WO2021160121A1

WO2021160121A1 - 粒细胞群嗜碱性粒细胞作为过敏性疾病诊断标记物的应用

Info

Publication number: WO2021160121A1
Application number: PCT/CN2021/076239
Authority: WO
Inventors: 何韶衡; 何萍
Original assignee: 辽宁汇普源生物医学科技开发有限责任公司
Priority date: 2020-02-10
Filing date: 2021-02-09
Publication date: 2021-08-19
Also published as: CN111349683A; CN111349683B

Abstract

本发明提供了粒细胞群嗜碱性粒细胞作为过敏性疾病诊断标记物的应用。本发明将嗜碱性粒细胞分类为单个核细胞群嗜碱性粒细胞和粒细胞群嗜碱性粒细胞，并对粒细胞群嗜碱性粒细胞进行了系统研究，并发现粒细胞群嗜碱性粒细胞特异性地与过敏性疾病关联，可用于过敏性疾病的诊断。该诊断方法特异性好，且检测容易，易于推广与临床应用。

Description

粒细胞群嗜碱性粒细胞作为过敏性疾病诊断标记物的应用

技术领域

本发明涉及医学诊断学领域，具体而言，涉及粒细胞群嗜碱性粒细胞作为过敏性疾病诊断标记物的应用。

背景技术

变态(过敏)反应性疾病发病率占世界总人口的30％以上，被世界卫生组织列为21世纪的四大非感染性疾病之一。随着工业经济的发展，生态环境的改变，近年来此类病例日益增多，该疾病已经成为常见病、多发病，是我国健康及经济发展领域需要解决的重大问题。

但是迄今为止，过敏性疾病的实验室定性诊断问题一直没有得到解决，临床上经常出现“假阴性”的问题，即医生由于查不到患者的过敏原而告诉患者他(她)不是过敏。难以定性诊断的原因主要有以下几个方面：(1)过敏原的种类数以千计，而临床上常用的只有数十种，因此如果患者的过敏原不包括在这数十种之内便会“漏诊”；(2)当前过敏原制剂的质量较低，亚洲包括我国无标准化过敏原，欧美也只是采用20多年前定义的第一代标准化过敏原制剂。由于第一代标准化过敏原制剂仅仅包括24个物种，而且采用第一代标准化过敏原制剂进行定性诊断也只能检测其中的一种主要过敏原(能诱发50％以上对该物种过敏的患者出现过敏反应的过敏原蛋白)，因此对于已知含有10种左右主要过敏原的物种如螨虫、蟑螂、花生等而言，即使使用了这些物种的第一代标准化过敏原制剂，也存在着因为制剂中不含有诱发患者过敏的特异性过敏原蛋白而导致“漏诊”的问题。如某一户尘螨过敏患者仅对户尘螨主要过敏原Der p21过敏，而对制剂中检测用的Der p1不过敏，在临床检测上就会出现螨虫阴性结果，从而使医生误认为该患者对户尘螨不过敏，出现“漏诊”；(3)临床上缺乏一种能够给过敏性疾病“定性”的方法，即先确定患者是否为过敏，再对患者进行过敏原筛查(如进行皮肤点刺试验，过敏原特异性IgE检测等)，确定患者对哪种过敏原过敏。这与临床上先确定患者为细菌感染，再确定患者为哪种细菌感染是一个道理。由于疾病“定性”诊断是避免“误诊”、“误治”的最佳方法，因此十分有必要研发出一种过敏性疾病的“定性”诊断方法。

发明内容

传统的流式细胞术检测人血液中嗜碱性粒细胞是在单个核细胞群设门，即检测单个核细胞群。在本研究中，发明人对粒细胞群设门，意外地发现粒细胞群中存在着大量的嗜碱性粒细胞。进而发明人将嗜碱性粒细胞分类为单个核细胞群嗜碱性粒细胞和粒细胞群嗜碱性粒细胞，并对粒细胞群嗜碱性粒细胞进行了系统研究。结果，发明人发现粒细胞群嗜碱性粒细胞特异性地与过敏性疾病关联，可用于过敏性疾病的诊断。

