CN109937047A - nNIF和nNIF相关肽以及相关方法 - Google Patents

nNIF和nNIF相关肽以及相关方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109937047A
CN109937047A CN201780067221.2A CN201780067221A CN109937047A CN 109937047 A CN109937047 A CN 109937047A CN 201780067221 A CN201780067221 A CN 201780067221A CN 109937047 A CN109937047 A CN 109937047A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nrp
nnif
net
seq
patient
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780067221.2A
Other languages
English (en)
Inventor
C·C·约斯特
G·A·齐默曼
A·S·韦里奇
J·希夫曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Utah Research Foundation UURF
Original Assignee
University of Utah Research Foundation UURF
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Utah Research Foundation UURF filed Critical University of Utah Research Foundation UURF
Publication of CN109937047A publication Critical patent/CN109937047A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了新生儿NET抑制因子(nNIF)和nNIF相关肽(NRP)。还提供了用于治疗和预防炎性病症和癌症的方法。另外，提供了用于抑制患有癌症的患者中的转移的方法。所述方法可包括将nNIF和/或NRP施用至患有炎性病症或癌症或处于发展炎性病症或癌症的风险的患者。

Description

nNIF和nNIF相关肽以及相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月28日提交的美国临时申请号62/492,019和2016年9月2日提交的美国临时申请号62/383,243的权益，所述申请各自特此以引用的方式整体并入。
技术领域
本公开涉及新生儿嗜中性粒细胞抑制因子(nNIF)和nNIF相关肽(NRP)。本公开还涉及使用nNIF和NRP抑制嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成的方法。此外，nNIF和NRP可用于治疗和预防炎性病症和癌症。
背景技术
嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)的形成可以是嗜中性粒细胞(多形核白细胞；PMN)的防御装备的重要组分，所述组分允许嗜中性粒细胞捕获、固定和推定杀死细胞外空间的微生物(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；以及Brinkmann V,等人,Science.2004；303(5663):1532-5)。NET形成通过通常称为NETosis的一种新的细胞死亡过程发生，尽管也描述了其中嗜中性粒细胞不会立即死亡的“至关重要的”NETosis(参见Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94和Yipp BG,等人,Nature medicine.2012；18(9):1386-93)。导致NET形成的分子机制尚未完全探明并且可能部分取决于刺激(参见Sorensen OE,等人,Journal ofclinical investigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；以及Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91)。然而，染色质的解凝以及DNA与组蛋白和颗粒内容物一起的挤出是中心事件(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinicalinvestigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Yipp BG,等人,Naturemedicine.2012；18(9):1386-93；Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91)。由肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)介导的组蛋白的去亚胺化(参见Wang Y,等人,JCell Biol.2009；184(2):205-13；Li P,等人J Exp Med.2010；207(9):1853-62；以及Kolaczkowska E,等人Nature communications.2015；6(6673))被认为是核解凝和NET形成的必要条件(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20)。
NET介导的病原体捕获和消除可补充传统的PMN抗微生物活性，包括吞噬作用和细胞内杀伤(参见Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83和Nauseef WM,Immunol Rev.2007；219(88-102))。临床观察结果指明，NET形成中的缺陷在一些情况下促成难治性感染(参见Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83和Bianchi M,等人,Blood.2009；114(13):2619-22)，但NET在体内病原体杀死中的重要性仍不清楚(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；以及Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94)。相反，有大量证据表明NET和NET相关因子(包括组蛋白和颗粒蛋白酶)介导血管和组织损伤，并且NET介导的损伤是先前未认识到的对宿主的先天免疫附带损伤的机制(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Kolaczkowska E,等人,Nature communications.2015；6(6673)；以及Xu J,等人Nature medicine.2009；15(11):1318-21)。实验模型和有限的临床观察结果表明，血管内或血管外NET形成促成菌血症中的组织损伤(Kolaczkowska E,等人,Nature communications.2015；6(6673)；Clark SR,等人,Nature medicine.2007；13(4):463-9；以及McDonald B,等人Cell host&microbe.2012；12(3):32433)、输血相关的急性肺损伤(参见Caudrillier A,等人,J Clin Invest.2012；122(7)2661-71)、肺移植后的原发性移植物功能障碍(参见Sayah DM,等人,American journal of respiratory andcritical care medicine.2015；191(4):455-63)、无菌性血管病变和免疫炎症(参见ChenG,等人,Blood.2014；123(24):3818-27；以及Lood C,等人,Nature medicine.2016；22(2):146-53)、血栓形成(参见Fuchs TA,等人,Proc Natl Acad Sci USA.2010；107(36):15880-5)和流感(参见Pillai PS,等人Science(New York,NY).2016；352(6284):463-6)。因此，NET形成可以是嗜中性粒细胞的重要适应不良活动(参见Sorensen OE,等人,Journal ofclinical investigation.2016；126(5):1612-20)，如果它被不适当地触发或在感染和炎症中不受调控。
人类新生儿具有独特且复杂的免疫调控、易感染和炎症病理。尽管婴儿在子宫内处于无菌环境中，但是在分娩之前或分娩过程中它可能受到病原体及其产物的激发(参见McDonagh S,等人,Journal of infectious diseases.2004；190(4):826-34)。此外，新生儿在分娩后迅速被细菌定殖，其是与循环和骨髓嗜中性粒细胞的增加相关的过程(参见Palmer C,等人PLoS biology.2007；5(7):e177；Jost T,等人,PloS one.2012；7(8):e44595；以及Deshmukh HS,等人,Nat Med.2014；20(5):524-30)。复杂的适应性似乎已经发展到预防围产期中以及从受保护的子宫内环境至持续的微生物定殖和暴露的突然新生儿过渡中的过度有害炎症(参见Dowling DJ,等人Trends in immunology.2014；35(7):299310；Adkins B.,Immunologic research.2013；57(1-3):246-57；以及Elahi S,等人,Nature.2013；504(7478):158-62)。然而，这些适应性可能伴随着对感染的易感性增加(参见Adkins B.,Immunologic research.2013；57(1-3):246-57和Elahi S,等人,Nature.2013；504(7478):158-62)。已经发现，从早产儿和足月儿的脐带血分离的PMN在刺激时不会形成NET，并且具有NET介导的细菌杀死的缺陷，从而表明这种适应(参见Yost CC,等人,Blood.2009；113(25):6419-27)。其他研究者随后报道了在体外刺激分离的新生儿嗜中性粒细胞时暂时延迟的NET形成(参见Marcos V,等人Blood.2009；114(23):4908-11,作者回复11-2)。
附图说明
本文公开的实施方案将结合附图从以下描述和随附权利要求书而变得更加清楚明白。这些附图仅描绘了典型的实施方案，所述实施方案将通过使用附图来另外具体且详细地描述，其中：
图1A是描绘来自7名早产新生儿的嗜中性粒细胞的一系列图像，所述新生儿在出生后的前28天内针对通过活细胞成像(NET＝红色荧光，黄色箭头；核DNA＝灰色；20x放大倍率，比例尺＝100μm)评估的响应于脂多糖(LPS)(100ng/mL，1小时)的NET形成进行纵向检查，并且图中描绘了NET相关组蛋白H3的释放(相对于基线的倍数变化；平均值±SEM)。单因素ANOVA与杜凯氏(Tukey)事后检验。与任意设定为1的对照组蛋白H3释放(红色虚线)相比，*P<0.05，**P<0.01。
图1B是描绘在分娩当天从健康足月新生儿的脐带血(左图)或在出生后第2天从静脉血(右图)中分离的嗜中性粒细胞的两个图像，所述嗜中性粒细胞用LPS(100ng/mL，1小时)刺激并且如图1A中成像。对来自第二足月新生儿的嗜中性粒细胞的NET形成的分析产生相同的模式。
图1C是描绘在分娩当天从健康孕妇的静脉血中分离的嗜中性粒细胞的两幅图像，所述嗜中性粒细胞在单独培养基中孵育或用LPS(100ng/mL)刺激1小时并如图1A中成像(60x放大倍率，比例尺＝100μm)。来自第二健康足月母亲的嗜中性粒细胞也响应于LPS而稳健地形成NET。
图1D是描绘从60日龄早产新生儿(n＝5)的静脉血中分离的嗜中性粒细胞的一系列图像，所述嗜中性粒细胞与第60天自体血浆或与储存的自体脐带血血浆一起预孵育1小时，用LPS刺激并如图1A中评估NET形成(60x放大倍率，比例尺＝100μm)。从健康成人的静脉血中分离并在自体或储存的脐带血血浆中预孵育的嗜中性粒细胞进行并行研究。在图中描绘了NET相关组蛋白H3的释放(相对于基线的倍数变化；平均值±SEM)。单因素ANOVA与杜凯氏(Tukey)事后检验。*LPS/成人对比LPS/新生儿，P<0.05；**自体血浆对比脐带血血浆中的新生儿PMN，P<0.01；自体血浆对比脐带血血浆中的成人PMN，图1A-1D表明NET-抑制因子存在于人脐带血中。
图2A是来自质谱法的nNIF的临时部分序列，以及CRISPP(参见Cercek L,等人Cancer Detect Prey.1992；16(5-6):305-19)和A1AT的公开序列。
图2B描绘健康足月新生儿脐带血血浆(n＝4)和成人静脉血浆(n＝4)的样品，所述样品通过蛋白质印迹使用针对A1AT的羧基末端的多克隆抗体进行分析(左图)(完整凝胶在图10中示出，其在下文描述)。右图描绘了使用全长A1AT的尺寸排阻、用针对A1AT羧基末端的相同多克隆抗体的定量蛋白质印迹以及使用合成nNIF(参见以下表2)产生的标准曲线来测量来自早产新生儿的脐带血血浆和来自健康成人的静脉血浆中的nNIF浓度(在每组中n＝8)。学生t检验，**P<0.01。
图2C是描绘通过LPS刺激的(100ng/mL，1小时)成人嗜中性粒细胞形成NET的一系列图像，所述嗜中性粒细胞在使用与亲和珠粒偶联的多克隆羧基末端A1AT抗体或来自亲和珠粒的洗脱液在对照培养基、脐带血血浆、耗竭nNIF的脐带血血浆中预孵育PMN后如图1A中进行评估(60x放大倍率，比例尺＝50μm)。此结果在来自不同供体的嗜中性粒细胞的三次实验中是一致的。
图2D是描绘全长A1AT、合成nNIF以及图2C中研究的耗竭脐带血血浆的样品和洗脱液样品的图像，使用羧基末端A1AT抗体对所述样品进行蛋白质印迹。由于其尺寸，在此16.5％Tris-tricine凝胶上未检测到全长A1AT(52kDa)。
图2E是描绘由LPS活化的成人PMN形成NET的一系列图像，所述PMN在对照培养基(第二图)中或与全长A1AT(2μm)或合成nNIF(1nM)(n＝3)一起预孵育1小时后如图1A中进行评估。单因素ANOVA与杜凯氏(Tukey)事后检验。*nNIF对比对照培养基/LPS和A1AT/LPS两者，P<0.05。在图中描绘了NET相关组蛋白H3含量(相对于基线的倍数变化)。图2A-2E表明nNIF和相关的NRP代表NET抑制肽家族。
图3A描绘LPS(100ng/mL)活化。**与对照相比，对于LPS和CRISPP-SCR/LPS，P<0.05；与LPS和CRISPP-SCR/LPS两者相比，对于CRISPP/LPS和nNIF/LPS，
图3B描绘乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)(20nM)活化。*与PMA或CRISPP-SCR/PMA相比，对于nNIF/PMA和CRISPP/PMA两者，P<0.05；**对于CRISPP/PMA对比CRISPP-SCR/PMA，P<0.01。
图3C描绘金黄色葡萄球菌(SA；MOI 100:1)活化。*与SA或CRISPP-SCR/SA相比，对于CRISPP/SA，P<0.05。
图3D描绘登革病毒(MOI 0.05:1)活化。单独病毒培养基充当登革热病毒的“模拟”对照(左图)。在孵育后，在成像前将PMN立即固定在孵育培养基(2％多聚甲醛)中，并且不可能定量组蛋白H3释放。
图3E描绘血红素(1μm)。*对于血红素、LPS和CRISPP-SCR/血红素对比对照，P<0.05；对于CRISPP/血红素对比血红素，图3A-3E表明nNIF和NRP CRISPP抑制由一系列NET诱导型激动剂触发的体外NET形成。将来自健康成人的静脉血的嗜中性粒细胞在单独培养基中或与nNIF、CRISPP或CRISPP-SCR(全部1nM)一起预孵育1小时，并用所指示的激动剂活化(各自n≥3)，并如图1A中在孵育1小时后评估NET形成(20x放大倍率；比例尺＝50μm)。所有数据都是±SEM。在图3A、3B、3C和3E中，任意设置为1的对照值由红色虚线表示。单因素ANOVA与杜凯氏事后检验应用于图3A、3B、3C和3E中。nNIF未在图3C或3D中研究。
图4A是描绘从健康成人的静脉血中分离的嗜中性粒细胞的一系列图像，所述嗜中性粒细胞在单独培养基中孵育(对照)或用LPS(100ng/mL)活化。在LPS后0、30或60分钟添加CRISPP(1nM)，并如图1A中在孵育另外1小时后通过活细胞成像评估NET的存在(20x放大倍率；比例尺＝100μm)。所述图像代表三个独立的实验。
图4B是描绘用LPS(100ng/mL，1小时)、DNA酶(3.78U/mL)、nNIF(1nM)或CRISPP(1nM)刺激的分离的成人嗜中性粒细胞的一系列图像，并且在孵育另外1小时后将NET如图4A中成像(60x放大倍率，比例尺＝20μm)。在第二实验中，在用nNIF或CRISPP处理后，NET也是完整的，但被DNA酶拆除。图4A和4B表明NRP不拆除NET。
图5A是描绘分离的成人嗜中性粒细胞的两个图像，所述嗜中性粒细胞在培养基中预孵育(1小时)，且然后单独(对照)或与LPS(100ng/mL，1小时)一起孵育，然后如图1A中进行活细胞成像(60x放大倍率，比例尺＝20μm)。
图5B是并行描绘嗜中性粒细胞的一系列图像，所述嗜中性粒细胞与合成的A1ATm358或乱序A1ATm358(A1ATm358-SCR)(1、10或100nM，1小时)一起预孵育，用LPS活化，并且在孵育1小时后通过活细胞成像评估NET。第二实验产生通过A1ATm358而非A1ATm358-SCR的相似浓度依赖性抑制模式。图5A和5B表明A1ATm358抑制NET形成。
图6A是描绘在预孵育后用LPS(100ng/mL)刺激以触发NET形成并与大肠杆菌的致病分离株一起孵育的嗜中性粒细胞的结果的图。测量总的吞噬细胞和NET介导的细菌杀死(参见Yost CC,等人,Blood.2009；113(25):6419-27)。单因素ANOVA与邦弗朗尼(Bonferonni)事后检验；*P<0.05，**P<0.01。
图6B是描绘在LPS刺激(100ng/mL，1小时)后通过二氢罗丹明检测测量的活性氧物质产生的图。
图6C是描绘荧光标记的大肠杆菌生物颗粒的吞噬作用的图，所述生物颗粒在孵育4小时后通过显微镜测量。用细胞松弛素B和D处理充当抑制吞噬作用的对照。学生t检验，*P<0.05。
图6D是描绘在博伊登(Boyden)室测定中检查的响应于IL-8(2ng/mL)的趋化性的图。虚线表示对任意设定为1的单独IL-8的反应。
图6E是描绘通过流式细胞术测量的通过凝血酶(0.1U/mL)活化的血小板上P-选择蛋白的表面易位的图。虚线表示未刺激的血小板上的表面P-选择蛋白。
图6F是描绘在混合用凝血酶(0.1U/mL)活化的血小板和用LPS(100ng/mL)活化的嗜中性粒细胞后测量的血小板-嗜中性粒细胞聚集体的形成的图。虚线表示响应于单独PMN的LPS刺激的对照聚集体形成。*与对照相比，对于CRISPP和CRISPP-SCR，P<0.05。图6A-6F是描绘与缓冲液或与CRISPP、nNIF或CRISPP-SCR(1nM，各自1小时)一起预孵育、然后测量功能反应的分离的成人嗜中性粒细胞或血小板的一系列图。对每种反应进行至少三次单独测定。误差棒＝SEM。杜凯氏事后检验应用于图6B、6D、6E和6F。图6A-6F表明NRP选择性地抑制NET形成。
图7A是描绘嗜中性粒细胞的一系列图像，所述嗜中性粒细胞在单独培养基中、与nNIF、nNIF-SCR、CRISPP或CRISPP-SCR(全部1nM)或者与不可逆的PAD4抑制剂Cl-脒(10μm)一起孵育1小时；用PMA(20nM)处理；且然后在聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片上孵育2小时，然后通过活细胞成像检查核解凝(箭头)(绿色荧光＝核DNA；60x放大倍率，比例尺＝20μm)。
图7B是描绘使用IMAGEJTM软件测量(n＝4)的核面积(每个细胞的平均核像素面积±SEM)的图。*配对学生t检验，P<0.05，§P＝0.057。
图7C是描绘在使用重组PAD4和合成底物的无细胞去亚胺化测定中检查的nNIF(1nM)、nNIF-SCR(1nM)和Cl-脒(10μm)的图。单因素ANOVA与杜凯氏事后检验，***P<0.001。
