CN116234818A - 用于治疗耐药微生物的防御素片段衍生脂肽 - Google Patents

用于治疗耐药微生物的防御素片段衍生脂肽 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于脂肽与人防御素片段的偶联开发针对耐药细菌、病毒、原虫、真菌或蠕虫的创新抗生素，以实现高抗微生物功效和生物膜降解以及低耐药性发展，同时保护天然微生物群，因此不仅可根除细菌、病毒、原虫、真菌或蠕虫感染，还可预防与抗生素治疗相关的许多病症，例如艰难梭菌感染。

Description

用于治疗耐药微生物的防御素片段衍生脂肽
技术领域
本发明涉及基于脂肪酸与防御素片段的偶联来开发针对耐药病原体的抗生素，以在保护天然微生物群的同时实现高抗微生物功效。
背景技术
抗生素耐药细菌是一个紧迫且日益严重的公共卫生威胁。具体而言，所谓的ESKAPE(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属)病原体占全世界医院感染的大部分，每年造成≥700,000人死亡(Kelly和Davies,2017)。世界卫生组织(WHO)最近公布了一份急需新抗生素的12种细菌清单，包括ESKAPE病原体(Tacconelli等人,2018)。虽然传统抗生素对抗病原体，但它们也对共生肠道微生物群产生广泛影响(Maier等人,2020)。施用破坏微生物组成，并可能导致长期的生态失调，这与越来越多的疾病相关联(Jackson等人,2018)。多样性和分类学丰富度的降低、抗微生物剂耐药性的传播以及机会性病原体定植的增加，包括艰难梭菌的继发感染，只是传统抗生素带来的众多副作用中的一小部分(Francino,2016；Kim等人,2017)。当前的抗微生物剂危机是制药公司和政府长期忽视新抗生素开发的结果(The Lancet,2020)。因此，迫切需要对多药耐药性更有弹性但重要的是保护天然微生物群的新策略(Falagas等人,2016)。
抗微生物肽(AMP)是存在于所有多细胞生物体中的小阳离子肽，表现出广泛的抗微生物和免疫学特性(Zasloff,2002)。防御素是人类中最重要的一类AMP，可保护宿主免受传染性微生物的侵害并塑造粘膜表面微生物群的组成(Bevins,2003；Ganz,2003；Peschel和Sahl,2006；Thaiss等人,2016)。防御素已被分为三组α、β和θ防御素。β-防御素和α-防御素HD5和HD6是由单核细胞、浆细胞样树突状细胞和血小板在表面上皮细胞中表达。α-防御素HNP1-4在白细胞中表达。大多数防御素不能被降解，但α-防御素HD5、HNP-4和β-防御素hBD-1可被肠蛋白酶降解为许多具有生物活性的片段。以前，在所有身体表面上组成性表达的hBD-1的抗微生物活性被低估，直到将其在如人肠道中发现的还原条件下进行分析。经还原的hBD-1令人惊讶地表现出增加的抗微生物活性，但可能会被肠蛋白酶降解(Raschig等人,2017；Schroeder等人,2011)。最近已经证明，hBD-1等的还原产生八个氨基酸的羧基末端片段(八肽)，所述片段具有保留的抗微生物活性但体内稳定性低(Wendler等人,2019)。
发明内容
发明人已经开发出一组新型且稳定的合成脂肽，其具有改善的抗微生物活性和对天然微生物群的保护。发明人已经用脂质例如棕榈酸和各种间隔物诸如糖或氨基酸修饰了hBD-1衍生的八肽，以产生具有增加的稳定性和杀菌活性同时在口服施用后保护胃肠道微生物群的脂肽(Pam)。
发明人已经证明，Pams对ESKAPE病原体以及对白色念珠菌和热带念珠菌高度有效。进一步证明，Pam可有效根除细菌产生的生物膜，而且耐药性的发展出人意料地可以忽略不计。发明人已经证明，作用方式是细胞包膜损伤，伴随着细胞膜的破坏和孔隙形成以及细胞膜电位的破坏。
强抗微生物作用通常与毒性相关。发明人已经证明，尽管具有强抗微生物功效，但Pam与细胞毒性不相关或与细胞毒性关联很小。通过口服施用Pam-3在体内测试安全性。没有从肾脏、肝脏或胃肠道中识别出化学或组织学上的危险信号。
在由鼠伤寒沙门氏菌引起的急性胃肠道感染和由啮齿类柠檬酸杆菌引起的确定的胃肠道感染中测试了体内功效，比较了有效性最低的Pam-1和有效性最高的Pam-3。Pam-3在两种模型以及肠道内容物和肠道组织中都显示出非常显著的CFU减少，而Pam-1仅在急性模型中显示出显著的CFU减少，并且这种情况仅针对肠道内容物。
发明人出人意料地证明，尽管对病原性细菌具有高抗微生物功效，但即使使用最有效的Pam-3，也未观察到口服治疗前后微生物群组成的变化。因此，物种的数量和复杂性仍然与经PBS处理的对照相当，并且该处理不影响细菌属的丰度。
附图说明
图1示出用棕榈酸和不同间隔物诸如糖或氨基酸或8-氨基-3.6-二氧杂辛酸(Ado)进行化学修饰以产生脂肽的八肽(人β-防御素1的C末端八个氨基酸)的化学结构，：
Pam1:Pam2-Glc-Suc-RGKAKCCK
Pam2:Pam-RGKAKCCK
Pam3:Pam-Ado-RGKAKCCK
Pam4:Pam3Cys-RGKAKCCK
Pam5:Pam-Lys(Pam)-RGKAKCCK
图2示出所有五种Pam以及由hBD-1还原产生的八肽针对以下的抗微生物活性：金黄色葡萄球菌；啮齿类柠檬酸杆菌；铜绿假单胞菌；鼠伤寒沙门氏菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，如通过径向扩散测定所确定。每种肽使用1μg。抑菌圈的直径指示抗微生物活性；2.5mm的直径(虚线)是空孔的直径。结果是三次独立实验的中值。
图3示出所有五种Pam对金黄色葡萄球菌；鲍曼不动杆菌；铜绿假单胞菌；屎肠球菌；大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中三种不同菌株的最小抑制浓度(MIC)。肉汤微量稀释测定及针对ESKAPE组的细菌的Pam。图3示出肉汤微量稀释测定实验的详细结果。虚线标记这些实验中使用的最高肽浓度。数据表示为平均值±SEM。实验独立进行了三次。
图4示出所有五种Pam针对白色念珠菌和热带念珠菌的抗真菌活性，如通过肉汤微量稀释测定所确定的。数据表示为平均值±SEM。实验独立进行了三次。
图5示出Pam-3对铜绿假单胞菌产生的生物膜的根除。Pam-3针对已建立的金黄色葡萄球菌ATCC25923(黑线)和铜绿假单胞菌PAO1(灰线)生物膜的杀菌活性。结果表示为用Pam-3处理24小时时龄生物膜1小时后的活细菌数(以log10 CFU表示)。值是来自三次独立实验的三个重复的平均值。通过使用Kruskal-Wallis检验比较每个时间点与时间点0来评估统计数据(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001)。
图6证实缺乏针对Pam-3的细菌耐药性发展，如针对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌所评估的。金黄色葡萄球菌ATCC 25923和鼠伤寒沙门氏菌DSM554分别对Pam-3和抗生素利福平和环丙沙星的耐药性发展。值是相对于第一代最小抑制浓度(MIC)的MIC的倍数变化(以log2表示)。
图7示出暴露于八肽以及通过报告基因测定确定的所有五种Pam后的细胞包膜损伤。
图8示出八肽和所有五种Pam与质子载体羰基氰化物间氯苯腙CCCP相比的细菌膜电位降低，如由膜电位测定所确定的。
图9示出细菌孔隙形成，如分别用Syto9和碘化丙锭着色所确定的。
图10示出Pam-3介导的杀伤的速度(rapidness)。Pam-3在1分钟内杀伤了90％以上的铜绿假单胞菌，并且在15分钟内杀伤了90％以上的金黄色葡萄球菌。在暴露于9.38μM(1倍MIC)Pam-3 1至120分钟后金黄色葡萄球菌ATCC25923(黑线)和铜绿假单胞菌PAO1(灰线)的杀伤。结果表示为每毫升的活细菌数(以log10 CFU表示)。值是三次独立实验的平均值。
图11示出在4倍MIC下温育30或60min后由Pam-3引起的金黄色葡萄球菌的细胞包膜损伤和孔隙形成。所有TEM图片的比例尺为0.2μm，并且所有SEM图片的比例尺为2μm。
图12示出120min后由五种不同的八肽衍生脂肽引起的金黄色葡萄球菌的细胞包膜损伤和孔隙形成，如通过透射和扫描电子显微镜检查所确定。在这里，使用120min的温育时间以与肉汤微量稀释测定的温育时间一致。所有TEM图片的比例尺为0.5μm，并且所有SEM图片的比例尺为2μm。
图13示出120min后由五种八肽衍生脂肽引起的肠炎沙门氏菌的细胞包膜损伤和孔隙形成，如通过扫描电子显微镜检查所确定的。在这里，使用120min的温育时间以与肉汤微量稀释测定的温育时间一致。所有TEM图片的比例尺为0.5μm，并且所有SEM图片的比例尺为2μm。
图14示出Pam-1到Pam-5针对大肠杆菌LPS突变体的MIC。
图15示出Pam-1至Pam-5针对金黄色葡萄球菌细胞包膜突变体的MIC。
图16示出如通过LHD测定所确定的细胞毒性。
图17示出如通过WST-1细胞增殖测定所确定的细胞毒性。
图18示出如通过红细胞溶血试验所确定的细胞毒性。
图19分别示出125和250μg Pam-1和Pam-3后的体重、谷氨酸草酰乙酸转氨酶和肌酐水平。小鼠剂量依赖性口服耐受性试验。动物用125μg的Pam-1、Pam-3或PBS处理两次，或用250μg的Pam-1、Pam-3或PBS处理一次。(a)小鼠的体重变化，(b)谷氨酸草酰乙酸转氨酶以及(c)应用Pam-1或Pam-3一天后的肌酐水平。结果表示为平均值±SEM。小鼠口服耐受性试验。动物用250μg Pam-1、Pam-3或PBS处理两次。示出了来自胃、小肠(空肠)、盲肠和结肠的代表性图像。比例尺，50μm。
图20示出用Pam-1分别处理鼠伤寒沙门氏菌引起的急性胃肠道感染和啮齿类柠檬酸杆菌引起的确定的胃肠道感染后盲肠和小肠的肠道内容物/肠道组织中的细菌载量(CFU)。小鼠用鼠伤寒沙门氏菌感染，并在感染后6小时和22小时后经口给予250μg Pam-1(N＝11)或PBS(N＝9)处理。小鼠用啮齿类柠檬酸杆菌感染，并在感染后5天后经口给予250μgPam-1(N＝10或11)或PBS(N＝11)处理。
图21示出用Pam-3分别处理鼠伤寒沙门氏菌引起的急性胃肠道感染和啮齿类柠檬酸杆菌引起的确定的胃肠道感染后的体重、盲肠和小肠的肠道内容物/组织中的细菌载量(CFU)。小鼠用鼠伤寒沙门氏菌感染，并在感染后6小时和22小时后经口给予250μg Pam-3(N＝12)或PBS(N＝9)处理。小鼠用啮齿类柠檬酸杆菌感染，并在感染后5天后经口给予250μgPam-3(N＝11或14)或PBS(N＝11)处理。(a)急性鼠伤寒沙门氏菌感染期间的体重变化。(b)盲肠内容物和组织中鼠伤寒沙门氏菌的CFU/ml。(c)小肠内容物和组织中鼠伤寒沙门氏菌的CFU/ml。(d)盲肠内容物和组织中啮齿类柠檬酸杆菌的CFU/g。(e)结肠内容物和组织中啮齿类柠檬酸杆菌的CFU/g。结果表示为管腔和组织中的活细菌数量(以log10 CFU表示)，并以平均值±SEM表示，如与PBS组相比有显著差异，如使用Mann-Whitney检验所计算的。
图22是详细的微生物组分析，分别包括用Pam-1处理前后的加权和未加权的unifrac分析、观察到的细菌物种和相对丰度。普食喂养(chow-fed)小鼠经口给予125μgPam-1(N＝5)处理两次或经口给予250μg Pam-1(N＝5-6)或PBS(N＝5)(作为对照)一次。在处理前后收集粪便样本以观察微生物组的短期变化。(a)分别在处理前后使用加权UniFrac距离对粪便微生物群组成进行主坐标分析(PCoA，包括组平均值)。(b)PCoA，包括分别在处理前后使用未加权UniFrac距离的粪便微生物群组成的组平均值。(c)处理前后的丰富度(观察到的物种)。(d)粪便微生物群是通过香农多样性指数计算的。通过使用Wilcoxon检验计算统计显著性。(e)Pam-1处理影响细菌属的丰度。
g是详细的微生物组分析，分别包括用Pam-3处理前后的加权和未加权的unifrac分析、观察到的细菌物种和相对丰度。普食喂养小鼠经口给予125μg Pam-3(N＝5)两次或经口给予250μg Pam-3(N＝6)或PBS(N＝5)(作为对照)。在处理前后收集粪便样本以观察微生物组的短期变化。(a)分别在处理前后使用加权UniFrac距离对粪便微生物群组成进行主坐标分析(PCoA，包括组平均值)。(b)PCoA，包括分别在处理前后使用未加权UniFrac距离的粪便微生物群组成的组平均值。(c)处理前后的丰富度(观察到的物种)。(d)粪便微生物群是通过香农多样性指数计算的。通过使用Wilcoxon检验计算统计显著性。(e)Pam-3处理影响细菌属的丰度。(f)按属进行汇总。LEfSe平台使用默认设置执行的统计分析((https://galaxyproject.org/learn/visualization/custom/lefse/)。
图24示出用氨苄西林处理后的微生物组分析。
图25示出所有五种Pam的杀菌作用，如通过肉汤微量稀释测定所确定的。
图26示出分别用Pam-1、Pam-3和PBS处理的小鼠肝脏、肾脏和胃肠道的组织学评分。
图27.人β防御素1-4的Clustal W(2.1)多序列比对。
图28.人α防御素5和6的Clustal W(2.1)多序列比对。
图29:人中性粒细胞肽1-3的Clustal W(2.1)多序列比对。
在Clustal W比对中：
*表示具有单个完全保守残基的位置。
:表示以下“强”组之一是完全保守的：
-S,T,A；N,E,Q,K；N,H,Q,K；N,D,E,Q；Q,H,R,K；M,I,L,V；M,I,L,F；H,Y；F,Y,W。
.表示以下“较弱”组之一是完全保守的：
-C,S,A；A,T,V；S,A,G；S,T,N,K；S,T,P,A；S,G,N,D；S,N,D,E,Q,K；N,D,E,Q,H,K；N,E,Q,H,R,K；V,L,I,M；H,F,Y。
具体实施方式
定义：
防御素片段：如本文所用的术语“防御素片段”是指属于抗微生物肽的防御素类别的肽。大多数防御素不能被胃肠道酶降解，但所述两种α-防御素HD5和HNP4以及所述β-防御素hBD-1在受到胃肠道酶或细菌酶作用时可降解为短线性肽。
Pam：如本文所用的术语Pam是指通过防御素片段与具有或不具有间隔物诸如氨基酸的糖的脂肪酸偶联以产生具有抗微生物特性的化合物而产生的化合物。
同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。两个氨基酸序列之间的同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970)确定，如在EMBOSS包(Rice等人,2000)的Needle程序中执行的，优选版本3.0.0或更高版本。使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)置换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle输出(使用nobrief选项获得)用作同一性百分比，并且计算如下：(同一残基×100)/(比对长度–比对中空位总数)。
正常微生物群：术语“正常微生物群”在本文中用于指示不失调的微生物群。正常微生物群的特征是具有足够的基因丰富度。
正常肠道微生物群的特征在于包括属于拟杆菌属、厚壁菌门、粪杆菌属、罗斯氏菌属、布劳氏菌属、瘤胃球菌属、粪球菌属、双歧杆菌属、甲烷短杆菌属、乳杆菌属、粪球菌属、梭菌属、阿克曼氏菌属、真杆菌属的细菌。
治疗：如本文用的术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指出于对抗病状、疾病或病症的目的而对患者进行的管理和护理。该术语旨在包括针对患者所罹患的给定病状的全部治疗范围，诸如出于以下目的而施用活性化合物：减轻或缓解症状或并发症；延缓病状、疾病或病症的进展；治愈或消除病状、疾病或病症；和/或预防病状、疾病或病症，其中“预防(preventing)”或“预防(prevention)”应理解为是指出于阻碍、减少活性化合物以预防或降低症状或并发症发病风险的目的而对患者进行管理和护理。待治疗的患者优选是哺乳动物，尤其是人。
修饰：术语“修饰”在本文中意指哺乳动物(例如，人)防御素的任何化学修饰。一种或多种修饰可以是一种或多种氨基酸的一种或多种取代、一种或多种缺失和/或一种或多种插入以及一种或多种氨基酸侧链的一种或多种置换；或在氨基酸序列或一种或多种脂质化中使用具有类似特征的非天然氨基酸以及插入任选的接头/间隔物。特别地，一种或多种修饰可以是酰胺化，诸如C末端的酰胺化。优选地，氨基酸修饰具有次要性质，即不显著影响多肽的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；单个缺失；小的氨基或羧基末端延伸；或通过改变净电荷或其他官能团(诸如多组氨酸标签、抗原表位或结合结构域)促进纯化的小的延伸。在一个实施方案中，小的延伸，诸如多组氨酸标签、抗原性表位或结合结构域，通过至多约20-25个残基的小接头肽附接至哺乳动物(例如，人)α或β防御素，并且所述接头可含有限制性内切酶切割位点。
Clustal W比对可用于预测哪些氨基酸残基可以被取代而不会显著影响蛋白质的生物活性。使用Clustal W 2.1(http://www.genom e.jp/tools/clustalw/)和以下设置比对序列：空位开放罚分：10，空位延伸罚分：0.05，加权转换：否，蛋白质的亲水性残基：GPSNDQE，亲水性空位：是，加权矩阵：BLOSUM(对于蛋白质)。以下组(Clustal W，“强”保守组)中的取代被视为保守取代：-S,T,A；N,E,Q,K；N,H,Q,K；N,D,E,Q；Q,H,R,K；M,I,L,V；M,I,L,F；H,Y；F,Y,W。以下组(Clustal W，“较弱”保守组)内的取代被视为半保守取代：-C,S,A；A,T,V；S,A,G；S,T,N,K；S,T,P,A；S,G,N,D；S,N,D,E,Q,K；N,D,E,Q,H,K；N,E,Q,H,R,K；V,L,I,M；H,F,Y。
保守取代的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小分子氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)组内进行的取代。
通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由Neu rath和Hill(1979)描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gl y、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
