CN1430056A - 一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是涉及一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,主要包括如下步骤来实现:1)、对亲和吸附剂进行预处理:取一定量的亲和吸附剂,加入一定量的缓冲液,混匀、离心弃上清后待用;2)、亲和吸附处理:标本经稀释后,加入经过预处理的亲和吸附剂,在振荡器上振摇;3)、游离AFP测定:吸附后的标本经离心处理后,再到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP;4)、总AFP测定:标本经稀释后,直接到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP;5)、计算出每一标本AFP的结合率,即可获得各个AFP糖链异质体。本发明有益的效果是:亲和吸附法测定AFP异质体是一种适合临床诊断的方法,能在较短的时间内获得与现有方法相同或更好的结果,且有方法简便、结果可靠和测定成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及测定方法,尤其是一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法。
背景技术
自1970年Purves用淀粉胶电泳在肝癌患者血清中发现AFP异质体以来[3],许多人对此作了大量深入研究,AFP异质体分类及临床评价都有较大进展[4,5]。国内其测定方法主限于两种[6,7]:亲和交叉免疫电泳放射自显影法和亲和电泳免疫印迹法,这两种方法操作步骤繁多、时间长、结果的判断还需要特殊设备,这些大大限制了AFP异质体测定在临床的应用。齐为民等(2001年)提出了在亲和电泳后将凝胶上的一定位置切下[8],加入酶联免疫吸附剂(ELISA)测定,方法仍然繁琐且有一定随意性,会造成较大的变异。可以说,长期来AFP异质体测定缺乏适合临床使用的常规方法。
血清甲胎蛋白(AFP)测定已广泛被应用于肝癌的诊断。人们在发现了AFP存在糖链有差别的异质体后,就利用它们与不同植物凝集素的亲和性进行分类[1],例如,岩藻糖苷化的AFP亲和豌豆凝集素(LCA)称LCA-AFP-V,氨基葡萄糖化的亲和刀豆素A(ConA)称ConA-AFP-V。许多报道表明测定AFP的某些糖链异质体可明显提高肝癌实验室诊断的特异性和灵敏度。但是长期以来,国内只有少数临床实验室能够测定AFP异质体,只有少数城市能满足临床测定AFP异质体的要求。这主要归结于迄今为止的异质体测定方法对于技术的要求较高、操作繁琐、试剂昂贵。本研究力图建立一种适合临床实验室常规分析的AFP异质体测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种解决了AFP异质体测定中测定时间长、操作繁琐、
本发明解决其技术问题所采用的技术方案。这种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,主要包括如下步骤来实现:1)、对亲和吸附剂进行预处理:取一定量的亲和吸附剂,加入一定量的缓冲液,混匀、离心弃上清后待用;2)、亲和吸附处理:标本经稀释后,加入经过预处理的亲和吸附剂,在振荡器上振摇;3)、游离AFP测定:吸附后的标本经离心处理后,再到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP;4)、总AFP测定:标本经稀释后,直接到到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP;5)、计算出每一标本AFP的结合率,为总AFP减去吸附后的游离AFP,再除以总AFP,即可获得各个AFP糖链异质体。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案还可以进一步完善。所述的对亲和吸附剂进行预处理,取100μl的亲和吸附剂,加入0.5ml缓冲液1,混匀1min,离心弃上清后,加入1ml缓冲液2混匀10min,离心弃上清后,加入100μl缓冲液2待用。所述的亲和吸附为,标本用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L,吸取100μl加入经预处理的亲和吸附剂,在振荡器上振摇(400r/min)20min。所述的游离AFP测定为,吸附后的标本经2000 r/min离心5min,再到ACS:180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP。所述的总AFP测定,用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L的标本中取100μl,加入缓冲液2后到ACS:180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP。
所述的缓冲液1为:0.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl),pH7.6。所述的缓冲液2:0.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl),pH7.6,再加入1mmol/LMgCl2,1mmol/L CaCl2,1mmol/L MnCl2。所述亲和剂为,扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil Lectin Sepharose 4B)。所述亲和剂为,刀豆凝集素A(ConA)Sepharose 4B(Concanavalin A-Sepharose 4B)。或者E-PHC或者其他外源性凝集素。
