CN109628601A - 一种与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于调节基因表达的非编码核酸技术领域，公开了一种与5‑氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子及其应用，microRNA分子为MiR‑195，MiR‑195核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本发明通过生物信息学技术预测可能参与肝癌细胞5‑氟尿嘧啶耐药的microRNA分子，基于分子克隆相关技术构建慢病毒载体，利用肝癌细胞感染microRNA病毒后明确的生物学功能变化，筛选出明确参与肝癌细胞5‑氟尿嘧啶耐药的microRNA，并进一步分析验证筛选得到的miR‑195促进肝癌细胞耐药的生物学功能及作用机制，为有效逆转肝癌5‑氟尿嘧啶耐药及提高肝癌的临床化疗效果提供有效途径。
Description
技术领域
本发明属于调节基因表达的非编码核酸技术领域，尤其涉及一种与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子及其应用。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：原发性肝癌是全球范围内发病率高且最为常见的恶性肿瘤之一，每年约100万人死于该病。5-氟尿嘧啶是临床上治疗原发性肝癌的一线化疗药物，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，抑制DNA的生物合成而杀死肿瘤细胞。然而，5-氟尿嘧啶的耐药是化疗失败的主要原因之一。
5-FU化疗耐药可能源自于酶的异常、基因异常和肿瘤微环境异常等因素；肿瘤的耐药现象的发生是多种基因，多种步骤的联合作用，目前已知的耐药机制非常多样且非常复杂。
因此，在肝癌的化疗方面如何提高肿瘤对化疗药物的敏感性及增强药物疗效，具有重要意义。MiRNA是一类短小的，长度为19-22个核苷酸的非编码RNA分子，能够诱导mRNA的降解或抑制蛋白质翻译。近年来有研究表明，miRNA的异常表达与肿瘤细胞增殖及化疗药物敏感性有关。作为抑癌基因miR-195在肿瘤发生中起着重要作用，它可能是肿瘤治疗的潜在靶点。
综上所述，现有技术存在的问题是：5-氟尿嘧啶的耐药性强导致肿瘤化疗失败。
解决上述技术问题的难度和意义：
解决化疗耐药的问题是改善化疗效果的关键，研究人员在寻找选择性肿瘤多药耐药逆转剂上取得了一些进展，但仍没有有效的肿瘤多药耐药逆转剂上市。
因此，研究和开发活性好、毒副作用小的多药耐药逆转剂仍是国内外抗肿瘤药物的研究热点，也是医药学领域研究的重点课题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子及其应用。
本发明是这样实现的，一种与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子，所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子为MiR-195，MiR-195核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子MiR-195的肝癌5-氟尿嘧啶耐药标志物。
本发明的另一目的在于提供一种所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子MiR-195在原发性肝癌5-氟尿嘧啶耐药细胞中低表达。
本发明的另一目的在于提供一种所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子MiR-195在原发性肝癌5-氟尿嘧啶敏感细胞中高表达。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子MiR-195的肝癌5-氟尿嘧啶耐药的药物。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述肝癌5-氟尿嘧啶耐药药物的药物靶点。
本发明的另一目的在于提供一种所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法，所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法包括：
步骤一，构建BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞系BEL-7402/5-FU；
步骤二，检测BEL-7402亲本细胞及BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达量；
步骤三，细胞增殖-毒性实验检测细胞转染后的耐药指数。
进一步，所述步骤一具体包括：采取对数生长期的BEL-7402细胞107个，接种于直径为10cm的培养皿中，待细胞生长稳定后加入终浓度为10μmol/L的5-氟尿嘧啶，2～3天换液1次，每次换液后加入等浓度的5-氟尿嘧啶；经过2月的培养后，通过有限稀释法获得单克隆的肝癌BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞，并在7d无药物干预下扩增细胞；细胞长期在终浓度为2μmol/L的5-氟尿嘧啶的培养液中培养。
进一步，所述步骤二具体包括：
1)引物SEQ ID NO：2；
2)细胞总RNA提取，将细胞用预冷的PBS洗涤两次，每组样品加入1mL提前预冷的Trizol，用加样枪反复吹打；在冰上放置5min，保证细胞充分的裂解；将处理的样品转入DEPC水处理过的1.5mLEP管中，加入200μL氯仿，上下颠倒充分混匀摇匀，静置5min使其分层；4℃12000rpm离心15min，离心后吸取约500μL上层液体至新的1.5mL DEPC水处理过的EP管中；加入与D步等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀；
室温静置10min后，4℃12000rpm离心15min，弃上清；加入1mL乙醇，可见有白色沉淀析出。将洗涤后的乙醇洗干净，后倒置在滤纸上，静止一段时间，用20μL DEPC水溶解；定量提取的RNA：取2μL RNA溶解于98μL TE buffer中，用紫外分光光度计测定其A260和A280值，分析RNA的纯度；
