CN109187983B - 中孕期母血清甲胎蛋白异质体l2和l3筛查胎儿开放性神经管畸形的方法 - Google Patents

中孕期母血清甲胎蛋白异质体l2和l3筛查胎儿开放性神经管畸形的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中孕期母血清甲胎蛋白异质体L2和L3筛查胎儿开放性神经管畸形(ONTD)的方法，该方法包括如下步骤：(1)、经超声影像学确诊为ONTD胎儿的多个孕妇构成病例组，随机抽取胎儿发育正常的多个孕妇构成对照组；(2)、采用酶联免疫法检测两组孕妇血清的AFP‑L2和AFP‑L3水平，并对中孕期妇女血清中AFP‑L2、AFP‑L3水平与胎儿ONTD的相关性进行统计学处理，以及不同构建的风险计算模型的筛查效率进行分析；(3)、根据ROC曲线计算出AFP‑L2、AFP‑L3筛查ONTD胎儿的最佳临界值、曲线下面积。本发明的有益效果为：中孕期母血清AFP‑L2和AFP‑L3的筛查ONTD胎儿具有较高的灵敏度和特异度，是筛查ONTD的较好标志物，使用AFP‑L2和AFP‑L3联合构建的风险计算模型比单独使用AFP、AFP‑L2、AFP‑L3对应MoM值筛查有更好的筛查效率。

Description

中孕期母血清甲胎蛋白异质体L2和L3筛查胎儿开放性神经管 畸形的方法
技术领域
本发明涉及医学检测领域，主要是一种中孕期母血清甲胎蛋白异质体L2和L3筛查胎儿开放性神经管畸形的方法。
背景技术
神经管畸形(Neural tube defects，NTD)是在胚胎发生过程中神经管闭合不全引起的一种严重的先天性出生缺陷性疾病，是环境和遗传共同作用的结果，在新生儿中的发病率为1‰[1]。根据受累的神经组织是否暴露于体表，分开放性神经管畸形(Open neuraltube defects，ONTD)和闭合性神经管畸形，其中ONTD比较常见，包括开放性脊柱裂、无脑儿和脑膨出，依据其缺陷的部位和严重程度而临床表现不同[2-3]。目前，中孕期(15～20+6周)血清学ONTD产前筛查，主要是筛查开放性脊柱裂、无脑儿和脑膨出这3种类型的ONTD，是通过定量测定母血中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)结合孕妇的孕周、末次月经、体重、年龄参数，并运用电脑统计分析软件计算出孕妇怀有ONTD胎儿的风险[4－6]。AFP作为唐氏综合征和ONTD产前筛查中主要标志物之一已经常规开展[7-8]。血清中AFP与小扁豆素(lensculinarisagglutinin，LCA)结合后，经电泳分成三带，依次命名为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，即LCA非结合型(AFP-L1、AFP-L2)和LCA结合型(AFP-L3)[9]。通常把与小扁豆素结合的AFP-L3称为AFP异质体，它是新一代的肿瘤标志物[10]。目前，已有血清AFP-L3筛查唐氏综合征方面的报道[11-14]以及检测孕妇羊水中甲胎蛋白异质体来诊断胎儿ONTD和脐膨出等方面的研究[15-17]，但尚未见母血清AFP-L2和AFP-L3筛查ONTD方面的报导。
本研究前期工作中遇到AFP筛查ONTD筛查效率不理想，中孕期母血清二联法(AFP和freeβ-HCG)采用Risks 2T产筛分析软件筛查胎儿无脑儿、脊柱裂、脑膨出的检出率为52.63％(10/19)、53.33％(32/60)、39.13％(9/23)[7]；而二联法采用LifeCycle 4.0产筛分析软件分别对46 089例和180 006例孕妇血清学产前筛查ONTD，其筛查灵敏度分别为0[18]和38.46％[19]。因此，急需寻找新的ONTD标志物，以提高ONTD产前筛查效率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种中孕期母血清甲胎蛋白异质体L2和L3筛查胎儿开放性神经管畸形的方法，采用病例对照的研究方法，选择61例健康胎儿孕妇和23例产前诊断为ONTD胎儿的孕妇作为研究对象，探讨母血清AFP-L2和AFP-L3水平与ONTD胎儿之间的关系及筛查效率。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种中孕期母血清甲胎蛋白异质体L2和L3筛查胎儿开放性神经管畸形的方法，该方法包括如下步骤：
(1)经超声影像学确诊为ONTD胎儿的多个孕妇构成病例组，随机抽取胎儿发育正常的多个孕妇构成对照组；
(2)采用酶联免疫法检测两组孕妇血清的AFP-L2和AFP-L3水平，使用AFP-L2、AFP-L3构建的风险计算模型，根据ROC曲线计算出AFP-L2、AFP-L3筛查ONTD胎儿的最佳临界值、曲线下面积；