除了20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(诸如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)也可取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可被氨基酸残基取代。“非天然氨基酸”已在蛋白质合成后被修饰，并且/或者在其一个或多个侧链中具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸可以是化学合成的，并且优选地是商购可获得的，并且包括哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3,3-二甲基脯氨酸。
哺乳动物α和/或β防御素片段中的必需氨基酸可根据本领域已知的程序鉴定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989)。另参见，(Hilton等人,1996)。必需氨基酸的同一性也可从与哺乳动物α和/或β防御素片段相关的多肽的同一性分析中推断出来(参见图27至图29中的Clustal W比对)。
可使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行和测试单个或多个氨基酸取代，之后是相关的筛选程序，诸如(Reidhaar-Olson和Sauer,1988)；(Bowie和Sauer,1989)；WO 95/17413或WO 95/22625中所公开的程序。可使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，(Lowman等人,1991)；美国专利第5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向诱变((Derbyshire等人,1986)；(Ner等人,1988))。当不能确定地预测给定取代的结果时，可根据上文描述的方法容易地测定衍生物以确定生物活性的存在或不存在。
化合物/多肽
如本文所述的化合物基于任选地经由接头与脂肪部分连接的防御素肽片段。这些化合物被称为肽、化合物、脂肽、(防御素的)经修饰的片段和(防御素的)化学修饰。
脂肪部分(a-b-c中的a)
脂质化在本文中意指脂质基团与哺乳动物(例如，人)防御素或防御素片段的任何C或N末端共价结合。特别是C4-C27长链脂肪部分的结合。脂肪部分可以是脂肪酸诸如丁酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸或甾醇诸如胆固醇。脂肪部分在下文进一步描述。
在一个实施方案中，提供如本文所定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)包含至少8个碳原子，诸如至少9个碳原子，诸如至少10个碳原子，诸如至少11个碳原子，诸如至少12个碳原子，诸如至少13个碳原子，诸如至少14个碳原子，诸如至少15个碳原子，诸如至少16个碳原子，诸如至少17个碳原子，诸如至少18个碳原子，诸如至少19个碳原子，诸如至少20个碳原子，诸如至少21个碳原子，诸如至少22个碳原子，诸如至少23个碳原子，诸如至少24个碳原子，诸如至少25个碳原子，诸如至少26个碳原子，诸如至少27个碳原子，诸如至少28个碳原子，诸如至少29个碳原子，诸如至少30个碳原子原子，诸如至少31个碳原子，诸如至少32个碳原子，诸如至少33个碳原子，诸如至少34个碳原子，诸如至少35个碳原子。
在一个实施方案中，提供如本文所定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)包含脂族链或脂族环。
脂族环
在一个实施方案中，提供如本文所定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)是包含甾烷结构的脂族环。
在一个实施方案中，提供如本文所定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)是甾醇。在一个实施方案中，所述甾醇选自由以下组成的组：胆固醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇和麦角甾醇。
在一个实施方案中，提供如本文所定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)是包含类固醇诸如胆固醇的脂族环。
在一个实施方案中，提供如本文定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)包含两个通过双键连接的相邻碳原子。
脂族链
在一个实施方案中，提供如本文所定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)是脂族支化的或非支化的链。
在一个实施方案中，提供如本文所定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)是非支化的C8至C26脂肪酸，诸如C12、C14、C16、C18、C20或C22脂肪酸。
在一个实施方案中，提供如本文所定义的化合物，其中所述脂肪部分(a)是非支化的C16脂肪酸。
接头/间隔物
呈糖、氨基酸或PEG剂形式的接头/间隔物的一个或多个插入可用于进一步修饰。接头/间隔物的实例是葡萄糖和/或蔗糖或半胱氨酸、赖氨酸或8-氨基-3.6-二氧杂辛酸(亲水性PEG剂)。
防御素部分
所述化合物的防御素部分是防御素的片段。防御素片段的实例可在实施例14的表格中找到。优选地，所述片段是已经通过质谱法鉴定的片段。所述化合物的肽组分的合适实例包括SEQ ID NO:6、36和39(它们是hBD1的片段)，SEQ ID NO:93、93、94、97、99、103、105、106、114、119和122(它们是HD5的片段)，以及SEQ ID NO:181、189、190、192、195、198、203和206(它们是HNP4的片段)。优选地，所述肽是hBD1或HD5的片段，更优选地是选自SEQ ID NO:36和39的hBD1的片段。本文所述的五种Pam基于SEQ ID NO:36。
方法和用途
先前的研究已经证明在N末端处脂肪酸修饰后AMP的活性增强。发明人选择了C16长链脂肪酸棕榈酸，并用不同的间隔物诸如糖或氨基酸对其进行了测试，以提高hBD-1衍生的八肽的稳定性和杀菌活性，同时保护宿主的微生物群。五种独特的脂肽Pam-1、Pam-2、Pam-3、Pam-4和Pam-5是基于从hBD-1还原产生的八肽设计的(图1)。
Pam-2代表所有其他Pam的前体N末端棕榈酰化八肽。Pam-3还含有8-氨基-3.6-二氧杂辛酸，即作为亲水性间隔物的PEG剂。Pam-1含有葡萄糖和蔗糖作为间隔物，而Pam-4含有半胱氨酸并且Pam-5含有赖氨酸。不同间隔物概念背后的想法是改变结构，这可能导致各种作用机制。
令人惊讶的是，Pam-1、Pam-4和Pam-5通常对测试的细菌菌株无活性，这与Pam-2和Pam-3介导的细菌生长的有效抑制作用形成鲜明对比(图2、图3和图25)。Pam-3对细菌生长的抑制最强烈，与八肽相当(金黄色葡萄球菌)或优于八肽(啮齿类柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌)，指向修饰特异性活性。值得注意的是，Pam-2和Pam-3始终抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长，鼠伤寒沙门氏菌是一种未修饰的八肽未能抑制的物种。Pam-3在体外针对对最后的抗生素粘菌素和替加环素具有耐药性的鲍曼不动杆菌也非常有效(图3和图25)。Pam-2、Pam-3和Pam-5对热带念珠菌非常有效，而只有Pam-3对白色念珠菌非常有效，并且Pam-5对白色念珠菌显示出一定的功效(图4)。
细菌生物膜对生长抑制剂和杀菌治疗方案具有高耐受性。除了抗菌剂的渗透受阻之外，治疗进一步复杂化，与浮游细菌相比受生物膜保护的细菌所表现出的耐受性提高了10至1000倍。发明人证明了Pam-3以剂量依赖性方式根除已建立的生物膜的能力。在1小时内，300μM的Pam-3消除了生物膜中铜绿假单胞菌生物膜并同样根除ˉ99.99％的金黄色葡萄球菌(图5)。
抗生素耐药性的发展正在以惊人的速度增加。评估了革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性鼠伤寒沙门氏菌对Pam-3发展出耐药性的能力。当亚抑制浓度的Pam-3存在下培养25代时，没有观察到金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC)显著增加。相比之下，标准抗生素利福平的MIC在传代五次后开始快速增加，并且在传代15次后增加≥4096倍(图6)。类似地，尽管暴露于Pam-3用于持续的连续传代，但没有出现抗性鼠伤寒沙门氏菌分离株，而环丙沙星的存在导致MIC在3代后已经增加，并且在19代后MIC增加≥256倍(图6)。这些结果表明，对Pam-3的耐药性发展即使存在也可以忽略不计，因此与对传统抗生素的新出现的耐药性形成鲜明对比。
抗微生物肽的主要靶标是细菌细胞包膜。破坏外膜和/或内膜的完整性和功能导致屏障功能丧失和膜电位消散(Cole和Nizet,2016)。为了阐明八肽衍生脂肽的作用方式，发明人使用枯草芽孢杆菌的基于ypuA启动子的荧光素酶报告菌株来鉴定细胞质膜相关和细胞包膜相关的应激。ypuA启动子被Pam-2和Pam-3激活(2倍)，表明细胞包膜受损，而Pam-1、Pam-4和Pam-5令人惊讶地似乎很少引发细胞包膜损伤(图7)。
还评估了八肽衍生脂肽对金黄色葡萄球菌NCTC8325跨膜电位的影响。质子载体羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)用作阳性对照以使细菌去极化，即导致它们的膜电位降低。去极化后，由于染料分子的自缔合，DiOC2(3)从绿色荧光变为红光发射。用任何脂肽处理都会以浓度依赖性方式引起膜电位的破坏，但对Pam-2、Pam-3和Pam-5最为明显(图8)。两个结果都强调八肽衍生脂肽作用于细菌膜。
由于多种AMP将细胞膜作为孔隙形成剂，因此分析了Pam-3诱导细胞膜损伤的能力。金黄色葡萄球菌NCTC8325用4倍MIC的Pam-3处理，并添加Syto9和碘化丙锭(PI)的混合物。膜渗透性Syto9将所有活细胞染成绿色，而红色荧光PI只能通过大的膜孔隙或损伤进入细胞。Pam-3导致PI大量涌入(图9)。孔隙形成与这些细菌的快速杀伤相关联。评估了杀菌动力学，即Pam-3介导的杀伤的速度。Pam-3在1min内杀伤了90％以上的铜绿假单胞菌，并且在15min内杀伤了90％以上的金黄色葡萄球菌(图10)。分别在Pam-3处理后2min和30min观察到根除到检测水平。
扫描电子显微镜检查(SEM)用于直接观察Pam-3处理后的细胞形态变化。暴露于Pam-3导致类似于hBD1的膜表面破坏和细胞裂解，而对照细胞则表现出明亮光滑的表面(图11)。进行透射电子显微镜检查(TEM)来分析细菌形态学的变化，以比较用五种脂肽处理前后金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌的细菌形态学。与孔隙形成和细胞包膜应激和去极化的诱导一致，用八肽衍生脂肽处理导致强烈的细胞包膜损伤，以及大多数细胞中的膜和孔隙破坏(图12和图13)。
另外，大肠杆菌BW 25113突变体的LPS组成不同，这使得它们可用于研究Pam与革兰氏阴性细菌的结合。为了比较，大肠杆菌BW25113和大肠杆菌ATCC 25922用作对照。大肠杆菌ATCC 25922具有全长的LPS，因此具有另外的O抗原，而大肠杆菌BW 25113则缺少O抗原。大肠杆菌BW 25113突变体ΔwaaG具有与野生型类似的磷酸盐残基，因此具有相同的电荷，但缺少外核。突变体ΔwaaY具有外核，而内核中缺少磷酸盐残基，导致细胞壁的负电荷较少。类似的LPS组成具有突变体ΔwaaP，但内核中的磷酸盐残基量为零(图14)。
为了鉴定革兰氏阳性细菌的细胞壁靶标，研究了金黄色葡萄球菌SA113的细胞壁突变体对Pam的敏感性。金黄色葡萄球菌SA113用作对照。ΔdltA突变体在肽聚糖层中缺乏D-丙氨酸，导致更多的负电荷，这会促进Pam的结合和随后的细胞壁破坏(Weidenmaier等人,2005)。类似的细胞壁组成具有ΔmprF突变体，在细胞膜中缺乏L-赖氨酸，导致更多的负电荷(Peschel和Collins,2001)。肽聚糖层中另外的磷壁酸具有tarH突变体，导致其增强(图15)(Wanner等人,2017)。
发明人进一步证明了Pam的抗微生物活性与LPS和细菌细胞壁电荷无关(图14和图15)。高抗微生物功效通常与低耐受性相关联，并且AMP也不例外。使用LDH、WST-1和溶血测定评估八肽衍生脂肽的耐受性。Pam-1、Pam-4和Pam-5无毒且显示无LDH活性。Pam-3显示很少的LDH活性，并且Pam-2显示一些LDH活性(图16)。Pam-1、Pam-4和Pam-5也显示正常的代谢活性，如通过WST-1测定所评估的。Pam-3显示代谢活动略有下降，并且Pam-2显示代谢活动适度下降(图17)。Pam-1、Pam-2、Pam-4和Pam-5显示最小的红细胞破坏，并且Pam-3显示出适度的红细胞破坏(图18)。
小鼠经口施用Pam-1和Pam-3后评估了Pam的急性耐受性。分别施用两剂125μg或一剂250μg的Pam-1或Pam-3后24小时的组织学分析和血清标志物测定显示无任何急性毒性。具体而言，体重没有变化，并且也没有全身毒性或痛苦的迹象(图19)。肌酐和谷草酰乙酸转氨酶血清水平的测量结果显示两组之间没有显著差异，表明对肾脏和肝脏代谢没有影响(图19)。最后，胃肠道、肝脏和肾脏组织的组织学检查显示没有改变，除了一只对照小鼠和两只经处理小鼠的空肠-回肠的肠绒毛略微缩短(图19)。由于在经PBS与Pam-3处理的动物之间没有观察到这些组织病理学发现的差异，因此它们被视为背景观察结果(图26)。因此得出结论，尽管如通过细胞毒性测定所确定的，耐受性存在细微差异，但令人惊讶的是Pam-1和Pam-3处理均与急性毒性无关。
Pam-1和Pam-3的体内功效是在由鼠伤寒沙门氏菌引起的急性胃肠道感染和由啮齿类柠檬酸杆菌引起的确定的胃肠道感染中测试的。
经Pam-1处理的动物显示盲肠内容物中鼠伤寒沙门氏菌的菌落形成单位(CFU)显著减少，但组织中未显著减少(Mann-Whitney检验，分别为p<0.017和p＝0.7197，图20)。经Pam-3处理的动物显示盲肠内容物以及盲肠组织中鼠伤寒沙门氏菌的CFU均显著减少(Mann-Whitney检验，p<0.0001和p＝0.0409，图20)。此外，Pam-3还降低了小肠中的病原体载量而不影响小肠组织(Mann-Whitney检验，分别为p＝0.0024和p＝0.8621，图20)。
令人惊讶的是，Pam-1处理感染了啮齿类柠檬酸杆菌的小鼠没有减少盲肠和结肠中的CFU(图20)。Pam-3处理减少了盲肠内容物和盲肠组织中啮齿类柠檬酸杆菌的数量(Mann-Whitney检验，p＝0.0104和p＝0.0473，图21)。处理还显著减少了结肠内容物和结肠组织中活柠檬酸杆菌的数量(Mann-Whitney检验，p＝0.0010和p＝0.0104)。
抗生素处理具有显著后果。观察性、临床和流行病学研究已经证明，抗生素处理会影响肠道微生物群组成，对健康产生直接影响(Blaser,2016；Francino,2016)。微生物群组成的变化、多样性降低、分类学丰富度降低和生态失调是主要后果(Dethlefsen和Relman,2011；Dethlefsen等人,2008)。此外，抗生素会产生长期影响，诸如对感染、肥胖和肥胖相关代谢疾病的易感性增加(Francino,2016；Lange等人,2016)。与传统抗生素相比，并且考虑到它们的抗微生物功效时，令人惊讶的是，Pam-1或Pam-3处理对共生微生物都没有任何明显影响。β多样性分析和加权Unifrac距离的计算结果证明，在经Pam-1和Pam-3处理的小鼠与经PBS灌胃的对照小鼠之间，处理前后的样本之间微生物群的变化类似(图22和图23)。类似地，虽然在两组(即处理组和未处理组)中观察到群落结构发生微小变化，但检测到的物种数量以及复杂性(图22和图23)仍然具有可比性，因此与诸如氨苄西林的传统抗生素的处理形成对比(图23)。与α和β多样性分析一致，Pam-1和Pam-3处理均未影响细菌属的丰度(图22和图23)。结合起来，这些结果令人惊讶地证明，Pam-1和Pam-3都与对健康微生物组的显著影响无关。这些数据证明，与传统抗生素相比，使用Pam处理将具有显著优势，因为传统抗生素通常会观察到对常驻微生物群的破坏性影响以及多样性的快速下降(Burdet等人,2019)。此外，经过抗生素处理后，肠道通常会被非共生细菌定殖，这会导致长期的环境变化(de Lastours和Fantin,2015)。即使使用强效抗菌剂Pam-3进行高剂量处理，细菌多样性也没有受到影响，而不是多样性的丧失。
总之，发明人证明，八肽衍生脂肽，特别是Pam-2和Pam-3是在后抗生素世界中对抗多重耐药性感染的有前途的替代品，因为它们对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体以及真菌具有广泛的抗微生物活性，并且它们针对胃肠道感染的功效很重要，而且不会破坏常驻微生物群。
体外合成
可使用如本领域中所知的常规方法，通过体外合成制备哺乳动物防御素片段和与脂肽偶联的哺乳动物防御素片段。各种商业上的合成装置是可获得的，例如AppliedBiosystems Inc.、Beckman等的自动合成仪。通过使用合成仪，天然存在的氨基酸可用非天然氨基酸取代，特别是D-异构体(或D-型)，例如D-丙氨酸和D-异亮氨酸、非对映体、具有不同长度或官能性的侧链等。具体的制备顺序和方式将通过方便性、经济性、所需要的纯度等来确定。可向各种肽或蛋白质提供化学连接，所述肽或蛋白质包含用于键合的方便的官能团，诸如用于酰胺或取代胺形成例如还原胺化的氨基、用于硫醚或二硫化物形成的硫醇基、用于酰胺形成或脂化的羧基等。如果希望的话，可在合成过程中或在表达过程中将各种基团引入到肽中，这允许连接至其他分子或表面。因此半胱氨酸可用来制备硫醚、用于连接至金属离子复合物的组氨酸、用于形成酰胺或酯的羧基基团、用于形成酰胺的氨基基团等。
剂量
哺乳动物α或β防御素片段与脂肽偶联以产生具有抗微生物特性的稳定肽，优选以有效预防或治疗由革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、病毒、原虫、真菌或寄生虫，同时保留宿主微生物群的量用于药物组合物中。