亲和吸附法测定AFP异质体的原理:所有测定AFP异质体的方法都是根据AFP异质体对植物凝集素,包括小扁豆凝集素(LCA)或刀豆素(ConA),的结合能力的不同而鉴别之,本方法也不例外。我们将用于亲和色谱的层析柱填料用作固相吸附剂。我们的实验证明,本文所用的ConA-Sepharose 4B和LCASepharose 4B都能有效地吸附各自亲和的AFP异质体,且AFP浓度在大约90μg/L时即基本达到平衡、可比较完全地被吸附,我们根据实验数据选择将样品稀释到AFP浓度大约50μg/L,这样就能保证从样品中基本除去该植物凝集素亲和的AFP异质体。经过吸附的样品中,只存在未被植物凝集素结合的AFP,就可以用目前临床实验室通用的化学发光免疫分析等方法测定。同一标本的未吸附样品可同时测得“总”AFP,经计算即得到相应AFP异质体的百分含量和浓度。
本发明有益的效果是:本方法能在50分钟内得出结果,灵敏度为0.1μg/L,CV可达8.3%,本法与亲和电泳免疫印迹法比较结果高度相关(r=0.895)。本文对41例肝癌、58例慢性肝病等的临床应用表明,本方法获得的结果与文献基本相符。亲和吸附法测定AFP异质体是一种适合临床诊断的方法,能在较短的时间内获得与现有方法相同或更好的结果,且有方法简便、结果可靠和测定成本低等优点。本方法介绍的AFP异质体测定是一种可靠和经济的方法。测定的条件经过优化后,测定时间仅需50-60min,预计测定成本60元左右,与和光公司的AFP-L3体外诊断试剂相比较,结果表明这两种方法显著相关(r=0.895,P<0.01水平)。和光公司的AFP-L3体外诊断试剂相当昂贵(每人份测定费在300元人民币以上),一般临床诊断实验室无法承受,测定时间也需要4-6小时,且测定步骤多(主要包括亲和电泳、抗体亲和印迹、免疫反应、酶联免疫反应、显色和光密度扫描测定)。我们的方法可以将实验室内现有的任何一种AFP测定“升级”为AFP异质体的测定。
附图说明:
图1是本发明的方法与亲和电泳免疫印迹法测定AFP异质体结果比较;
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
材料与方法:
一、标本58例各类慢性肝病(经临床且结合B超、CT、免疫测定诊断,(男性52例,女性6例,年龄26-68岁,均来自杭州市传染病医院),42例原发性肝癌(男性37例,女性5例,年龄26-72岁,来自本院、浙江省肿瘤医院和杭州市传染病医院)。32例正常孕妇(均来自本院)。
二、试剂
1、缓冲液1:0.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl),pH7.6
2、缓冲液2:0.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl),pH7.6,再加入1mmol/L MgCl2,1mmol/L CaCl2,1mmol/L MnCl2
3、扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil Lectin Sepharose 4B),CodeNo.17-0444-01,lot.290573,est exp 2004.08,Pharmacia Biotech.
4、刀豆凝集素A(ConA)Sepharose 4B(Concanavalin A-Sepharose 4B),Code No.c-9017,lot.22K1480,Sigma
5、AFP化学发光免疫试剂,ACS:180配套,Beyer
6、AFP-L3体外诊断用,AFP Differentiation Kit L,Code No.413-52101,lot.MQ403,est exp 2003.02,和光纯药工业株式会社
7、统计方法:主要采用Microsoft Excel和SPSS 10.0统计软件。三、仪器
1、ACS:180SE化学发光免疫分析仪,Beyer
2、EDAS290数码图像分析系统,Kodak
这种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,主要包括如下步骤来实现:(1)亲和吸附剂预处理,分别取100μl的亲和吸附剂(LCA Sepharose 4B和ConA-Sepharose 4B),加入0.5ml缓冲液1,混匀1min,离心弃上清后,加入1ml缓冲液2混匀10min,离心弃上清后,加入100μl缓冲液2待用;(2)亲和吸附,标本用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L,吸取100μl分别加入经预处理的这两种亲和吸附剂,在振荡器上振摇(200r/min)20min;(3)游离AFP测定,吸附后的标本经2000r/min离心5min,再到ACS:180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP;(4)总AFP测定,同时从每份用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L的标本中取100μl,加入缓冲液2后到ACS:180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP;(5)每一标本AFP的LCA(或ConA)结合率=(总AFP-吸附后的游离AFP)/总AFP×100%,即可获得各个AFP糖链异质体。
本方法的测定精度:取一份标本分别连续测定20次,LCA游离AFP的CV为8.3%(均值11.9μg/L)和ConA游离AFP的CV为13.3%(均值5.3μg/L)。本方法的测定灵敏度:AFP测定的试剂盒的最低检测浓度为0.9μg/L。本方法与亲和电泳免疫印迹法的比较:对35份样品同时用本方法测定亲和LTA的AFP异质体(LCA-AFP-V%)及电泳免疫印迹法测定AFP-L3(%),进行比较,结果见图1。用SPSS10.0统计软件进行相关性分析,结果表明这两种方法显著相关(r=0.895,P<0.01水平)。
部分病例AFP异质体测定结果的分析:本文对来自41例肝癌、58例AFP高于正常的各类慢性肝炎和32例妊娠的标本用化学发光免疫法测定了总AFP,用本文介绍的方法测定了AFP异质体(AFP-ConA-V和AFP-LCA-V)百分浓度,并计算了后两者的绝对浓度以及两者的比值(L/C)。以总AFP大于300μg/L为阳性,经卡方检验,肝癌的阳性率与比慢性肝病高(x2=3.84,P=0.05);经t检验,AFP-ConA-V%在这两种疾病中差别不大(t=2.0,P>0.05);以AFP-LCA-V%大于25%为阳性,经卡方检验,肝癌的阳性率显著高于慢性肝病(x2=5.1,P<0.001),但它与妊娠差异不大(x2=0.46,P>0.5);L/C是AFP-LCA-V与AFP-ConA-V之比,经t检验,肝癌与慢性肝病的差异明显(t=5.35,P<0.001),但它与妊娠差异不大(t=0.00,P>0.5)。