具体地，本发明涉及粒细胞群嗜碱性粒细胞的检测剂在制备用于诊断过敏性疾病的试剂盒中的应用，其中血液中增加的粒细胞群嗜碱性粒细胞数量是罹患过敏性疾病的指征。

该诊断方法特异性好，且检测容易，易于推广与临床应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中用流式细胞术检测粒细胞群中CCR3 ⁺和CD123 ⁺HLA-DR ^-嗜碱性粒细胞的设门方法；

图2为本发明一个实施例中用流式细胞术检测过敏性鼻炎患者单个核细胞群中的CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群(1)、CCR3 ⁺细胞亚群(2)和CCR3 ⁺CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群(3)占单个核细胞的比例及计数与健康对照组相比无显著增加(注：AR＝过敏性鼻炎患者；sAR＝季节性过敏性鼻炎患者；pAR＝常年性过敏性鼻炎患者；nAR＝过敏原检测阴性的过敏性鼻炎患者；HC＝健康对照组)；

图3为本发明一个实施例中用流式细胞术检测过敏性鼻炎患者单个核细胞群中CD63在三个嗜碱性粒细胞亚群即CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群(1)、CCR3 ⁺细胞亚群(2)和CCR3 ⁺CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群(3)中的表达水平与健康对照组相比无显著增加(注：AR＝过敏性鼻炎患者；sAR＝季节性过敏性鼻炎患者；pAR＝常年性过敏性鼻炎患者；nAR＝过敏原检测阴性的过敏性鼻炎患者；HC＝健康对照组)；

图4为本发明一个实施例中用流式细胞术检测过敏性鼻炎患者血液粒细胞群中的 CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群(1)、CCR3 ⁺细胞亚群(2)和CCR3 ⁺CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群(3)占粒细胞的比例及计数与健康对照组相比显著增加(注：AR＝过敏性鼻炎患者；sAR＝季节性过敏性鼻炎患者；pAR＝常年性过敏性鼻炎患者；nAR＝过敏原检测阴性的过敏性鼻炎患者；HC＝健康对照组)；

图5为本发明一个实施例中用流式细胞术检测过敏性鼻炎患者血液粒细胞群中CD123 ⁺HLA-DR ^-(A),CCR3 ⁺(B),CD123 ⁺HLA-DR ^-CCR3 ⁺(C)嗜碱性粒细胞群的CD63表达与健康对照组相比显著增加(注：AR＝过敏性鼻炎患者；sAR＝季节性过敏性鼻炎患者；pAR＝常年性过敏性鼻炎患者；nAR＝过敏原检测阴性的过敏性鼻炎患者；HC＝健康对照组；

图6为本发明一个实施例中用流式细胞术检测过敏性鼻炎患者血液粒细胞群中CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群(A),CCR3 ⁺细胞亚群(B),CD123 ⁺HLA-DR ^-CCR3 ⁺细胞亚群(C)中CD203c ⁺细胞的百分比；与健康对照组相比CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群中CD203c ⁺细胞的百分比显著增加(注：AR＝过敏性鼻炎患者；sAR＝季节性过敏性鼻炎患者；pAR＝常年性过敏性鼻炎患者；nAR＝过敏原检测阴性的过敏性鼻炎患者；HC＝健康对照组)；

图7为本发明一个实施例中用流式细胞术检测过敏性哮喘患者血液单个核细胞群中的CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群、CCR3 ⁺细胞亚群和CCR3 ⁺CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群占单个核细胞的比例及计数与健康对照组相比无显著增加(注：AS＝过敏性哮喘患者；HC＝健康对照组)；

图8为本发明一个实施例中用流式细胞术检测过敏性哮喘患者血液粒细胞群中的CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群、CCR3 ⁺细胞亚群和CCR3 ⁺CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群占粒细胞的比例及计数与健康对照组相比显著增加(注：AS＝过敏性哮喘患者；HC＝健康对照组)；

图9为本发明一个实施例中用流式细胞术将细胞群区分为单个核细胞和粒细胞群的示意图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及粒细胞群嗜碱性粒细胞的检测剂在制备用于诊断过敏性疾病的试剂盒中的应用，其中，血液中增加的粒细胞群嗜碱性粒细胞数量是罹患过敏性疾病的指征。

在一些实施方式中，粒细胞群和单核细胞群嗜碱性粒细胞通过前向角散射与侧向角散射两个指标进行区别；细胞通过上述两个指标可被划分为基本不同的两种细胞群。

如图9所示，粒细胞群嗜碱性粒细胞的侧向角散射(SSC)强度在约50K～100K以上，且前向角散射(FSC)强度在约50K～250K范围内，单核细胞群嗜碱性粒细胞的SSC强度在约0K～100K以下，FSC强度在约50K～250K范围内。这种区分对本领域技术人员是容易的。