对于此类治疗，适当的剂量当然会根据例如所用化合物的化学性质和药代动力学数据、个体宿主、施用方式以及所治疗病状的性质和严重程度而变化。
然而，一般而言，为了在哺乳动物例如人中获得令人满意的结果，人α防御素或β防御素衍生片段与脂肽(Pam)偶联的指定日剂量优选为从约0.1mg Pam/kg体重至约1000mgPam/kg体重，更优选为从约1.0mg Pam/kg体重至约500mg Pam/kg体重，例如，以至多每天一次、两次或三次分开的剂量施用或连续施用。
优选实施方案的化合物可通过与常规使用类似的施用方式以类似的剂量施用于哺乳动物，例如人。
本领域技术人员可容易地确定适当的浓度和剂量。
在一个实施方案中，哺乳动物Pam每天施用至少一次，诸如每天至少两次，例如每天至少3次或连续施用。
经口或胃肠外施用制剂
与脂肽偶联产生Pam的哺乳动物α防御素片段和β防御素片段可治疗性地用于配制用于通过任何常规途径施用的组合物中。
在一个实施方案中，根据所公开方法的至少一种Pam的施用是经口的。
在一个实施方案中，根据所公开方法的至少一种Pam的施用通常是鼻内或肺内的。鼻内和肺内施用对于肺部给药是正常的。
在一个实施方案中，根据所公开方法的至少一种哺乳动物Pam的施用是皮下或静脉内的。
在一些实施方案中，优选实施方案的组合物可被配制为冻干物，使用适当的赋形剂提供作为冻干物的稳定性，随后再水化。含有哺乳动物Pam的药物组合物可根据常规方法制造，例如通过混合、造粒、包衣、溶解或冻干工艺。在一个优选的实施方案中，含有哺乳动物Pam的药物组合物被配制为无菌和等渗的溶液。
药学上可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员所熟悉的。对于配制为液体溶液的组合物，可接受的载体和/或稀释剂包括盐水和无菌水，并且可任选地包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和其他常见添加剂。
所公开的化合物可被配制成多种用于经口施用的制剂。固体形式制剂可包括粉末、片剂、滴剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。适用于经口施用的其他形式可包括液体形式的制剂，包括乳液、糖浆、酏剂、水溶液、水混悬液、牙膏、凝胶洁牙剂、口香糖，或旨在在使用前不久转化为液体形式制剂，诸如溶液、悬浮液和乳液的固体形式制剂。
所公开的化合物可被配制成用于经颊、舌下、经口、直肠、阴道、真皮、透皮、颅内、皮下或静脉内施用的多种制剂。所述制剂可含有(除了哺乳动物α防御素片段和/或哺乳动物β防御素片段以及其他任选的活性成分)载体、填充剂、崩解剂、流动调节剂、糖和甜味剂、香料、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐、缓冲剂、稀释剂、分散剂和表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或本领域已知的其他药物赋形剂。本领域的技术人员可按照公认的实践，诸如Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro(1990)中描述的那些，以适当的方式进一步配制哺乳动物Pam。
实施例
实施例1
基于八肽的脂肽的抗微生物活性筛选
方法：将对数期细菌在TSB(TSB,Becton Dickinson,USA)中培养至多18小时，洗涤并在10ml琼脂中稀释至4×106CFU。将细菌在10ml的10mM磷酸钠(pH 7.4)中温育，其中含有0.3mg/ml TSB粉末和1％(w/v)低EEO琼脂糖(AppliChem)。将脂肽用移液器移入打孔的孔中，并在37℃下扩散到凝胶中，持续3小时。之后，将10mM磷酸钠缓冲液中的含有6％ TSB(w/v)和1％琼脂糖的富含营养的凝胶倒在第一块凝胶上，并在37℃下温育至多24小时。然后测量抑菌圈的直径。
鲍曼不动杆菌DSM30007、屎肠球菌DSM2918、肺炎克雷伯菌DSM30104和铜绿假单胞菌DSM1117的临床分离株由Robert-Bosch-Hosp ital Stuttgart,德国检验医学部提供。啮齿类柠檬酸杆菌DSM16636和大肠杆菌DSM8695获自德国Deutsche Sammlung vonMikroorga nismen und Zellkultur GmbH Braunschweig。鲍曼不动杆菌LMG944、鲍曼不动杆菌ECII、大肠杆菌6940、大肠杆菌DSM682、屎肠球菌11037CHB、屎肠球菌20218CHB、肺炎克雷伯菌6727和肺炎克雷伯菌6970以及金黄色葡萄球菌DSM20231、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC33592、金黄色葡萄球菌ATCC43300、鼠伤寒沙门氏菌血清型DSM554、铜绿假单胞菌ATCC27853、铜绿假单胞菌NRZ01677和铜绿假单胞菌PAO1的临床分离株由医学微生物学和卫生研究所(Tübingen,德国)提供。枯草芽孢杆菌ypuA和金黄色葡萄球菌NCTC8325获自微生物学和感染医学学院间研究所(Tübingen,德国)。野生型鼠伤寒沙门氏菌菌株SL1344含有染色体整合的luxCDAB E盒，这通过卡那霉素抗性以及萘啶酸和卡那霉素抗性得到证实，生物发光啮齿类柠檬酸杆菌菌株ICC180获自Helmholtz感染研究中心(Braunschweig,德国)。
所有细菌都储存在-80℃的低温小瓶(Roth)中。在每次实验之前，来自冷冻原种的接种物在37℃下在LB或哥伦比亚血琼脂平板(BD)上生长过夜。对于实验，在胰蛋白酶大豆肉汤(BD)中制备新鲜培养物。
所有脂肽均由EMC Microcollections GmbH(Tübingen,德国)化学合成并通过沉淀纯化。所有肽溶解于0.01％乙酸中。
结果：使用径向扩散测定(图2)和MIC测定(图3)筛选了五种八肽衍生Pam(脂肽)(图1)对几种病原性细菌的抗微生物活性。Pam-1、Pam-4和Pam-5通常对测试菌株无活性，这与Pam-2和Pam-3介导的令人惊讶的细菌生长抑制作用形成鲜明对比。Pam-3对细菌生长的抑制最强烈，与八肽相当(金黄色葡萄球菌)或优于八肽(啮齿类柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌)，指向修饰特异性活性。值得注意且令人惊讶的是，Pam-2和Pam-3始终抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长，鼠伤寒沙门氏菌是一种未修饰的八肽未能抑制的物种。
实施例2
八肽衍生脂肽的杀菌活性筛选
方法：肉汤微量稀释测定。通过离心(2500rpm，10min，4℃)收集对数期细菌，用含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液洗涤两次并且将600nm处的光密度调整为0.1。将大约5×105CFU/ml细菌在含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液中，以最终体积100μl以连续肽浓度(1.17–150μM)在37℃下温育2小时。温育后，添加100μl的6％ TSB(w/v)并在600nm处测量吸光度(Tecan,瑞士)并监测18小时。之后，以每孔100μl接种到LB琼脂上，以通过微生物学确定活细菌的数量。杀菌活性以LC99.9表示，即杀伤≥99.9％细菌的最低浓度。
对于时间-杀伤实验，将细菌(5×105CFU/ml)与9.38μM Pam-3在含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液中一起在LoBind管(Eppendorf)中以总体积550μl温育。作为未处理的对照，将细菌在含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液中温育。在37℃和150rpm下温育1至120min后，从悬浮液中取出50μl样本并添加到50μl的0.05％(v/v)聚茴脑磺酸钠(Sigma-Aldrich)溶液中，这会中和剩余的肽活性，并将其铺在LB琼脂上以确定活细菌的数量。
结果：Pam-1和Pam-4显示无杀菌活性或显示低杀菌活性(图25)，而Pam-5出人意料且与径向扩散测定相反，显示针对这些病原体的适度作用。与径向扩散测定的结果类似，Pam-2和Pam-3两者都非常有效。值得注意的是，Pam-2和Pam-3出人意料地抑制了鲍曼不动杆菌分离株(DSM30007)的生长，所述分离株对最后的抗生素粘菌素和替加环素具有耐药性(图3)。尽管Pam-2与Pam-3在杀菌方面有一些相似之处，但事实证明后者优于所有其他Pam，并且在浓度为4.69至18.75μM时对这些细菌非常有效(图25)。
实施例3
基于八肽的脂肽的抗真菌活性筛选
方法：肉汤微量稀释测定。将念珠菌在TSB中于37℃下过夜培养，离心(1500rpm，10min，室温)并用含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液洗涤两次。对念珠菌细胞进行计数并将大约5×105CFU/ml真菌在含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液中以最终体积100μl以连续肽浓度(1.17–150μM)在37℃下温育2小时。温育后，添加100μl的6％ TSB(w/v)并在600nm处测量吸光度(Tecan,瑞士)并监测18小时。之后，以每孔100μl接种到YPD琼脂上，以通过微生物学确定活细菌的数量。
结果：Pam-1和Pam-4显示对白色念珠菌和热带念珠菌没有抗真菌活性。Pam-2显示对热带念珠菌有适度的抗真菌活性，但令人惊讶的是它对白色念珠菌没有活性。Pam-5出人意料地显示对热带念珠菌有良好的活性以及对白色念珠菌有适度的活性。Pam-3显示对热带念珠菌和白色念珠菌有非常强的活性(图4)。
实施例4
生物膜根除评估。
方法：生物膜降解测定。将铜绿假单胞菌的对数期培养物在BM2培养基中稀释，并且将金黄色葡萄球菌的对数期培养物在TSB中稀释至5×105CFU/ml。将100μl的每种细菌悬浮液添加到圆底聚苯乙烯微量滴定板中，并在37℃的潮湿气氛中温育24小时。然后，用PBS通过两个洗涤步骤去除浮游细菌。接下来，将生物膜在37℃的潮湿气氛中暴露于含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液中以最终体积100μl以连续肽稀释液(9.38–300μM)，持续1小时。作为对照，将细菌暴露于含有1％(w/v)TSB且不含肽的10mM磷酸钠缓冲液。之后，将每个孔中的粘附细菌重新悬浮，并通过微生物学测定活细菌的数量。为了在对数尺度上可视化数据，在没有发生生长时，分配了1CFU的值。
结果：细菌生物膜对生长抑制剂和杀菌治疗方案具有高耐受性。除了抗菌剂的渗透受阻之外，治疗进一步复杂化，与浮游细菌相比受生物膜保护的细菌所表现出的耐受性提高了10至1000倍。因此，我们评估了Pam-3以剂量依赖性方式根除已建立的生物膜的能力。在1小时内，300μM的Pam-3消除了生物膜中铜绿假单胞菌生物膜并同样根除ˉ99.99％的金黄色葡萄球菌(图5)。
实施例5
细菌耐药性发展评估。
方法：用金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌评估对脂肽耐药性的发展。为了进行比较，确定了对临床相关抗生素利福平和环丙沙星(Sigma-Aldrich)的耐药性的发展。将细菌在TSB中以150rpm于37℃下培养过夜。将细菌用含1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液洗涤两次。将洗涤后的细菌在含有1％(重量/体积)TSB的10mM磷酸钠缓冲液中以最终体积100μl以连续Pam-3或抗生素浓度(最终浓度为1.17至150μM肽或0.0156至0.5μg/ml利福平或环丙沙星)在37℃下温育2小时。温育后，添加100μl的6％ TSB(重量/体积)并在潮湿的气氛中于37℃和150rpm下温育板21小时。
确定每个细菌物种的MIC，即导致缺乏可见细菌生长的脂肽/抗生素的最低浓度。此后，将5×105CFU/ml的0.5倍MIC悬浮液添加到含有脂肽/抗生素的新鲜培养基中，并如上所述温育这些混合物。将这个程序重复25代。
结果：评估了金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌对Pam-3发展出耐药性的能力。当亚抑制浓度的Pam-3存在下培养25代时，没有观察到金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC)显著增加。相比之下，标准抗生素利福平的MIC在传代五次后开始快速增加，并且在传代15次后增加≥4096倍(图6)。类似地，尽管暴露于Pam-3用于持续的连续传代，但没有出现抗性鼠伤寒沙门氏菌分离株，而环丙沙星的存在导致MIC在3代后已经增加，并且在19代后MIC增加≥256倍(图6)。
实施例6
八肽衍生脂肽作用方式的确定。
方法I：通过报告基因测定确定与细菌膜的相互作用。
具有枯草芽孢杆菌1S34遗传背景的特定细菌报告菌株，携带ypuA基因的启动子，与萤火虫荧光素酶报告基因融合，用于鉴定由抗微生物化合物处理引起的细胞包膜相关损伤。在37℃下，将细菌在含有5μg/ml红霉素的LB肉汤中培养至OD600为0.9，并稀释至OD600为0.02。在微量滴定板中制备连续肽稀释液(0.15–150μM)，并与调整后的细菌悬浮液在37℃下温育1小时。随后，添加含有2mM荧光素(Iris Biotech，德国)的柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH5)，并使用酶标仪(Tecan，瑞士)测量发光。
方法II：测定膜电位
将金黄色葡萄球菌NCTC8325在LB+0.1％葡萄糖中生长至对数期，收获，并将600nm处的光密度(OD600)调整为0.5。将细菌与30μM 3,3'-二乙基氧杂羰花青碘化物(DiOC2(3)，InvitrogenTM)置暗处温育15min，并用连续肽浓度处理30min。质子载体羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，Sigma Aldrich)用作阳性对照，并且DMSO或0.01％乙酸用作阴性对照。使用酶标仪(Tecan,瑞士)在485nm的激发波长和530nm(绿色)和630nm(红色)的两个发射波长下测量荧光。
方法III：测定细菌孔隙形成
使用活/死BacLight细菌活力试剂盒(Molecular Probes)监测孔隙形成。在37℃下，将金黄色葡萄球菌的LB中生长至对数生长期，并且将100μl等分试样用37.5μM Pam-3(4倍MIC)处理或不处理作为对照。肽处理10min后取样，然后添加0.2μl的SYTO9和碘化丙锭(PI)的1:1混合物，并在室温下置暗处进一步温育15min。使用Zeiss Axio Observer Z1自动显微镜进行荧光显微镜检查。使用Orca Flash 4.0V2相机g(Hamamatsu)、C Plan-Apo63x/1.4Oil DIC和αPlan-Apochromat 100x/1.46Oil Ph3物镜(Zeiss)获取图像并使用Zen软件包(Zeiss)进行处理。
方法IV：透射和扫描电子显微镜检查。
进行了电子显微镜检查，用于细菌形态学分析。将大约1.2×109CFU/ml细菌在含有1％(重量/体积)TSB肉汤的10mM磷酸钠缓冲液中与150μM Pam或37.5μM Pam-3(4倍MIC)在37℃下温育30或120min。作为对照，细菌暴露于0.01％乙酸。之后将细菌在卡氏试剂(Karnovsky’s reagent)中固定。
对于图11的透射电子显微镜检查，将细菌在毛细管中高压冷冻(HPF Compact 03，Engineering Office M.Wohlwend GmbH)，用丙酮中的2％ OsO4和0.4％乙酸双氧铀作为置换介质进行冷冻置换(AFS2，Leica Microsystems)并包埋在EPON中。将超薄切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并用在120kV下运行的TecnaiSpirit(Thermo Fisher Scientific)进行分析。
对于图12和图13的透射电子显微镜检查(TEM)，将固定后的样本(1％ OsO4，1h)用蒸馏水冲洗，用乙酸双氧铀(在蒸馏水中2％)封闭染色，酒精脱水(逐步30％–96％)，浸入环氧丙烷中并包埋在甘氨酸醚(在60℃下聚合48h，Serva，Heidelberg)中。用LIBRA 120(CarlZeiss AG，oberkochen)在120kV下检查超薄切片。
对于扫描电子显微镜检查(SEM)，将细菌在PBS中洗涤，并且最后用1％ OsO4在冰上固定1小时。接下来，在涂布多溶素的盖玻片上制备样本，以梯度系列脱水至100％乙醇，并用CO2进行临界点干燥(Polaron)。最后，用3nm厚的铂层(Safematic CCu-010)溅射涂覆样本，并在5kV的加速电压下用Hitachi Regulus 8230场发射扫描电子显微镜(Hitachi)进行检查。
结果：抗微生物肽的主要靶标是细菌细胞膜。破坏外膜和/或内膜的完整性和功能导致屏障功能丧失和膜电位消散。为了阐明八肽衍生脂肽的作用方式，我们使用枯草芽孢杆菌的基于ypuA启动子的荧光素酶报告菌株来鉴定细胞质膜相关和细胞包膜相关的应激。ypuA启动子被Pam-2和Pam-3激活(2倍)，表明细胞包膜受损(图7)。
评估了八肽衍生脂肽对金黄色葡萄球菌NCTC8325跨膜电位的影响。质子载体羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)用作阳性对照以使细菌去极化，即导致它们的膜电位降低。去极化后，由于染料分子的自缔合，DiOC2(3)从绿色荧光变为红光发射。用任何脂肽处理都会以浓度依赖性方式引起膜电位的破坏，对Pam-2、Pam-3和Pam-5最为明显(图8)。两个结果都强调八肽衍生的脂肽作用于细菌膜。
由于多种AMP将细胞膜作为孔隙形成剂，因此分析了Pam-3诱导细胞膜损伤的能力。金黄色葡萄球菌NCTC8325用4倍MIC的Pam-3处理，并添加Syto9和碘化丙锭(PI)的混合物。膜渗透性Syto9将所有活细胞染成绿色，而红色荧光PI只能通过大的膜孔隙或损伤进入细胞。Pam-3导致PI大量涌入(图9)。孔隙形成与这些细菌的快速杀伤相关联。我们测定了杀菌动力学以评估Pam-3介导的杀伤的速度。Pam-3在1min内杀伤了90％以上的铜绿假单胞菌，并且在15min内杀伤了90％以上的金黄色葡萄球菌(图10)。分别在Pam-3处理后2min和30min观察到根除到检测水平。