3)细胞总mRNA反转录，取提取好的5μg总RNA；
4)进行Real time PCR实验，将9μl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，分别加入对应的1μl cDNA，小心粘上Real time PCR专用封口膜，并短暂离心混合，在设置Realtime PCR程序前将准备好的384-PCR板放在冰上；扩增程序95℃10min，95℃15s，60℃60s，40循环；用GraphpadPrism6软件进行数据分析并制表。
进一步，所述步骤三具体包括：当肝癌BEL-7402/5-FU细胞处于生长活跃状态时，于转染前一天接种到六孔板中，经16～18小时后，细胞总面积达到50-80％，将5μlLipofectamineTM2000加入500μl无血清培养基中放置15分钟，每5μl miR-195质粒及对照NC也分别加入500μl无血清培养基室温预孵育15分钟，后混合均匀，室温放置20分钟；6小时后更换为10％胎牛血清培养液，转染48小时后分别消化离心各组细胞分别按每孔8000个细胞接种于96孔板培养箱预培养24小时，待细胞贴壁后给予不同浓度5-氟尿嘧啶处理，将96孔板在培养箱孵育4天后，更换新鲜培养液后向每孔加入10ul噻唑蓝溶液，将培养板在培养箱内孵育2.5小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度；
肝癌BEL-7402亲本细胞中接种于6孔板，细胞密度1×105个细胞，加入2mL无抗生素的10％胎牛血清培养液过夜，细胞贴壁密度融合达50％-60％时，6孔板取5μl浓度为20μM的化学合成寡聚核苷酸miR-195antagomiR/阴性对照antagomiRNC，加入500μl无血清培养基稀释，静置15分钟；取5μl Lipofectamine2000加入500μl无血清培养基静置5分钟，混合均匀室温再放置20分钟形成转染复合物后加入6孔板中，细胞培养箱中培养，转染6-8h后换液。48小时后细胞增殖-毒性实验测定转染antagomiR及阴性对照inhibiorNC后BEL-7402细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性变化。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明公开了一种与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子，为MiR-195，其核苷酸序列为UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC。MiR-195具有在肝癌5-氟尿嘧啶耐药细胞中低表达、在肝癌5-氟尿嘧啶敏感细胞中高表达的特性，是一种新的肝癌5-氟尿嘧啶耐药标志物。因此，本发明为设计抗肝癌5-氟尿嘧啶耐药药物提供了新的靶点，并以此为依据，用以设计和开发直接针对肝癌5-氟尿嘧啶耐药的新药。本发明公开的MiR-195具有促进肝癌细胞耐药的生物学功能及作用机制，为有效逆转肝癌5-氟尿嘧啶耐药及提高肝癌的临床化疗效果提供有效途径。
本发明通过生物信息学技术预测可能参与肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的microRNA分子，基于分子克隆相关技术构建慢病毒载体，利用肝癌细胞感染microRNA病毒后明确的生物学功能变化，筛选出明确参与肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的microRNA，并进一步分析验证筛选得到的miR-195促进肝癌细胞耐药的生物学功能及作用机制，为有效逆转肝癌5-氟尿嘧啶耐药及提高肝癌的临床化疗效果提供有效途径。
附图说明
图1是本发明实施例提供的与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的构建BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞系(BEL-7402/5-FU)，通过细胞增殖-毒性实验检测BEL-7402/5-FU对5-氟尿嘧啶的耐药能力示意图。
图3是本发明实施例提供的Real-time PCR检测BEL-7402/5-FU及BEL-7402亲本细胞中miR-195的表达水平示意图。
图4是本发明实施例提供的细胞增殖-毒性实验检测转染miR-195后构建的BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的耐药能力示意图。
图5是本发明实施例提供的细胞增殖-毒性实验检测转染miR-195antagomiR后肝癌BEL-7402亲本细胞对5-氟尿嘧啶的耐药能力示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对5-氟尿嘧啶的耐药性强导致肿瘤化疗失败的问题；本发明通过生物信息学技术预测可能参与肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的microRNA分子，基于分子克隆相关技术构建慢病毒载体，利用肝癌细胞感染microRNA病毒后明确的生物学功能变化，筛选出明确参与肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的microRNA。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子为MiR-195，MiR-195的核苷酸序列为SEQ ID NO：1UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC。
如图1所示，本发明实施例提供的与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法包括以下步骤：
S101：构建BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞系(BEL-7402/5-FU)；
