエル）を用いてブロック（周囲温度で蒸留水中９０分）した。２回続けて洗浄（先の洗浄用緩衝液）した後、プレートを直ちに使用するか又は乾燥（３７℃で１６時間）し、そしてシールした。（ｂ）血清試料のテストテスト対象である血清を０．０７％（ｕ／ｖ）トゥイーン８０、０．１６％（ｗ／ｖ）ブロモフェノール・ブルー、０．２５％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．１４ＭのＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）のＮ−メチルイソチアゾロン／ＨＣｌ及び０．１％（ｗ／ｖ）のオキシプリオン（Oxyprion）、ｐＨ７．２を含む５０ｍＭリン酸緩衝液で２００倍に希釈した。部分標本（１００μｌ）を抗原で被覆されたミクロタイタープレート（上記の（ａ）を見よ）の適当なウエルに添加し、周囲温度で４５分間インキュベートし、ついで、このウエルを０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｕ／ｖ）トゥイーン８０、０．００１％（ｗ／ｖ）のＮ−メチルイソチアゾロン／ＨＣｌ及び０．０１％（ｗ／ｖ）のオキシプリオン（Oxypri on）、ｐＨ７．８を含む１０ｍＭのトリス−塩酸（３５０μｌ／ウエル）で５回洗浄した。特異的抗原の結合は、（２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）のチオメルサル、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ画分Ｖ及び０．０５％（ｗ／ｖ）の８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、ｐＨ７．２で）適当に希釈したウサギ抗−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ複合体（１００μｌ／ウエル）を用い、周囲温度で１５分間インキュベーションすることにより検出した。５回続けて洗浄（前述のように）した後、ＴＭＢ基質を呈色反応のために使用し（１００μｌ／ウエル）、反応は周囲温度で１５分後にウエル当たり５０ μ１の２５％（ｗ／ｖ）のリン酸を添加することにより停止させ、そして各検定ウエルの吸光度を４５０ｎｍで記録した。（ｃ）唾液試料のテストテスト対象である唾液は１パートのオムニザルＹＧバッファー（ｐＨ７．２、リン酸系の緩衝液）で希釈し、その部分標本（１００μｌ）を抗原で被覆されたミクロタイタープレート（上記の（ａ）を見よ）の適当なウエルに添加した。周囲温度で３０分間インキュベートした後、そのウエルを（血清試料の場合と同様に緩衝液で）５回洗浄し、ついで特異的抗体の結合を周囲温度でビオチン−アビジン結合検定により検出した。簡単に述べると、Ｒｂ抗−ヒトＩｇＧビオチン（５ｍＭリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｕ／ｖ）トゥイーン８０、２．５％（ｗ／ｖ）アノロンシー(Anoronthy)、１％（ｕ／ｖ）の熱不活性化正常ウサギ血清、０．０１％（ｗ／ｖ）チオメルサル及び２．５％（ｗ／ｖ）ゼラチン、ｐＨ７．５で適当に希釈されたもの）を各ウエルに添加（１００μｌ）し、３０分間インキュベートした。５回続けて洗浄（前と同様に）した後、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体（５ｍＭリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、２％（ｕ／ｖ）の熱不活性化正常ウサギ血清、０．０１％（ｗ／ｖ）チオメルサル及び０．０５％（ｗ／ｖ）の８−アミノ−ナフタレン−１−スルホン酸、ｐＨ７．２で適当に希釈されたもの）を適当なウエルに添加（１００μｌ）し、１５分間インキュベートし、ついでこのウエルを前と同様に５回洗浄した。発色させるためにＴＭＢ基質を用い（１００μｌ／ウエル）、ウエル当たり５０μｌの２５％（ｗ／ｖ）リン酸を添加して１５分後に反応を停止させ、そして各検定の吸光度を４５０ｎｍて記録した。（ｘ）ドット・ブロット検定１個の血清試料に対する個々の画分とプールされた画分をテストするため、テスト対象である材料をニトロセルロースのシート上にスポットし、ついで詳述したウエスタン・ブロットの手順と同様に処理した。