扫描电子显微镜检查(SEM)用于直接观察Pam-3处理后的细胞形态变化。暴露于Pam-3导致类似于hBD1的膜表面破坏和细胞裂解(Raschig等人,2017)，而对照细胞则表现出明亮光滑的表面(图11)。
进行透射电子显微镜检查(TEM)来分析细菌形态学的变化，以比较用脂肽处理前后金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌的细菌形态学。与孔隙形成和细胞包膜应激和去极化的诱导一致，用八肽衍生脂肽处理导致强烈的细胞包膜损伤，以及大多数细胞中的膜和孔隙破坏(图12和图13)。
实施例7
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌突变体中可能的细胞壁靶点的鉴定。
大肠杆菌BW 25113突变体的LPS组成不同，这使得它们可用于研究Pam与革兰氏阴性细菌的结合。为了比较，将大肠杆菌BW 25113和大肠杆菌ATCC 25922用作对照。大肠杆菌ATCC 25922具有全长的LPS，因此具有另外的O抗原，而大肠杆菌BW 25113则缺少O抗原。大肠杆菌BW 25113突变体ΔwaaG具有与野生型类似的磷酸盐残基，因此具有相同的电荷，但缺少外核。突变体ΔwaaY具有外核，而内核中缺少磷酸盐残基，导致细胞壁的负电荷较少。类似的LPS组成具有突变体ΔwaaP，但内核中的磷酸盐残基量为零。
为了鉴定革兰氏阳性细菌的细胞壁靶标，研究了金黄色葡萄球菌SA113的细胞壁突变体对Pam的敏感性。金黄色葡萄球菌SA113用作对照。ΔdltA突变体在肽聚糖层中缺乏D-丙氨酸，导致更多的负电荷，这会促进Pam的结合和随后的细胞壁破坏(Weidenmaier等人,2005)。类似的细胞壁组成具有ΔmprF突变体，在细胞膜中缺乏L-赖氨酸，导致更多的负电荷(Peschel和Collins,2001)。肽聚糖层中另外的磷壁酸具有tarH突变体，导致其增强(Wanner等人,2017)。
方法：肉汤微量稀释测定。通过离心(2500rpm，10min，4℃)收集对数期细菌，用含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液洗涤两次并且将600nm处的光密度调整为0.1。将大约5×105CFU/ml细菌在含有1％(w/v)TSB的10mM磷酸钠缓冲液中，以最终体积100μl以连续肽浓度(1.17–150μM)在37℃下温育2小时。温育后，添加100μl的6％ TSB(w/v)并在600nm处测量吸光度(Tecan,瑞士)并监测18小时。之后，以每孔100μl接种到LB琼脂上，以通过微生物学确定活细菌的数量。
结果：Pam的抗微生物活性与LPS和细菌细胞壁电荷无关(图14和图15)。
实施例8
八肽衍生脂肽耐受性的评估。
方法：通过乳酸脱氢酶浓度和WST-1细胞增殖测定以及溶血测定确定细胞毒性。
结果：Pam-1、Pam-4和Pam-5显示无LDH活性。Pam-3显示很少的LDH活性，并且Pam-2显示一些LDH活性(图16)。Pam-1、Pam-4和Pam-5显示正常的代谢活性，Pam-3的代谢活性略有下降，并且Pam-2的代谢活性适度下降(图17)。Pam-1、Pam-2、Pam-4和Pam-5显示最小的红细胞破坏，并且Pam-3显示出适度的红细胞破坏(图18)。
因此，令人惊讶的是，考虑到它们的高功效，Pam是无毒的。
实施例9
经口施用后急性耐受性的评估。
方法：将C57BL/6N小鼠在Helmholtz感染研究中心(HZI)的动物设施中在增强的无特定病原体(SPF)条件下产生和维持(包括繁殖和圈养)(Stehr等人,2009)。实验中使用的动物是性别和年龄匹配的。使用8-12周龄的雌性和雄性小鼠。经灭菌的食物和水随意提供。小鼠保持严格的12小时光照周期(早上7:00开始光照，晚上7:00结束光照)下，并且每笼饲养二至六只小鼠。通过CO2窒息和颈椎脱臼对所有小鼠实施安乐死。所有动物实验均经德国Lower Saxony当地政府同意后进行(批准许可编号：33.19-42502-04-18/2499)。
年龄和性别匹配的小鼠每天经口给予两剂溶解在100μl PBS中的肽(0、125μg或250μg)。记录体重和外观。第二天，处死小鼠并取出胃、肾脏、脾、肝脏、小肠、盲肠和结肠用于组织学评分。从心脏抽取约1ml血液以测量炎性标志物，包括肾脏中的肌酐和肝脏中谷氨酸-草酰乙酸-转氨酶(GOT)的酶水平。
结果：施用两剂250μg的Pam-1或Pam-3后24小时的组织学分析和血清标志物测定未显示任何急性毒性。具体而言，体重没有变化，并且也没有全身毒性或痛苦的迹象(图19)。此外，肌酐和GOT血清水平的测量结果显示两组之间没有显著差异，表明对肾脏和肝脏代谢没有影响(图19)。最后，胃肠道、肝脏和肾脏组织的组织学检查显示没有改变，除了一只对照动物和两只经处理动物的空肠-回肠肠绒毛略微缩短(图19)。由于在经PBS与Pam-3处理的动物之间没有观察到这些组织病理学发现的差异，因此它们被视为背景观察结果(图26)。因此，我们得出结论，Pam-1和Pam-3处理与急性毒性无关。
实施例10
由鼠伤寒沙门氏菌引起的急性胃肠道感染的处理。
方法：粪便中细菌载量的分析。收集新鲜粪便样本并称重。通过使用Mini-Beadbeater-96(BioSpec)用1mm氧化锆/二氧化硅珠进行两次25秒珠打，将样本在1ml LB培养基中均质化。为了确定CFU，将经均质的样本的稀释液铺板在含50μg/ml卡那霉素的LB板上。
肠内容物和全身器官中细菌载量的分析。
在指定时间点用CO2窒息处死所有小鼠。无菌取出肠组织(小肠、盲肠、结肠)。为了收集肠内容物，用PBS冲洗器官。纵向切开器官，用PBS彻底清洗并称重。使用Polytron匀浆器(Kinemtatica)在PBS中将器官和内容物均质化。将经均质的样本的稀释液铺板在含有50μg/ml卡那霉素的LB板上以确定CFU。
对于鼠伤寒沙门氏菌感染实验，使用了10至14周龄的年龄和性别匹配的小鼠。实验中使用了雌性和雄性小鼠。在通过经口灌胃法用20mg/小鼠的链霉素处理小鼠之前，停止饮水和进食4小时。之后，小鼠随意供应水和食物。链霉素处理后20小时，再次停止饮水和进食，4小时后小鼠经口感染200μl PBS中的105CFU鼠伤寒沙门氏菌。感染后立即提供随意饮用水以及感染(静脉推注)后2小时提供食物。静脉推注6小时和22小时后，小鼠接受溶解在100μl PBS中的250μg脂肽或仅经口给予PBS。感染后48小时，处死小鼠，取出肠道器官以评估内腔和组织中的细菌负荷。每天给小鼠称重以记录潜在的体重减轻。
小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌，并在感染后6小时和22小时经口给予250μg Pam-1或Pam-3或PBS。
结果：Pam-1处理的动物显示盲肠内容物中鼠伤寒沙门氏菌的菌落形成单位(CFU)显著减少，但组织中未显著减少(Mann-Whitney检验，p<0.017，图20)。
Pam-3处理的动物倾向于显示体重减轻减少(图21)，并且显示出盲肠内容物和组织中鼠伤寒沙门氏菌的CFU显著减少(Mann-Whitney检验，p<0.0001和0.05，图21)。此外，Pam-3还降低了小肠中的细菌载量而不影响小肠组织(Mann-Whitney检验，p<0.001，图21)。这个实施例证明Pam并且尤其是Pam-3在根除急性胃肠道感染方面的功效。
实施例11
处理由啮齿类柠檬酸杆菌引起的确定的胃肠道感染。
方法：啮齿类柠檬酸杆菌感染。生物发光表达啮齿类柠檬酸杆菌菌株ICC180用于所有感染实验(Wiles等人,2004)。啮齿类柠檬酸杆菌接种物通过在含有50μg/ml卡那霉素的LB肉汤中在37℃下过夜培养细菌来制备。随后，将培养物在新鲜培养基中按1:100稀释，并在LB肉汤中在37℃下传代培养4小时(Thiemann等人,2017)。将细菌在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次。给小鼠经口接种在200μlPBS中稀释的108CFU啮齿类柠檬酸杆菌。监测小鼠的体重并收集粪便以测量病原体负荷。感染后5天，小鼠两次经口接受溶解在100μlPBS中的250μg肽或仅经口接受PBS。第二天，处死小鼠以评估盲肠和结肠的内腔和组织中的细菌负荷。
小鼠感染啮齿类柠檬酸杆菌，并在感染后5天接受两剂250μgPam-1、Pam-3或PBS。
结果：令人惊讶的是，Pam-1处理并未减少盲肠中的CFU(图20)。Pam-3处理减少了盲肠内容物和盲肠组织中的细菌数量(Mann-Whitney检验，p<0.05和0.05，图21)。处理还显著减少了结肠内容物和结肠组织中活柠檬酸杆菌的数量(Mann-Whitney检验，p<0.01和p<0.05)。这些数据一起证实Pam并且尤其是Pam-3针对两种不同的肠道病原体的体内功效。
实施例12
施用Pam后的微生物组分析。
方法：以8小时的间隔用Pam-1或Pam-3(125或250μg/每剂)或经口给予PBS治疗小鼠两次，并且在应用前和应用后24小时收集新鲜粪便样本。使用16S rRNA测序分析微生物群组成。在不同时间点(感染前后)收集粪便样本，并使用先前描述的基于苯酚-氯仿的方法从速冻粪便中提取细菌DNA。简言之，向每个粪便样本中添加500μl的提取缓冲液(200mMTris(Roth)、20mM EDTA(Roth)、200mM NaCl(Roth)，pH 8.0)、200μl的20％ SDS(AppliChem)、500μl的苯酚:氯仿:异戊醇(PCI)(24:24:1)(Roth)和100μl的氧化锆/二氧化硅珠(直径0.1mm)(Roth)。使用Mini-Bead Beater-96(BioSpec)通过机械破碎进行细菌裂解两次各2min。离心后，将水相用另一种酚:氯仿:异戊醇提取处理，然后使用500μl异丙醇(J.T.Baker)和0.1体积的3M乙酸钠(Applichem)沉淀DNA。将样本在-20℃下温育至少数小时或过夜，并在4℃下以最大速度离心20min。洗涤所得DNA沉淀物，使用高速真空干燥并重新悬浮于含100μg/ml RNA酶I(Applichem)的TE缓冲液(Applichem)中。对粗DNA进行柱纯化(BioBasic Inc.)以去除PCR抑制剂。
V4区的16S rRNA基因扩增(F515/R806)根据确定的方案进行。简言之，将DNA标准化至25ng/μl，并用于带有经由特异性引物(获自Sigma)掺入的独特12碱基Golary条形码的PCR测序。使用Q5聚合酶(NewEnglandBiolabs)对每个样本一式三份进行PCR，PCR条件为在98℃下初始变性30秒，之后进行25个循环(在98℃下10秒，在55℃下20秒和在72℃下20秒)。汇集并标准化至10nM后，经由250bp双端测序(PE250)在Illumina MiSeq平台上对PCR扩增子进行测序。使用Usearch8.1软件包(http://www.drive5.com/usearch/)对产生的读段进行组装、过滤和聚类。使用QIIME v1.8.0基于样本特定的条形码对序列进行针对低质量读段的过滤并分箱(Caporasoetal.,2010)。使用-fastq_mergepairs–用fastq maxdiffs30进行合并。使用fastq_filter(-fastq_maxee 1)，使用250bp的最小读取长度以及每个样本的最小读取数＝1000进行质量过滤。通过开放参考OTU挑选将读段聚类为97％ ID OTU，并使用UPARSE算法确定代表性序列(Edgar,2010)。使用RDP分类器进行丰度过滤(OTU簇>0.5％)和分类学分类，所述分类器在80％的自举置信度截止值下执行。使用UCLUST从头组装没有匹配参考数据集的序列。使用FastTree与PyNAST比对确定OTU之间的系统发育关系。所得OTU绝对丰度表和映射文件用于R统计编程环境包phyloseq中的统计分析和数据可视化。
结果：β多样性分析和加权Unifrac距离的计算结果证明，在经Pam-1和Pam-3处理的小鼠与经PBS灌胃的对照小鼠之间，处理前后样本之间的微生物群变化类似(图22和图23)。类似地，虽然在两组(即治处理和未处理组)中观察到群落结构发生微小变化，但检测到的物种数量以及复杂性(图22)令人惊讶地仍然具有可比性，因此与诸如氨苄西林的传统抗生素的处理形成对比(图24)。与α和β多样性分析一致，Pam-1或Pam-3处理令人惊讶地没有影响细菌属的丰度(图22和图23)。结合起来，这些结果证明，在进行应用程序的情况下，Pam-1或Pam-3对健康的普食喂养小鼠的处理令人惊讶地不会影响微生物群的整体群落结构或多样性。
实施例13
施用Pam-3、氨苄西林和左氧氟沙星后的微生物组分析
方法：以8小时的间隔用Pam-3(125或250μg/每剂)经口处理小鼠两次或用左氧氟沙星(2mg溶于100μl PBS)或氨苄西林(5g/L在饮用水中)或经口给予PBS处理小鼠一次，并在应用前和应用后24小时收集新鲜粪便样本。
使用16S rRNA测序分析微生物群组成。在不同时间点(感染前后)收集粪便样本，并使用先前描述的基于苯酚-氯仿的方法从速冻粪便中提取细菌DNA。简言之，向每个粪便样本中添加500μl的提取缓冲液(200mM Tris(Roth)、20mM EDTA(Roth)、200mM NaCl(Roth)，pH 8.0)、200μl的20％ SDS(AppliChem)、500μl的苯酚:氯仿:异戊醇(PCI)(24:24:1)(Roth)和100μl的氧化锆/二氧化硅珠(直径0.1mm)(Roth)。使用Mini-Bead Beater-96(BioSpec)通过机械破碎进行细菌裂解两次各2min。离心后，将水相用另一种酚:氯仿:异戊醇提取处理，然后使用500μl异丙醇(J.T.Baker)和0.1体积的3M乙酸钠(Applichem)沉淀DNA。将样本在-20℃下温育至少数小时或过夜，并在4℃下以最大速度离心20min。洗涤所得DNA沉淀物，使用高速真空干燥并重新悬浮于含100μg/ml RNA酶I(Applichem)的TE缓冲液(Applichem)中。对粗DNA进行柱纯化(BioBasic Inc.)以去除PCR抑制剂。
V4区的16S rRNA基因扩增(F515/R806)根据确定的方案进行。简言之，将DNA标准化至25ng/μl，并用于带有经由特异性引物(获自Sigma)掺入的独特12碱基Golary条形码的PCR测序。使用Q5聚合酶(NewEnglandBiolabs)对每个样本一式三份进行PCR，PCR条件为在98℃下初始变性30秒，之后进行25个循环(在98℃下10秒，在55℃下20秒和在72℃下20秒)。汇集并标准化至10nM后，经由250bp双端测序(PE250)在Illumina MiSeq平台上对PCR扩增子进行测序。使用Usearch8.1软件包(http://www.drive5.com/usearch/)对产生的读段进行组装、过滤和聚类。使用QIIME v1.8.0基于样本特定的条形码对序列进行针对低质量读段的过滤并分箱。使用-fastq_mergepairs–用fastq_maxdiffs 30进行合并。使用fastq_filter(-fastq_maxee 1)，使用250bp的最小读取长度以及每个样本的最小读取数＝1000进行质量过滤。通过开放参考OTU挑选将读段聚类为97％ ID OTU，并使用UPARSE算法确定代表性序列。使用RDP分类器进行丰度过滤(OTU簇>0.5％)和分类学分类，所述分类器在80％的自举置信度截止值下执行。使用UCLUST从头组装没有匹配参考数据集的序列。使用FastTree与PyNAST比对确定OTU之间的系统发育关系。所得OTU绝对丰度表和映射文件用于R统计编程环境包phyloseq中的统计分析和数据可视化。
结果：对观察到的物种、细菌多样性和细菌属丰度的分析表明，左氧氟沙星或氨苄西林治疗后微生物群发生了显著变化。相比之下，令人惊讶的是，Pam-3的施用没有引起差异或仅引起轻微差异。这些结果证明Pam-3相对于普通抗生素的重大优势。
实施例14
表格包含hBD-1、HD5、HD6和HNP4片段的序列，这些序列可与能够在生物学上鉴定的防御素片段相比通过计算机模拟来生成。
用肠蛋白酶对hBD1进行的计算机模拟消化可用质谱法鉴定的片段
Figure BDA0004113295470000372
Figure BDA0004113295470000381
Figure BDA0004113295470000391
用肠蛋白酶对HD5进行的计算机模拟消化可用质谱法鉴定的片段
Figure BDA0004113295470000393
Figure BDA0004113295470000401
Figure BDA0004113295470000411
Figure BDA0004113295470000412
Figure BDA0004113295470000421
Figure BDA0004113295470000431
Figure BDA0004113295470000432
Figure BDA0004113295470000441
Figure BDA0004113295470000451
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项目
1.一种具有结构a-b-c或c-b-a的化合物，其中a)是脂肪部分；b)是任选的接头/间隔物，并且c)是选自任何α-或β-防御素片段，例如人防御素5(HD5)的片段、人中性粒细胞防御素4(HNP4)和/或人β防御素-1(hBD-1)的片段的肽。
2.一种具有结构a-b-c的化合物，其中a)是选自C4-C27长链脂肪酸诸如丁酸、月桂酸、棕榈酸或胆固醇的脂肪部分，b)是任选的接头/间隔物和/或PEG剂，并且c)是选自任何α-或β-防御素片段，例如人防御素5(HD5)的片段、人中性粒细胞防御素4(HNP4)和/或人β防御素-1(hBD-1)的片段的肽。
3.一种具有结构a-b-c的化合物，其中a)是脂肪部分；b)是选自糖和/或氨基酸和/或PEG剂的任选的接头/间隔物，并且c)是选自任何α-或β-防御素片段，例如人防御素5(HD5)的片段、人中性粒细胞防御素4(HNP4)和/或人β防御素-1(hBD-1)的片段的肽。
4.一种具有结构a-b-c的化合物，其中a)是棕榈酸；b)是选自糖和/或氨基酸和/或PEG剂的任选的接头/间隔物，并且c)是选自任何α-或β-防御素片段，例如人防御素5(HD5)的片段、人中性粒细胞防御素4(HNP4)和/或人β防御素-1(hBD-1)的片段的肽。
5.一种具有结构a-b-c的化合物，其，其中a)是棕榈酸；b)是8-氨基-3.6-二氧杂辛酸，即亲水性PEG剂，并且c)是选自任何α-或β-防御素片段，例如人防御素5(HD5)的片段、人中性粒细胞防御素4(HNP4)和/或人β防御素-1(hBD-1)的片段的肽。