S102：检测BEL-7402亲本细胞及BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达量；
S103：细胞增殖-毒性实验检测细胞转染后的耐药指数。
下面结合实验对本发明的应用效果做详细的描述。
5-氟尿嘧啶在肝癌的治疗过程中发挥着重要作用，但出现的耐药现象是限制其临床疗效的主要原因。明确新的microRNA在肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药中的生物学功能和机制为有效提高肝癌的临床疗效提供新的生物靶标选择。
本发明公开了一种肿瘤耐药microRNA分子，为miR-195，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1。
本发明还公开了miR-195作为设计抗肝癌5-氟尿嘧啶耐药药物靶点的用途，以及miR-195在肝癌5-氟尿嘧啶耐药性的临床诊断中的应用，以及根据这一靶点设计出的药物。
1、构建BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞系(BEL-7402/5-FU)
采用高浓度短时间5-氟尿嘧啶冲击法诱导BEL-7402/5-FU耐药细胞株。取对数生长期的BEL-7402细胞约107个，接种于直径为10cm的培养皿中，待细胞生长稳定后加入终浓度为10μmol/L的5-氟尿嘧啶，2～3天换液1次，每次换液后加入等浓度的5-氟尿嘧啶。经过2月的培养后，通过有限稀释法获得单克隆的肝癌BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞，并在7d无药物干预下扩增细胞。为了维持BEL-7402/5-FU耐药细胞株的耐药性，细胞长期在终浓度为2μmol/L的5-氟尿嘧啶的培养液中培养。
2、检测BEL-7402亲本细胞及BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达量
1)引物设计SEQ ID NO：2
hsa_miR_195_PrimerForwardPrimer(20μM)：
forward:5’-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3’and reverse:5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’
2)细胞总RNA提取
A.整个RNA提取过程需要带口罩和手套，并且在冰上操作，防止RNA降解。
B.将细胞用预冷的PBS洗涤两次，每组样品加入1mL提前预冷的Trizol，用加样枪反复吹打。
C.在冰上放置5min，保证细胞充分的裂解。
D.将上步处理的样品转入DEPC水处理过的1.5mLEP管中，加入200μL氯仿，上下颠倒充分混匀摇匀，静置5min使其分层。4℃12000rpm离心15min，离心后吸取约500μL上层液体至新的1.5mL DEPC水处理过的EP管中。
E.加入与D步等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀。
F.室温静置10min后，4℃12000rpm离心15min，弃上清。加入1mL乙醇，可见有白色沉淀析出。将洗涤后的乙醇洗干净，后倒置在滤纸上，静止一段时间，用20μL DEPC水溶解。
G.定量提取的RNA：取2μL RNA溶解于98μL TE buffer中，用紫外分光光度计测定其A260和A280值，分析RNA的纯度。
3)细胞总mRNA反转录
取提取好的5μg总RNA，用天根生化科技(北京)有限公司的逆转录试剂盒进行反转录实验，反应体系如表1所示：
表1逆转录体系(20μl)
反应条件：16℃30min，42℃30min，85℃5min，所得cDNA低温保存。
4)进行Real time PCR实验
A.使用德国Roche公司2×MasterMix试剂盒进行实验；
B.按表2所示反应体系加样至每孔；
表2 Real time PCR体系(9μl)
将9μl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，分别加入对应的1μl cDNA，小心粘上Real time PCR专用封口膜，并短暂离心混合，在设置Real time PCR程序前将准备好的384-PCR板放在冰上。
C.扩增程序(ABI QuantStudio 6Flex)
95℃10min，95℃15s，60℃(收集荧光)60s，40循环。
D.用GraphpadPrism6软件进行数据分析并制表。
3、细胞增殖-毒性实验检测细胞转染后的耐药指数
当肝癌BEL-7402/5-FU细胞处于生长活跃状态时，于转染前一天接种到六孔板中，经16～18小时后，细胞总面积达到50-80％左右，将5μl LipofectamineTM2000加入500μl无血清培养基中放置15分钟，每5μl miR-195质粒及对照NC(终浓度为20μM)也分别加入500μl无血清培养基室温预孵育15分钟，后混合均匀，室温放置20分钟。6小时后更换为10％胎牛血清培养液，转染48小时后分别消化离心各组细胞分别按每孔8000个细胞接种于96孔板培养箱预培养24小时(在37℃，5％CO2的条件下)，待细胞贴壁后给予不同浓度5-氟尿嘧啶处理，将96孔板在培养箱孵育4天后，更换新鲜培养液后向每孔加入10ul噻唑蓝溶液，将培养板在培养箱内孵育2.5小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
肝癌BEL-7402亲本细胞中接种于6孔板，细胞密度1×105个细胞，加入2mL无抗生素的10％胎牛血清培养液过夜，细胞贴壁密度融合达50％-60％时，6孔板(每孔)取5μl浓度为20μM的化学合成寡聚核苷酸miR-195antagomiR/阴性对照antagomiRNC，加入500μl无血清培养基稀释，静置15分钟；取5μl Lipofectamine2000加入500μl无血清培养基静置5分钟，混合均匀室温再放置20分钟形成转染复合物后加入6孔板中，细胞培养箱中培养，转染6-8h后换液。48小时后细胞增殖-毒性实验测定转染antagomiR及阴性对照inhibiorNC后BEL-7402细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性变化。