主として、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む画分又は画分のプールを調製した。ニトロセルロース（バイオラド、８．４×７ｃｍ）カタログＮｏ．１６２−０１４５）のシートに、そのニトロセルロースにいかなるタンパク質も移さないように注意しながら、鉛筆と定規を使って２４個の小さな四角の印を付けた。２μｇのタンパク質を含む各画分又はプールの部分標本（２μｌ）を、ニトロセルロース膜の印を付けた四角のそれぞれの中に注意してスポット（三連で）した。このスポットを大気条件下で乾燥させた後、膜のそれぞれをブロック用溶液（２０ｍＭトリス一塩酸、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に溶解した１％ｗ／ｖＢＳＡ）中で室温で１時間インキュベートした。このブロック用溶液は続いてデカントし、膜をトゥイーン−トリス緩衝化食塩水（２０ｍＭトリス−塩酸、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖトゥイーン−２０、ｐＨ７．５）で３回洗浄し、ついでそれぞれの膜を３種のヒト血清型（トゥイーン−トリス緩衝化食塩水中の１％ＢＳＡで６０倍ｖ／ｖに希釈したもの）の中の一つと共に室温で一晩インキュベートした。この３種のヒト血清型はヘリサル・イライザ（HELISA L ELISA）(コルテクス)テストにより同定され、臨床テストによりエイチ．ピロリ陽性、境界、陰性と確認されたものであった。一晩インキュベートした後、膜をトゥイーン−トリス緩衝化食塩水中で２回洗浄し、ついで複合体溶液（ウサギ抗−ヒトＩｇＧ−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体〔ダコ、カタログＮｏ．Ｐ−４０６〕をトゥイーン−トリス緩衝化食塩水中の１％ＢＳＡで５００倍ｖ／ｖ希釈したもの）中で室温で３時間インキュベートした。続いて膜をトゥイーン−トリス緩衝化食塩水中で２回、トリス緩衝化食塩水（２０ｍＭトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で１回洗浄し、ついで４−クロロ−１ −ナフトール溶液（２０ｍｌメタノール中６０ｍｇ、１００ｍｌトリス緩衝化食塩水及び６０μｌの３０％Ｈ₂Ｏ₂）中で２〜３０分間発色させた。発色は水中で洗浄することにより停止させた。ＥＬＩＳＡのカットオフ値は、組織病理学により決定された既知のエイチ．ピロリ状態を患う患者の頻度をＥＬＩＳＡ反応性に対してプロットすることによる、別の研究で決定された。結果モノＱエイチアール５／５カラムでの無細胞音波処理物の溶出プロフィルは図１に示すとおりである。ウレアーゼ活性を含む画分は１２ｍｌと１８ｍｌの間の溶出容積の中に位置した。モノＱエイチアール５／５カラムからのプールのスペロース６カラム上での溶出プロフィルでは、１０ｍｌと１９ｍｌの間の溶出容積の位置にウレアーゼを含む画分が得られた。抗原反応性画分はスペロース６溶出液のイライザグラム（ＥＬＩＳＡｇｒａｍ）及びウエスタン・ブロットにより決定された。エイチ．ピロリに感染していることが知られている患者由来の血清は未感染の主体と比べて異なるイライザグラムのパターンを示した。スペロース６溶出液のＥＬＩＳＡ反応性の典型的なプロフィルは図２に示すものである。感染主体と未感染主体の間で最大の相違を与えた抗原調製物が以下の診断検定の開発のために選択された。この抗原画分は幾らかウレアーゼの存在が検出されたが、ウレアーゼの主ピークの右側にあるものが選択された。反応性画分の未変性ＰＡＧＥにより、研究した２株由来の１６個の検出可能なタンパク質バンドであって、７００〜４０ｋＤａの範囲の分子量を持つバンドが示された（表１、図３）。表１スペロース６カラムからの反応性画分の未変性ＰＡＧＥ。検出されたタンパク質バンドの分子量バンドが観察されたゲル泳動の数（総数１０）。記された数値は平均値±ＳＥＭである。イミュノブロット分析により、これらのタンパク質バンドの中の９個が免疫反応性であることを明らかにした（表２、図４）。表２スペロース６カラムからの反応性画分の未変性ＰＡＧＥのウエスタン・ブロット分析により検出されたタンパク質バンドの分子量 ¹バンドが観察されたブロット分析の数（総数２６）。² のバンドはウレアーゼ活性を示した。³ この強く染色された領域は通常１個の区別できない領域として現れた（分子量の範囲は２４０〜３３０ｋＤａ）。示した数値は平均値±ＳＥＭである。