CN1430056A - 一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法 - Google Patents

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本发明是涉及一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，主要包括如下步骤来实现：1)、对亲和吸附剂进行预处理：取一定量的亲和吸附剂，加入一定量的缓冲液，混匀、离心弃上清后待用；2)、亲和吸附处理：标本经稀释后，加入经过预处理的亲和吸附剂，在振荡器上振摇；3)、游离AFP测定：吸附后的标本经离心处理后，再到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP；4)、总AFP测定：标本经稀释后，直接到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP；5)、计算出每一标本AFP的结合率，即可获得各个AFP糖链异质体。本发明有益的效果是：亲和吸附法测定AFP异质体是一种适合临床诊断的方法，能在较短的时间内获得与现有方法相同或更好的结果，且有方法简便、结果可靠和测定成本低等优点。

Description

一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法
                       技术领域
本发明涉及测定方法，尤其是一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法。
                       背景技术
自1970年Purves用淀粉胶电泳在肝癌患者血清中发现AFP异质体以来[3]，许多人对此作了大量深入研究，AFP异质体分类及临床评价都有较大进展[4，5]。国内其测定方法主限于两种[6，7]：亲和交叉免疫电泳放射自显影法和亲和电泳免疫印迹法，这两种方法操作步骤繁多、时间长、结果的判断还需要特殊设备，这些大大限制了AFP异质体测定在临床的应用。齐为民等(2001年)提出了在亲和电泳后将凝胶上的一定位置切下[8]，加入酶联免疫吸附剂(ELISA)测定，方法仍然繁琐且有一定随意性，会造成较大的变异。可以说，长期来AFP异质体测定缺乏适合临床使用的常规方法。
血清甲胎蛋白(AFP)测定已广泛被应用于肝癌的诊断。人们在发现了AFP存在糖链有差别的异质体后，就利用它们与不同植物凝集素的亲和性进行分类[1]，例如，岩藻糖苷化的AFP亲和豌豆凝集素(LCA)称LCA-AFP-V，氨基葡萄糖化的亲和刀豆素A(ConA)称ConA-AFP-V。许多报道表明测定AFP的某些糖链异质体可明显提高肝癌实验室诊断的特异性和灵敏度。但是长期以来，国内只有少数临床实验室能够测定AFP异质体，只有少数城市能满足临床测定AFP异质体的要求。这主要归结于迄今为止的异质体测定方法对于技术的要求较高、操作繁琐、试剂昂贵。本研究力图建立一种适合临床实验室常规分析的AFP异质体测定方法。
                       发明内容
本发明的目的是提供一种解决了AFP异质体测定中测定时间长、操作繁琐、
本发明解决其技术问题所采用的技术方案。这种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，主要包括如下步骤来实现：1)、对亲和吸附剂进行预处理：取一定量的亲和吸附剂，加入一定量的缓冲液，混匀、离心弃上清后待用；2)、亲和吸附处理：标本经稀释后，加入经过预处理的亲和吸附剂，在振荡器上振摇；3)、游离AFP测定：吸附后的标本经离心处理后，再到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP；4)、总AFP测定：标本经稀释后，直接到到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP；5)、计算出每一标本AFP的结合率，为总AFP减去吸附后的游离AFP，再除以总AFP，即可获得各个AFP糖链异质体。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案还可以进一步完善。所述的对亲和吸附剂进行预处理，取100μl的亲和吸附剂，加入0.5ml缓冲液1，混匀1min，离心弃上清后，加入1ml缓冲液2混匀10min，离心弃上清后，加入100μl缓冲液2待用。所述的亲和吸附为，标本用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L，吸取100μl加入经预处理的亲和吸附剂，在振荡器上振摇(400r/min)20min。所述的游离AFP测定为，吸附后的标本经2000 r/min离心5min，再到ACS：180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP。所述的总AFP测定，用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L的标本中取100μl，加入缓冲液2后到ACS：180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP。
所述的缓冲液1为：0.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6。所述的缓冲液2：0.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6，再加入1mmol/LMgCl2，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MnCl2。所述亲和剂为，扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil Lectin Sepharose 4B)。所述亲和剂为，刀豆凝集素A(ConA)Sepharose 4B(Concanavalin A-Sepharose 4B)。或者E-PHC或者其他外源性凝集素。
亲和吸附法测定AFP异质体的原理：所有测定AFP异质体的方法都是根据AFP异质体对植物凝集素，包括小扁豆凝集素(LCA)或刀豆素(ConA)，的结合能力的不同而鉴别之，本方法也不例外。我们将用于亲和色谱的层析柱填料用作固相吸附剂。我们的实验证明，本文所用的ConA-Sepharose 4B和LCASepharose 4B都能有效地吸附各自亲和的AFP异质体，且AFP浓度在大约90μg/L时即基本达到平衡、可比较完全地被吸附，我们根据实验数据选择将样品稀释到AFP浓度大约50μg/L，这样就能保证从样品中基本除去该植物凝集素亲和的AFP异质体。经过吸附的样品中，只存在未被植物凝集素结合的AFP，就可以用目前临床实验室通用的化学发光免疫分析等方法测定。同一标本的未吸附样品可同时测得“总”AFP，经计算即得到相应AFP异质体的百分含量和浓度。
本发明有益的效果是：本方法能在50分钟内得出结果，灵敏度为0.1μg/L，CV可达8.3％，本法与亲和电泳免疫印迹法比较结果高度相关(r＝0.895)。本文对41例肝癌、58例慢性肝病等的临床应用表明，本方法获得的结果与文献基本相符。亲和吸附法测定AFP异质体是一种适合临床诊断的方法，能在较短的时间内获得与现有方法相同或更好的结果，且有方法简便、结果可靠和测定成本低等优点。本方法介绍的AFP异质体测定是一种可靠和经济的方法。测定的条件经过优化后，测定时间仅需50-60min，预计测定成本60元左右，与和光公司的AFP-L3体外诊断试剂相比较，结果表明这两种方法显著相关(r＝0.895，P＜0.01水平)。和光公司的AFP-L3体外诊断试剂相当昂贵(每人份测定费在300元人民币以上)，一般临床诊断实验室无法承受，测定时间也需要4-6小时，且测定步骤多(主要包括亲和电泳、抗体亲和印迹、免疫反应、酶联免疫反应、显色和光密度扫描测定)。我们的方法可以将实验室内现有的任何一种AFP测定“升级”为AFP异质体的测定。