结果显示：
1)细胞增殖-毒性实验检测筛选得到的BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞系5-氟尿嘧啶耐药能力
细胞增殖-毒性实验结果显示，相对于BEL-7402亲本细胞，BEL-7402/5-FU细胞在高浓度的5-氟尿嘧啶处理下存活率更高，耐药能力显著增强，参见图2。
2)Real-time PCR检测肝癌BEL-7402亲本及BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达水平通过Real-time PCR检测分析肝癌BEL-7402亲本和BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达水平，结果显示，相对于亲本细胞，miR-195在肝癌BEL-7402/5-FU细胞中表达显著降低，参见图3。由此推测miR-195的表达有可能与肝癌5-氟尿嘧啶耐药能力相关。
3)细胞增殖-毒性实验检测转染miR-195后对肝癌BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶耐药能力的影响
为明确miR-195是否对肝癌细胞的5-氟尿嘧啶耐药能力有所影响，通过将构建的真核表达质粒miR-195转染至BEL-7402/5-FU细胞，使miR-195在BEL-7402/5-FU细胞中表达增高并比较加药处理后细胞的5-氟尿嘧啶耐药能力，参见图4，结果显示，转染miR-195组的细胞5-氟尿嘧啶耐药能力显著低于其他组细胞。
4)细胞增殖-毒性实验检测转染miR-195antagomiR后对肝癌BEL-7402细胞5-氟尿嘧啶耐药能力影响
将化学合成的miR-195antagomiR/antagomiRNC转染至肝癌BEL-7402细胞中，使得miR-195在BEL-7402中表达降低。参见图5，结果显示，相对于对照组细胞，转染miR-195antagomiR组的细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性显著增强，进一步证明了miR-195的与肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药能力密切相关。
综上所述，随着microRNA在肿瘤发生和耐药性获得过程中的研究不断深入，本发明通过生物信息学技术预测可能参与肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的microRNA分子，基于分子克隆相关技术构建慢病毒载体，利用肝癌细胞感染microRNA病毒后明确的生物学功能变化，筛选出明确参与肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的microRNA，并进一步分析验证筛选得到的miR-195促进肝癌细胞耐药的生物学功能及作用机制，为有效逆转肝癌5-氟尿嘧啶耐药及提高肝癌的临床化疗效果提供有效途径。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南华大学
<120> 一种与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人源序列(Homo sapiens)
<400> 1
uagcagcaca gaaauauugg c 21
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人源序列(Homo sapiens)
<400> 2
tagcagcaca gaaatattgg cgcgagcaca gaattaatac gac 43
Claims (10)
1.一种与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子，其特征在于，所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子为MiR-195，MiR-195核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.一种包含权利要求1所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子MiR-195的肝癌5-氟尿嘧啶耐药标志物。
3.一种如权利要求1所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子MiR-195在原发性肝癌5-氟尿嘧啶耐药细胞中低表达。
4.一种如权利要求1所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子MiR-195在原发性肝癌5-氟尿嘧啶敏感细胞中高表达。
5.一种包含权利要求1所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子MiR-195的肝癌5-氟尿嘧啶耐药的药物。
6.一种包含权利要求5所述肝癌5-氟尿嘧啶耐药药物的药物靶点。
7.一种如权利要求1所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法，其特征在于，所述与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法包括：
步骤一，构建BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞系BEL-7402/5-FU；
步骤二，检测BEL-7402亲本细胞及BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达量；
步骤三，细胞增殖-毒性实验检测细胞转染后的耐药指数。