未変性ＰＡＧＥ上で観察された５個の主要な領域のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、各領域に対して７〜９個の副成分が検出された（表３）。表３未変性ＰＡＧＥ上で観察された５個の主要な領域のサブユニット分析 ¹バンドが観察されたゲル泳動の数。^* ウレアーゼ陽性^** 強いブロット示した数値は平均値±ＳＥＭである。この反応性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３２個の検出可能なサブユニット成分が明らかになり、そのうちの１８個は陽性の血清と免疫反応性であった（表４、図５）。表４スペロース６カラムからの反応性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥのウエスタン・ブロット分析により検出されたサブユニット成分の分子量示した数値は平均値±標準偏差である。ｎ¹は２９回の泳動のうちバンドが検出された分析の数である。このゲルの分析の慎重な検討により、それぞれユニークであるように見えた１０個のサブユニット成分が同定された。これらのうち６個は主要なバンドであった（表５）。これらのタンパク質のうちの５個のＮ末端アミノ酸配列決定により、１はＷＯ−Ａ−９６２５４３０号で開示された抗原に相当したが、他の２個は新規であった（データ・バンクに記述された対応する配列はなかった）。一方、残りの２個は既知のＮ末端配列と正確な対応を示した（表６）。表５ゲル分析により反応性画分中に確認されたユニークなサブユニット成分表６反応性抗原画分中に確認された５個のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列新規な抗原を含むこれらの反応性画分のＥＬＩＳＡ診断における有用性をテストした。カットオフは唾液に対しては０．７ＥＬＩＳＡユニット、血清に対しては２．５ＥＬＩＳＡユニットと決定した（図６）。表７は組織学によるエイチ．ピロリ感染の検出に対する血清及び唾液のＥＬＩＳＡ及びドット・ブロット検定の能力を示す。この結果によれば、血清及び唾液の両方共高い感受性を示し、素晴らしい陽性及び陰性の予想値が得られた。唾液のドットブロット分析は唾液又は血清のＥＬＩＳＡ程に高くはないが許容され得る尺度としての能力を示した。表７組織学（幽門洞生検）的検出に対するＥＬＩＳＡ又はドットブロットにより決定された唾液及び血清抗体の比較実施例２（ａ）エイチ．ピロリの培養は適当な条件の下で生育させ、その細胞はリン酸緩衝化食塩水中に収穫した。続いて、細胞破砕物及び他の混合物、例えば寒天、を除去するため繰り返し遠心分離し、そして新鮮なＰＢＳを３回添加して洗浄細胞ペレットを得た。（ｂ）この洗浄細胞をイオン交換クロマトグラフィーの工程で使用するため、０．１Ｍのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．２に再懸濁した。次に、細胞懸濁液を細胞の破砕が保証される程に十分な強度及び時間の音波処理（１００寒天プレートからの細胞を含む１０ｍｌの試料に対して、６μで３０秒間処理、６０秒切断、を２５回繰り返す）に付した。（ｃ）この懸濁液を次に遠心分離にかけて細胞破砕物を除去し、可溶性細胞タンパク質を含む上清を得た。マシア）などの強アニオン交換樹脂を用い、予め定めた方法で溶出緩衝液を０から１．０Ｍの塩化ナトリウム濃度の増加に基づく勾配溶出を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより分画した。この画分を次にウレアーゼの存在にっいて検定した。（ｅ）ウレアーゼを含む画分を次にプールし、球状タンパク質に対し５×１０³ 〜５×１０⁶Ｄａのカットオフ範囲を持つ樹脂を用いるゲル浸透クロマトグラフィーに付した。（ｆ）適当なピークを以下の工程により選択した。 (i) 全ての画分についてウレアーゼ検定を行いそしてウレアーゼ活性を含むタンパク質ピークを同定する工程、 (ii) ウレアーゼ陽性であることが分かった画分の全て及びこのウレアーゼピークの直ぐ隣のタンパク質ピークであって、未変性タンパク質のウエスタン・ブロット分析によりより低い（見かけの）分子量を持つものおよび変性（ＳＤＳ）処理により生成したそれらの断片の画分を、エイチ．ピロリ陽性の個体から集めたヒト血清から調製されたプール由来のＩｇＧを用いて分析する工程、及び (iii) 上記のようにして電気泳動的に分離された後にエイチ．