(3)检测时，采用酶联免疫法检测待测孕妇血清的AFP-L2和AFP-L3水平，使用AFP-L2、AFP-L3构建的风险计算模型进行筛查。
本发明的有益效果为：中孕期母血清AFP-L2和AFP-L3的筛查ONTD胎儿具有较高的灵敏度和特异度，是筛查ONTD的较好标志物，使用AFP-L2和AFP-L3联合构建的风险计算模型比单独使用AFP、AFP-L2、AFP-L3对应MoM值筛查有更好的筛查效率。
附图说明
图1为AFP、AFP-L2、AFP-L3MoM值分布柱形图。
图2为AFP、AFP-L2、AFP-L3对应MoM值单截断及AFP-L2、AFP-L3二联风险计算模型筛查ONTD的ROC曲线。
图3为AFP MoM单截断值筛查效果图。
图4为AFP-L2 MoM单截断值筛查效果图。
图5为AFP-L3 MoM单截断值筛查效果图。
图6为AFP-L2、AFP-L3二联风险计算模型筛查效果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明做详细的介绍：
实施例：这种中孕期母血清甲胎蛋白异质体L2和L3筛查胎儿开放性神经管畸形(ONTD)的方法，该方法包括如下步骤：
(1)经超声影像学确诊为ONTD胎儿的多个孕妇构成病例组，随机抽取胎儿发育正常的多个孕妇构成对照组。
(2)采用酶联免疫法检测两组孕妇血清的AFP-L2和AFP-L3水平，并对中孕期妇女血清中AFP-L2、AFP-L3水平与胎儿ONTD的相关性进行统计学处理，以及不同构建的风险计算模型的筛查效率进行分析。
(3)根据ROC曲线计算出AFP-L2、AFP-L3筛查ONTD胎儿的最佳临界值、曲线下面积。
(4)检测时，采用酶联免疫法检测待测孕妇血清的AFP-L2和AFP-L3水平，使用AFP-L2、AFP-L3构建的风险计算模型进行筛查，当待测孕妇血清的AFP-L2和AFP-L3水平超过设定的阀值，则判定待测孕妇的胎儿开放性神经管畸形。
本发明的机理及实验：
1对象与方法
1.1对象
采用病例对照研究方法，回顾性分析2007年10月至2016年9月来自杭州市妇产科医院(杭州市妇幼保健院)和杭州市余杭区妇幼保健院2家产前筛查门诊、妊娠15～20+6周的单胎孕妇。根据有无胎儿ONTD将研究对象分为病例组和对照组，纳入病例组是指经超声影像学确诊为ONTD胎儿的孕妇共23例(16例脊柱裂，5例无脑儿，2例脑膨出)，对照组为随机抽取同时期胎儿发育正常的孕妇61例。病例组孕妇的年龄小于对照组，病例组和对照组孕天及体质量差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。
1.2诊断和排除标准
1.2.1病例诊断依据中国出生缺陷监测网制订的诊断标准[20]进行：NTD根据受累的神经组织是否暴露于体表，分ONTD和闭合性神经管畸形，其中ONTD比较常见，包括开放性脊柱裂、无脑儿和脑膨出，依据其缺陷的部位和严重程度而临床表现不同[2-3，20]。
1.2.2排除标准：①双胎、多胎妊娠；②合并其他内科疾病如胰岛素依赖性糖尿病及严重妊娠并发症；③吸烟；④试管婴儿；⑤随访结果为21三体、18三体、13三体以及其他出生缺陷；⑥资料信息不全者；⑦孕妇信息与血清标本不匹配者。
1.3检测试剂和仪器2家筛查机构统一使用1235 Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪(美国PerkinElmer公司)进行检测，配套双标记试剂盒(AFP/freeβ-HCG)、增强液、洗液、质标品和标准品(美国PerkinElmer公司)，在各定点医院抽取空腹外周静脉血2～3ml，30min后分离血清标本并保存于2～8℃冰箱，于1周内送检，筛查指标为AFP和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(freeβsubunit of human chorionic gonadotropin，freeβ-HCG)。测定方法采用时间分辨荧光免疫(DELFIA)法，检测步骤按说明书进行，产前筛查检测结束后多余血清标本储存于－80℃冰箱保存。人甲胎蛋白异质体(AFP-L2和AFP-L3)检测，应用RT-6100酶标仪(美国Rayto公司)，988洗板机(北京Tianshi公司)；AFP-L2(美国BIM公司,批号：B170658)和AFP-L3试剂(美国BIM公司,批号：B160785)。检测前将病例组和对照组的信息资料与储存的血清标本进行匹配，并血清标本进行低温离心混匀和批量检测，采用采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测AFP-L2和AFP-L3浓度，建模分析时以中位数倍数(multiple of Median,MoM)表示所测量的AFP、freeβ-hCG、AFP-L2和AFP-L3水平。