6.用棕榈酸和/或8-氨基-3.6-二氧杂辛酸对任何α-或β-防御素片段，例如人防御素5(HD5)的片段、人中性粒细胞防御素4(HNP4)和/或的人β防御素-1(hBD-1)的片段进行化学修饰，以保护和/或增加微生物群，例如细菌丰度、基因丰富度和/或细菌门。
7.用棕榈酸和/或8-氨基-3.6-二氧杂辛酸对任何α-或β-防御素片段，例如人防御素5(HD5)的片段、人中性粒细胞防御素4(HNP4)和/或的人β防御素-1(hBD-1)的片段进行化学修饰以限制毒性。
8.用棕榈酸和/或8-氨基-3.6-二氧杂辛酸对任何α-或β-防御素片段，例如人防御素5(HD5)的片段、人中性粒细胞防御素4(HNP4)和/或的人β防御素-1(hBD-1)的片段进行化学修饰，以减少和/或减慢细菌耐药性的发展。
9.一种具有抗微生物活性的肽，所述肽是人β防御素-1(hBD-1)的经修饰的片段，其中所述肽由以下序列组成：
Pam2-Glc-Suc-RGKAKCCK(PAM-1)
Pam-RGKAKCCK(PAM-2)、
Pam-Ado-RGKAKCCK(PAM-3)、
Pam3Cys-RGKAKCCK(PAM-4)、
Pam-Lys(Pam)-RGKAKCCK(PAM-5)。
10.如项目1至8所述的肽、化合物或化学修饰，其中所述肽由以下序列组成：
Pam-RGKAKCCK(PAM-2)、
Pam-Ado-RGKAKKC(PAM-3)。
11.如项目1至8所述的肽、化合物或化学修饰，其中所述肽由以下序列组成：
Pam-Ado-RGKAKCCK(PAM-3)。
12.如前述项目中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其中所述肽是用棕榈酸化学修饰的hBD-1的C末端八个氨基酸(PAM-2)和/或用8-氨基-3.6-二氧代辛酸化学修饰的hBD-1的C末端八个氨基酸(PAM-3)。
13.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌感染、病毒感染、原虫感染、真菌感染或蠕虫感染(蠕虫病)。
14.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何耐药革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌感染。
15.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗耐药病毒感染。
16.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗耐药原虫感染。
17.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗耐药真菌感染。
18.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗耐药蠕虫感染(蠕虫病)。
19.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由ESKAPE病原体(屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和/或肠杆菌)引起的任何细菌感染。
20.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌胃肠道感染。
21.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何耐药革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌胃肠道感染。
22.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由ESKAPE病原体(屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和/或肠杆菌)引起的任何胃肠道感染。
23.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何细菌感染，特别是通过生物膜根除和细菌膜破坏杀伤病原体同时保护或增加微生物群，例如细菌丰度、丰富度和多样性和/或细菌耐药性发展最小的细菌门。
24.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何细菌性胃肠道感染，特别是通过生物膜根除和细菌膜破坏杀伤病原体同时保护或增加微生物群，例如细菌丰度、丰富度和多样性和/或细菌耐药性发展最小的细菌门。
25.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何细菌感染，特别是杀伤病原体，同时保护或增加微生物群，例如细菌基因丰富度和/或细菌门。
26.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何细菌性胃肠道感染，杀伤病原体同时保护或增加胃肠道微生物群，例如细菌基因丰富度和/或细菌门。
27.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于通过生物膜根除和细菌膜破坏杀伤任何病原性细菌。
28.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于通过生物膜根除和细菌膜破坏杀伤任何病原性胃肠道细菌。
29.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗任何细菌性胃肠道感染，保护胃肠道微生物群，从而降低继发性胃肠道感染例如艰难梭菌的风险。
30.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、啮齿类柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌和/或肠炎沙门氏菌引起的任何细菌感染。
31.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、啮齿类柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌和/或鼠伤寒沙门氏菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
32.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的任何细菌感染。
33.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
34.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由大肠杆菌引起的任何细菌感染。
35.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由大肠杆菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
36.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由啮齿类柠檬酸杆菌引起的任何细菌感染。
37.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由啮齿类柠檬酸杆菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
38.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由铜绿假单胞菌引起的任何细菌感染。
39.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由铜绿假单胞菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
40.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由肠炎沙门氏菌引起的任何细菌感染。
41.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由肠炎沙门氏菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
42.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的任何细菌感染。
43.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
44.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由白色念珠菌引起的任何真菌感染。
45.如项目1至12中任一项所述的肽、化合物或化学修饰，其用于治疗由白色念珠菌引起的任何真菌性胃肠道感染。
46.如前述项目中任一项所述的治疗或用途，其中所述治疗由用Pam2-Glc-Suc-RGKAKCCK(PAM-1)和/或Pam-RGKAKCCK(PAM-2)和/或Pam-Ado-RGKAKCCK(PAM-3)和/或Pam3Cys-RGKAKCCK(PAM-4)和/或Pam-Lys(Pam)-RGKAKCCK(PAM-5)的治疗组成。
47.如前述项目中任一项所述的治疗或用途，其中所述治疗由用Pam-RGKAKCCK(PAM-2)和/或Pam-Ado-RGKAKCCK(PAM-3)的治疗组成。
48.如前述项目中任一项所述的治疗或用途，其中所述治疗由用Pam-Ado-RGKAKCCK(PAM-3)的治疗组成。
49.根据前述项目中任一项所述的方法、治疗或用途，其中PAM-1和/或PAM-2和/或PAM-3和/或PAM-4和/或PAM-5是以介于1mg/kg与1000mg/kg之间的日剂量施用于有此需要的受试者。
50.如前述项目中任一项所述的方法、治疗或用途，其中PAM-1和/或PAM-2和/或PAM-3和/或PAM-4和/或PAM-5是每天两次施用于有此需要的受试者。
51.如前述项目中任一项所述的方法、治疗或用途，其中PAM-1和/或PAM-2和/或PAM-3和/或PAM-4和/或PAM-5是每日一次施用于有此需要的受试者。
52.如前述项目中任一项所述的方法、治疗或用途，其中PAM-3是每天两次或连续施用于有此需要的受试者。
53.如前述项目中任一项所述的方法、治疗或用途，其中PAM-1和/或PAM-2和/或PAM-3和/或PAM-4和/或PAM-5的施用为经口、局部(即眼、耳、鼻、皮肤)、阴道内、直肠、鞘内、肺内或静脉内。
54.如前述项目中任一项所述的方法、治疗或用途，其中PAM-3是经口施用的。
55.如前述项目中任一项所述的方法、治疗或用途，其中PAM-3是肺内施用的。
56.一种药物，其包含项目1-12中任一项所述的肽和药学上可接受的载体。
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<223> 防御素的切割产物
<400> 2
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala
20 25 30
Lys
<210> 3
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 3
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys
20 25 30
Lys
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 4
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys
20 25 30
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 5
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
20 25
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 6
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
20 25
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 7
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys
20 25
<210> 8
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 8
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
20 25
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 9
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
20 25
<210> 10
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 10
Tyr Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
1 5 10 15
Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
20
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 11
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys
20
<210> 12
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 12
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly
1 5 10 15
Lys Ala Lys Cys Cys Lys
20
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 13
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe
20
<210> 14
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 14
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly
1 5 10 15
Lys Ala Lys
<210> 15
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 15
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 16
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 17
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5 10 15
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 18
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 19
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 20
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 21
Tyr Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 22
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 23
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 24
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 25
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 26
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 27
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 28
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 29
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 30
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 31
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 32
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu
1 5 10
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 33
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 34
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 35
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 36
Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 37
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 38
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 39
Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 40