ピロリ陽性の血清プール由来のヒトＩｇＧとは反応するが、エイチ．ピロリ陰性の血清から調製された同様の血清プールとは反応しないことが示されたタンパク質のバンドを選択する工程。こうして同定されたバンドはそれぞれ、Ｎ末端アミノ酸分析に付し、そしてその配列を利用可能なコンピュータ・データベースからの既知のタンパク質の配列と比較した。請求の範囲１．下記の特性、すなわち、変性条件かつ還元条件下で測定するとき、約５３ｋＤａの分子量を持ち、かつ下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：１）を持つこと、ＭＤＬ？ＶＬＧＩＮＴＡ、変性条件かつ還元条件下で測定するとき、約４３ｋＤａの分子量を持ち、かつ下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：２）を持つこと、ＭＲＶＰＫ（Ｓ）ＫＧＦＡＩＬＳＫ、変性条件かつ還元条件下で測定するとき、約４３ｋＤａの分子量を持ち、かつ下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：３）を持つこと、？？ＧＫＡＰＤＦＫＰＡ、変性条件かつ還元条件下で測定するとき約５４ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：４）を持つこと、ＭＬＫ（Ｖ）Ｉ（Ｅ）Ｋ（Ｖ又はＳ）ＬＥ（Ｓ）Ｉ、自然（非変性）の条件下で測定するとき約３７０ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：５）を持つこと、Ｍ（Ｋ）ＬＴＩ？ＬＥＶ（Ｅ）、自然（非変性）の条件下で測定するとき約１４０ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：６）を有すること、ＭＹＩＰＹＶＩＥ、自然（非変性）の条件下で測定するとき約９０ｋＤａの分子量を持ち、かつ下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：７）を有すること、ＭＮＬＤＣ（Ｓ）ＬＱＶ、変性条件かつ還元条件下で測定するとき約１５．９から１６．９ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：８）を持つこと、ＧＫＩＧＩＦＦＧＴＤＳＧＮＡＥＡＩＡＥＫ、又は自然（非変性）の条件下で測定するとき約３４４ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列（配列番号：９）を有すること、ＭＬＶＴＫＬＡＰＤＦＬＡＰ？Ｖ、上記の配列において括弧内の文字はそれに先行するアミノ酸の代替アミノ酸を表す、を持つエイチ．ピロリ抗原タンパク質。２．請求項１記載のタンパク質の抗原性断片。３．下記の配列、すなわち、ＭＤＬ？ＶＬＧＩＮＴＡ（配列番号：１）、ＭＲＶＰＫ（Ｓ）ＫＧＦＡＩＬＳＫ（配列番号：２）、？？ＧＫＡＰＤＦＫＰＡ（配列番号：３）、ＭＬＫ（Ｖ）Ｉ（Ｅ）Ｋ（Ｖ又はＳ）ＬＥ（Ｓ）Ｉ（配列番号：４）、Ｍ（Ｋ）ＬＴＩ？ＬＥＶ（Ｅ）（配列番号：５）、ＭＹＩＰＹＶＩＥ（配列番号：６）、ＭＮＬＤＣ（Ｓ）ＬＱＶ（配列番号：７）、ＧＫＩＧＩＦＦＧＴＤＳＧＮＡＥＡＩＡＥＫ（配列番号：８）、ＭＬＶＴＫＬＡＰＤＦＬＡＰ？Ｖ（配列番号：９）、又はＭＦＴＬＲＥＬＰＦＡＫＤＳＮＧＤＦＬＳＰ（配列番号：１０）、上の配列中の括弧内の文字はそれに先行するアミノ酸の代替アミノ酸を表す、を持つ請求項２記載の抗原性断片。４．請求項１記載の少なくとも一つのタンパク質又は請求項２又は請求項３記載の少なくとも一つの抗原性断片を含んで成る抗原組成物。５．他のエイチ．ピロリ抗原及び／又はその断片の一つ以上をさらに含んで成る請求項４記載の抗原組成物。６．エイチ．ピロリの検出及び／又は診断に使用するための、下記のＮ末端アミノ酸配列、すなわちＭＦＴＬＲＥＬＰＦＡＫＤＳＮＧＤＦＬＳＰ（配列番号：１０）。を有するエイチ．ピロリ由来のスーパーオキシドディスムターゼ酵素。７．エイチ．ピロリを検出及び／又は診断する方法であって、（ａ）テストの対象である試料を、請求項１記載の抗原性タンパク質の少なくとも一つ、請求項２又は請求項３記載の抗原性断片の少なくとも一つ、請求項４又は請求項５記載の抗原組成物、又は請求項６記載のスーパーオキシドディスムターゼ酵素と接触させる工程、及び（ｂ）エイチ．ピロリに対する抗体の存在を検出する工程、を含んで成る方法。