1.4妊娠结局随访每位筛查对象均在新生儿出生前后进行三级网络随访，对孕期发生自然流产、死胎或死产的胎儿进行相关检查以确诊，并对新生儿进行常规体格检查。按照《中国出生缺陷监测方案》填报《出生缺陷儿登记卡》，出生缺陷诊断按国际疾病分类标准(International Statistical Classification of Diseases and Related HealthProblems,Tenth Revision，ICD-10)[21]。
1.5建立不同模型对ONTD筛查效率进行比较通过AFP-L2、AFP-L3多指标以建立模型形式对ONTD筛查效率比较分析，使用AFP-L2、AFP-L3构建的风险计算模型相比于原单独使用AFP MoM值作为单截断的方式有更好的筛查效率。其中MoM值计算：AFP浓度值中位数方程的计算采用杭州市妇产科医院2017年中孕期母血清样本共21656例的AFP值。拟合优度R方＝0.9628，拟合效果良好。中位数方程为中位数方程为:
log10(AFP)＝1.149127+0.0002336289*GA+0.00002.828739*GA2
采用所有对照样本的各指标中位数作为计算MoM值的中位数指标，相当于常数方程。使用所得的中位数方程及中位数计算MoM之后，ONTD样本与对照样本各指标MoM值柱形对比图如图1所示。
AFP-L2、AFP-L3的MoM值服从多元正态分布f(AFP-L2MoM,AFP-L3MoM),按照风险计算模型的建模方法[22]，可以计算得出各指标分布的对应参数，模型通过计算分布似然作为ONTD风险。使用相同的原理分别构建四个模型：模型一：AFP单联；模型二：AFP-L2单联；模型三：AFP-L3单联；模型四：AFP-L2、AFP-L3二联。为了体现出AFP-L2、AFP-L3对筛查效率提升的可能性，所选实验样本的ONTD样本中，有一半为漏筛样本，以AFP≥2.5MoM作为单值截断时，ONTD样本漏筛率为52.38％。
1.6统计学处理应用Excel 2007软件建立检测结果数据库，以IBM SPSS 21.0软件进行统计学处理，数据正态性检验采用One-sample Kolmogorov-Smirnov检验，正态分布数据采用均数±标准差
Figure BDA0001761182590000044
表示，病例组和对照组间AFP-L2和AFP-L3水平等比较，采用独立样本t检验，绘制受试者工作特征(ROC)曲线，使用Python语言进行ROC分析与最佳切值计算[23]，并计算AFP-L2和AFP-L3的最佳临界值、曲线下面积(AUC)、约登指数；利用Python语言，基于贝叶斯定理，通过AFP-L2、AFP-L3多指标建立多元正态概率模型形式对ONTD筛查效率比较分析[22]。P<0.05为差异有统计学意义。
表1 各组基线数据比较
Figure BDA0001761182590000041
注：ONTD是指开放性神经管畸形
2结果
2.1两组血清AFP-L2和AFP-L3水平比较两组血清AFP-L2水平比较：孕有ONTD胎儿的孕妇的AFP-L2水平为7.68±3.62(6.12～9.25)ng/mL，高于对照组的3.62±1.63(3.20～4.04)ng/mL，差异有统计学意义(t＝5.182,P<0.001)。孕有ONTD胎儿的孕妇AFP-L3水平为2.90±1.48(2.26～3.54)ng/mL，高于对照组的0.84±0.59(0.68～0.99)ng/mL，差异有统计学意义，(t＝6.500,P<0.001)，见表2。
表2 ONTD与对照组中孕期血清AFP-L2、AFP-L3水平比较
Figure BDA0001761182590000042
注：AFP是指甲胎蛋白；freeβ-HCG是指游离人绒毛膜促性腺激素β亚基；AFP-L2是指甲胎蛋白异质体L2；AFP-L3是指甲胎蛋白异质体L3；ONTD是指开放性神经管畸形
2.2AFP-L2和AFP-L3单独筛查ONTD胎儿的价值AFP-L2筛查ONTD胎儿的AUC为0.856(95％CI:0.730～0.954，P<0.001)。AFP-L3筛查ONTD胎儿的AUC为0.914(95％CI:0.829～0.982，P<0.001)。根据ROC曲线计算出AFP-L2、AFP-L3筛查ONTD胎儿的最佳临界值分别为：1.563MOM、1.676MOM,此时的敏感度、特异度、约登指数分别为：73.90％、96.70％、0.706；82.60％、86.90％、0.695。见表3和见图2。
表3 AFP、AFP-L2、AFP-L3单独筛查和联合筛查ONTD价值
Figure BDA0001761182590000043
注：AFP是指甲胎蛋白；AFP-L2是指甲胎蛋白异质体L2；AFP-L3是指甲胎蛋白异质体L3