图7D是一系列图像，其中左图描绘在培养基中、与nNIF或nNIF-SCR(两者均1nM)或与Cl-脒(10μm)一起预孵育30分钟并用PMA(20nM)活化15分钟的嗜中性粒细胞，并且通过免疫细胞化学检测瓜氨酸化组蛋白H3(n＝3)。绿色荧光＝瓜氨酸化-组蛋白H3，品红色荧光＝核DNA(60x放大倍率；比例尺＝20μm)。右图描绘使用IMAGEJTM软件定量的组蛋白H3瓜氨酸化(每个细胞平均瓜氨酸化组蛋白H3像素面积±SEM)(n＝3)。单因素ANOVA与杜凯氏事后检验，*P<0.05。
图7E是描绘嗜中性粒细胞的一系列图像，所述嗜中性粒细胞与FLAG标记的CRISPP-FLAG或CRISPP-SCR-FLAG(两者均1nM)一起孵育1小时，用LPS(100ng/mL)活化另外2小时，且然后使用抗FLAG抗体通过共聚焦显微镜检查(n＝3)。黄色荧光＝FLAG标签；蓝色荧光＝核复染色(60x放大倍率，比例尺＝20μm)。FLAG标记的肽未被分离的人血小板内化(未公布的实验)。图7A-7E表明NRP抑制活化的嗜中性粒细胞中的核解凝和组蛋白瓜氨酸化。
图8A描绘通过活细胞成像(60x放大倍率，比例尺＝50μm)和组蛋白H3释放(红色虚线＝任意设定为1的基线)评估的腹膜液NET形成(红色荧光，黄色箭头)的结果。每组三只小鼠。单因素ANOVA与杜凯氏事后检验，***对于CRISPP和nNIF对比CRISPP-SCR，P<0.001。
图8B描绘通过使用IMAGEJTM软件计数在四个随机显微视野(60x放大倍率；比例尺＝50μm)中越过标准化网格线的NET的数量来量化腹膜表面上的NET形成的结果(红色荧光，黄色箭头)。第二实验产生类似的模式。图8A和8B描绘未预处理或用nNIF、CRISPP或CRISPP-SCR(10mg/kg腹膜内；1小时)预处理并用大肠杆菌(4.5x 107细菌，腹膜内)接种的C57BL/6小鼠。在3小时后，处死动物，并且收集腹膜液(图8A)和膜(图8B)用于分析。
图8C描绘如图8A和8B中未预处理(左侧两个条形)或用CRISPP、nNIF或CRISPP-SCR预处理并用大肠杆菌腹膜内接种的C57BL/6小鼠。在3小时后计数腹膜液中的嗜中性粒细胞数(3-5只小鼠/组)。单因素ANOVA与诺伊曼-科伊尔(Neuman-Keul)事后检验；对于CRISPP对比CRISPP-SCR或未预处理的，*对于对照对比所有其他组，P<0.05。
图8D描绘如图8A和8B中用CRISPP或CRISPP-SCR预处理并用大肠杆菌接种的C57BL/6小鼠(5只动物/组)。在3小时后，测量腹膜液中的细菌菌落形成单位(cfu)(单加尾曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验；*P<0.05)。
图8E描绘如图8A中成像并测量的腹膜液NET形成(10只小鼠/组)。*与CRISPP-SCR/大肠杆菌和大肠杆菌相比，对于CRISPP/大肠杆菌和nNIF/大肠杆菌，P<0.05。
图8F描绘如图8B中成像和定量的腹膜表面上的NET形成(每组中3只小鼠)。*对于大肠杆菌对比对照，P<0.05(红色虚线)；**对于CRISPP-SCR/大肠杆菌对比对照，P<0.01；对于CRISPP/大肠杆菌和nNIF/大肠杆菌对比CRISPP-SCR/大肠杆菌，单因素ANOVA与杜凯氏事后检验应用于图8E和8F中。在图8E和8F中，如图8A和8B中将未预处理或用nNIF、CRISPP或CRISPP-SCR预处理的Swiss-Webster小鼠腹膜内接种大肠杆菌。在3小时后，收集腹膜液和膜。图8A-8F表明nNIF和CRISPP抑制体内NET形成。
图9A是描绘用LPS(25mg/kg腹膜内)激发的C57BL/6小鼠的图。在LPS之前1小时和之后6小时给予CRISPP、nNIF或CRISPP-SCR(10mg/kg腹膜内)。无处理或单独给予LPS的动物进行并行研究(对于每种条件，n≥10只小鼠)。**使用对数秩(曼特尔-考克斯(Mantel-Cox))统计工具，P<0.01。与CRISPP-SCR-LPS相比，nNIF-LPS与CRISPP-LPS之间的存货差异趋于显著(§P＝0.051)。
图9B是描绘经受盲肠结扎和穿刺(CLP)的C57BL/6小鼠的图。在手术之前1小时和之后6小时给予nNIF或nNIF-SCR(10mg/kg腹膜内)(在每组中n≥7)。对经受假手术的小鼠进行并行研究(在每组中n＝3)。临床疾病严重程度得分(参见Araujo CV,等人,Shock.2016；45(4):393-403)在24小时确定。单因素ANOVA与诺伊曼-科伊尔事后检验；**对于nNIF对比nNIF-SCR组，P<0.01。
图9C是描绘在图9B中评估全身性疾病的严重程度且然后每天跟踪的小鼠的图，其中在144小时处死存活者。使用对数秩(曼特尔-考克斯)统计工具。**P<0.01。图9A-9C表明nNIF和CRISPP改善了实验性全身性炎症的存活。
图10是描绘在脐带血样品中检测到而在来自成人的血浆中检测不到通过针对A1AT的羧基末端的抗体识别的低分子量肽的图像。通过蛋白质印迹检查来自四名健康足月新生儿的脐带血血浆的样品和来自四名健康成人志愿者的静脉血样品。如上所述，这是从起制备的图2B的左图的完整凝胶。
图11是描绘nNIF和CRISPP在纳摩尔浓度下抑制NET形成的一系列图像。将来自健康成人志愿者的PMN在单独培养基中或与所指示浓度的nNIF或CRISPP一起预孵育1小时。然后添加LPS(100ng/mL)，并将白细胞孵育1小时，然后如图1A中进行活细胞成像(红色荧光＝NET；绿色荧光＝核DNA；20x放大倍率)。在来自不同供体的嗜中性粒细胞的三个实验中观察到nNIF和CRISPP对NET形成的这种浓度依赖性抑制。
图12A描绘在单独培养基中、与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)抑制剂西维来司钠(SIVL；200nM)或与CRISPP或CRISPP-SCR(两者均为1nM)一起预孵育1小时、随后用PMA(20nM)处理和另外1小时孵育之后如图7A-7E中评估的核解凝(白色箭头和放大图像)(n＝3)。绿色荧光＝核DNA，(60x放大倍率，比例尺＝20μm)。使用IMAGEJTM软件定量核面积(每个细胞的核像素面积±SEM)。单因素ANOVA与杜凯氏事后检验；**P<0.01，***P<0.001。
图12B描绘NE酶活性，所述活性通过将合成底物(MeOSuc)-AAPV-(pNA)裂解成(MeOSuc)-AAPV和(pNA)作为通过液相色谱法和通过质谱法的色谱图峰鉴别检测到的产物来进行检查。将(MeOSuc)-AAPV-(pNA)(160μm)与NE(2mU)、西维来司钠(160μm)或NE和西维来司钠(左图)或与NE(2mU)、nNIF(10nM)或NE和nNIF(右图)一起在37℃下孵育3小时。色谱图在X轴和Y轴上偏移以便于比较。在单独NE存在下，(MeOSvc)-AAPV-(pNA)峰几乎完全消除，并且产生(MeOSvc)-AAPV和(pNA)峰。在西维来司钠存在下，此底物裂解被抑制但未被消除。相比之下，它不受nNIF抑制。在三个单独的实验中观察到这种模式。使用采用不同方案、NE底物和检测方法的两种额外测定，nNIF和CRISPP两者都不抑制多个实验中的NE活性。图12A和12B表明NE介导核解凝，但nNIF和CRISPP不抑制体外NE活性。
图13是描绘FLAG标记的CRISPP抑制LPS活化的嗜中性粒细胞的NET形成的一系列图像。将成人嗜中性粒细胞在单独培养基中或与CRISPP、FLAG标记的CRISPP(CRISPP-FLAG)或FLAG标记的CRISPP-SCR(CRISPP-SCR-FLAG)(全部1nM)一起预孵育30分钟；用LPS(100ng/mL)刺激；并且孵育1小时，然后如图1A中进行活细胞成像以评估NET形成(红色荧光＝NET；绿色荧光＝核DNA；20x放大倍率)。在来自不同供体的嗜中性粒细胞的三个单独实验中观察到CRISPP-FLAG和CRISPP而非CRISPP-SCR-FLAG抑制NET形成。
图14描绘了蛋白酶高温需要A1(HTRA1)在妊娠晚期的人胎盘中上调，并裂解C-末端中的A1AT，从而产生尺寸稍大、但包括nNIF的序列的片段(参见Frochaux V,等人,Plosone.9(10):e109483.doi:10.1371)。合成通过HTRA1裂解A1AT产生的肽，并且发现所述肽抑制NET形成。
具体实施方式
本公开涉及新生儿嗜中性粒细胞抑制因子(nNIF)和nNIF相关肽(NRP)。本公开还涉及使用nNIF和NRP抑制嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成的方法。nNIF和NRP可用于治疗和预防炎性病症和癌症。将容易理解的是，如本文总体描述的实施方案是示例性的。各种实施方案的以下更详细的描述并不意图限制本公开的范围，而仅是代表各种实施方案。此外，在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可改变本文公开的方法的步骤或动作的顺序。换言之，除非实施方案的适当操作需要步骤或动作的特定顺序，否则可修改特定步骤或动作的顺序或使用。
本文引用的每一专利、报告和其他参考文献以引用的方式整体并入。
“NET抑制肽(NIP)”是抑制嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成的抗炎剂。NIP的实例包括但不限于：新生儿NET抑制因子(nNIF)；nNIF的药学上可接受的盐；nNIF的天然存在形式的类似物，所述nNIF类似物抑制NETosis和/或NET的形成，并且相对于给定人nNIF通过至少一个氨基酸添加、缺失或取代或通过并入具有封闭基团的一个或多个氨基酸而在结构上改变；nNIF类似物的药学上可接受的盐；nNIF相关肽(NRP)；NRP的药学上可接受的盐；NRP类似物；或NRP类似物的药学上可接受的盐。
“新生儿嗜中性粒细胞抑制因子肽”或“nNIF肽”在本文中定义为天然存在于哺乳动物中的nNIF。
“新生儿NIF相关肽”或“NRP”在本文中被定义为癌症相关的SCM识别、免疫防御遏制和丝氨酸蛋白酶保护肽(CRISPP)，其天然存在于人中；A1ATm358，其已被证明抑制NET形成；HTRA1-CF；其他nNIF相关肽；以及NRP的天然存在形式的类似物，所述类似物抑制NETosis和/或NET的形成，并且相对于给定人NRP通过至少一个氨基酸添加、缺失或取代或通过并入具有封闭基团的一个或多个氨基酸而在结构上改变。
“炎性病症”在本文中被定义为以病理性炎症为特征的病症。炎性病症包括但不限于与感染、自身免疫性和过敏相关的疾患。如本文所定义的炎性病症可包括但不限于急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；支气管肺发育不良(BPD)；慢性阻塞性肺病(COPD)；囊性纤维化；癌症及其并发症中的炎症；炎性肠病(IBD)；炎性肺病(ILD)；流感诱发的肺炎；坏死性小肠结肠炎(NEC)；新生儿慢性肺病(CLD)；牙周炎；先兆子痫；早产儿视网膜病变(ROP)；败血症；全身炎症反应综合征(SIRS)；血栓形成；输血相关的急性肺损伤(TRALI)；血管炎；自身免疫性综合征，包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和韦格纳氏肉芽肿病(WG)；以及未消退的炎症的病症。存在本文未列出但本领域技术人员已知的其他炎性病症。例如，参见Kumar,等人,Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease,第43-77页,第8版,2010,Saunders Elsevier,Philadelphia,PA；Nathan,Nature,2002,420:846-852；和Amulic,等人,Annu Rev Immunol,2012,30:459-489。
当与NIP结合使用时，短语“不全面抑制多形核白细胞(PMN)功能”意味着虽然NIP可抑制或基本上抑制NETosis，但是NIP不抑制或基本上不抑制其他PMN功能。其他PMN功能包括但不限于趋化性、趋化因子合成和分泌、细胞因子合成和分泌、细胞外细菌杀死、细胞内细菌杀死、吞噬作用和/或活性氧物质(ROS)产生。测定这些功能的方法是本领域中已知的。例如，实施例16描述测定吞噬细菌杀死的方法。
本公开涉及NET抑制肽(NIP)、新生儿NET抑制因子(nNIF)、nNIF类似物、nNIF相关肽(NRP)和NRP类似物的治疗用途和相关用途。在一些实施方案中，所述NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物可用于抑制NETosis和/或嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)的形成。
在探索钝化新生儿NET部署的机制中，在脐带血中发现了一种肽，所述肽在体外和体内抑制NET形成并且似乎是NET产生的内源性调控因子。还鉴别了抑制NETosis的相关肽。除了在特定炎性环境或组织隔室中的调控活性之外，这些先前未识别的NET形成的调控因子可能具有作为选择性抗炎剂的潜力。
本公开的第一方面涉及治疗炎性病症的方法。在某些实施方案中，本公开提供了治疗患有炎性病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NIP或NIP的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述炎性病症的病理效应或症状。所述病理效应或症状可包括以下中的一种或多种：疼痛、灼热、发红、肿胀和/或水肿、低血压、纤维化和/或炎症后纤维化、终末器官衰竭(即肾脏、心脏、肝脏)、组织损伤和/或功能丧失。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有炎性病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含nNIF或nNIF的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述炎性病症的病理效应或症状。
在其他实施方案中，本公开提供了治疗患有炎性病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含nNIF类似物或nNIF类似物的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述炎性病症的病理效应或症状。
在其他实施方案中，本公开提供了治疗患有炎性病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NRP或NRP的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述炎性病症的病理效应或症状。
在仍然其他实施方案中，本公开提供了治疗患有炎性病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述炎性病症的病理效应或症状。
在一些实施方案中，所述患者可以是哺乳动物。在某些实施方案中，所述患者可以是人。需要抑制NETosis和/或NET形成的任何患者或受试者可潜在地是用NIP、NIP的药学上可接受的盐、nNIF、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、NRP、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物和/或NRP类似物的药学上可接受的盐治疗的候选者。
在一些实施方案中，所述炎性病症可至少部分地涉及嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成和/或NETosis或至少部分地由其引起。在一些实施方案中，所述炎性病症可以是急性炎性病症、慢性炎性病症和/或免疫病症。在其他实施方案中，所述炎性病症可以是自身免疫性病症。在其他实施方案中，所述炎性病症可以是凝血病症。
在一些实施方案中，所述炎性病症可以是以下中的一种或多种(但不限于)：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；支气管肺发育不良(BPD)；慢性阻塞性肺病(COPD)；囊性纤维化；癌症及其并发症中的炎症；炎性肠病(IBD)；炎性肺病(ILD)；流感诱发的肺炎；坏死性小肠结肠炎(NEC)；新生儿慢性肺病(CLD)；牙周炎；先兆子痫；早产儿视网膜病变(ROP)；败血症；全身炎症反应综合征(SIRS)；血栓形成；输血相关的急性肺损伤(TRALI)；血管炎；自身免疫性综合征，包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和韦格纳氏肉芽肿病(WG)；以及未消退的炎症的病症。存在本文未列出但本领域技术人员已知的其他炎性病症。例如，参见Kumar,等人,Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease,第43-77页,第8版,2010,Saunders Elsevier,Philadelphia,PA；Nathan,Nature,2002,420:846-852；和Amulic,等人,Annu Rev Immunol,2012,30:459-489。
在另一方面，本公开涉及用于治疗患有癌症的患者的方法。在一些实施方案中，所述癌症可以是黑素瘤、卵巢癌、胃癌、肺癌或另一种合适的癌症中的至少一种。在某些实施方案中，用于治疗患有癌症的患者的方法可包括向所述患者施用有效量的包含NIP的药物组合物。所述药物组合物还可包含NIP和药学上可接受的载体。在各种实施方案中，所述药物组合物可减轻或被配置为减轻癌症的病理效应或症状。
在一些实施方案中，所述NIP可以是以下中的一种：nNIF、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、NRP、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物和/或NRP类似物的药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述药物组合物可抑制或基本上抑制NET形成。例如，所述药物组合物可至少部分地通过抑制患有癌症的患者中的NET形成来减轻癌症的病理效应或症状。如上所述，患者可以是哺乳动物，如人。
在另一方面，本公开涉及用于治疗处于发展癌症的风险的患者的方法。如上所述，所述癌症可以是黑素瘤、卵巢癌、胃癌、肺癌或另一种合适的癌症中的至少一种。在某些实施方案中，用于治疗处于发展癌症的风险的患者的方法可包括向所述患者施用有效量的包含NIP的药物组合物。所述药物组合物还可包含NIP和药学上可接受的载体。在各种实施方案中，所述药物组合物可降低或被配置为降低发展癌症的风险。
在一些实施方案中，所述NIP可以是以下中的一种：nNIF、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、NRP、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物和/或NRP类似物的药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述药物组合物可抑制或基本上抑制NET形成。例如，所述药物组合物可至少部分地通过抑制处于发展癌症的风险的患者中的NET形成来降低发展所述癌症的风险。如上所述，患者可以是哺乳动物，如人。
在另一方面，本公开涉及用于抑制或基本上抑制患有癌症的患者中的转移的方法。所述癌症可以是黑素瘤、卵巢癌、胃癌、肺癌或另一种合适的癌症中的至少一种。在某些实施方案中，用于抑制转移的方法可包括向所述患者施用有效量的包含NIP的药物组合物。所述药物组合物还可包含NIP和药学上可接受的载体。在各种实施方案中，所述药物组合物可降低或被配置为降低所述患者中转移的风险。
在一些实施方案中，所述NIP可以是以下中的一种：nNIF、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、NRP、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物和/或NRP类似物的药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述药物组合物可抑制或基本上抑制NET形成。例如，所述药物组合物可至少部分地通过抑制患有癌症的患者中的NET形成来降低转移的风险。如上所述，患者可以是哺乳动物，如人。