8.如权利要求7所述的与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：采取对数生长期的BEL-7402细胞107个，接种于直径为10cm的培养皿中，待细胞生长稳定后加入终浓度为10μmol/L的5-氟尿嘧啶，2～3天换液1次，每次换液后加入等浓度的5-氟尿嘧啶；经过2月的培养后，通过有限稀释法获得单克隆的肝癌BEL-74025-氟尿嘧啶耐药细胞，并在7d无药物干预下扩增细胞；细胞长期在终浓度为2μmol/L的5-氟尿嘧啶的培养液中培养。
9.如权利要求7所述的与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：
1)引物SEQ ID NO：2；
2)细胞总RNA提取，将细胞用预冷的PBS洗涤两次，每组样品加入1mL提前预冷的Trizol，用加样枪反复吹打；在冰上放置5min，保证细胞充分的裂解；将处理的样品转入DEPC水处理过的1.5mLEP管中，加入200μL氯仿，上下颠倒充分混匀摇匀，静置5min使其分层；4℃12000rpm离心15min，离心后吸取500μL上层液体至新的1.5mL DEPC水处理过的EP管中；加入与D步等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀；
室温静置10min后，4℃12000rpm离心15min，弃上清；加入1mL乙醇，可见有白色沉淀析出；将洗涤后的乙醇洗干净，后倒置在滤纸上，静止一段时间，用20μL DEPC水溶解；定量提取的RNA：取2μL RNA溶解于98μL TE buffer中，用紫外分光光度计测定其A260和A280值，分析RNA的纯度；
3)细胞总mRNA反转录，取提取好的5μg总RNA；
4)进行Real time PCR实验，将9μl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，分别加入对应的1μl cDNA，小心粘上Real time PCR专用封口膜，并短暂离心混合，在设置Real timePCR程序前将准备好的384-PCR板放在冰上；扩增程序95℃10min，95℃15s，60℃60s，40循环；用GraphpadPrism6软件进行数据分析并制表。
10.如权利要求7所述的与5-氟尿嘧啶耐药性相关的microRNA分子的检测方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：当肝癌BEL-7402/5-FU细胞处于生长活跃状态时，于转染前一天接种到六孔板中，经16～18小时后，细胞总面积达到50-80％，将5μlLipofectamineTM2000加入500μl无血清培养基中放置15分钟，每5μl miR-195质粒及对照NC也分别加入500μl无血清培养基室温预孵育15分钟，后混合均匀，室温放置20分钟；6小时后更换为10％胎牛血清培养液，转染48小时后分别消化离心各组细胞分别按每孔8000个细胞接种于96孔板培养箱预培养24小时，待细胞贴壁后给予不同浓度5-氟尿嘧啶处理，将96孔板在培养箱孵育4天后，更换新鲜培养液后向每孔加入10ul噻唑蓝溶液，将培养板在培养箱内孵育2.5小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度；
肝癌BEL-7402亲本细胞中接种于6孔板，细胞密度1×105个细胞，加入2mL无抗生素的10％胎牛血清培养液过夜，细胞贴壁密度融合达50％-60％时，6孔板取5μl浓度为20μM的化学合成寡聚核苷酸miR-195antagomiR/阴性对照antagomiRNC，加入500μl无血清培养基稀释，静置15分钟；取5μl Lipofectamine2000加入500μl无血清培养基静置5分钟，混合均匀室温再放置20分钟形成转染复合物后加入6孔板中，细胞培养箱中培养，转染6-8h后换液；48小时后细胞增殖-毒性实验测定转染antagomiR及阴性对照inhibiorNC后BEL-7402细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性变化。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111334576A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-06-26 | 浙江大学 | 一种与肝癌索拉非尼耐药相关的miRNA标志物及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132424A (zh) * | 2015-08-17 | 2015-12-09 | 深圳大学 | microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用 |
| CN105363042A (zh) * | 2015-10-21 | 2016-03-02 | 苏州圣诺生物医药技术有限公司 | 一种药物组合物及其应用 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132424A (zh) * | 2015-08-17 | 2015-12-09 | 深圳大学 | microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用 |
| CN105363042A (zh) * | 2015-10-21 | 2016-03-02 | 苏州圣诺生物医药技术有限公司 | 一种药物组合物及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李杰等: "不同缺氧模型对HepG2细胞中miR-210表达的影响", 《军事医学》 * |
| 杨晓燕等: "MiR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶耐药性的影响", 《中南医学科学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111334576A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-06-26 | 浙江大学 | 一种与肝癌索拉非尼耐药相关的miRNA标志物及其应用 |
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