2.3AFP-L2和AFP-L3联合筛查ONTD胎儿的价值如以AFP-L2、AFP-L3替代AFP并通过AFP-L2、AFP-L3多指标以建立模型形式对ONTD筛查效率比较分析，使用AFP-L2和AFP-L3联合构建的风险计算模型相比于原单独使用AFP MoM值作为单值截断的方式有更好的筛查效率。将四个模型计算的风险值绘成柱形图，与原有使用AFP MoM值作为判断标准的数据进行对比，原AFP MoM值单截断值筛查效果及相同的样本在模型一至模型四的风险计算模型中的筛查效果对比(见图3－图6)。通过比较结果显示，模型四(AFP-L2和AFP-L3二联)ONTD样本与对照样本的重叠部分最小，区分度效果最好(见图6),且筛查效果远优于原使用AFPMoM进行单截断的方式(见图3)。AFP-L2和AFP-L3联合筛查ONTD胎儿的AUC为0.923(95％CI:0.930～0.992，P<0.001)，见图2，最佳临界值分别为：1.885MOM,其敏感度、特异度、约登指数分别为：82.60％、98.20％、0.808。
3讨论
本研究结果显示，孕有ONTD胎儿的孕妇血清AFP-L2和AFP-L3水平均高于孕有健康胎儿孕妇的对照组水平，差异均有统计学意义(均P<0.001)。Kelleher[15]和Buamah[16]的研究结果表明，尤其是当羊水AFP浓度的升高不是很明显时(高于平均值2～5个标准差)，或者孕周不确定，或者当羊水总AFP浓度和超声数据不一致时，LCA非结合型甲胎蛋白百分比测量是一个诊断异常胎儿较有价值的辅助手段。
本研究结果显示，单指标AFP-L2和AFP-L3筛查ONTD胎儿的AUC分别为0.856和0.914(均P<0.001)，均高于传统AFP筛查ONTD胎儿AUC的0.791，根据ROC曲线计算出AFP-L2、AFP-L3筛查ONTD胎儿的最佳临界值分别为：1.563MOM、1.676MOM,此时的敏感度、特异度、约登指数分别为：73.90％、96.70％、0.706；82.60％、86.90％、0.695。AFP-L2和AFP-L3的灵敏度和特异度均高于AFP。龙峰等[24]AFP-L3％的受试者工AUC的值为0.710，显示以AFP-L3％≥10％为界限可以很好地区分唐氏综合征孕妇和正常孕妇。Yamamoto等[12]结果表明AFPMoM，AFP-L3％，L3MoM和L3MoM/AFP MoM的AUC分别为0.750,0.868,0.949和0.946，L3MoM和L3MoM/AFP MoM的AUC显著高于AFP-L3％(P<0.05)和AFP MoM(P<0.05)。
本研究结果还显示，通过AFP-L2、AFP-L3多指标以建立模型形式对ONTD筛查效率比较分析，使用AFP-L2和AFP-L3联合构建的风险计算模型相比于原单独使用AFP MoM值作为单值截断的方式有更好的筛查效率。通过比较结果显示，模型四(AFP-L2和AFP-L3二联)ONTD样本与对照样本的重叠部分最小，区分度效果最好,且筛查效果远优于原使用AFP MoM进行单截断的方式。AFP-L2和AFP-L3联合筛查ONTD胎儿的AUC为0.923(95％CI:0.930～0.992，P<0.001)。远高于单独的AFP、AFP-L2和AFP-L3筛查ONTD胎儿的AUC。
本研究不足之处是，本研究病例组的ONTD的病例数相对过少，特别是无脑儿和脑膨出的病例还是太少，有待后期继续扩大对病例组的收集工作。综上所述，中孕期母血清AFP-L2和AFP-L3筛查效率优于AFP，是筛查ONTD胎儿的新的标志物，使用AFP、AFP-L2、AFP-L3构建的风险计算模型有更好的筛查效率。
参考文献
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可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种中孕期母血清甲胎蛋白异质体L2和L3联合构建胎儿开放性神经管畸形风险计算模型的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）、经超声影像学确诊为开放性神经管畸形ONTD胎儿的多个孕妇构成病例组，随机抽取胎儿发育正常的多个孕妇构成对照组；
（2）、采用酶联免疫法检测两组孕妇血清的AFP-L2和AFP-L3水平，使用AFP-L2、AFP-L3构建风险计算模型，该模型假设AFP-L2、AFP-L3的MoM值服从多元正态分布f(AFP-L2MoM ,AFP-L3MoM) ,计算得出各指标分布的对应参数，以分布似然作为ONTD风险，再根据ROC曲线计算出AFP-L2、AFP-L3筛查ONTD胎儿的最佳临界值、曲线下面积。
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