在本发明中，“过敏性疾病”可指代自身过敏性疾病或由于某些外部过敏原所诱导产生的疾病。

在一个优选实施形式中，过敏原选自草花粉、树花粉、动物皮屑、动物毛发(羽毛)、蟑螂或其分泌物或脱落物、霉菌或其孢子。

在一个优选实施形式中，过敏原是选自包括以下的组的一种或多种医药物质：抗生素，优选β-内酰胺，更优选选自包括以下的组的β-内酰胺：青霉素G、青霉素V、PPL、MDM、阿莫西林和氨比西林；先锋霉素，更优选选自包括以下的组的先锋霉素：头孢唑林、头孢孟多、头孢克洛、Cefonaxim、头孢他啶、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、卡巴培南、单环内酰胺、β-内酰胺酶-抑试剂、更优选克拉维酸；大环内酯、氨基糖苷、利福霉素、糖肽、多肽、四环素、咪唑、氟喹诺酮、吡唑啉酮，更优选Sulfomethoxazol；链阳性霉素、硝基呋喃、异烟肼、喷他眯；防腐剂，优选氯己定、杀真菌剂、抗病毒试剂、抗疟疾-试剂、镇痛剂、COX-2-抑试剂和非甾体抗炎药，优选选自包括以下的组的防腐剂：阿司匹林、Lys-阿司匹林、布洛芬、酮洛芬、双氯芬酸、萘普生、对乙酰氨基酚、安乃近、吲哚美辛、甲灭酸、苯基丁氮酮和异丙安替比林；神经肌肉阻滞剂，优选选自包括以下的组的神经肌肉阻滞剂：琥珀胆碱、阿曲库铵、顺-阿曲库铵、美维库铵、巴夫龙、罗库溴铵、维库溴铵和琥珀酰胆碱；安眠药和局麻药，优选选自包括以下的组的安眠药和局麻药：咪达唑仑、丙泊酚、硫喷妥、芬太尼和利多卡因；镇静剂；鸦片类药剂；射线-造影剂，优选选自包括以下的组的射线-造影剂：离子型碘造影剂，非离子型碘化造影剂，异硫蓝、专利蓝和亚甲蓝；质子泵抑试剂；抗抽搐药(Antikonvulsiva)和抗精神病，优选选自包括以下的组的抗抽搐药(Antikonvulsiva)和抗精神病：卡马西平、苯妥英和丙戊酸；抗精神病试剂；抗抑郁药；多巴胺；抗组胺；皮质类固醇和糖皮质激素；化学治疗剂和免疫抑试剂；利尿药；抗凝剂；血管收缩剂和血管舒张剂；心脏药，进一步选自包括以下的组的心脏药：抑胃酶氨酸、ACE-抑试剂、Α-受体阻滞剂、Β-受体阻滞剂；钙拮抗剂和抗高血压药；(抗)溃疡药；(抗)甲状腺试剂；雌激素；肝素及其衍生物；胰岛素；以及链激酶和尿激酶。

在一些实施方式中，过敏原是胶质体、血浆扩容剂或助剂，进一步选自包括以下的组的过敏原：白蛋白、右旋糖苷、明胶、羟乙基淀粉、喷他淀粉、左旋糖、聚多卡醇600，乳糖，羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、鱼精蛋白和抑肽酶。

在一些实施方式中，过敏原是食品添加剂，进一步选自包括以下的组的食品添加剂：防腐剂、色素、精炼剂、抗氧化剂和乳化剂。

在一些实施方式中，过敏原是环境试剂或有害物质试剂，进一步选自包括以下的组的试剂：异氰酸盐/酯，异噻唑啉酮，甲醛，氧化乙烯，邻苯二甲酸酐，氯胺T，DMSO，以及在烘培加工、食品加工和洗涤工业中使用的乳液和酶。