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 41
Tyr Ser Ala Cys Pro Ile Phe
1 5
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 42
Ser Ala Cys Pro Ile Phe
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 43
Arg Gly Lys Ala Lys
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 44
Ala Lys Cys Cys Lys
1 5
<210> 45
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala
20 25 30
Lys Cys Cys Lys
35
<210> 46
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 46
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala
20 25 30
Lys
<210> 47
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 47
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys
20 25 30
Lys
<210> 48
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 48
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 49
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
20 25
<210> 50
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 50
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
20 25
<210> 51
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 51
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys
20 25
<210> 52
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 52
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
20 25
<210> 53
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 53
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
20 25
<210> 54
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 54
Tyr Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
1 5 10 15
Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
20
<210> 55
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 55
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys
20
<210> 56
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 56
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly
1 5 10 15
Lys Ala Lys Cys Cys Lys
20
<210> 57
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 57
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe
20
<210> 58
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 58
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly
1 5 10 15
Lys Ala Lys
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 59
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe Thr Lys
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 60
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 61
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5 10 15
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 62
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile
1 5 10 15
Phe
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 63
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 64
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 65
Tyr Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
1 5 10 15
<210> 66
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 66
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5 10
<210> 67
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 67
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr
1 5 10
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 68
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5 10
<210> 69
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 69
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
1 5 10
<210> 70
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 70
Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu
1 5 10
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 71
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 72
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 73
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 74
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 75
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr
1 5 10
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 76
Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu
1 5 10
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 77
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 78
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 79
Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
1 5
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 80
Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 81
Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr Lys
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 82
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg
1 5
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 83
Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
1 5
<210> 84
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 84
Ile Gln Gly Thr Cys Tyr
1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 85
Tyr Ser Ala Cys Pro Ile Phe
1 5
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 86
Ser Ala Cys Pro Ile Phe
1 5
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 87
Arg Gly Lys Ala Lys
1 5
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 88
Ala Lys Cys Cys Lys
1 5
<210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
20 25 30
<210> 90
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 90
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu
20 25
<210> 91
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 91
Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
20 25
<210> 92
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 92
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg
20 25
<210> 93
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 93
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr
20 25
<210> 94
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 94
Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile
1 5 10 15
Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
20 25
<210> 95
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 95
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu
20 25
<210> 96
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 96
Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu
20 25
<210> 97
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 97
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg
20 25
<210> 98
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 98
Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg
20
<210> 99
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 99
Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
20
<210> 100
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 100
Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr
20
<210> 101
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 101
Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile
1 5 10 15
Ser Gly Arg Leu Tyr Arg
20
<210> 102
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 102
Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Gly Arg Leu
20
<210> 103
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 103
Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile
1 5 10 15
Ser Gly Arg Leu Tyr
20
<210> 104
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 104
Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Gly Arg
20
<210> 105
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 105
Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu
1 5 10 15
Cys Cys Arg
<210> 106
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 106
Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Arg
<210> 107
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 107
Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile
1 5 10 15
Ser Gly Arg
<210> 108
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 108
Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Tyr
<210> 109
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 109
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
1 5 10 15
<210> 110
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 110
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 111
Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg
1 5 10 15
<210> 112
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 112
Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg
1 5 10 15
<210> 113
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 113
Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 114
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg
1 5 10
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 115
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu
1 5 10
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 116
Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10
<210> 117
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 117
Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg
1 5 10
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 118
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr
1 5 10
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 119
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 120
Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg
1 5
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 121
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu
1 5 10
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 122
Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
1 5
<210> 123
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 123
Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 124
Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg
1 5
<210> 125
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 125
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg
1 5
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 126
Arg Leu Cys Cys Arg
1 5
<210> 127
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 127
Cys Arg Thr Gly Arg
1 5
<210> 128
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu
20 25 30
<210> 129
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 129
Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu
20 25 30
<210> 130
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 130
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe
20 25
<210> 131
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 131
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg
20 25
<210> 132
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 132
Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe
20 25
<210> 133
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 133
Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg
20 25
<210> 134
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 134
Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met
1 5 10 15
Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu
20 25
<210> 135
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 135
Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly
1 5 10 15
Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu
20
<210> 136
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 136
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met
20
<210> 137
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 137
Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met
1 5 10 15
Gly Ile Asn His Arg Phe
20
<210> 138
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 138
Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Cys Thr Val Met
20
<210> 139
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 139
Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met
1 5 10 15
Gly Ile Asn His Arg
20
<210> 140
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 140
Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly
1 5 10 15
Ile Asn His Arg Phe
20
<210> 141
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 141
Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His
1 5 10 15
Arg Phe Cys Cys Leu
20
<210> 142
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 142
Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly
1 5 10 15
Ile Asn His Arg
20
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 143
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 144
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 144
Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His
1 5 10 15
Arg Phe
<210> 145
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 145
Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His
1 5 10 15
Arg
<210> 146
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 146
Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys
1 5 10 15
Leu
<210> 147
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 147
Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
<210> 148
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 148
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 149
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 149
Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu
1 5 10 15
<210> 150
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 150
Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr
1 5 10
<210> 151
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 151
Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe
1 5 10
<210> 152
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 152
Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg
1 5 10
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 153
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr
1 5 10
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 154
Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met
1 5 10
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 155
Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe
1 5 10
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 156
Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 157
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 157
Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg
1 5 10
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 158
Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 159
Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr
1 5
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 160
Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu
1 5
<210> 161
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 161
Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr
1 5
<210> 162
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 162
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg
1 5
<210> 163
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 163
Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met
1 5
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 164
Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr
1 5
<210> 165
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 165
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg
1 5
<210> 166
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 166
Thr Cys His Cys Arg Arg
1 5
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 167
Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr
1 5
<210> 168
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 168
Gly Ile Asn His Arg Phe
1 5
<210> 169
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 169
Thr Cys His Cys Arg
1 5
<210> 170
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 170
Gly Thr Cys Thr Val Met
1 5
<210> 171
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 171
Arg Ser Cys Tyr
1
<210> 172
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 172
Val Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val
1 5 10 15
Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr Arg
20 25 30
Val
<210> 173
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 173
Val Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val
1 5 10 15
Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 174
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 174
Val Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val
1 5 10 15
Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr
20 25
<210> 175
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 175
Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile
1 5 10 15
Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr Arg Val
20 25
<210> 176
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 176
Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile
1 5 10 15
Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr Arg
20 25
<210> 177
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 177