                         附图说明：
图1是本发明的方法与亲和电泳免疫印迹法测定AFP异质体结果比较；
                         具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
材料与方法：
一、标本58例各类慢性肝病(经临床且结合B超、CT、免疫测定诊断，(男性52例，女性6例，年龄26-68岁，均来自杭州市传染病医院)，42例原发性肝癌(男性37例，女性5例，年龄26-72岁，来自本院、浙江省肿瘤医院和杭州市传染病医院)。32例正常孕妇(均来自本院)。
二、试剂
1、缓冲液1：0.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6
2、缓冲液2：0.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6，再加入1mmol/L MgCl2，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MnCl2
3、扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil Lectin Sepharose 4B)，CodeNo.17-0444-01，lot.290573，est exp 2004.08，Pharmacia Biotech.
4、刀豆凝集素A(ConA)Sepharose 4B(Concanavalin A-Sepharose 4B)，Code No.c-9017，lot.22K1480，Sigma
5、AFP化学发光免疫试剂，ACS：180配套，Beyer
6、AFP-L3体外诊断用，AFP Differentiation Kit L，Code No.413-52101，lot.MQ403，est exp 2003.02，和光纯药工业株式会社
7、统计方法：主要采用Microsoft Excel和SPSS 10.0统计软件。三、仪器
1、ACS：180SE化学发光免疫分析仪，Beyer
2、EDAS290数码图像分析系统，Kodak
这种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，主要包括如下步骤来实现：(1)亲和吸附剂预处理，分别取100μl的亲和吸附剂(LCA Sepharose 4B和ConA-Sepharose 4B)，加入0.5ml缓冲液1，混匀1min，离心弃上清后，加入1ml缓冲液2混匀10min，离心弃上清后，加入100μl缓冲液2待用；(2)亲和吸附，标本用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L，吸取100μl分别加入经预处理的这两种亲和吸附剂，在振荡器上振摇(200r/min)20min；(3)游离AFP测定，吸附后的标本经2000r/min离心5min，再到ACS：180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP；(4)总AFP测定，同时从每份用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L的标本中取100μl，加入缓冲液2后到ACS：180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP；(5)每一标本AFP的LCA(或ConA)结合率＝(总AFP-吸附后的游离AFP)/总AFP×100％，即可获得各个AFP糖链异质体。
本方法的测定精度：取一份标本分别连续测定20次，LCA游离AFP的CV为8.3％(均值11.9μg/L)和ConA游离AFP的CV为13.3％(均值5.3μg/L)。本方法的测定灵敏度：AFP测定的试剂盒的最低检测浓度为0.9μg/L。本方法与亲和电泳免疫印迹法的比较：对35份样品同时用本方法测定亲和LTA的AFP异质体(LCA-AFP-V％)及电泳免疫印迹法测定AFP-L3(％)，进行比较，结果见图1。用SPSS10.0统计软件进行相关性分析，结果表明这两种方法显著相关(r＝0.895，P＜0.01水平)。
部分病例AFP异质体测定结果的分析：本文对来自41例肝癌、58例AFP高于正常的各类慢性肝炎和32例妊娠的标本用化学发光免疫法测定了总AFP，用本文介绍的方法测定了AFP异质体(AFP-ConA-V和AFP-LCA-V)百分浓度，并计算了后两者的绝对浓度以及两者的比值(L/C)。以总AFP大于300μg/L为阳性，经卡方检验，肝癌的阳性率与比慢性肝病高(x2＝3.84，P＝0.05)；经t检验，AFP-ConA-V％在这两种疾病中差别不大(t＝2.0，P＞0.05)；以AFP-LCA-V％大于25％为阳性，经卡方检验，肝癌的阳性率显著高于慢性肝病(x2＝5.1，P＜0.001)，但它与妊娠差异不大(x2＝0.46，P＞0.5)；L/C是AFP-LCA-V与AFP-ConA-V之比，经t检验，肝癌与慢性肝病的差异明显(t＝5.35，P＜0.001)，但它与妊娠差异不大(t＝0.00，P＞0.5)。
                 表2部分病例AFP及其异质体测定结果的分析
分组 n   AFP          μg/L AFP-ConA-V％   AFP-LCA-V％ AFP-ConA-Vμg/L AFP-LCA-Vμg/L       **L/C
均值 *阳性率％ 均值 S 均值 S 阳性率％ 均值 S 均值 S 均值 S
  肝癌   41   16223.6     80.0   62.7   14   31.7   8.1   80.0   11076   16342.5   5263   9202.7   0.51   0.17
  慢性肝病   58   817.6     62.1   67.3   8.5   23.9   7.0   44.8   565.9   534.3   207   199.1   0.36   0.11
  妊娠   32   226.4     21.9   64.8   11   32.8   10.5   85.7   144.9   98.4   86.9   94.9   0.51   0.21
我们初步应用本方法在临床中的发现：我们对41例临床诊断为肝癌、58例各种其他慢性肝病的血清标本，用本法测定了AFP-ConA-V和AFP-LCA-V两种异质体，同时还比较了血清“总”AFP，以及22例孕妇的结果，这些数据与大多数文献(近年的国外文献)报道相符[4，5，9]。根据我们的观察，肝癌患者的血清AFP平均值比良性病变要高出两个数量级，大于300μg/L的阳性率为80％也高于慢性肝病患者，后者中其实有相当数量的“候补”的肝癌患者；同文献报道的一样，本法测定的AFP-LCA-V的百分率和绝对值、以及AFP-LCA-V和AFP-ConA-V(L/C)的比值都能很好地用于从慢性肝病中鉴别肝癌，即这两种疾病中都有显著差异(P＜0.001))。我们发现，正常孕妇的AFP异质体百分含量和L/C比值都与肝癌患者相近，但绝对浓度较低。