在某些实施方案中，包含NIP的药物组合物可能不全面抑制PMN的功能。PMN的功能包括但不限于趋化性、吞噬作用、活性氧物质(ROS)产生、细胞因子/趋化因子合成和分泌、NET形成/NETosis和/或细胞内/细胞外细菌杀死。在某些实施方案中，所述药物组合物可能不抑制或基本上不抑制PMN吞噬作用。在其他实施方案中，所述药物组合物可能不抑制或基本上不抑制PMN趋化性。在其他实施方案中，所述药物组合物可能不抑制或基本上不抑制ROS的产生。在其他实施方案中，所述药物组合物可能不抑制或基本上不抑制PMN细胞内细菌杀死。因此，施用包含NIP的药物组合物以治疗患有癌症或处于发展癌症的风险的患者可避免用于治疗或预防癌症的化疗方案的一些副作用。
在另一方面，本公开涉及用于治疗患有癌症的患者的方法，其中所述方法包括鉴别患者中的癌细胞处或附近的NET形成。在一些实施方案中，所述方法还可包括向具有NET形成的患者(例如，其中鉴别NET形成的患者)施用有效量的包含NIP和药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述癌症的病理效应或症状。在某些实施方案中，所述方法可包括从所述患者获得癌细胞的样品。可对所述癌细胞或包含癌细胞的样品进行检查和/或测试以鉴别NET形成的存在。
在另一方面，本公开涉及用于治疗处于发展癌症的风险的患者的方法。在各种实施方案中，所述方法可包括鉴别患者中的NET形成。在鉴别处于发展癌症的风险的患者中的NET形成后，所述方法可包括向所述患者施用有效量的包含NIP和药学上可接受的载体的药物组合物以降低所述患者发展癌症的风险。
在一些实施方案中，所述药物组合物可基本上抑制NET形成和/或NETosis。在其他实施方案中，所述药物组合物可抑制或基本上抑制NET介导的炎性组织损伤。
在另一方面，本公开涉及诊断患有癌症的患者的方法，所述患者将受益于用NET抑制肽(NIP)治疗。在某些实施方案中，所述方法可包括从所述患者获得癌细胞的样品，检测在所述癌细胞的样品中是否存在NET形成，和/或当检测到所述癌细胞的样品中存在NET形成时将所述患者诊断为将受益于用NIP治疗的患者。
在各种实施方案中，所述癌细胞可包括黑素细胞、卵巢细胞、胃细胞、肺细胞或其他合适类型的癌细胞中的至少一种。
在另一方面，本公开涉及诊断和治疗患有癌症的患者的方法，所述患者将受益于用NET抑制肽(NIP)治疗。在一些实施方案中，所述方法可包括从所述患者获得癌细胞的样品，检测在所述癌细胞的样品中是否存在NET形成，当检测到所述癌细胞的样品中存在NET形成时将所述患者诊断为将受益于用NIP治疗的患者，和/或向所述被诊断的患者施用有效量的包含NIP的药物组合物。
在某些实施方案中，所述NIP可以是以下中的一种：新生儿NET抑制因子(nNIF)、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、nNIF相关肽(NRP)、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物和/或NRP类似物的药学上可接受的盐。在各种实施方案中，所述癌细胞可包括黑素细胞、卵巢细胞、胃细胞、肺细胞或其他合适类型的癌细胞中的至少一种。如上所论述，所述药物组合物可基本上抑制NET形成。此外，所述患者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述患者可以是任。
被选择用于抑制NETosis和/或NET形成的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐的特定形式可通过已知用于产生肽产物的各种技术来制备。例如，nNIF和NRP的脊椎动物形式可通过使用蛋白质分离技术的适当组合从天然来源提取而获得。其他技术也在本公开的范围内。
在某些实施方案中，NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐可使用肽化学的标准技术合成，并且可评估其对NETosis和/或NET形成活性的抑制。关于合成，可通过用于产生肽产物的多种技术来制备所选择的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐。仅并入L-氨基酸的那些NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐可通过应用重组DNA技术以商业量产生。为此目的，将编码所需NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物的DNA并入表达载体中并转化到宿主细胞(例如，酵母、细菌或哺乳动物细胞)中，所述宿主细胞然后在适合NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物表达的条件下培养。已经为此目的调整了多种基因表达系统，并且通常驱动从所选宿主天然使用的表达调控元件表达所需基因。
在适用于产生选定NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物的方法中，以及可用于产生并入非遗传编码的氨基酸的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物以及N-和C-末端衍生形式的方法中，可使用自动肽合成的技术，所述技术的总体描述例如出现在Stewart和Young,Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,1984,Pierce ChemicalCompany,Rockford,IL；Bodanszky和Bodanszky,The Practice of Peptide Synthesis,1984,Springer-Verlag,New York,NY；以及Applied Biosystems 430A User’s Manual,1987,ABI Inc.,Foster City,CA中。在这些技术中，NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物通过使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧基羰基(t-Boc)方案顺序添加适当保护的氨基酸从其C-末端树脂缀合的残基生长，如例如Orskov,等人,FEBS Lett,1989,247(2):193-196所描述。
一旦合成了所需的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物，从树脂裂解并完全脱保护，所述肽然后可进行纯化以确保回收具有选定氨基酸序列的单一寡肽。可使用任何标准方法实现纯化，所述方法包括但不限于在烷基化二氧化硅柱(例如C4-、C8-或C18-二氧化硅)上的反相高压液相色谱法(RP-HPLC)。这种柱分级通常通过运行增加百分比的有机溶剂(例如，乙腈，在水性缓冲液中)的线性梯度(例如，10％-90％)来完成，所述有机溶剂通常含有少量(例如，0.1％)配对剂如三氟乙酸(TFA)或三乙醇胺(TEA)。或者，可使用离子交换HPLC来基于其电荷特征分离肽种类。收集柱级分，并且任选地合并含有所需和/或所要求纯度的肽的那些。在一些实施方案中，然后可以确立的方式处理NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物以使裂解酸(例如，TFA)与药学上可接受的酸(如乙酸、盐酸、磷酸、马来酸、酒石酸、琥珀酸等)交换以产生所述肽的药学上可接受的酸加成盐。
可使用肽化学的标准技术产生人NIP、nNIF和/或NRP的类似物，并且可全部根据本文提供的指导评估其对NETosis和/或NET形成活性的抑制。在一些实施方案中，所述类似物至少部分地基于如下的人nNIF(SEQ ID NO:1)、CRISPP(SEQ ID NO:2)、A1ATm358(SEQ IDNO:3)和/或HTRA1-CF(SEQ ID NO:4)的序列(其中X可以是任何天然存在的氨基酸)：
不会破坏NIP、nNIF和/或NRP的NET抑制活性的NIP、nNIF和/或NRP的一个或多个氨基酸或的任何取代、添加或缺失可有用地用于本公开中。在某些实施方案中，所述NIP、nNIF和/或NRP类似物至少与天然人NIP、nNIF和/或NRP一样有活性。如本公开中所描述，可在体外测定NET抑制活性。在其他实施方案中，与天然人NIP、nNIF和/或NRP相比，所述NIP、nNIF和/或NRP类似物具有一种或多种增强的性质。例如，此类类似物可表现出增强的血清稳定性、增强的受体结合和增强的信号转导活性。可有效用于本公开的对NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物的其他修饰是使分子抗氧化的那些修饰。
研究人员可通过将所述肽或类似物施用至患有炎性病症的个体来确定特定NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐是否可用于治疗炎性病症。研究人员然后可使用诊断生物标志物确定因此治疗的个体是否显示出炎症减轻和炎性疾患的改善。
本公开还涵盖任何脊椎动物NIP、nNIF和/或NRP序列中氨基酸的非保守取代，条件是所述非保守取代发生在已知在从不同物种分离的NIP、nNIF和/或NRP中变化的氨基酸位置处。通过比对已知的脊椎动物NIP、nNIF和/或NRP序列，可容易地确定非保守的残基位置。
对于施用至患者，所述NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐可以药学上可接受的形式提供(例如，作为例如通过0.22μ过滤器无菌过滤且基本上无热原的制剂)。可能需要待配制的NIP、nNIF和/或NRP肽在HPLC上作为单个或个体化峰迁移，在其分析时表现出均一和可靠的氨基酸组成和序列，并且另外符合各国家机构设定的调控药物产品质量的标准。
可补充水性载体或媒介物以用作具有一定量明胶的注射剂，所述明胶用于在注射部位处或附近储存NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐，以使其缓慢释放到至所需的作用部位。有效实现储库效应的明胶的浓度预期在10％至20％的范围内。替代胶凝剂，如透明质酸(HA)也可用作储存剂。
本公开的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐也可被配制为缓释植入制剂，以用于延长和持续施用NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐。这种持续释放制剂的实例包括生物相容性聚合物的复合物，如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。药物递送媒介物中可降解聚合物的结构、选择和用途已经在若干出版物中进行了综述，包括Domb等人,Polym Advan Technol,1992,3:279-292。在药物制剂中选择和使用聚合物的另外指导可在Chasin和Langer(编辑),BiodegradablePolymers as Drug Delivery Systems,Dekker,Drugs and the PharmaceuticalSciences的第45卷,1990,New York,NY的文本中找到。脂质体也可用于提供nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐的持续释放。除了其他地方之外，关于如何使用和制备目标药物的脂质体制剂的细节可在美国专利号4,944,948；5,008,050；4,921,706；4,927,637；4,452,747；4,016,100；4,311,712；4,370,349；4,372,949；4,529,561；5,009,956；4,725,442；4,737,323；已经4,920,016中找到。当需要提供高局部浓度的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐(例如，在炎症部位附近以抑制NETosis和/或NET形成等)时，持续释放制剂可能是特别令人感兴趣的。
本公开的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐也可并入植入或局部的一个或多个装置中，以用于延长和持续施用NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐。
对于治疗用途，所选择的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐可与药学上可接受并且适于通过所选施用途径递送肽的载体一起配制。合适的药学上可接受的载体是常规用于基于肽的药物的那些，如稀释剂、赋形剂等。可参考Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London,UK。在某些实施方案中，所述化合物可被配制用于通过输注或通过注射(例如，皮下、肌肉内或静脉内)施用，并且因此可以无菌和无热原形式的水溶液使用，并任选地缓冲至生理学上可耐受的Ph(例如，微酸性或生理pH)。因此，所述化合物可在媒介物中施用，如蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲盐水或5％葡萄糖溶液。如果需要，可通过并入溶解度增强剂如乙酸来增强NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐的水溶性。
本公开的另一方面涉及治疗早产并发症的方法。
在实施方案中，本公开提供了治疗患有早产并发症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NIP或NIP的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述早产并发症的病理效应或症状，如长期需要与新生儿慢性肺病相关的氧气支持或者需要手术干预或在发展坏死性小肠结肠炎的婴儿中进行长时间的全胃肠外营养。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有早产并发症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含nNIF或nNIF的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述早产并发症的病理效应或症状。
在其他实施方案中，本公开提供了治疗患有早产并发症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含nNIF类似物或nNIF类似物的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述早产并发症的病理效应或症状。
在其他实施方案中，本公开提供了治疗患有早产并发症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NRP或NRP的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述早产并发症的病理效应或症状。
在仍然其他实施方案中，本公开提供了治疗患有早产并发症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述早产并发症的病理效应或症状。
在一些实施方案中，所述患者可以是哺乳动物。在某些实施方案中，所述患者可以是人。
在一些实施方案中，所述早产并发症可至少部分地涉及嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成和/或NETosis或至少部分地由其引起。在某些实施方案中，所述药物组合物可基本上抑制NET形成和/或NETosis。在其他实施方案中，所述药物组合物可抑制或基本上抑制NET介导的炎性组织损伤。
在一些实施方案中，所述早产并发症可以是(但不限于)以下中的一种或多种：坏死性小肠结肠炎(NEC)、呼吸窘迫综合征(RDS)、肺炎、支气管肺发育不良(BPD)、新生儿慢性肺病(CLD)、神经发育迟缓、早产儿视网膜病变(ROP)和/或败血症。
本公开的另一方面涉及预防炎性病症的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了预防处于发展炎性病症的风险的患者的炎性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NIP或NIP的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述炎症病症的病理效应或症状的风险。
在一些实施方案中，本公开提供了预防处于发展炎性病症的风险的患者的炎性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含nNIF或nNIF的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述炎症病症的病理效应或症状的风险。
在其他实施方案中，本公开提供了预防处于发展炎性病症的风险的患者的炎性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含nNIF类似物或nNIF类似物的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述炎症病症的病理效应或症状的风险。
在其他实施方案中，本公开提供了预防处于发展炎性病症的风险的患者的炎性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NRP或NRP的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发发展所述炎性病症的病理效应或症状的风险。
在仍然其他实施方案中，本公开提供了预防处于发展炎性病症的风险的患者的炎性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述炎症病症的病理效应或症状的风险。
在一些实施方案中，所述患者可以是哺乳动物，包括人。
在一些实施方案中，所述炎性病症可至少部分地涉及嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成和/或NETosis或至少部分地由其引起。在一些实施方案中，所述炎性病症可以是急性炎性病症。在其他实施方案中，所述炎性病症可以是慢性炎性病症。在其他实施方案中，所述炎性病症可以是自身免疫性病症。在其他实施方案中，所述炎性病症可以是凝血病症。
在一些实施方案中，所述炎性病症可以是(但不限于)上文定义和/或列出的炎性病症中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述药物组合物可基本上抑制NET形成和/或NETosis。在其他实施方案中，所述药物组合物可抑制或基本上抑制NET介导的炎性组织损伤。
本公开的另一方面涉及预防早产并发症的方法。
在实施方案中，本公开提供了预防处于发展早产并发症的风险的患者的早产并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含新生儿NIP或NIP的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述早产并发症的病理效应或症状的风险。
在一些实施方案中，本公开提供了预防处于发展早产并发症的风险的患者的早产并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含新生儿nNIF或nNIF的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述早产并发症的病理效应或症状的风险。
在某些实施方案中，本公开提供了预防处于发展早产并发症的风险的患者的早产并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含nNIF类似物或nNIF类似物的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述早产并发症的病理效应或症状的风险。
在其他实施方案中，本公开提供了预防处于发展早产并发症的风险的患者的早产并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含nNIF相关肽(NRP)或NRP的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述早产并发症的病理效应或症状的风险。
在仍然其他实施方案中，本公开提供了预防处于发展早产并发症的风险的患者的早产并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物以降低发展所述早产并发症的病理效应或症状的风险。
在一些实施方案中，所述患者可以是哺乳动物，包括人。