８．その試料が唾液の試料である、請求項７記載の方法。９．その試料が血液の試料である、請求項７記載の方法。１０．エイチ．ピロリの検出及び／又は診断に使用するためのキットであって、請求項１記載のタンパク質の少なくとも一つ、請求項２又は請求項３記載の抗原性断片の少なくとも一つ、請求項４又は請求項５記載の抗原組成物、又は請求項６記載のスーパーオキシドディスムターゼ酵素を含んで成るキット。１１．主体における免疫応答を引き出すことができる組成物であって、請求項１記載のタンパク質の少なくとも一つ、請求項２又は請求項３記載の抗原性断片の少なくとも一つ、請求項４又は請求項５記載の抗原組成物、又は請求項６記載のスーパーオキシドディスムターゼ酵素を含んで成る組成物。１２．該組成物がワクチン組成物である請求項１１記載の組成物。１３．少なくとも一つのアジュバントをさらに含んで成る請求項１２記載の組成物。１４．請求項１記載のタンパク質の少なくとも一つ、請求項２又は請求項３記載の抗原性断片の少なくとも一つ、請求項４又は請求項５記載の抗原組成物、又は請求項６記載のスーパーオキシドディスムターゼ酵素の、免疫原組成物の調製における使用。１５．免疫原組成物がワクチン組成物である請求項１４記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｇ０１Ｎ 33/573 ＡＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ロバートリューリンクランシーオーストラリア国、エヌエスダブリュー 2300、ニューカッスル、ワットストリート、ロイヤルニューカッスルホスピタル、ユニバーシティオブニューカッスル、デパートメントオブパソロジー (72)発明者ロイスマクシェインオーストラリア国、エヌエスダブリュー 2300、ニューカッスル、キングアンドワットストリーツ、デイヴィッドマディソンビルディング、レベル４、オーストレイリアンインスティチュートオブミュコサルイミュノロジー (72)発明者クリストファージョンスミス英国、エルエル17 ０ティーイー、デンビグシャー、ローアルト、トレメアチオンレーン、イスフリン (72)発明者デイヴィッドロバートタイアマン英国、エルエル33 ０イーエヌ、グイネッド、ランバイアフェチァン、テラスウォーク、ペンランコテジーズ２ (72)発明者バウホーシンガポール国、シンガポール 119260、ケントリッジクレセント 10、ザナショナルユニバーシティオブシンガポール、ファカルティオブメディシン、デパートメントオブマイクロバイオロジー

Claims

【特許請求の範囲】１．エイチ．ピロリ抗原であるタンパク質であって、変性条件下かつ還元条件下で測定するとき、約４３ｋＤａから約５３ｋＤａの範囲の分子量を持つタンパク質。２．約４３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。ＭＤＬ？ＶＬＧＩＮＴＡ３．約４３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。ＭＲＶＰＫ（Ｓ）ＫＧＦＡＩＬＳＫ４．約５３ｋＤａの分子量を持ち、かつ、そのアミノ末端に下記のアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。？？ＧＫＡＰＤＦＫＰＡ５．エイチ．ピロリ抗原であるタンパク質であって、下記の特性を有するタンパク質、 (i) 変性条件かつ還元条件の下で測定するとき約５４ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列を持つこと、ＭＬＫ（Ｖ）Ｉ（Ｅ）Ｋ（Ｖ又はＳ）ＬＥ（Ｓ）Ｉ、 (ii) 未変性条件下で測定するとき約３７０ｋＤａの分子量を持ち、かつ下記のＮ末端アミノ酸配列を有すること、Ｍ（Ｋ）ＬＴＩ？ＬＥＶ（Ｅ）、 (iii) 未変性条件下で測定するとき約１４０ｋＤａの分子量を持ち、かつ下記のＮ末端アミノ酸配列を有すること、ＭＹＩＰＹＶＩＥ、 (iv) 未変性条件下で測定するとき約９０ｋＤａの分子量を持ち、かつ下記のＮ末端アミノ酸配列を有すること、ＭＮＬＤＣ（Ｓ）ＬＱＶ、 (v) 変性条件かつ還元条件の下で測定するとき約１５．９から１６．９ｋＤａの分子量を持ち、かつ、下記のＮ末端アミノ酸配列を持つこと、ＧＫＩＧＩＦＦＧＴＤＳＧＮＡＥＡＩＡＥＫ、 (vi) 未変性条件下で測定するとき約３４４ｋＤａの分子量を持ち、かつ下記のＮ末端アミノ酸配列を有すること、ＭＬＶＴＫＬＡＰＤＦＬＡＰ？