Claims (9)

1、一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征是，主要包括如下步骤来实现：1)、对亲和吸附剂进行预处理：取一定量的亲和吸附剂，加入一定量的缓冲液，混匀、离心弃上清后待用；2)、亲和吸附处理：标本经稀释后，加入经过预处理的亲和吸附剂，在振荡器上振摇；3)、游离AFP测定：吸附后的标本经离心处理后，再到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP；4)、总AFP测定：标本经稀释后，直接到到化学发光分析仪上测定上清液中的AFP；5)、计算出每一标本AFP的结合率，为总AFP减去吸附后的游离AFP，再除以总AFP，即可获得各个AFP糖链异质体。
2、根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征在于：所述的对亲和吸附剂进行预处理，取100μl的亲和吸附剂，加入0.5ml缓冲液1，混匀1min，离心弃上清后，加入1ml缓冲液2混匀10min，离心弃上清后，加入100μl缓冲液2待用。
3、根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征在于：所述的亲和吸附为，标本用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L，吸取100μl加入经预处理的亲和吸附剂，在振荡器上振摇(200r/min)20min。
4、根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征在于：所述的游离AFP测定为，吸附后的标本经2000r/min离心5min，再到ACS：180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP。
5、根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征在于：所述的总AFP测定，用缓冲液2稀释至AFP大约50μg/L的标本中取100μl，加入缓冲液2后到ACS：180化学发光分析仪上测定上清液中的AFP。
6、根据权利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征在于：所述的缓冲液1为：0.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/LNaCl)pH7.6。
7、根据权利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征在于：所述的缓冲液2：0.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6，再加入1mmol/L MgCl2，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MnCl2。
8、根据权利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征在于：所述亲和剂为，扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil LectinSepharose 4B)。
9、根据权利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法，其特征在于：所述亲和剂为，刀豆凝集素A(ConA)Sepharose4B(Concanavalin A-Sepharose 4B)。
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