在一些实施方案中，所述早产并发症可至少部分地涉及嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成和/或NETosis或至少部分地由其引起。在其他实施方案中，所述药物组合物可基本上抑制NET形成和/或NETosis。在其他实施方案中，所述药物组合物可抑制或基本上抑制NET介导的炎性组织损伤。
在其他实施方案中，所述早产并发症可以是(但不限于)以下中的一种或多种：坏死性小肠结肠炎(NEC)、呼吸窘迫综合征(RDS)、肺炎、支气管肺发育不良(BPD)、新生儿慢性肺病(CLD)、神经发育迟缓、早产儿视网膜病变(ROP)和/或败血症。
在另一方面，本公开涉及包含NIP的药物组合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物可包含新生儿NET抑制因子(nNIF)或nNIF的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，所述药物组合物可包含nNIF类似物或nNIF类似物的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在其他实施方案中，所述药物组合物可包含nNIF相关肽(NRP)或NRP的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在仍然其他实施方案中，所述药物组合物可包含NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，所述药物组合物可包含nNIF(例如，人nNIF)或其盐，并且所述nNIF或其盐可包含以下氨基酸序列的至少一部分：
在各种实施方案中，所述药物组合物可包含CRISPP或其盐，并且所述CRISPP或其盐可包含以下氨基酸序列的至少一部分：
在一些实施方案中，所述药物组合物可包含A1ATm358或其盐，并且所述A1ATm358或其盐可包含以下氨基酸序列的至少一部分：
在某些实施方案中，所述药物组合物可包含HTRA1-CF或其盐，并且所述HTRA1-CF或其盐可包含以下氨基酸序列的至少一部分：
在其他实施方案中，nNIF、nNIF的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的盐、NRP、NRP的盐、NRP类似物、NRP类似物的盐、CRISPP、CRISPP的盐、A1ATm358、A1ATm358的盐、HTRA1-CF或HTRA1-CF的盐的至少一个氨基酸可与化学修饰剂结合。在一些实施方案中，所述化学修饰剂可选自脂质、聚乙二醇(PEG)、糖类或任何其他合适的分子中的至少一种。所述药物组合物的其他化学修饰—例如，阳离子化、甲基化和环化—也在本公开的范围内。
脂质与肽的连接(脂化)可增加药物组合物的亲脂性。
PEG与肽的连接(PEG化)增加肽的分子量。在一些实施方案中，PEG化可改善药物组合物的溶解度。在其他实施方案中，PEG化可降低药物组合物的剂量频率和/或毒性。在其他实施方案中，PEG化可延长药物组合物的循环寿命，和/或延长药物组合物的稳定性，和/或可增强药物组合物的保护免于蛋白水解降解。PEG化还可降低药物组合物的免疫原性和/或抗原性。
将一种或多种糖连接至肽(糖基化)可在药物组合物中起到多种功能和/或结构作用。糖基化可改善药物组合物向靶标或选择靶标的递送。糖基化还可降低药物组合物的毒性。
在一些实施方案中，包含nNIF、nNIF的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的盐、NRP、NRP的盐、NRP类似物或NRP类似物的盐的药物组合物可以有效抑制或基本上抑制选自炎性组织损伤和/或炎性血管损伤中的至少一种的损伤的量存在。
在一些实施方案中，包含nNIF、nNIF的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的盐、NRP、NRP的盐、NRP类似物或NRP类似物的盐的药物组合物可能不全面抑制PMN的功能。如上所述，PMN的功能包括但不限于趋化性、吞噬作用、活性氧物质(ROS)产生、细胞因子/趋化因子合成和分泌、NET形成/NETosis和/或细胞内/细胞外细菌杀死。在某些实施方案中，所述药物组合物可能不抑制或基本上不抑制PMN吞噬作用。在其他实施方案中，所述药物组合物可能不抑制或基本上不抑制PMN趋化性。在其他实施方案中，所述药物组合物可能不抑制或基本上不抑制ROS的产生。在其他实施方案中，所述药物组合物可能不抑制或基本上不抑制PMN细胞内细菌杀死。
在一些实施方案中，所述药物组合物可包含nNIF类似物、nNIF类似物的盐、NRP类似物或NRP类似物的盐，并且所述类似物或所述类似物的盐可能不是天然存在的类似物或所述类似物的盐。
在一些实施方案中，所述药物组合物可以有效抑制或基本上抑制NET形成和/或NETosis的量存在。在一些实施方案中，所述NET形成和/或NETosis可由细菌、真菌、寄生虫、病毒和/或NET形成和/或NETosis的任何其他适当的刺激物刺激。在某些实施方案中，所述病毒可以是出血热病毒。出血热病毒描述于例如Borio等人,JAMA,2002,287(18):2391-2405中，并且包括但不限于诸如埃博拉病毒和马尔堡病毒的丝状病毒、诸如拉沙病毒的沙粒病毒、汉坦病毒以及诸如登革热病毒和黄热病病毒的黄病毒。在其他实施方案中，所述NET形成和/或NETosis可由一种或多种细菌物种刺激，所述细菌物种包括但不限于芽孢杆菌属物种、埃希氏杆菌属物种、弗朗西斯氏菌属物种、葡萄球菌属物种、链球菌属物种、耶尔森氏菌属物种和/或一种或多种任何其他适当的革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。在实施方案中，芽孢杆菌属物种可以是炭疽芽孢杆菌(炭疽)。在实施方案中，埃希氏杆菌属物种可以是大肠杆菌。在实施方案中，弗朗西斯氏菌属物种可以是土拉弗朗西斯菌(兔热病)。在实施方案中，葡萄球菌属物种可以是金黄色葡萄球菌。
在其他实施方案中，NET形成和/或NETosis可由β-防御素1、HIV-1、脂多糖(LPS)、乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)和/或金黄色葡萄球菌α-毒素刺激。
在一些实施方案中，所述药物组合物可包含NRP和/或NRP类似物。在某些实施方案中，所述药物组合物可包含癌症相关的SCM识别、免疫防御抑制和丝氨酸蛋白酶保护肽(CRISPP)和/或CRISPP类似物。在各种实施方案中，所述药物组合物可包含A1ATm358和/或A1ATm358类似物。在一些实施方案中，所述药物组合物可包含HTRA1-CF和/或HTRA1-CF类似物。在一些其他实施方案中，所述药物可包含另一种NRP。在某些实施方案中，所述NRP可以是脐带血的分离和纯化的组分。
在另一方面，本公开涉及用于抑制哺乳动物中NET和/或NETosis的形成的组合物。
在一些实施方案中，用于抑制哺乳动物中NET和/或NETosis的形成的组合物可包含nNIF、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、NRP、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述哺乳动物可以是人。
在另一方面，本公开涉及NET抑制肽(NIP)。
在一些实施方案中，所述NIP可以是包含SEQ ID NO:1的分离和纯化的nNIF蛋白。在某些其他实施方案中，所述分离和纯化的nNIF蛋白可包含SEQ ID NO:1的至少24个连续氨基酸。在其他实施方案中，所述分离和纯化的nNIF蛋白可包含SEQ ID NO:1的至少12个连续氨基酸。在仍然其他实施方案中，所述分离和纯化的nNIF蛋白可包含SEQ ID NO:1的至少6个连续氨基酸。
在某些实施方案中，所述NIP可以是分离和纯化的nNIF蛋白，其中所述序列可与SEQ ID NO:1至少80％相同。在其他实施方案中，所述分离和纯化的nNIF可与SEQ ID NO:1至少60％相同。在其他实施方案中，所述分离和纯化的nNIF可与SEQ ID NO:1至少40％相同。在仍然其他实施方案中，所述分离和纯化的nNIF可与SEQ ID NO:1至少20％相同。
在一些实施方案中，所述NIP可以是包含SEQ ID NO:2的分离和纯化的CRISPP蛋白。在某些其他实施方案中，所述分离和纯化的CRISPP蛋白可包含SEQ ID NO:2的至少24个连续氨基酸。在其他实施方案中，所述分离和纯化的CRISPP蛋白可包含SEQ ID NO:2的至少12个连续氨基酸。在仍然其他实施方案中，所述分离和纯化的CRISPP蛋白可包含SEQ IDNO:2的至少6个连续氨基酸。
在某些实施方案中，所述NIP可以是分离和纯化的CRISPP蛋白，其中所述序列可与SEQ ID NO:2至少80％相同。在其他实施方案中，所述分离和纯化的CRISPP可与SEQ ID NO:2至少60％相同。在其他实施方案中，所述分离和纯化的CRISPP可与SEQ ID NO:2至少40％相同。在仍然其他实施方案中，所述分离和纯化的CRISPP可与SEQ ID NO:2至少20％相同。
在一些实施方案中，所述NIP可以是包含SEQ ID NO:3的分离和纯化的A1ATm358蛋白。在某些其他实施方案中，所述分离和纯化的A1ATm358蛋白可包含SEQ ID NO:3的至少24个连续氨基酸。在其他实施方案中，所述分离和纯化的A1ATm358蛋白可包含SEQ ID NO:3的至少12个连续氨基酸。在仍然其他实施方案中，所述分离和纯化的A1ATm358蛋白可包含SEQID NO:3的至少6个连续氨基酸。
在某些实施方案中，所述NIP可以是分离和纯化的A1ATm358蛋白，其中所述序列可与SEQ ID NO:3至少80％相同。在其他实施方案中，所述分离和纯化的A1ATm358可与SEQ IDNO:3至少60％相同。在其他实施方案中，所述分离和纯化的A1ATm358可与SEQ ID NO:3至少40％相同。在仍然其他实施方案中，所述分离和纯化的A1ATm358可与SEQ ID NO:3至少20％相同。
在一些实施方案中，所述NIP可以是包含SEQ ID NO:4的分离和纯化的HTRA1-CF蛋白。在某些其他实施方案中，所述分离和纯化的HTRA1-CF蛋白可包含SEQ ID NO:4的至少24个连续氨基酸。在其他实施方案中，所述分离和纯化的HTRA1-CF蛋白可包含SEQ ID NO:4的至少12个连续氨基酸。在仍然其他实施方案中，所述分离和纯化的HTRA1-CF蛋白可包含SEQID NO:4的至少6个连续氨基酸。
在某些实施方案中，所述NIP可以是分离和纯化的HTRA1-CF蛋白，其中所述序列可与SEQ ID NO:4至少80％相同。在其他实施方案中，所述分离和纯化的HTRA1-CF可与SEQ IDNO:4至少60％相同。在其他实施方案中，所述分离和纯化的HTRA1-CF可与SEQ ID NO:4至少40％相同。在仍然其他实施方案中，所述分离和纯化的HTRA1-CF可与SEQ ID NO:4至少20％相同。
在另一方面，本公开涉及nNIF蛋白类似物、CRISPP蛋白类似物、A1ATm358类似物和/或HTRA1-CF类似物。在一些实施方案中，所述nNIF蛋白类似物可以是分离和纯化的nNIF类似物，CRISPP蛋白类似物可以是分离和纯化的CRISPP类似物，A1ATm358蛋白类似物可以是分离和纯化的A1ATm358类似物，和/或HTRA1-CF蛋白类似物可以是分离和纯化的HTRA1-CF类似物。
有效剂量和治疗方案可通过常规方法确定，例如，通过在实验室动物中以低剂量开始且然后在监测作用的同时增加剂量，并且还系统地改变剂量方案。当确定给定受试者的最佳剂量时，临床医生可考虑许多因素。其中最主要的是任何NIP是否在血浆中正常循环，并且如果如此，则任何此类NIP的量。另外的因素包括患者的体型、患者的年龄、患者的一般状况、所治疗的特定病症、病症的严重程度、患者中其他药物的存在以及NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物、其盐等的体内活性。可在考虑动物研究和临床文献的结果后选择试验剂量。
存在许多用于评估分子是否具有所需作用的特定治疗方案。面临确定特定NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP和/或NRP类似物是否可用于抑制NETosis和/或NET形成的任务的研究人员将选择适当的方案来进行作出这种确定。
用于向个体施用肽的递送方法和制剂是本领域中已知的，并且技术人员将能够确定对于特定情况将肽递送至个体的任何特定方法的适合性。仅出于说明的目的，提供了用于向个体施用肽的方法和制剂的以下实例。
肽可口服施用至个体；然而，消化系统的作用可降低肽的生物利用度。为了增加肽口服生物利用度，肽可在含有酶抑制剂的制剂中施用，或者肽可作为胶束、纳米颗粒或乳液的一部分施用以便保护所述肽免受消化活性。
肽也可通过注射施用。可皮下、肌肉内或静脉内注射肽。关于通过注射施用肽的方法的进一步公开内容见于例如美国专利号5,952,301中。
肽可进一步通过肺部递送施用。可使用干粉吸入系统，其中肽通过肺组织吸收，从而允许在不注射的情况下递送，同时绕过口服施用所见的生物利用度的潜在降低。参见Onoue等人,Expert Opin Ther Pat,2008,18:429。
为了用于抑制哺乳动物(包括人)中的NETosis和/或NET形成，本公开在其一个方面中提供呈无菌填充的小瓶或安瓿形式的包装或药盒，所述小瓶或安瓿含有呈单位剂量或多剂量的NETosis和/或NET形成抑制量的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐，其中所述包装或药盒并入说明其内容物用于抑制这种NETosis和/或NET形成的用途的标签。在各种实施方案中，所述包装或药盒含有NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐和所需的载体作为准备施用的制剂。或者，并且根据一些其他实施方案，所述包装或药盒提供呈适合于在合适的载体(如磷酸盐缓冲盐水)中复原的形式(如冻干形式)的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐。
在一个实施方案中，所述包装或药盒是含有可注射溶液的无菌填充的小瓶或安瓿，所述可注射溶液包含溶解于水性媒介物中的有效NETosis和/或NET形成抑制量的NIP、nNIF、nNIF类似物、NRP、NRP类似物和/或其盐。
炎症途径和免疫机制具有检查点和调节性制动，所述检查点和调节性制动阻止效应事件的不适当的起始或不受调控的传播，否则其可能导致宿主的病理性间接损伤(参见Nathan C.,Nature.2002；420(6917):846-52和Medzhitov R.,Nature.2008；454(7203):428-35)。炎症反应的严格控制和调节似乎在胎儿和新生儿中特别重要，但所涉及的细胞和分子机制仍未完全确定(参见Dowling DJ,等人,Trends in immunology.2014；35(7):299310；Adkins B.,等人,Immunologic research.2013；57(1-3):246-57；Elahi S,等人,Nature.2013；504(7478):158-62；Arck PC,等人,Nature medicine.2013；19(5):548-56；以及Levy O.,Nat Rev Immunol.2007；7(5):379-90)。脐带血中的nNIF和胎盘基质中的A1ATm358可代表调节围产期环境中的NETosis的调控因子。胎盘IL-8(一种NETosis诱导型趋化因子(参见Fuchs TA,等人,J Cell Biol.2007；176(2):231-41)和合胞体滋养层微粒在体外触发NET形成，并且NET存在于患有先兆子痫的女性的胎盘中(参见Gupta AK,等人,HumImmunol.2005；66(11):1146-54)。因此，NET诱导型刺激似乎在母体-胎儿界面处产生，从而表明不受调控的NET形成可在母胎环境中引起炎症病理。过量的分娩期NET形成也可具有额外的负面后果，包括长期新生儿免疫失调(参见Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Dowling DJ,等人,2014；35(7):299310；Adkins B.等人,Immunologic research.2013；57(1-3):246-57；Arck PC,等人,Nature medicine.2013；19(5):548-56；以及Sangaletti S,等人,Blood.2012；120(15):3007-18)。如果没有严格控制NET形成，则在分娩后，新生儿立即处于NET介导的血管损伤和血栓形成的风险(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinicalinvestigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；以及Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Kolaczkowska E,等人,Naturecommunications.2015；6(6673)；Clark SR,等人,Nature medicine.2007；13(4):463-9；Fuchs TA,等人,Proc Natl Acad Sci USA.2010；107(36):15880-5；以及Saffarzadeh M,等人,Curr Opin Hematol.2013；20(1):3-9)，所述血管损伤和血栓形成由微生物定殖(参见Palmer C,等人,PLoS biology.2007；5(7):e177和Jost T,等人,PloS one.2012；7(8):e44595)和随后的嗜中性粒细胞动员(参见Deshmukh HS,等人,Nat Med.2014；20(5):524-30)触发。新生儿血浆中的nNIF和胎盘间质中的相关NRP A1ATm358(参见Niemann MA,等人,Journal of cellular biochemistry.1997；66(3):346-57)代表在出生前和出生后立即选择性地限制NET形成的潜在“终止信号”(参见Nathan C.,Nature.2002；420(6917):846-52)。新生儿PMN快速发展完全NET能力(参见图1A-1D)并且在子宫外生命的最初几天内新生儿血液中的nNIF降低与建立人婴儿的常驻微生物群并行(参见Palmer C,等人,PLoSbiology.2007；5(7):e177和Jost T,等人,PloS one.2012；7(8):e44595)并且表明这些是免疫发育的受调控特征。在初始筛选中，nNIF在来自健康成人或患有慢性炎症综合征的成人患者的血浆样品中未检测到或者最低限度地存在(参见图2B)。这表明，但不受任何特定理论的束缚，nNIF表达可能主要是胎儿和新生儿的特征，某些其他免疫调控机制也是如此(参见Dowling DJ,等人,Trends in immunology.2014；35(7):299310；Adkins B.,Immunologic research.2013；57(1-3):246-57；以及Elahi S,等人,Nature.2013；504(7478):158-62)。
研究和先前的观察结果表明nNIF和A1ATm358通过胎盘中的A1AT的蛋白水解裂解产生。A1AT在人胎盘组织隔室中是丰富的(参见Castellucci M,等人,Cell and tissueresearch.1994；278(2):283-9和Frochaux V,等人,PloS one.2014；9(10):e109483)。已经提出在胎盘中发生A1AT的进行性蛋白水解裂解，并且已知在体外介导A1AT至A1ATm358的酶促片段化的蛋白酶(参见Niemann MA,等人,Matrix.1992；12(3):233-41；Niemann MA,等人,Biochim Biophys Acta.1997；1340(1):12330；以及Pei D,等人,J Biol Chem.1994；269(41):25849-55)，尽管特定胎盘蛋白酶尚未鉴别。在妊娠晚期人胎盘合胞体滋养层中增加的一种蛋白酶(高温需要蛋白酶1)裂解羧基末端中的A1AT(参见Frochaux V,等人,PloSone.2014；9(10):e109483)。不受任何具体理论束缚，这些发现表明在胎盘中用于产生A1AT的生物活性片段的机制，所述片段在新生儿分娩和分离后不再具有活性。