在一些实施方式中，过敏原是选自包括以下材料的组：蜱蟎的培养物和/或粪便。

在一些实施方式中，过敏原选自包括以下材料的组：分类学节足动物门的虾或含虾的食物；分类学节足动物门的鳌虾或含鳌虾的食物；源自分类学的植物百合纲(Plantae Liliopsidae)的水果、荚果、谷物或豆类，或含有这种水果、荚果、谷物和/或豆类的食品；源自分类学的植物木兰亚纲(Plantae Magnoliopsidae)的水果、荚果、谷物或豆类，或含有这种水果、荚果、谷物和/或豆类的食品；以及属于分类学的植物木兰亚纲的坚果或含坚果的食物。

在一些实施方式中，过敏原选自包括以下材料的组：牛奶、含牛奶的食物、鸡蛋白、含鸡蛋白的食物、鱼和含鱼的食物。

在一些实施方式中，过敏原选自包括以下材料的组：大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、黑麦属(Secale)、小麦属(Triticum)、玉蜀黍属(Zea)、落花生属(Arachis)、Corylis、核桃属(Juglans)、李属(Prunus)、腰果属(Anacardium)、黄连木属(Pistacia)和大豆属(Glycine)。

在一些实施方式中，所述过敏性疾病包括过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、特应性皮炎、重症过敏、花粉症、食物过敏、荨麻疹、过敏性紫癜、嗜酸性粒细胞胃肠炎和药物过敏。

在一些具体的实施方式中，所述过敏性疾病包括过敏性鼻炎以及过敏性哮喘。

过敏性鼻炎可进一步包括单纯性的过敏性鼻炎、季节性过敏性鼻炎、常年性过敏性鼻炎以及过敏原检测阴性的过敏性鼻炎。

过敏性哮喘可进一步包括总IgE阳性和/或总IgE阴性的过敏性哮喘。

在一些实施方式中，所述粒细胞群嗜碱性粒细胞通过统计选自以下中的任一种细胞亚群的细胞数量占活白细胞的比例进行表征：

CCR3 ⁺细胞亚群、CCR3 ⁺CD63 ⁺细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-CD203c ⁺细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-CD63 ⁺细胞亚群、CD49f ⁺细胞亚群。

这些细胞亚群的检测用途如下表1所示。

表1

序号	细胞亚群	用途
1	CCR3 ⁺细胞亚群	检测嗜碱性粒细胞数量
2	CCR3 ⁺CD63 ⁺细胞亚群	检测活化的嗜碱性粒细胞数量(激发试验)
3	CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群	检测嗜碱性粒细胞数量
4	CD123 ⁺HLA-DR ^-CD203c ⁺细胞亚群	检测活化的嗜碱性粒细胞数量(激发试验)
5	CD123 ⁺HLA-DR ^-CD63 ⁺细胞亚群	检测活化的嗜碱性粒细胞数量(激发试验)
6	CD49f ⁺细胞亚群	检测嗜碱性粒细胞数量

在一些实施方式中，所述血液为离体样本。

在一些实施方式中，所述血液为外周血。

在一些实施方式中，所述检测剂用于通过免疫学方法特异性测量粒细胞群嗜碱性粒细胞；特别是测量粒细胞群嗜碱性粒细胞的细胞表面标志物。

在一些实施方式中，特异性地测量细胞表面标志物所需的试剂(特异性的结合剂)是，例如，细胞表面标志物配体或受体(如果存在的话)、结合细胞表面标志物的凝集素、结合细胞表面标志物的适配体或结合细胞表面标志物的抗体。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少10 ⁷l/mol的亲和力。特异性的结合剂优选对其靶分子具有10 ⁸l/mol、或更优选10 ⁹l/mol的亲和力。技术人员将理解，使用术语"特异性的"表示，样品中存在的其它生物分子不与期望检测的细胞表面标志物的特异性的结合剂发生显著的结合。

优选地，特异性的结合剂与除靶分子之外的生物分子的结合亲和力最多是与靶分子亲和力的仅10％或更少、仅5％或更少、仅2％或更少、或仅1％或更少。优选的特异性的结合剂将同时满足上述关于亲和力和特异性的最小标准。

在一些实施方式中，所述检测剂包括抗体。

在本发明中，“抗体”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是全长抗体或抗体功能片段。“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，术语“抗体功能片段”是包含抗体CDR的一部分或全部的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且结合至给定表位。抗体功能片段可以选自例如F(ab’)2、Fab、Fv、scFv。