Val Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val
1 5 10 15
Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe
20 25
<210> 178
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 178
Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val
1 5 10 15
Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr Arg Val
20 25
<210> 179
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 179
Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val
1 5 10 15
Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr Arg
20
<210> 180
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 180
Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile
1 5 10 15
Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr
20
<210> 181
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 181
Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe
1 5 10 15
Thr Tyr Cys Cys Thr Arg Val
20
<210> 182
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 182
Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe
1 5 10 15
Thr Tyr Cys Cys Thr Arg
20
<210> 183
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 183
Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr
1 5 10 15
Tyr Cys Cys Thr Arg Val
20
<210> 184
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 184
Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile
1 5 10 15
Gly Gly Val Ser Phe
20
<210> 185
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 185
Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr
1 5 10 15
Tyr Cys Cys Thr Arg
20
<210> 186
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 186
Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val
1 5 10 15
Ser Phe Thr Tyr
20
<210> 187
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 187
Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe
1 5 10 15
Thr Tyr
<210> 188
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 188
Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val
1 5 10 15
Ser Phe
<210> 189
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 189
Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr
1 5 10 15
Arg Val
<210> 190
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 190
Val Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg
1 5 10 15
<210> 191
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 191
Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr
1 5 10 15
Tyr
<210> 192
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 192
Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr
1 5 10 15
Arg
<210> 193
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 193
Arg Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe
1 5 10 15
<210> 194
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 194
Thr Glu Leu Arg Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe
1 5 10 15
<210> 195
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 195
Val Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe Cys Arg Arg
1 5 10
<210> 196
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 196
Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 197
Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 198
Val Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe Cys Arg
1 5 10
<210> 199
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 199
Val Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe
1 5 10
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 200
Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg
1 5
<210> 201
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 201
Val Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe
1 5
<210> 202
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 202
Thr Tyr Cys Cys Thr Arg Val
1 5
<210> 203
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 203
Leu Val Phe Cys Arg Arg
1 5
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 204
Thr Tyr Cys Cys Thr Arg
1 5
<210> 205
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 205
Arg Thr Glu Leu Arg
1 5
<210> 206
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 206
Leu Val Phe Cys Arg
1 5
<210> 207
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 207
Cys Cys Thr Arg Val
1 5
<210> 208
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 208
Val Cys Ser Cys Arg
1 5
<210> 209
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 防御素的切割产物
<400> 209
Thr Glu Leu Arg
1

Claims (39)

1.一种具有结构a-b-c的化合物，其中a)包括或者是月桂酸、棕榈酸或胆固醇；b)是选自糖和/或氨基酸和/或PEG剂的任选的接头/间隔物，并且c)是选自人β防御素-1(hBD-1)的片段的肽。
2.如权利要求1所述的化合物，其中a包括或者是月桂酸或棕榈酸，优选棕榈酸。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述hBD-1的片段是SEQ ID NO:36或39。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括用棕榈酸和/或8-氨基-3.6-二氧杂辛酸化学修饰的hBD-1的所述C末端八个氨基酸或由其组成。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有抗微生物活性。
6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物是人β防御素-1(hBD-1)的经修饰的片段，其中所述化合物选自以下列表：
Pam2-Glc-Suc-RGKAKCCK(PAM-1)
Pam-RGKAKCCK(PAM-2)、
Pam-Ado-RGKAKCCK(PAM-3)、
Pam3Cys-RGKAKCCK(PAM-4)和
Pam-Lys(Pam)-RGKAKCCK(PAM-5)。
7.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌感染、病毒感染、原虫感染、真菌感染或蠕虫感染(蠕虫病)。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何耐药革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌感染。
9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗耐药病毒感染。
10.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗耐药原虫感染。
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗耐药真菌感染。
12.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗耐药蠕虫感染(蠕虫病)。
13.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由ESKAPE病原体(屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和/或肠杆菌)引起的任何细菌感染。
14.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌胃肠道感染。
15.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何耐药革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌胃肠道感染。
16.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由ESKAPE病原体(屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和/或肠杆菌)引起的任何胃肠道感染。
17.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何细菌感染，特别是通过生物膜根除和细菌膜破坏杀伤所述病原体，同时保护或增加微生物群例如细菌丰度、丰富度和多样性和/或细菌耐药性发展最小的细菌门。
18.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何细菌、胃肠道感染，特别是通过生物膜根除和细菌膜破坏杀伤所述病原体，同时保护或增加微生物群，例如细菌丰度、丰富度和多样性和/或细菌耐药性发展最小的细菌门。
19.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何细菌感染，特别是杀伤所述病原体，同时保护或增加微生物群，例如细菌基因丰富度和/或细菌门。
20.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何细菌、胃肠道感染，杀伤所述病原体，同时保护或增加胃肠道微生物群，例如细菌基因丰富度和/或细菌门。
21.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于通过生物膜根除和细菌膜破坏杀伤任何病原性细菌。
22.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于通过生物膜根除和细菌膜破坏杀伤任何病原性胃肠道细菌。
23.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗任何细菌性胃肠道感染，保护胃肠道微生物群，从而降低继发性胃肠道感染例如艰难梭菌的风险。
24.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、啮齿类柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌和/或肠炎沙门氏菌引起的任何细菌感染。
25.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、啮齿类柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌和/或鼠伤寒沙门氏菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
26.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的任何细菌感染。
27.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
28.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由大肠杆菌引起的任何细菌感染。
29.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由大肠杆菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
30.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由啮齿类柠檬酸杆菌引起的任何细菌感染。
31.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由啮齿类柠檬酸杆菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
32.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由铜绿假单胞菌引起的任何细菌感染。
33.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由铜绿假单胞菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
34.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由肠炎沙门氏菌引起的任何细菌感染。
35.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由肠炎沙门氏菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
36.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的任何细菌感染。
37.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的任何细菌性胃肠道感染。
38.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由白色念珠菌引起的任何真菌感染。
39.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其用于治疗由白色念珠菌引起的任何真菌性胃肠道感染。
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