除了nNIF和A1ATm358之外，CRISPP被鉴别为NRP。CRISPP相关肽已经在来自患有多种类型癌症的患者的血浆中检测到(参见Cercek L,等人,Cancer Detect Prey.1992；16(5-6):305-19；Cercek L,等人,Cancer Detect Prey.1993；17(3):433-45；以及Cercek L,等人,Cancer Detect Prey.1993；17(3):447-54)，但未与NETosis的调控相关联。NET形成促进实验性转移(参见Cools-Lartigue J,等人,J Clin Invest.2013；123(8):3446-58)，并且还可促成癌症相关感染和败血症的结果。因此，内源性CRISPP相关肽可通过抑制NET的形成而对肿瘤并发症具有显著影响。
据发现nNIF和CRISPP抑制由金黄色葡萄球菌、细菌毒素LPS(一种先前未识别的病毒触发剂)、登革热(一种宿主来源的DAMP)、血红素和有效的药理学激动剂PMA诱导的体外NET部署。此分析表明NRP中断通过可由不同活化途径介导的不同刺激(例如，真菌激动剂等)触发的NET形成(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20)。此外，nNIF和CRISPP在大肠杆菌腹膜炎的鼠模型中抑制体内NET形成(参见图8A-8F)。在此，NET形成可能由细菌、LPS和宿主来源的介质诱导，从而表明NRP能够抑制由多种激动剂刺激的嗜中性粒细胞的NET部署，所述激动剂在复杂的炎症环境中以组合方式起作用并且可能同时经由多于一种途径诱导NET形成(参见Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94)。在此模型中验证nNIF和CRISPP作为NET部署的抑制剂(参见图8A-8F)也补充了体外抑制的分析(参见图3A-3E)，因为表明NET形成的途径在体内和体外变化(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20)。
nNIF和CRISPP被用作探针以探索NRP抑制NET形成的机制。虽然由许多激动剂诱导的NETosis涉及ROS产生(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinicalinvestigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Brinkmann V,等人,Science.2004；303(5663):1532-5；Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91；LoodC,等人,Nature medicine.2016；22(2):146-53；Branzk N,等人,SeminImmunopathol.2013；35(4):513-30；以及Schauer C,等人,Nature medicine.2014；20(5):511-7)，但当前(参见图6B)和先前(参见Yost CC,等人,Blood.2009；113(25):6419-27)实验表明NRP在一个或多个不同的步骤起作用。基于迄今为止的研究，无论激动剂如何，染色质解凝都在NET部署中起作用(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinicalinvestigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Yipp BG,等人,Naturemedicine.2012；18(9):1386-93；Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91；Farley K,等人,Journal of immunology.2012；189(9):4574-81；Pilsczek FH,等人,Journal of immunology.2010；185(12):7413-25；以及Branzk N,等人,Seminimmunopathol.2013；35(4):513-30)。已经发现在基于NETosis中染色质解凝的早期研究的测定中(参见Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91)，nNIF和CRISPP抑制PMA刺激的嗜中性粒细胞中小叶的损失和细胞核的扩增(参见图7A、12A和12B)。嗜中性粒细胞异染色质解凝由PAD4介导，所述PAD4催化组蛋白精氨酸转化为瓜氨酸，随后组蛋白-DNA结合弱化且核小体解旋(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinicalinvestigation.2016；126(5):1612-20；Wang Y,等人,J Cell Biol.2009；184(2):205-13；Li P,等人,J Exp Med.2010；207(9):1853-62；以及Kolaczkowska E,等人,Naturecommunications.2015；6(6673))。在基于合成底物的去亚胺化的PAD4活性的无细胞测定中，发现nNIF的抑制与Cl-脒(一种确立的PAD4抑制剂)并行(参见图7C)。这与每种剂对核解凝的抑制一致(参见图7A)。在用PMA活化的活的完整人嗜中性粒细胞中，nNIF和Cl-脒抑制核组蛋白瓜氨酸化，其在核解凝之前发生(参见图7D)。在初步测定中，CRISPP还抑制PAD4活性和核组蛋白瓜氨酸化。总之，这些发现表明NRP至少部分地通过抑制PAD4活性和核组蛋白去亚胺化来抑制核解凝和NET形成。NE也被认为在NETosis中起作用(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20)。NE介导PMA活化的嗜中性粒细胞中的核组蛋白裂解(参见Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91)；NE活性的抑制剂阻断核解凝(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinicalinvestigation.2016；126(5):1612-20；Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91；以及Farley K,等人,Journal of immunology.2012；189(9):4574-81)(参见图12A和12B)和体内NET形成(参见Cools-Lartigue J,等人,J Clin Invest.2013；123(8):3446-58)；NE的内源性调控因子影响NETosis(参见Farley K,等人,Journal ofimmunology.2012；189(9):4574-81和Zabieglo K,等人,Journal of leukocytebiology.2015；98(1):99-106)；并且NET产生在NE缺陷型小鼠中受损(参见KolaczkowskaE,等人,Nature communications.2015；6(6673))。然而，发现NRP在体外测定中不直接抑制NE活性(参见图12A和12B)。然而，NRP可能以其他方式中断NETosis途径中的NE介导的事件。抑制NET形成的CRISPP的FLAG标记的构建体(参见图13)通过活化的PMN内化(参见图7E)并且在嗜中性粒细胞细胞质中的NE附近紧密定位，从而表明不受特定理论束缚，NRP可具有多于一个位点和作用机制。
nNIF和CRISPP有效抑制人和鼠嗜中性粒细胞的NET形成(参见图3A-3E和8A-8F)，而据报道PAD4的合成抑制剂作为人和小鼠嗜中性粒细胞的NETosis抑制剂具有不同的功效(参见Lewis HD,等人,Nature chemical biology.2015)。在体内施用NRP时的结果的初步分析种，nNIF和CRISPP在用LPS激发的小鼠中检查，所述LPS引起无菌全身性炎症、NET形成、器官损伤和死亡(参见Clark SR,等人,Nature medicine.2007；13(4):463-9；McDonald B,等人,Cell host&microbe.2012；12(3):32433；Tanaka K,等人,PloS one.2014；9(11):e111888；以及Wildhagen KC,等人,Blood.2014；123(7):1098101)。NRP在此模型中提供了早期存活优势(参见图9A)，从而表明在没有任何特定理论束缚的情况下，NET是在病原体不存在下的炎性损伤的剂，以及因此需要它们的包含和消除。nNIF还改善了多微生物败血症的CLP模型中的死亡率(参见图9B和9C)，从而支持现有证据表明NET是这种实验综合征中的间接血管和组织损伤的效应物(参见Czaikoski PG,等人,PloS one.2016；11(2):e0148142)。两种模型的结果表明，与其他嗜中性粒细胞效应子功能一样(参见Nathan C.,Nature.2002；420(6917):846-52)，NET产生已经进化为含有且消除病原体，但如果它在没有感染的情况下被病理性炎症信号活化或者以不受控制的方式被微生物活化，则也可损伤宿主。NRP还可具有作为特定综合征中的抗炎疗法的潜力(参见Nathan C.,Nat RevImmunol.2006；6(3):173-82)，其中NET形成促成急性或进行性病理性炎症。
实施例
为了进一步说明这些实施方案，提供了以下实施例。这些实施例不意图限制所要求保护的发明的范围，本发明的范围应仅基于所附权利要求书来确定。
实施例1-人新生儿嗜中性粒细胞的NET形成可通过脐带血中的肽调控
检查在分娩当天来自脐带血和来自生命后期收集的婴儿外周血的嗜中性粒细胞的体外NET部署。NET形成使用绿(细胞渗透性)和橙(细胞不可渗透)DNA染色进行活细胞成像来定量地评估，并通过上清液NET相关组蛋白H3测量进行定量评估(参见Mclnturff AM,等人,Blood.2012；120(15):3118-25)。从脐带血分离的PMN(第0天)(无论是来自早产(N＝8)还是健康足月婴儿(N＝2))在刺激时都不形成NET(参见图1A和1B)，这与之前的观察结果一致(参见Yost CC,等人Blood.2009；113(25):6419-27)。然而，足月和早产新生儿迅速发展形成NET的持久能力(参见图1A和1B)。连续评估7名早产新生儿的子宫外生命的最初60天内的NET形成。对于即使是最早出生的婴儿，在子宫外第3天也可展示刺激的NET形成(参见以下表1)，并且在第3天与第14天之间达到最大NET形成能力(参见图1A)。围产期NET形成受损是新生儿的特征。在分娩前立即从健康孕妇分离的PMN稳健地形成NET(参见图1C)。
表1：早产儿受试者的临床特征和感染并发症
NET能力的快速发展(参见图1A)表明脐带血中的因子调节NET形成。进行“转换”实验，其中将来自60日龄早产新生儿的PMN与储存的第0天自体脐带血血浆或与新鲜收集的自体第60天静脉血血浆一起预孵育。将来自健康成人的PMN在第0天脐带血血浆中预孵育或者并行地在自体成人血浆中预孵育。在第0天脐带血血浆中预孵育抑制用LPS刺激的第60天新生儿PMN和对照成人PMN的NET形成，而新鲜分离的自体血浆则不(参见图1D)。这一结果和NET能力的时程(参见图1A)与脐带血血浆因子一致，所述脐带血血浆因子抑制NET形成并且在分娩后婴儿的循环中迅速减少。
涉及脐带血血浆的热变性、蛋白酶K处理和脂质提取以鉴别NET抑制因子的实验表明它是一种蛋白质。对来自早产儿的第0天脐带血血浆和第28天静脉血血浆的蛋白质组进行了检查，其NET形成能力在图1A中总结的实验中确定。双向凝胶电泳显示蛋白质和肽簇在脐带血和第28天血浆样品中具有差异表现。使用NCBI人胰蛋白酶特异性数据库，对来自所述簇中的一个的蛋白质进行的胰蛋白酶消化和串联质谱分析得到部分或完整序列，包括脐带血血浆中具有预测分子量为约4kDa的肽。其序列与α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)(一种已知的具有抗炎和免疫调节特性的52kDa血浆蛋白酶抑制剂)的羧基末端中的序列相同(参见图2A)(参见Janciauskiene SM,等人,Respir Med.2011；105(8):1129-39和Jonigk D,等人,Proc Natl Acad Sci USA.2013；110(37):15007-12)。使用针对A1AT的羧基末端18个氨基酸产生的多克隆抗体进行蛋白质印迹，在足月婴儿脐带血血浆中发现了比在来自健康成人的静脉血血浆中丰度高得多的约4-6kDa肽(参见图2B，左图)，并且其暂时被称为新生儿NET-抑制因子(nNIF)。然后将脐带血血浆使用固定在亲和树脂珠上的抗A1AT羧基末端抗体进行免疫耗竭。检测从亲和珠洗脱的耗竭的血浆和肽的NET抑制活性。未改变的脐带血血浆抑制LPS刺激的成人PMN的NET形成，如先前实验中所述(参见图1C)，从免疫亲和珠洗脱的肽也如此，而免疫耗竭的血浆则不如此(参见图2C)。与耗竭的血浆相比，在亲和纯化洗脱液中发现4-6kDa候选nNIF肽的量高得多(参见图2D)。并行地，合成在脐带血血浆中检测到的29个氨基酸的肽(参见图2A)，并且发现这种合成的nNIF具有有效的NET抑制活性(参见图2E)。乱序对照肽(nNIF-SCR；参见以下表2)不如此。这些结果可证明nNIF或包含它的较大蛋白质是来自早产和足月新生儿的脐带血血浆中NET形成的内源性抑制剂(参见图2B)。从人血浆和重组A1AT纯化的市售活性全长A1AT不抑制NET形成(参见图2E)，这与先前的报道一致(参见Farley K，等人，Journal of immunology.2012；189(9)：4574-81和Frenzel E，等人，IntJ Biol Sci.2012；8(7)：1023-5)，从而表明完整A1AT不促成NET抑制活性。
表2：NET抑制肽及其特异性乱序肽对照的序列
nNIF KFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQ(SEQ ID NO：1)
nNIF-SCR LNTNKTKMGVQFPKMPFFKQIPVNSLEFV(SEQ ID NO：5)
CRISPP M_IPPEVKFNKPFVFLMIDQNTKVPLFMGK(SEQ ID NO：2)
CRISPP-SCR V_MDITPMQVGPLKMKPKVIFNPFKLFENF(SEQ ID NO：6)
A1ATm<sup>358</sup> MFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMLKVVS(SEQ ID NO：3)
A1ATm<sup>358</sup>-SCR PMVSVAMMLSENIFKLPEVKSVPTEFFPKFINMKLLPFQI(SEQ ID NO：7)
在使用抗A1AT羧基末端抗体的定量蛋白质印迹和使用不同浓度的合成nNIF构建的标准曲线的测定的情况下，在早产儿脐带血血浆样品中检测到nNIF，而它在来自健康成人的血浆中不可检测，或者仅以痕量水平检测到(参见图2B，右图)。使用相同的测定，在来自成人受试者(N＝10)的血浆样品中未检测到具有适当分子量的肽，所述成人受试者患有可能令人信服地诱导NET调控因子的慢性炎性综合征(患有多血管炎、巨细胞动脉炎或类风湿性关节炎的肉芽肿病)。因此，nNIF可能在生命的最初几天限于胎盘血和新生儿的血液。
实施例2-nNIF和nNIF相关肽(NRP)是先前未识别的PMN调节剂家族
基于nNIF的序列分析鉴别另外的NET抑制肽。nNIF与癌症相关的SCM-识别、免疫防御抑制和丝氨酸蛋白酶保护肽(CRISPP)(一种基于癌症患者的血液中存在的因子的共有肽)具有实质相似性(参见图2A)(参见Cercek L,等人,Cancer Detect Prey.1992；16(5-6):305-19；Cercek L,等人,Cancer Detect Prey.1993；17(3):433-45；以及Cercek L,等人Cancer Detect Prey.1993；17(3):447-54)。合成CRISPP和乱序对照肽(CRISPP-SCR)，并且发现CRISPP抑制由LPS触发的NET形成，nNIF也是如此，而CRISPP-SCR则不(参见图3A)。除了通过阳性免疫选择分离的PMN之外，nNIF和CRISPP抑制通过Ficoll-Paque和差速离心分离的嗜中性粒细胞的NET形成。后处理方案证明nNIF和CRISPP不会降解或拆除先前形成的NET(参见图4A和4B)。因此，它们与DNA酶不同，所述DNA酶已被证明在它们形成后破坏NET(参见Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Kolaczkowska E,等人,Nature communications.2015；6(6673)；Caudrillier A,等人,J Clin Invest.2012；122(7):2661-71；以及Saffarzadeh M,等人,Curr Opin Hematol.2013；20(1):3-9)。还检查了A1AT的先前描述的44个氨基酸的羧基末端裂解片段A1ATm358，其与人胎盘中的基质结合并且在序列上与nNIF重叠(参见NiemannMA,等人,Matrix.1992；12(3):233-41和Niemann MA,等人,Journal of cellularbiochemistry.1997；66(3):346-57)(参见以上表2)。合成A1ATm358，并且发现它抑制NET形成，尽管具有比nNIF更低的效力(参见图5A和5B)。
不受任何具体理论束缚，这些观察结果表明nNIF、CRISPP和A1ATm358代表先前未识别的调节NET形成的nNIF相关肽(NRP)家族(参见图1A-5B)。NRP在脐带血(nNIF)、胎盘(A1ATm358)以及在某些情况下成人血浆(CRISPP相关肽)中的存在表明NET抑制因子可广泛分布并且可鉴别其他NRP。
实施例3-CRISPP和nNIF抑制由一系列NET触发激动剂诱导的NET形成
检查了当通过不同激动剂诱导NET形成时NRP的抑制活性，集中于nNIF和CRISPP。两者均在多个实验中抑制LPS刺激的NET部署(参见图2E、3A和11)。乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)通常用作有效非生理激动剂以在体外诱导NET形成(参见Sorensen OE,等人,Journal ofclinical investigation.2016；126(5):1612-20；Papayannopoulos V,等人,J CellBiol.2010；191(3):677-91；Farley K,等人,Journal of immunology.2012；189(9):4574-81；以及Fuchs TA,等人,J Cell Biol.2007；176(2):231-41)。nNIF和CRISPP而非CRISPP-SCR阻断PMA刺激的NET部署(参见图3B)。CRISPP还抑制由活金黄色葡萄球菌诱导的NET形成(参见Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Kolaczkowska E,等人Nature communications.2015；6(6673)；Yost CC,等人Blood.2009；113(25):6419-27；以及Fuchs TA,等人,J Cell Biol.2007；176(2):231-41)(参见图3C)。这一结果可能表明，除了由PMA触发的“自杀性”NETosis之外，NRP还抑制“至关重要的”NETosis(参见Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94和Fuchs TA,等人J Cell Biol.2007；176(2):231-41)，因为据报道金黄色葡萄球菌通过染色质解凝和囊泡输出释放NET而无嗜中性粒细胞溶解(参见Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Yipp BG,等人,Naturemedicine.2012；18(9):1386-93；以及Pilsczek FH,等人,Journal of immunology.2010；185(12):7413-25)。还检查了NRP抑制由其他病原体诱导的NETosis的能力，并且发现CRISPP抑制由登革热病毒刺激的NET产生(参见图3D)。若干病毒触发NET部署(参见SaitohT,等人Cell host&microbe.2012；12(1):109-16；Jenne CN,等人Cell host&microbe.2013；13(2):169-80；以及Raftery MJ,等人J Exp Med.2014；211(7):1485-9743-45)，但是登革热(其与骨髓细胞上的配体相互作用)(参见Cheung R,等人J ClinInvest.2011；121(11):4446-61)先前尚未报道具有这种活性。为了进一步探索nNIF和NRP的抑制活性，对血红素进行了检查。血红素是一种内源性损伤相关分子模式(DAMP)和毒素(参见Gladwin MT,等人,Blood.2014；123(24):3689-90)，其已显示在镰状细胞血管病变的鼠模型中诱导NET(参见Chen G,等人,Blood.2014；123(24):3818-27)。发现血红素触发人PMN的NET形成，并且nNIF和CRISPP抑制这种反应(参见图3E)。因此，NRP抑制由微生物和微生物毒素、宿主来源的DAMP和药理学激动剂诱导的NET部署。