在一些实施方式中，所述抗体具有可供检测的标记。

在一些实施方式中，所述可供检测的标记为荧光标记。

在一些实施方式中，所述荧光标记选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC、APC/Cy7、APC/H7、APC/R 700、BB 515、BB 700、BD IMag/DM、BUV 395、BUV 496、BUV 563、BUV 661、BUV 737、BUV 805、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 480、Brilliant Violet 510、Brilliant Blue 515、Brilliant Violet 570、Brilliant Violet 605、Brilliant Violet 650、Brilliant Violet 711、Brilliant Violet 750、Brilliant Violet785、Brilliant Violet 786、FITC、NA/LE、LEAF、Pacific Blue、PE、PE/CF594、PE/Cy5、PE/Cy7、PE/Dazzle、PerCP、PerCP/Cy5.5、V450和V500中的一种或多种。

所述试剂盒优选为用于实施流式细胞术的试剂盒。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还包含FcR阻断剂、用于标记死细胞的染料、红细胞裂解液和细胞洗涤缓冲液中的一种或多种。

FcR广泛表达在B细胞、单核细胞、巨噬细胞、DC细胞、粒细胞等，容易结合抗体的Fc片段，从而导致假阳性结果。在FcR高表达的细胞的染色过程中，推荐使用商品化的FcR 阻断剂或相应物种的血清阻断FcR与抗体结合，降低检测背景，消除假阳性。

流式细胞术是其结果容易被死细胞所干扰的技术，因为：1.死细胞容易摄取抗体和探针，导致明显的非特异性染色；并且2.死细胞自发荧光特别强。

上述原因会导致背景荧光增强，使得实验者无法观察到一些标记的弱阳性表达。死细胞还可能会释放DNA，DNA非常粘稠，所以最后会导致细胞成团，既影响结果，又容易堵塞管路。在流式分选中，一般都不希望对活力不好的细胞进行分选。因而可采用用于标记死细胞的染料减少对结果的干扰，在一个优选的实施方式中，所述用于标记死细胞的染料选自7氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)、碘化丙啶(PI)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、TO-PRO-3、Zombie Dyes和SYTOX中的一种或多种。上述染料通常会进入细胞膜受损的细胞，结合到细胞的DNA上，从而使得检测时能够很容易将死细胞与活细胞区分开来。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种用于诊断过敏性疾病的方法，其包括对血液中的粒细胞群嗜碱性粒细胞进行定量。

进一步的，所述方法还包括计算粒细胞群嗜碱性粒细胞在一定数量白细胞中的比例。

本发明中典型的诊断过敏性疾病的方法是一种流式细胞法，其可包括：

(1)用FcR阻断剂和死细胞去除染料孵育血液标本；

(2)荧光耦合的流式抗体孵育血液标本；

(3)裂解血液标本中的红细胞；

(4)洗涤细胞；和

(5)使用流式细胞仪进行检测；

(6)计算粒细胞群嗜碱性粒细胞在一定数量白细胞中的比例。

在一些实施方式中，根据粒细胞群中CCR3 ⁺细胞占白细胞的比例或绝对数量、CCR3 ⁺CD63 ⁺细胞占白细胞的比例或绝对数量、CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞占白细胞的比例或绝对数量、CD123 ⁺HLA-DR ^-CD203c ⁺细胞占白细胞的比例或绝对数量、CD123 ⁺HLA-DR ^-CD63 ⁺细胞占白细胞的比例或绝对数量、或者CD49f ⁺细胞占白细胞的比例或绝对数量来计算粒细胞群嗜碱性粒细胞在一定数量白细胞中的比例。

在一些实施方式中，根据粒细胞群中CCR3 ⁺CD63 ⁺细胞占白细胞的比例或绝对数量、CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞占白细胞的比例或绝对数量、或者CD123 ⁺HLA-DR ^-CD63 ⁺细胞占白细胞的比例或绝对数量来计算粒细胞群嗜碱性粒细胞在一定数量白细胞中的比例。

在一些实施方式中，所述裂解血液标本中的红细胞优选包括加入红细胞裂解液，均匀混合后孵育血液标本；所述红细胞裂解液优选为渗透压低于人血浆晶体渗透压的低渗溶液如蒸馏水，或者含NH ₄Cl的低渗溶液；所述孵育血液标本优选在2℃～40℃，更优选的4℃～37℃的温度进行；所述孵育血液标本优选以30s～60min，更优选为1min～30min的孵育时间进行；所述孵育血液标本优选为在避光的环境中进行。