表2部分病例AFP及其异质体测定结果的分析
分组 | n | AFP μg/L | AFP-ConA-V% | AFP-LCA-V% | AFP-ConA-Vμg/L | AFP-LCA-Vμg/L | **L/C | |||||||
均值 | *阳性率% | 均值 | S | 均值 | S | 阳性率% | 均值 | S | 均值 | S | 均值 | S | ||
肝癌 | 41 | 16223.6 | 80.0 | 62.7 | 14 | 31.7 | 8.1 | 80.0 | 11076 | 16342.5 | 5263 | 9202.7 | 0.51 | 0.17 |
慢性肝病 | 58 | 817.6 | 62.1 | 67.3 | 8.5 | 23.9 | 7.0 | 44.8 | 565.9 | 534.3 | 207 | 199.1 | 0.36 | 0.11 |
妊娠 | 32 | 226.4 | 21.9 | 64.8 | 11 | 32.8 | 10.5 | 85.7 | 144.9 | 98.4 | 86.9 | 94.9 | 0.51 | 0.21 |
我们初步应用本方法在临床中的发现:我们对41例临床诊断为肝癌、58例各种其他慢性肝病的血清标本,用本法测定了AFP-ConA-V和AFP-LCA-V两种异质体,同时还比较了血清“总”AFP,以及22例孕妇的结果,这些数据与大多数文献(近年的国外文献)报道相符[4,5,9]。根据我们的观察,肝癌患者的血清AFP平均值比良性病变要高出两个数量级,大于300μg/L的阳性率为80%也高于慢性肝病患者,后者中其实有相当数量的“候补”的肝癌患者;同文献报道的一样,本法测定的AFP-LCA-V的百分率和绝对值、以及AFP-LCA-V和AFP-ConA-V(L/C)的比值都能很好地用于从慢性肝病中鉴别肝癌,即这两种疾病中都有显著差异(P<0.001))。我们发现,正常孕妇的AFP异质体百分含量和L/C比值都与肝癌患者相近,但绝对浓度较低。
Claims (9)
1、一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征是,主要包括如下步骤来实现:1)、对亲和吸附剂进行预处理:取一定量的亲和吸附剂,加入一定量的缓冲液,混匀、离心弃上清后待用;2)、亲和吸附处理:标本经稀释后,加入经过预处理的亲和吸附剂,在振荡器上振摇;3)、游离AFP测定:吸附后的标本经离心处理后,再到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP;4)、总AFP测定:标本经稀释后,直接到到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP;5)、计算出每一标本AFP的结合率,为总AFP减去吸附后的游离AFP,再除以总AFP,即可获得各个AFP糖链异质体。
2、根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征在于:所述的对亲和吸附剂进行预处理,取100μl的亲和吸附剂,加入0.5ml缓冲液1,混匀1min,离心弃上清后,加入1ml缓冲液2混匀10min,离心弃上清后,加入100μl缓冲液2待用。
3、根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征在于:所述的亲和吸附为,标本用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L,吸取100μl加入经预处理的亲和吸附剂,在振荡器上振摇(200r/min)20min。
4、根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征在于:所述的游离AFP测定为,吸附后的标本经2000r/min离心5min,再到ACS:180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP。
5、根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征在于:所述的总AFP测定,用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L的标本中取100μl,加入缓冲液2后到ACS:180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP。
6、根据权利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征在于:所述的缓冲液1为:0.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/LNaCl)pH7.6。
7、根据权利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征在于:所述的缓冲液2:0.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl),pH7.6,再加入1mmol/L MgCl2,1mmol/L CaCl2,1mmol/L MnCl2。
8、根据权利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征在于:所述亲和剂为,扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil LectinSepharose 4B)。
9、根据权利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法,其特征在于:所述亲和剂为,刀豆凝集素A(ConA)Sepharose4B(Concanavalin A-Sepharose 4B)。
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