实施例4-NRP选择性地抑制NET形成而不中断其他关键嗜中性粒细胞抗微生物功 能或血小板反应
使用细菌杀死测定检测总的、吞噬性和NET介导的PMN杀死大肠杆菌(大肠杆菌)致病性菌株，并且发现CRISPP抑制细胞外NET介导的和总的细菌杀死，但是吞噬细胞内杀死没有改变(参见图6A)。在使用nNIF或CRISPP的另外孵育中，NRP不抑制博伊登室中活性氧物质(ROS)、吞噬作用或白细胞介素8(IL-8)诱导的趋化性的产生(参见图6B-6D)。尽管未在所有测定中测试每种肽，但这些实验表明NRP选择性地抑制NET形成，同时使PMN的其他关键抗微生物活性保持完整。此外，使用流式细胞术发现，CRISPP不抑制凝血酶刺激的血小板对P-选择蛋白的表面易位，或通过活化的人血小板和PMN形成异型聚集体(参见图6E和6F)。活化的血小板的这些和其他功能据报道在抗微生物防御中起作用(参见Vieira-de-Abreu A,等人,Semin Immunopathol.2012；34(1):5-30)。此外，活化的血小板与嗜中性粒细胞的相互作用诱导NET形成(参见Clark SR,Ma AC,等人,Platelet TLR4activates neutrophilextracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.Nature medicine.2007；13(4):463-9；以及Caudrillier A,等人,J Clin Invest.2012；122(7):2661-71)。图6E和6F表明PMN而非血小板是NRP的细胞靶标，并且血小板炎症活性不被NRP破坏。
实施例5-nNIF和CRISPP抑制活化的嗜中性粒细胞中的核染色质解凝和组蛋白瓜 氨酸化
nNIF和CRISPP用作探明NRP的作用机制的探针。ROS的产生被认为是介导NET形成的许多途径(而非所有途径)中必不可少的(参见Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91；Lood C,等人,Nature medicine.2016；22(2):146-53；Yost CC,等人,Blood.2009；113(25):6419-27；Farley K,等人,Journal ofimmunology.2012；189(9):4574-81；以及Branzk N,等人,Semin Immunopathol.2013；35(4):513-30)，但未受CRISPP抑制(参见图6B)。与此结果一致，先前的观察结果表明，ROS补充不足以使NET能力恢复至新生儿PMN(参见Yost CC,等人,Blood.2009；113(25):6419-27)，从而表明但不受任何特定理论束缚，nNIF还在与受ROS影响的那些不同的一个或多个调控步骤中起作用。核染色质的解凝据报道是NET形成所需的关键事件(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,JCell Biol.2012；198(5):773-83；Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94；Yipp BG,等人,Nature medicine.2012；18(9):1386-93；Papayannopoulos V,等人,J CellBiol.2010；191(3):677-91；Farley K,等人,Journal of immunology.2012；189(9):4574-81；Fuchs TA,等人,J Cell Biol.2007；176(2):231-41；以及Branzk N,等人,2013；35(4):513-30)。如先前所报道，发现PMA诱导PMN细胞核的解凝和分叶征损失(参见图7A)(参见Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91)。解凝细胞核的数量通过nNIF和CRISPP显著降低，但未通过nNIF-SCR或CRISPP-SCR显著降低(参见图7A)。嗜中性粒细胞染色质解凝由PAD4介导，其通过催化组蛋白精氨酸转化为瓜氨酸来弱化组蛋白-DNA结合(参见Sorensen OE,等人,Journal of clinical investigation.2016；126(5):1612-20；Wang Y,等人,J Cell Biol.2009；184(2):205-13；以及Li P,等人,J Exp Med.2010；207(9):1853-62)。与此一致，PAD4、Cl-脒的不可逆抑制剂(参见Li P,等人,J ExpMed.2010；207(9):1853-62)在本文公开的实验条件下阻断核解凝(参见图7A，下图)。然后使用无细胞PAD4测定，并且发现nNIF阻断其活性，用作对照的Cl-脒也如此(参见图7C)。在NRP的初始比较中，抑制PAD4的效力的排序是nNIF≈CRISPP>A1ATm358，这与它们对NETosis的相对抑制相同。并行地，在活化的嗜中性粒细胞中检查核组蛋白H3瓜氨酸化(参见Sorensen OE,等人,2016；126(5):1612-20和Li P,等人,J Exp Med.2010；207(9):1853-62)，并且在用PMA活化15分钟内检测到快速瓜氨酸化。这受到nNIF和Cl-脒的抑制(参见图7D)，从而表明NRP在此步骤起作用以阻断核解凝(参见图7A)。
嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)也牵涉于核解凝和NET形成(参见Sorensen OE,等人,2016；126(5):1612-20；Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83；Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91；Kolaczkowska E,等人,Nature communications.2015；6(6673)；以及Branzk N,等人,Semin Immunopathol.2013；35(4):513-30)。NE抑制剂西维来司钠在体外阻断核解凝(参见图12A和12B)。CRISPP和CRISPP-SCR用添加至每个肽的羧基末端的FLAG标签(CRISPP-F、CRISPP-SCR-F)合成，并且发现两者均被活化的嗜中性粒细胞内化(参见图7E)，CRISPP-F抑制NET形成(参见图13)，并且在蛋白质亲近测定中，CRISPP-F最初定位在NE的40nm内。这表明NRP可阻断NETosis中的NE的作用。然而，在体外测定中，nNIF和CRISPP都不抑制NE活性(参见图12A和12B)。
NRP抑制体内NET形成并改变全身性炎症的结果。为了确定nNIF和NRP是否在体内抑制NET形成，使用用大肠杆菌的临床分离株腹膜内(i.p.)感染C57BL/6小鼠建立了新的体内NETosis模型。在接种后3小时，腹膜液样品的活细胞成像展示稳健的NET形成。此外，在腹膜的浆膜表面上观察到NET的沉积。nNIF和CRISPP而非CRISPP-SCR抑制腹膜液PMN的NET形成(参见图8A)和腹膜表面上NET的部署(参见图8B)。通过增加的嗜中性粒细胞数目和细菌计数证实了活动性腹膜炎(参见图8C和8D)。PMN的数量在来自CRISPP处理的动物的样品中更大，并且趋势是在nNIF处理的小鼠中更多的数量(参见图8C)，这可能是由于溶解性NETosis的抑制(参见Brinkmann V,等人,J Cell Biol.2012；198(5):773-83和Yipp BG,等人,Blood.2013；122(16):2784-94)。大肠杆菌菌落形成单位的数量在来自NRP处理的动物的样品中也大于用CRISPP-SCR对照处理的那些(参见图8D)，从而表明NET介导的细菌杀死减少。nNIF和CRISPP还抑制感染大肠杆菌的Swiss Webster小鼠中的腹膜NET形成(参见图8E和8F)，从而表明这一结果可跨小鼠背景泛化。
在第二模型中，发现腹膜内LPS在C57BL/6小鼠中触发腹膜NET形成，尽管不如活大肠杆菌一样稳健，并且LPS诱导的腹膜NET形成受到nNIF和CRISPP而非CRISPP-SCR抑制。血管内NET已经在用腹膜内LPS激发的小鼠中观察到(参见McDonald B,等人,Cell host&microbe.2012；12(3):32433和Tanaka K,等人,PloS one.2014；9(11):e111888)并且导致组织损伤且当它们通过静脉被LPS、细菌或其他激动剂诱导时导致死亡(参见KolaczkowskaE,等人,Nature communications.2015；6(6673)；Xu J,等人,Nature medicine.2009；15(11):1318-21；McDonald B,等人,Cell host&microbe.2012；12(3):32433；CaudrillierA,等人,J Clin Invest.2012；122(7):2661-71；以及Chen G,等人,Blood.2014；123(24):3818-27)。因此，在给予腹膜内LPS的小鼠中检查死亡率，并且发现所有用CRISPP处理的动物(n＝6)，但用CRISPP-SCR处理的那些(n＝6)中仅30％在实验在50小时终止时存活(P<0.02)。在第二实验中，其中还检查了nNIF，并且其被延长至72小时，与在50小时用单独CRISPP-SCR或LPS处理的小鼠相比，用LPS激发的NRP处理组中的死亡率降低(各组n＝10)在50小时。图9A示出来自两个实验的组合数据。在第二实验中的72小时，由nNIF提供的存活优势是持久性的(与单独LPS相比，P＝0.007)，而CRISPP的存活优势则不如此。这可能是由于在这些条件下nNIF和CRISPP的药代动力学或半衰期的差异。
使用多微生物败血症的盲肠结扎和穿刺(CLP)模型也进行了类似的实验(参见Hubbard WJ,等人,Shock.2005；24增刊1(52-7)；Araujo CV,等人,Shock.2016；45(4):393-403；以及Czaikoski PG,等人,PloS one.2016；11(2):e0148142)。用nNIF处理的小鼠在24小时具有较低的临床疾病评分(参见Araujo CV,等人,Shock.2016；45(4):393-403)并且与nNIF-SCR处理的动物相比在CLP后144小时显著提高存活率(参见图9B和9C)。总之，这些实验(参见图8A-9C)证明nNIF和CRISPP在体内抑制NET形成，并提供初始证据表明它们在全身性无菌炎症和感染的模型中具有有益作用，其中NET形成可影响组织损伤和死亡率(参见Kolaczkowska E,等人,Nature communications.2015；6(6673)；Clark SR,等人,Naturemedicine.2007；13(4):463-9；McDonald B,等人,Cell host&microbe.2012；12(3):32433；以及Czaikoski PG,等人,PloS one.2016；11(2):e0148142)。
实施例6-由HTRA1(HTRA1-CF)产生的A1AT裂解片段抑制NET形成
可能发生胎盘中A1AT的进行性蛋白水解裂解，并且已经报告了由人溶基质素-3裂解A1AT，从而产生A1ATm358(参见Pei D,等人,J Biol Chem.1994；269(41):25849-55)。此外，其他蛋白酶可使A1AT片段化。因此，一种或多种胎盘蛋白酶可裂解A1AT以产生nNIF。这可能发生在血管外胎盘隔室或脐带血中，这取决于蛋白酶和底物的局部可用性。蛋白酶高温需要A1(HTRA1)在妊娠晚期的人胎盘中上调，并且HTRA1裂解C-末端中的A1AT，从而产生尺寸稍大、但包括nNIF的序列的片段(参见Frochaux V,等人,Plos one.9(10):e109483.doi:10.1371)。
合成由HTRA1裂解A1AT产生的肽(HTRA1-CF)，并且发现HTRA1-CF抑制NET形成(参见图14)。不受任何具体理论束缚，因为一种或多种胎盘蛋白酶可酶促裂解A1AT，所以这种裂解可以是产生nNIF的机制。
实施例7-动物研究
所有小鼠研究均由犹他大学(University of Utah)的机构动物护理和审查委员会(Institutional Animal Care and Review Board)批准。对于所有实验，年龄为8与12周之间的Swiss Webster和C57BL/6雄性小鼠购自CHARLES RIVERS LABORATORIESTM或JACKSONLABORATORIESTM。将小鼠圈养在无特定病原体的微型隔离笼中，所述微型隔离笼位于保持恒定温度和12小时光-暗循环的房间中。所有处理组均重量匹配并在实验开始时随机分配至处理。进行所述实验的研究人员在测试期间对实验组不知情。在设计实验时没有使用纳入或排除标准。
实施例8-试剂
脂多糖(大肠杆菌血清型0111:134和肠炎沙门氏菌)、聚-L-赖氨酸、细胞松弛素B、细胞松弛素D、多聚甲醛(p-FA)、西维来司钠、NE、NE底物(MeOSuc)-AAPV-(pNA)和凝血酶购自SIGMA-另外的试剂是：着色剂、鬼笔环肽、绿(细胞渗透性DNA染色)和橙(细胞不可渗透的DNA染色)(MOLECULAR)；Cl-脒DNA酶(PROMEGATM)；抗CD15-微珠(MILTENYITM)；Medium-199(LONZATM)和微球菌DNA酶
实施例9-nNIF和NRP合成
nNIF、NRP及其特异性乱序肽对照(参见以上表2)由DNA/肽设施合成，所述DNA/肽设施是犹他大学健康科学中心核心的一个单元。核心设施还验证了所提供的肽的序列和纯度。
实施例10-PMN和血小板分离
根据犹他大学机构审查委员会批准的方案从健康成人、健康足月婴儿和早产婴儿的ACD或EDTA抗凝静脉血中分离PMN(参见Yost CC,等人,Blood.2009；113(25):6419-27和Mclnturff AM,等人,Blood.2012；120(15):3118-25)。对于从其收集脐带血和外周血样品的8名早产婴儿，在生命的前两个月的五个单独时间点获得脐带和外周血血浆和PMN制剂。使用抗CD15涂覆的微珠和AUTO-细胞分选仪(MILTENYITM)通过阳性免疫选择制备PMN悬浮液(>96％纯)，并以2×106个细胞/mL浓度在370℃下在5％CO2/95％空气中重新悬浮于无血清M-199培养基中。如所描述分离人血小板(参见Weyrich AS,等人,J ClinInvest.1996；97(6):1525-34)。
实施例11-NET形成的活细胞成像
如先前报告的那样进行NET形成的定性评估(参见Yost CC,等人,Blood.2009；113(25):6419-27和Mclnturff AM,等人,Blood.2012；120(15):3118-25)。简言之，将从早产儿、健康足月婴儿和健康成人分离的原代PMN(2×106个细胞/mL)与对照缓冲液一起孵育或在37℃下在5％CO2/95％空气中在涂有聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片上用所指示的激动剂或细菌刺激1小时。对于选定实验，在刺激前将原代PMN与自体血浆、脐带血血浆、nNIF(0.2-70nM)、CRISPP(0.2-70nM)、nNIF-SCR(1nM)或CRISPP-SCR(1nM)一起预孵育一小时。在预孵育和/或刺激后，用PBS轻轻洗涤PMN，并与细胞可渗透(绿，MOLECULAR)和不可渗透(橙，MOLECULAR)的DNA荧光染料的混合物一起孵育。使用FV1000IX81共聚焦显微镜和FLUOVIEWTM软件(OLYMPUSTM)完成共聚焦显微镜检查。使用了20x和60x物镜。对于每个视野，在20μm的范围内以1μm的步长获得Z-系列图像。FLUOVIEWTM和ADOBETMPHOTOSHOPTM CS2软件用于图像处理。
实施例12-登革热病毒诱导的NET形成的成像
使用BSL 2安全方案，将从健康成人(2×106个细胞/mL)分离的原代PMN与模拟感染缓冲液或活登革病毒(M010.05)一起孵育以用于活细胞成像。在孵育1小时后，将感染的PMN用2％p-FA固定10分钟，然后与荧光标记的细胞渗透和细胞不可渗透的DNA染料一起孵育，并使用共聚焦显微镜针对活细胞成像进行成像。
实施例13-NET形成的定量：NET相关组蛋白H3含量
如先前所描述测定NET相关组蛋白H3含量(参见Mclnturff AM,等人,Blood.2012；120(15):3118-25)。在对照和刺激的原代PMN(2×106/mL；各种激动剂)的活细胞成像后，将细胞与含有DNA酶(40U/mL)的PBS一起在室温下孵育15分钟以分解并释放响应于刺激形成的NET。轻轻移除上清液并以420x g离心5分钟。然后在蛋白质印迹之前将无细胞上清液与4x Laemmli缓冲液3:1混合。使用针对人组蛋白H3蛋白(CELL)和红外缀合的第二抗体的多克隆第一抗体。在红外成像系统上进行成像和光密度测定。这种测定先前在如本研究中采用的体外条件下被验证为NET形成的替代物(参见Mclnturff AM,等人,Blood.2012；120(15):3118-25)。
实施例14-脐带血中nNIF的分离和鉴别血浆
将来自单个早产儿的两种血浆样品(一种来自脐带血且一种来自在子宫外第28天取得的外周血样品)在2D-电泳之前使用首先通过等电聚焦(pH范围3-8)且然后按尺寸(TGXTM预制凝胶，BIO-RADTM)的分离进行大量血浆蛋白除去(NORGENTM)。比较所得凝胶的差异蛋白质含量。将六个差异表达的蛋白质簇(“斑点”)送至犹他大学蛋白质组学核心进行分析。在使用LTQ-FT离子阱/FTMS混合质谱仪(THERMO ELECTRONTM)进行胰蛋白酶消化和串联质谱分析后，候选蛋白质/肽被鉴别为潜在NET抑制因子。
实施例15-nNIF的亲和除去
使血浆样品经受大量血浆蛋白除去(NORGENTM)。然后与来自购自THERMOSCIENTIFICTM的免疫沉淀试剂盒的树脂珠粒偶联的针对A1AT的羧基末端18个氨基酸产生的多克隆抗体(LIFESPAN BIOSCIENCESTM)用于免疫耗竭样品。与树脂珠粒偶联的非免疫IgG并行用作对照。将血浆在来自试剂盒的裂解缓冲液中稀释并与抗A1AT C-末端抗体偶联珠粒或与对照珠粒一起在4℃下孵育过夜。然后通过离心分离珠粒，并且收集免疫耗竭的血浆样品和对照血浆样品。将A1AT C-末端抗体偶联珠粒和对照珠粒在室温下重新悬浮于试剂盒包括的洗脱缓冲液中10分钟，然后离心并收集洗脱液和对照上清液。使用A1AT C-末端抗体且通过串联质谱法通过蛋白质印迹(16.5％Tris-tricine凝胶,BIO-RADTM)对洗脱液进行分析。在NET形成的测定中检查免疫耗竭的血浆和洗脱液样品。将活性全长天然和重组A1AT(两者均来自SIGMA-)悬浮于洗脱缓冲液中并且并行地测试。
实施例16-细菌杀死测定
如先前所描述测定原代人PMN的NET介导的杀死和吞噬细菌杀死(参见Yost CC,等人,Blood.2009；113(25):6419-27)。
实施例17-趋化性测定
使用改良的博伊登室测定±与nNIF(1nM)、CRISPP(1nM)或CRISPP-SCR(1nM)一起预孵育1小时来评估从健康成人供体分离的PMN的趋化性。使用重组人IL-8(2ng/mL)作为化学引诱物。如先前所描述，通过计数10个随机选择的高倍视野中的PMN来确定通过5微米过滤器的趋化性(参见Hill HR,等人,Lancet.1974；2(7881):617-9)。在单独的实验中，使用相同的系统来评价nNIF、CRISPP或CRISPP-SCR(全部1nM)的化学引诱物活性。
实施例18-吞噬作用测定
从健康成人供体的血液中分离PMN，并以2×106个细胞/mL的浓度重新悬浮于M-199中。将白细胞在标准条件下与细胞松弛素D和B(10μM)、nNIF(1nM)、CRISPP(1nM)或CRISPP-SCR(1nM)一起预孵育60分钟。在预孵育后，将PMN与6×106个大肠杆菌生物颗粒(MOLECULAR)一起在旋转器上在37℃下在5％CO2/95％空气中孵育4小时。然后将PMN洗涤并重新悬浮在起始体积的M-199中，然后离心到玻璃盖玻片上并用2％p-FA固定10分钟且用0.1％Triton-X-100透化10分钟。用WGA 555(INVITROGENTM)和(MOLECULAR)染色白细胞，并使用共聚焦显微镜捕获随机选择的高倍视野图像。IMAGEJTM软件(NIH)用于确定对在488nm处检测到的荧光标记的大肠杆菌生物颗粒呈阳性的PMN的百分比。