在一些实施方式中，所述洗涤细胞优选包括将红细胞裂解后的血液标本离心，弃去上清液，加入细胞洗涤缓冲液；然后重复离心，弃上清。所述血液标本离心优选以90g～600g，更优选100g～400g，最优选150g～300g的离心力进行；所述血液标本优选以4℃～37℃的温度进行；所述细胞洗涤缓冲液优选与人血浆晶体渗透压相等的等渗溶液如PBS缓冲液，或者含0.9％NaCl的生理盐水等。

在一些实施方式中，所述使用流式细胞仪进行检测优选包括加入细胞洗涤缓冲液，重悬细胞后用流式细胞仪检测粒细胞群中目的细胞的数量。所述检测粒细胞群中目的细胞的数量优选包括使用流式细胞仪对至少100 000～1000 000个活的白细胞进行检测。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

1.流式细胞检测方法

加入FcR阻断剂和死细胞去除染料：取100μL血液标本于流式上样管，然后加入5μL人FcR阻断剂和5μL死细胞去除染料(7-AAD)，用移液器轻轻吹打血液标本5次，室温(18℃～22℃)避光孵育10min；

加入荧光耦合的流式抗体：孵育结束后，每管按照表2序号分别加入下列荧光耦合的抗体各5μL，用移液器轻轻吹打血液标本5次，室温(18℃～22℃)避光孵育15min。

裂解红细胞：孵育结束后，加入1.5mL红细胞裂解液，用移液器轻轻吹打血液标本5次，室温(18～22℃)避光孵育12min；

洗涤细胞：孵育结束后，将含血液标本的流式上样管置于离心机中，设置离心条件：离心力：200g，离心机温度：20℃，离心时间：6min，开始离心；离心结束后，移液器在不触及管底细胞的条件下小心吸取部分上清液后弃掉，保留约150μL上清液；然后加入1mL PBS缓冲液，用移液器均匀混合后重复上述离心、弃上清；

流式细胞仪检测：加入300μL的PBS缓冲液，用移液器均匀混合后，用流式细胞仪对100000个活白细胞进行分选，分为粒细胞群和单核细胞群，并分别检测目标细胞(即粒细胞群中的细胞)数量。

2.粒细胞群和单核细胞群嗜碱性粒细胞的区分与检测。

通过前向角散射与侧向角散射两个指标来区别流式细胞术检测细胞：前向角散射(FSC)的强度与细胞的大小有关，同一个细胞群体，FSC强，则细胞尺寸大，而FSC弱，则细胞尺寸小。侧向角散射(SSC)的强度与细胞内部结构的复杂程度有关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。

采用如上所述的流式细胞术检测外周血的白细胞，可以将细胞群区分为单个核细胞和粒细胞群(图9)，并分别检测二者中的CCR3和CD123阳性细胞，结果如图1所示。

3.粒细胞群嗜碱性粒细胞的数量特异性地在过敏性疾病中增加。

用流式细胞术检测过敏性鼻炎患者单个核细胞群中的CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群、CCR3 ⁺细胞亚群和CCR3 ⁺CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群，或上述三个细胞亚群中的CD63的表达水平，与健康对照组相比无显著增加(图2、图3)。然而，用流式细胞术检测过敏性鼻炎患者粒细胞群中的CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群、CCR3 ⁺细胞亚群和CCR3 ⁺CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群，或上述三个细胞亚群中的CD63的表达水平，与健康对照组相比均发生显著增加(图4、图5)。进一步地，发明人检测了过敏性鼻炎患者血液粒细胞群中CD123 ⁺HLA-DR-细胞亚群(A),CCR3 ⁺细胞亚群(B),CD123 ⁺HLA-DR ^-CCR3 ⁺细胞亚群(C)中CD203c ⁺细胞的百分比；与健康对照组相比CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群中CD203c ⁺细胞的百分比显著增加，其他组别并没有显著性地增加(图6)。

类似的现象也出现在过敏性哮喘的检测中，过敏性哮喘患者单个核细胞群中的 CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群、CCR3 ⁺细胞亚群和CCR3 ⁺CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群占单个核细胞的比例及计数与健康对照组相比无显著增加，而在粒细胞群中则发生了显著增加(图7、图8)。