Ｖ、又は (vii) 下記のＮ末端アミノ酸配列を有するスーパーオキシドディスムターゼ酵素であること、ＭＦＴＬＲＥＬＰＦＡＫＤＳＮＧＤＦＬＳＰ、ただし、上記の配列中、括弧内の文字はそれに先行する文字に代替するアミノ酸を示す。６．請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のタンパク質の抗原性断片。７．下記の配列を有する請求項６に記載の抗原性断片、ＭＤＬ？ＶＬＧＩＮＴＡ、？？ＧＫＡＰＤＦＫＰＡ、ＭＬＫ（Ｖ）Ｉ（Ｅ）Ｋ（Ｖ又はＳ）ＬＥ（Ｓ）Ｉ、ＭＲＶＰＫ（Ｓ）ＫＧＦＡＩＬＳＫ、Ｍ（Ｋ）ＬＴＩ？ＬＥＶ（Ｅ）、ＭＹＩＰＹＶＩＥ、ＭＮＬＤＣ（Ｓ）ＬＱＶ、ＧＫＩＧＩＦＦＧＴＤＳＧＮＡＥＡＩＡＥＫ、ＭＬＶＴＫＬＡＰＤＦＬＡＰ？Ｖ、又はＭＦＴＬＲＥＬＰＦＡＫＤＳＮＧＤＦＬＳＰ。８．請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のタンパク質の少なくとも一つ、又は請求項６又は請求項７に記載の抗原性断片の少なくとも一つを含んで成る抗原組成物。９．他のエイチ．ピロリ抗原及び／又はその断片の一つ以上をさらに含むものである請求項８記載の抗原組成物。１０．エイチ．ピロリの検出及び／又は診断に使用するための、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項６又は請求項７に記載の抗原性断片、又は請求項８又は請求項９に記載の抗原組成物。１１．エイチ．ピロリを検出及び／又は診断する方法であって、（ａ）請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の抗原性タンパク質の少なくとも一つ、請求項６又は請求項７に記載の抗原性断片の少なくとも一つ、又は請求項８又は請求項９に記載の抗原組成物をテスト対象である試料と接触させる工程、及び（ｂ）エイチ．ピロリに対する抗体の存在を検出する工程、を含んで成る方法。１２．上記の試料が唾液の試料である請求項１１記載の方法。１３．上記の試料が血液の試料である請求項１１記載の方法。１４．請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質の少なくとも一つ、請求項６又は請求項７に記載の抗原性断片の少なくとも一つ、又は請求項８又は請求項９に記載の抗原組成物の、エイチ．ピロリの検出及び／又は診断における使用。１５．上記の検出及び／又は診断がイン・ビトロで行われるものである、請求項１１〜請求項１３いずれか１項に記載の方法又は請求項１４に記載の使用。１６．エイチ．ピロリの検出及び／又は診断に使用するためのキットであって、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のタンパク質の少なくとも一つ、請求項６又は請求項７に記載の抗原性断片の少なくとも一つ又は請求項８又は請求項９に記載の抗原組成物を含んで成るキット。１７．主体で免疫応答を引き出すことができる組成物であって、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のタンパク質の少なくとも一つ、請求項６又は請求項７に記載の抗原性断片の少なくとも一つ又は請求項８又は請求項９に記載の抗原組成物を含んで成る組成物。１８．必要に応じて一つ以上のアジュバントをさらに含むワクチン組成物である請求項１７記載の組成物。１９．請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のタンパク質の少なくとも一つ、請求項６又は請求項７に記載の抗原性断片の少なくとも一つ又は請求項８又は請求項９に記載の抗原組成物の、免疫原組成物、好ましくはワクチンの調製における使用。２０．主体に免疫応答を誘発するための、請求項１７又は請求項１８に記載の免疫原組成物の使用。２１．主体におけるエイチ．ピロリ感染の治療法又は予防法であって、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のタンパク質の少なくとも一つ、請求項６又は請求項７に記載の抗原性断片の少なくとも一つ又は請求項８又は請求項９に記載の抗原組成物の有効量を主体に投与する工程を含んで成る方法。２２．タンパク質の少なくとも一つ、抗原性断片の少なくとも一つ又は抗原組成物がワクチンの形で投与されるものである請求項２１記載の方法。