实施例19-活性氧物质产生
将从健康成人全血中分离的人PMN在M-199培养基中重新悬浮至2×106个细胞/mL的浓度，并在37℃下在5％CO2/95％空气中±CRISPP(1nM)或CRISPP-SCR(1nM)肽预孵育1小时。然后将PMN用LPS(100ng/mL)刺激1小时，洗涤并用二氢罗丹明(7.25mM；MOLECULAR)和过氧化氢酶(1000单位/mL；)混合物重新悬浮，并在37℃下孵育10分钟。在孵育后，将样品置于4℃并如在犹他大学核心设施中所进行(BECTONDICKINSONTM，CELLQUESTTM软件)的使用流式细胞术分析ROS依赖性荧光。
实施例20-血小板活化测定
如所描述测量活化的血小板的P-选择蛋白易位和表面展示(参见van Velzen JF,等人,Thromb Res.2012；130(1):92-8)以及血小板-嗜中性粒细胞聚集体的形成(参见Evangelista V,等人,Blood.1996；88(11):4183-94)。
实施例21-核解凝测定
分离PMN并在M-199培养基中重新悬浮至2×106个细胞/mL，与nNIF(1nM)，CRISPP(1nM)、nNIF-SCR(1nM)、CRISPP-SCR(1nM)或PAD4抑制剂Cl-脒(10μm)一起在37℃下在5％CO2/95％空气中预孵育1小时，并在聚-L-赖氨酸涂覆的玻璃盖玻片上±PMA(20nM)处理2小时。如所描述鉴别核解凝(参见Papayannopoulos V,等人,J Cell Biol.2010；191(3):677-91)。经由共聚焦显微镜捕获每个样品的五个随机选择的高倍视野，并使用细胞可渗透的荧光DNA染料绿分析核面积。使用IMAGEJTM软件(NIH)确定每个高倍视野>100个单独细胞的核像素面积。
实施例22-PAD4活性测定
使用PAD4抑制剂筛选测定试剂盒(CAYMANTM)测定PAD4活性的nNIF抑制。简言之，将nNIF(1nM)与重组PAD4和PAD4酶底物(2mM)在PAD4测定试剂中在37℃下孵育30分钟。PAD4抑制剂Cl-脒(10μm)用作PAD4抑制的阳性对照。用PAD4终止溶液终止反应，并使用包括的氨检测器测定检测。在SPECTRAMAXTM M5荧光板读数器(MOLECULAR DEVICESTM)上在405nm的激发后，在470nm处测量氨检测器荧光。
实施例23-组蛋白H3瓜氨酸化测定
将成人PMN在与nNIF、CRISPP、nNIF-SCR或CRISPP-SCR(1nM)或与Cl-脒(10μm)一起预孵育15分钟后在37℃下在5％CO2/95％空气中用PMA(20nM)刺激15分钟，旋涂到聚-L-赖氨酸涂覆的载玻片上，并使用用于检测人瓜氨酸化组蛋白H3(ABCAMTM)的第一抗体通过免疫细胞化学进行检测。使用FV1000IX81共聚焦显微镜和FLUOVIEWTM软件(OLYMPUSTM)经由共聚焦显微镜完成成像。使用IMAGEJTM软件(NIH)完成半定量以确定每个细胞的平均瓜氨酸化组蛋白H3含量。
实施例24-CRISPP肽细胞定位
FLAG标记的CRISPP(F-CRISPP)和FLAG标记的CRISPP-SCR(F-CRISPP-SCR)肽由犹他大学的核心设施合成，并使用免疫细胞化学进行检测。将成人嗜中性粒细胞与F-CRISPP(1nM)或F-CRISPP-SCR(1nM)在37℃下在5％CO2/95％空气中一起预孵育1小时，然后用LPS(100ng/mL)刺激2小时。然后将PMN旋涂到玻璃盖玻片上，使用2％p-FA固定和0.1％TritonX-100透化。使用具有的单克隆抗FLAG抗体作为核复染剂检测FLAG标记的肽。
实施例25-大肠杆菌和LPS诱导的腹膜炎的小鼠模型
将C57/BL6或Swiss-Webster小鼠通过在感染(大肠杆菌，4.5×107cfu/小鼠，腹膜内注射)或接种(LPS，25mg/kg，腹膜内)之前1小时腹膜内注射用CRISPP(10mg/kg)、nNIF(10mg/kg)或CRISPP-SCR(10mg/kg)以盲检方式进行预处理对照小鼠注射单独盐水。将小鼠在感染/接种后3小时在CO2室中处死，并收获腹膜液和膜样品。简言之，将腹部消毒并在中线打开而不损伤肌肉。用无菌盐水溶液(1mL)灌洗腹膜腔并分析体内NET形成、细菌学和白细胞积聚。使用共聚焦显微镜的活细胞成像和NET相关组蛋白H3释放测定来定性地且定量地分析腹膜液中的NET。使用活细胞成像定量地评估腹膜的浆膜表面上的NET，然后对每个组织样品五个随机选择的高倍视野进行标准化网格分析(IMAGEJTM软件，NIH)。通过用0.1％Triton X-100透化所有回收的白细胞10分钟并在5％绵羊血琼脂板(HARDY DIAGNOSTICSTM)上进行连续稀释和细菌培养来定量腹膜细菌菌落形成单位(cfu)计数。在24小时孵育后，测定细菌计数。在特克氏溶液(Turk’s solution)(2％乙酸)中稀释后，使用光学显微镜在Neubauer室中测定腹膜灌洗液中的总白细胞计数。使用60x油浸物镜进行差异性白细胞分析，以评估用May-Gruenwald-Giemsa染料染色的细胞离心细胞的形态。所有小鼠都包括在最终分析中。
实施例26-由LPS诱导的全身性炎症的小鼠模型(“内毒素血症”)
将C57/BL6小鼠在用LPS(25mg/kg，腹膜内注射)接种前1小时和接种后6小时通过腹膜内注射用CRISPP(10mg/kg)、nNIF(10mg/kg)或CRISPP-SCR(10mg/kg)以盲检方式进行预处理。对照小鼠腹膜内注射单独盐水。在这些实验中未使用液体复苏和抗生素处理。在50或72小时间隔内评估存活率。所有小鼠都包括在最终存活分析中。
实施例27-使用盲肠结扎和穿刺(CLP)的多微生物败血症的小鼠模型
将C57BL/6小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(分别100mg/kg和10mg/kg，腹膜内)麻醉，并如先前所描述进行盲肠结扎和穿刺(CLP)(参见Araujo CV,等人,Shock.2016；45(4):393-403)。腹膜内nNIF(10mg/kg)或nNIF-SCR(10mg/kg)在CLP手术之前1小时和之后6小时给予。动物在手术后立即接受皮下无菌等渗盐水(1mL)用于液体复苏。假手术小鼠进行相同的程序，除了没有进行CLP。在CLP后24小时，如先前所述对所有动物的临床疾病严重程度进行评分(参见Araujo CV,等人,Shock.2016；45(4):393-403)。在此评估中，较高的得分反映疾病严重程度增加。在手术程序后对nNIF/CLP(n＝7)、nNIF-SCR/CLP(n＝8)、nNIF/假手术(n＝3)或nNIF-SCR/假手术(n＝3)组中小鼠的存活率进行跟踪持续5天。
实施例28-嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性测定
将NE的合成荧光底物(MeOSuc)-AAPV-(pNA)(160μm)与生物活性NE(500nM)±NE抑制剂、西维来司钠(160μm)或nNIF(50nM)一起在37℃下孵育3小时。用5％冰醋酸淬灭反应并以14,000rpm离心5分钟。使用AGILENTTM 1100系列HPLC和5μm柱(4.6×150mm)在30分钟10％至90％B梯度(缓冲液A H2O中的0.1％TFA，缓冲液B ACN中的0.1％TFA)获得色谱图。获得质谱用于使用3500三重四极质谱仪对反应产物进行二次验证。色谱图在X轴和Y轴上均偏移(分别偏移0.5分钟和0.1A214)以获得更大可见性。通过将所有数据标准化至每个图中显示的最高HPLC峰来确定相对A214。
实例29-统计数据
GRAPHPAD PRISMTM统计软件(版本5)用于分析结果。对每个实验变量确定平均值±平均值的标准误差(SEM)。学生t检验用于图2B、6C和7中。ANOVA用于鉴别多个实验组之间存在的差异。如果发现显著差异，则杜凯氏事后检验(图1A、1D、2E、3A-3C、3E、6B-6F、7C、7D、8A、8E和8F)、邦弗朗尼多重比较检验(图6A)或纽曼-科伊尔斯事后程序(图8C和9B)用于确定具有显著差异的组。单加尾曼-惠特尼统计工具用于图8D。对于图9A和9C，对数秩(曼特尔-考克斯)统计工具用于比较组之间的存活曲线，并且采用事后邦弗朗尼校正。每个统计测试中使用的所有数据都满足特定测试的假设，并且是正态分布的。所有<0.05的P值被认为是统计上显著的。
实施例30-研究批准
犹他大学机构审查委员会批准了这项研究(IRB#：0392、11919和39621)，并且所有人受试者根据赫尔辛基宣言提供了知情同意书。所有鼠类实验均由犹他大学机构动物护理和使用委员会(#12-11017)批准，并在由美国实验动物管理协会批准的设施中进行。
实施例31-胎盘HTRA1蛋白酶裂解α-1-抗胰蛋白酶并产生新生儿NET-抑制因子
不受任何特定理论束缚，假设胎盘表达的HTRA1(一种丝氨酸蛋白酶)通过裂解AAT调控NET抑制肽的形成。为了测试这一假设，经由蛋白质印迹评估足月和早产胎盘的HTRA1表达。通过ELISA测定来自足月和早产婴儿以及成人的HTRA1和AAT血浆表达。将生物活性(0.5μg)或胎盘洗脱的HTRA1与AAT(8μM)一起在37℃下孵育18小时。使用蛋白质印迹和质谱法检测AAT的羧基末端片段。在LPS刺激(100ng/mL)之前，将反应产物与从健康成人分离的PMN一起孵育1小时，并使用活细胞成像评估NET形成。使用流式细胞术评估活性氧物质，使用改良的博伊登室测定评估趋化性，并使用大肠杆菌评估细菌杀灭。
足月和早产婴儿胎盘表达HTRA1，其中与成人(58.6±11.6μg/mL)相比，来自足月(465.1±71.8μg/mL)和早产(385.9±71.3μg/mL)婴儿脐带血的血浆中HTRA1的水平显著更高。与AAT一起孵育的生物活性和胎盘来源的HTRA1产生4kD AAT片段。此外，用LPS刺激的PMN预孵育此片段抑制NET形成。来自HTRA1-AAT的裂解片段对活性氧物质产生、趋化性或吞噬作用没有影响。然而，与乱序HTRA1-AAT片段相比，此片段与LPS刺激的PMN的孵育显著降低NET相关的细菌杀死。
在胎盘中表达的HTRA1与AAT相互作用以产生具有与nNIF相同的NET抑制性质的羧基末端裂解片段。
因此，胎盘HTRA1可在胎儿循环中产生nNIF作为妊娠期间的耐受机制。
本领域技术人员将显而易知的是，可在不脱离本发明基础原理的情况下对上述实施方案的细节作出许多改变。因此，本发明的范围应当仅由以下权利要求书确定。
序列表
<110> The University of Utah Research Foundation
<120> nNIF和nNIF相关肽以及相关方法
<130> 21101.0375U2
<150> PCT/US2017/050072
<151> 2017-09-05
<150> 62/492,019
<151> 2017-04-28
<150> 62/383,243
<151> 2016-09-02
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys
1 5 10 15
Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln
20 25
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 2
Met Xaa Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu
1 5 10 15
Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Val Pro Leu Phe Met Gly Lys
20 25 30
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe
1 5 10 15
Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro
20 25 30
Leu Phe Met Leu Lys Val Val Ser
35 40
<210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met
1 5 10 15
Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Trp Asn Pro
20 25 30
Thr Gln Lys
35
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乱序肽对照
<400> 5
Leu Asn Thr Asn Lys Thr Lys Met Gly Val Gln Phe Pro Lys Met Pro
1 5 10 15
Phe Phe Lys Gln Ile Pro Val Asn Ser Leu Glu Phe Val
20 25
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乱序肽对照
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 6
Val Xaa Met Asp Ile Thr Pro Met Gln Val Gly Pro Leu Lys Met Lys
1 5 10 15
Pro Lys Val Ile Phe Asn Pro Phe Lys Leu Phe Glu Asn Phe
20 25 30
<210> 7
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乱序肽对照
<400> 7
Pro Met Val Ser Val Ala Met Met Leu Ser Glu Asn Ile Phe Lys Leu
1 5 10 15
Pro Glu Val Lys Ser Val Pro Thr Glu Phe Phe Pro Lys Phe Ile Asn
20 25 30
Met Lys Leu Leu Pro Phe Gln Ile
35 40
<210> 8
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe
1 5 10 15
Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val
20 25 30
Val Asn Pro Thr Gln Lys
35
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met
1 5 10 15
Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn
20 25 30
Pro Thr Gln Lys
35
<210> 10
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乱序肽对照
<400> 10
Phe Asn Val Val Pro Ser Asn Pro Thr Thr Val Pro Phe Gln Ile Pro
1 5 10 15
Val Phe Lys Glu Phe Glu Lys Ser Lys Asn Gln Met Leu Pro Leu Lys
20 25 30
Met Gly Lys Ile
35

Claims (54)

1.一种治疗患有癌症或处于发展癌症的风险的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用有效量的包含NET抑制肽(NIP)和药学上可接受的载体的药物组合物以减轻所述癌症的病理效应或症状，或降低发展所述癌症的风险。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述NIP是以下中的一种：新生儿NET抑制因子(nNIF)、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、nNIF相关肽(NRP)、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、卵巢癌、胃癌或肺癌中的至少一种。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物基本上抑制嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述患者是人。
6.一种抑制患有癌症的患者中的转移的方法，所述方法包括：
向所述患者施用有效量的包含NET抑制肽(NIP)和药学上可接受的载体的药物组合物以降低所述患者中转移的风险。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述NIP是以下中的一种：新生儿NET抑制因子(nNIF)、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、nNIF相关肽(NRP)、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、卵巢癌、胃癌或肺癌中的至少一种。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述药物组合物基本上抑制嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述患者是人。
11.一种诊断患有癌症的患者的方法，所述患者将受益于用NET抑制肽(NIP)治疗，所述方法包括：
从所述患者获得癌细胞的样品；
检测所述癌细胞的样品中是否存在NET形成；以及
当检测到所述癌细胞的样品中存在NET形成时，将所述患者诊断为将受益于用NIP治疗的患者。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述癌细胞包括黑素细胞、卵巢细胞、胃细胞或肺细胞中的至少一种。
13.一种诊断和治疗患有癌症的患者的方法，所述患者将受益于用NET抑制肽(NIP)治疗，所述方法包括：
从所述患者获得癌细胞的样品；
检测所述癌细胞的样品中是否存在NET形成；
当检测到所述癌细胞的样品中存在NET形成时，将所述患者诊断为将受益于用NIP治疗的患者；以及
向所述被诊断的患者施用有效量的包含NIP的药物组合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述NIP是以下中的一种：新生儿NET抑制因子(nNIF)、nNIF的药学上可接受的盐、nNIF类似物、nNIF类似物的药学上可接受的盐、nNIF相关肽(NRP)、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述癌细胞包括黑素细胞、卵巢细胞、胃细胞或肺细胞中的至少一种。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述药物组合物基本上抑制NET形成。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述患者是人。
18.一种治疗患有炎性病症或处于发展炎性病症的风险的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含新生儿NIF相关肽(NRP)、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐中的至少一种和药学上可接受的载体，以减轻所述炎性病症的病理效应或症状或降低发展所述炎性病症的风险。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述NRP是以下中的至少一种：癌症相关的SCM识别、免疫防御遏制和丝氨酸蛋白酶保护肽(CRISPP)；A1AT的44个氨基酸的羧基末端裂解片段(A1ATm358)；或A1AT的高温需要A1(HTRA1)裂解片段(HTRA1-CF)。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述炎性病症是选自急性炎性病症、慢性炎性病症或免疫病症中的至少一种。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述炎性病症是自身免疫性病症。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述炎性病症是选自以下中的至少一种：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、支气管肺发育不良(BPD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、癌症中的炎症、炎性肠病(IBD)、炎性肺病(ILD)、流感诱发的肺炎、坏死性小肠结肠炎(NEC)、新生儿慢性肺病(CLD)、牙周炎、先兆子痫、早产儿视网膜病变(ROP)、败血症、全身炎症反应综合征(SIRS)、血栓形成、输血相关的急性肺损伤(TRALI)、血管炎、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏肉芽肿病(WG)或未消退的炎症的病症。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述血栓形成是静脉血栓形成。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述血栓形成是动脉血栓形成。