上述检测中健康人(n＝24)过敏性鼻炎患者(n＝182)、过敏性哮喘患者(n＝125)血液粒细胞群中嗜碱性粒细胞和活化嗜碱性粒细胞的数量(单位：个/100 000个白细胞)；过敏性鼻炎患者：sAR(n＝30)；pAR(n＝79)；nAR(n＝73)；过敏性哮喘患者：AS(IgE ^-)(n＝82)；AS(IgE ⁺)(n＝43)

AR＝过敏性鼻炎患者；sAR＝季节性过敏性鼻炎患者；pAR＝常年性过敏性鼻炎患者；nAR＝过敏原检测阴性的过敏性鼻炎患者；AS＝过敏性哮喘患者；HC＝健康对照组。

由此，发明人发现粒细胞群中的以下细胞亚群能够用于过敏性疾病的检测：

CCR3 ⁺细胞亚群、CCR3 ⁺CD63 ⁺细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-CD203c ⁺细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-CD63 ⁺细胞亚群、CD49f ⁺细胞亚群(数据见表3，图略)。

用于检测上述细胞亚群的抗人荧光耦合抗体的组合方案见表2，阳性检测结果见表3。

表2

序号	抗人荧光耦合抗体的组合方案
1	APC-CCR3 ⁺
2	APC-CCR3 ⁺FITC-CD63 ⁺
3	FITC-CD123 ⁺APC/CY7-HLA-DR ^-
4	FITC-CD123 ⁺APC/CY7-HLA-DR ^-PE-CD203c ⁺
5	FITC-CD123 ⁺APC/CY7-HLA-DR ^-PE-CD63 ⁺
6	PE-CD49f ⁺

表3

由以上实施例可知，本发明提供的用流式细胞术通过检测人血液粒细胞群中嗜碱性粒细胞的数量来诊断过敏性鼻炎、过敏性哮喘的试剂盒的组成简单、检测方法简便易行，具有在节约医疗成本和血液标本的基础上快速、准确地诊断鼻炎、哮喘患者是否患有过敏性鼻炎、过敏性哮喘的特点。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

粒细胞群嗜碱性粒细胞的检测剂在制备用于诊断过敏性疾病的试剂盒中的应用，其中血液中增加的粒细胞群嗜碱性粒细胞数量是罹患过敏性疾病的指征。
根据权利要求1所述的应用，所述过敏性疾病包括过敏性鼻炎以及过敏性哮喘。
根据权利要求1或2所述的应用，所述粒细胞群嗜碱性粒细胞通过统计选自以下细胞亚群中的任一种的细胞数量占活白细胞的比例进行表征：

CCR3 ⁺细胞亚群、CCR3 ⁺CD63 ⁺细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-CD203c ⁺细胞亚群、CD123 ⁺HLA-DR ^-CD63 ⁺细胞亚群、CD49f ⁺细胞亚群。
根据权利要求1或2所述的应用，所述血液为离体样本。
根据权利要求1或2所述的应用，所述血液为外周血。
根据权利要求1或2所述的应用，所述检测剂为抗体。
根据权利要求6所述的应用，所述抗体具有可供检测的标记。
根据权利要求7所述的应用，所述可供检测的标记为荧光标记。
根据权利要求8所述的应用，所述荧光标记选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC、APC/Cy7、APC/H7、APC/R 700、BB 515、BB 700、BD IMag/DM、BUV 395、BUV 496、BUV 563、BUV 661、BUV 737、BUV 805、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 480、Brilliant Violet 510、Brilliant Blue 515、Brilliant Violet 570、Brilliant Violet 605、Brilliant Violet 650、Brilliant Violet 711、Brilliant Violet 750、Brilliant Violet785、Brilliant Violet 786、FITC、NA/LE、LEAF、Pacific Blue、PE、PE/CF594、PE/Cy5、PE/Cy7、PE/Dazzle、PerCP、PerCP/Cy5.5、V450和V500中的一种或多种。
根据权利要求1或2所述的应用，所述试剂盒中还包含选自FcR阻断剂、用于标记死细胞的染料、红细胞裂解液和细胞洗涤缓冲液中的一种或多种。
根据权利要求10所述的应用，所述用于标记死细胞的染料选自7-AAD、PI、DAPI、TO-PRO-3、Zombie Dyes和SYTOX中的一种或多种。