25.如权利要求18所述的方法，其中所述药物组合物基本上抑制嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)介导的炎性组织损伤。
26.如权利要求18所述的方法，其中所述患者是人。
27.一种治疗患有早产并发症或处于发展早产并发症的风险的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含新生儿NIF相关肽(NRP)、NRP的药学上可接受的盐、NRP类似物或NRP类似物的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体，以减轻所述早产并发症的病理效应或症状或降低发展所述早产并发症的风险。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述NRP是以下中的至少一种：癌症相关的SCM识别、免疫防御遏制和丝氨酸蛋白酶保护肽(CRISPP)；A1AT的44个氨基酸的羧基末端裂解片段(A1ATm358)；或A1AT的高温需要A1(HTRA1)裂解片段(HTRA1-CF)。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述早产并发症是选自以下中的至少一种：坏死性小肠结肠炎(NEC)、呼吸窘迫综合征(RDS)、肺炎、支气管肺发育不良(BPD)、新生儿慢性肺病(CLD)、神经发育迟缓、早产儿视网膜病变(ROP)或败血症。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述药物组合物基本上抑制嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)介导的炎性组织损伤。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述患者是人。
32.一种药物组合物，其包含：
新生儿NIF相关肽(NRP)；以及
药学上可接受的载体。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述NRP是以下中的至少一种：癌症相关的SCM识别、免疫防御遏制和丝氨酸蛋白酶保护肽(CRISPP)；A1AT的44个氨基酸的羧基末端裂解片段(A1ATm358)；或A1AT的高温需要A1(HTRA1)裂解片段(HTRA1-CF)。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述NRP是CRISPP或其盐，并且其中所述CRISPP或其所述盐的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80％相同。
35.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述NRP是A1ATm358或其盐，并且其中所述A1ATm358或其所述盐的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少80％相同。
36.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述NRP是HTRA1-CF或其盐，并且其中所述HTRA1-CF或其所述盐的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少80％相同。
37.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述CRISPP、所述A1AT358或所述HTRA1-CF的至少一个氨基酸与化学修饰剂结合，并且其中所述化学修饰剂是选自脂质、聚乙二醇(PEG)或糖类中的至少一种。
38.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述CRISPP、所述A1AT358或所述HTRA1-CF以可有效基本上抑制选自炎性组织损伤或炎性血管损伤中的至少一种的损伤的量存在。
39.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述CRISPP、所述A1AT358或所述HTRA1-CF不全面抑制多形核白细胞(PMN)功能。
40.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述CRISPP、所述A1AT358或所述HTRA1-CF基本上不抑制多形核白细胞(PMN)的选自以下中的至少一种的一种或多种活性：趋化性、趋化因子合成和分泌、细胞因子合成和分泌、细胞外细菌杀死、细胞内细菌杀死、吞噬作用和活性氧物质(ROS)产生。
41.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述CRISPP、所述A1AT358或所述HTRA1-CF不是天然存在的。
42.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述CRISPP、所述A1AT358或所述HTRA1-CF以可有效基本上抑制嗜中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)形成的量存在。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述NET形成由细菌、真菌、寄生虫或病毒中的至少一种刺激。
44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述病毒是出血热病毒、丝状病毒、沙粒病毒、汉坦病毒或黄病毒中的至少一种。
45.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述细菌是芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、弗朗西斯氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属或耶尔森氏菌属中的至少一种。
46.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述NET形成由β-防御素1、HIV-1、脂多糖(LPS)、乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)或金黄色葡萄球菌α-毒素中的至少一种刺激。
47.一种nNIF相关肽(NRP)，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4中的一个的六个或更多个连续氨基酸。
48.如权利要求47所述的NRP，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中的一个的至少12个连续氨基酸。
49.如权利要求47所述的NRP，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中的一个的至少24个连续氨基酸。
50.如权利要求47所述的NRP，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中的一个。
51.一种nNIF相关肽(NRP)，其中所述NRP的序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4中的一个至少20％相同。
52.如权利要求51所述的NRP，其中所述NRP的序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4中的一个至少40％相同。
53.如权利要求51所述的NRP，其中所述NRP的序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4中的一个至少60％相同。
54.如权利要求51所述的NRP，其中所述NRP的序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4中的一个至少80％相同。
CN201780067221.2A 2016-09-02 2017-09-05 nNIF和nNIF相关肽以及相关方法 Pending CN109937047A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662383243P 2016-09-02 2016-09-02
US62/383,243 2016-09-02
US201762492019P 2017-04-28 2017-04-28
US62/492,019 2017-04-28
PCT/US2017/050072 WO2018045371A2 (en) 2016-09-02 2017-09-05 nNIF AND nNIF-RELATED PEPTIDES AND RELATED METHODS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109937047A true CN109937047A (zh) 2019-06-25

Family

ID=61309026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780067221.2A Pending CN109937047A (zh) 2016-09-02 2017-09-05 nNIF和nNIF相关肽以及相关方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US10857201B2 (zh)
EP (1) EP3506924A4 (zh)
JP (1) JP2019534247A (zh)
KR (1) KR20190045271A (zh)
CN (1) CN109937047A (zh)
AU (1) AU2017321965A1 (zh)
BR (1) BR112019004299A2 (zh)
CA (1) CA3035770A1 (zh)
MX (1) MX2019002479A (zh)
RU (1) RU2019109049A (zh)
SG (1) SG11201901830UA (zh)
WO (1) WO2018045371A2 (zh)
ZA (1) ZA201901942B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11324801B2 (en) 2016-09-02 2022-05-10 University Of Utah Research Foundation NNIF and nNIF-related peptides and related methods
WO2021226111A1 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 University Of Utah Research Foundation Immunothrombosis in covid-19 acute respiratory distress syndrome

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160194365A1 (en) * 2013-07-08 2016-07-07 The University Of Utah Research Foundation Methods for treatment of and prophylaxis against inflammatory disorders

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7799766B2 (en) * 1998-04-08 2010-09-21 Theta Biomedical Consulting & Development Co., Inc. Composition for treating hormonally-dependent cancers
US9308235B2 (en) * 2012-05-09 2016-04-12 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Treatment of primary and metastatic carcinoma

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160194365A1 (en) * 2013-07-08 2016-07-07 The University Of Utah Research Foundation Methods for treatment of and prophylaxis against inflammatory disorders

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COOLS-LARTIGUE J等: "Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis", 《JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》 *
SIMPSON RJ等: "Proteomics-driven cancer biomarker discovery: looking to the future", 《CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190201487A1 (en) 2019-07-04
MX2019002479A (es) 2019-09-19
SG11201901830UA (en) 2019-03-28
ZA201901942B (en) 2020-10-28
CA3035770A1 (en) 2018-03-08
KR20190045271A (ko) 2019-05-02
EP3506924A4 (en) 2020-05-20
EP3506924A2 (en) 2019-07-10
JP2019534247A (ja) 2019-11-28
RU2019109049A3 (zh) 2020-12-24
WO2018045371A3 (en) 2018-04-12
WO2018045371A2 (en) 2018-03-08
RU2019109049A (ru) 2020-10-05
AU2017321965A1 (en) 2019-04-04
US10857201B2 (en) 2020-12-08
BR112019004299A2 (pt) 2019-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10646556B2 (en) Methods for treatment of and prophylaxis against inflammatory disorders
Li et al. Evidence that rhesus macaques self-cure from a Schistosoma japonicum infection by disrupting worm esophageal function: a new route to an effective vaccine?
US20100172922A1 (en) Expression and Purification of HIP/PAP and Uses Therefor
Benoit et al. Pure endotoxin does not pass across the intestinal epithelium in vitro
US20130053329A1 (en) Methods of inhibiting apoptosis or inflammation in a mammal by administering an isolated bcl protein
WO2021233885A1 (en) Mimotope peptides of the spike protein from the sars-cov-2 virus
CN109937047A (zh) nNIF和nNIF相关肽以及相关方法
CN111870688A (zh) ACE2蛋白与IL-6或TNFα拮抗剂组合及其应用
CN111423502A (zh) 多肽、其衍生物及其在制备抗肺纤维化的药物中的应用
US9611296B2 (en) Peptides that bind to amino-truncated amyloid-beta-peptide and use of said peptides
US20190183925A1 (en) Composition for suppressing or preventing abnormality in intestinal environment
US20180215812A1 (en) Peptides and binding partners therefor
US11324801B2 (en) NNIF and nNIF-related peptides and related methods
Hu et al. Further comments on the role of ACE‐2 positive macrophages in human lung
CN107206109A (zh) 用于体外和体内检测细菌和/或真菌的荧光多分枝探针
Zhou et al. Chromofungin, a chromogranin A-derived peptide, protects against sepsis-induced acute lung injury by inhibiting LBP/TLR4-dependent inflammatory signaling
KR20190087987A (ko) 장내 환경의 이상을 억제 또는 예방하기 위한 조성물
CN116234818A (zh) 用于治疗耐药微生物的防御素片段衍生脂肽
CN111748541B (zh) 一种产mdp的酶制剂在维持肠道稳态中的用途
Merselis et al. Molecular Functionality, Cellular Trafficking, and Clinical Relevance of the Pore-Forming Protein Perforin-2
Lo Identification and characterization of Francisella tularensis proteins required for invasion and escape into non-phagocytic epithelial cells
WO2018224548A1 (en) Point-of-care testing of pro-thymosin 100-109 for detecting sepsis
WO2017198853A1 (en) New active compounds against pathogenic microorganisms

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40004861

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190625

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication