CN106771207A

CN106771207A - 一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒

Info

Publication number: CN106771207A
Application number: CN201610952959.4A
Authority: CN
Inventors: 周勇; 吴秀兰
Original assignee: Chongqing Gao Sheng Biological Medicine LLC
Current assignee: Chongqing Gao Sheng Biological Medicine LLC
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒及其制备方法。本发明能够在同一条检测试纸条上联合检测胰腺癌临床诊断的CA19‑9、CEA、CA242等三种肿瘤标记物，利用免疫层析技术，将CA19‑9、CEA、CA242的单克隆抗体固定在硝酸纤维素膜上制备成反应膜，同时，用不同发射光的量子点标记三种单克隆抗体，将上述量子点标记的抗体混合后喷在玻璃纤维膜上制备成结合垫，再辅以样品垫、吸水垫，组合成量子点免疫试纸条。本发明公开的试剂盒是采用双抗体夹心法原理，快速检测人全血或血清、血浆中的三种抗原，规避了以前单独检测方法的很多缺陷，一滴血便可以同时检测三种肿瘤标记物、结果更加直观、且灵敏度和特异性均得到了显著的提高，显示出了其在临床应用中巨大潜力。

Description

一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒

技术领域

本发明属于体外诊断学领域，涉及一种肿瘤诊断试剂盒，尤其是涉及一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

胰腺癌是指胰腺外分泌系统发生的癌，大多数胰腺癌起源于导管上皮为导管腺癌，少数为囊腺癌、腺泡细胞癌等，它是一种死亡率极高（～99.9%，确诊后）的肿瘤。由于早期无特异性临床症状，胰腺癌的症状取决于肿瘤所在的位置和大小。临床上约有90%以上的患者确诊时已经属于中晚期，失去了最佳治疗时机，其5年生存率仅为5%。在世界普通癌症中，患胰腺癌的男性居世界第四位，女性居第五位，而且预后效果差。因此，实现对胰腺癌的早期诊断，提高胰腺癌患者的生存率，必然是治疗该疾病的关键。

目前，诊断胰腺癌的常用检测指标有CA19-9、CEA、CA242、POA和MUC等几种。在实际诊断胰腺癌时，一般是用CA19-9、CEA、CA242三种具有代表性的指标来综合确诊胰腺癌，多种肿瘤标记物的综合分析在特异性和灵敏度上明显高于单一指标。常规实验室或医疗单位用于检测该三项指标通常仅限于采用单一试剂盒，即一个试剂盒针对一种肿瘤标记物的检测，此种方式存在的缺点是：1、检测步骤繁多，费时费力；2、目前三种标记物分别采用三种单指标试剂盒进行检测，然后再进行综合判断，由于不同生产厂家的试剂盒存在差异，且同一厂家的不同试剂盒由于检测的标记物不同可能会存在控制条件、参数的差异而导致检测结果存在误差，此种误差在综合分析三种标记物的特异性和灵敏度上会产生较大的影响，可能导致判断结果相差甚远。因此，开发一种能够在相对统一的检测条件下同时检测该三种胰腺癌肿瘤标记物的试剂盒，降低了由于人为原因造成的系统检测误差，大大提高了胰腺癌临床检测的特异性和灵敏度。

现已商品化的免疫层析试纸条多用胶体金作为标记物，虽然检测结果通过肉眼可见，但是胶体金由于颗粒粒径较大、均一性差、免疫标记物不稳定等导致无法实现准确定量检测、灵敏度低等缺陷。量子点（QDs）是一种半导体纳米晶，其激发光谱宽，呈连续分布，发射光谱窄，单色性好、颜色可调并且具有持久的光化学稳定性，其独特的光学性质使其作为一种新型的荧光探针而得到广泛应用。因此，本发明用量子点取代传统的胶体金作为标记物可以弥补胶体金标记的不足，发明高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉的免疫层析方法，提高胰腺癌阳性检测率。

发明内容

本发明目的在于应用量子点荧光免疫层析技术研制出一种操作简便、价格低廉和结果准确的临床联合检测胰腺癌的试剂盒，可以同时检测CA19-9、CEA、CA242三种肿瘤标记物，从而大大提高胰腺癌的检测速度和效率，相对于单检试剂盒具有灵敏度高及特异性强等优势。同时，每种肿瘤标记物的荧光颜色不同，在紫外光照射下，结果判断更加直观。

本发明实现其目的采用如下技术方案：

一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，包括试纸条、吸滴管、样本稀释液、样本稀释杯和存贮介质，所述的反应卡自下而上依次由样品垫、量子点标记的结合垫、反应膜和吸水垫连接在一起后固定于背衬上而组成；其中，所述的反应膜上含有由CA19-9单克隆抗体、CEA单克隆抗体、CA242单克隆抗体分别包被而成的3条T线即检测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的C线即质控线。

其中，所述的量子点标记的结合垫按照以下方法制备得到：将CA19-9单克隆抗体用Em=530nm的量子点标记、CEA单克隆抗体用Em=610nm的量子点标记、CA242单克隆抗体用Em=652nm的量子点标记，即得三种检测液，将三种检测液用检测稀释液混合后（优选为等比例混合），包被于玻璃纤维膜上，即得。

优选的，所述的硝酸纤维素膜上的3条检测线和1条质控线按照以下次序排列而成：从靠近吸水垫一端到靠近量子点结合垫一端依次为羊抗鼠IgG质控线（C）、CA19-9单克隆抗体（T1）、CEA单克隆抗体（T2）、CA242单克隆抗体（T3）检测线。

所述反应膜为硝酸纤维素膜。

所述检测稀释液的组分为5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐温Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01M PBS缓冲溶液。

所述样本稀释液的组分为0.5～1.0%吐温Tween-20、0.02～0.05%proclin300的0.01M PBS缓冲溶液。

所述的背衬为各种硬质的支持物，只有在紫外照射下无荧光且具有负载和支持的功能都可用于本发明。

本发明所述的量子点可为Ⅱ-Ⅳ族元素组成的化合物，如CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe等，以及它们组成的核壳式量子点（如CdSe@CdS、CdSe@ZnS等）的任意一种，且均为水溶性羧基量子点。

本发明所述同步定量胰腺癌的量子点免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：

1）量子点标记抗体的制备：

A、取不同波长量子点分别用磷酸缓冲液调节pH=6～8，加入EDC和sulfo-NHS（QDs: EDC的摩尔比为1:50～1:200；EDC: sulfo-NHS的摩尔比为1:1～5:1），涡旋振荡均匀，室温活化15～60 min；

B、分别对应加入胰腺癌标记物的相应抗体（CA19-9单抗、CEA单抗、CA242单抗，且QDs和抗体的摩尔比为1:4～1:10），室温振荡反应1～4 h；

C、反应结束后用分子截留量30～100 KDa的超滤离心管浓缩至30～100 ul，然后采用凝胶尺寸排阻法进行纯化，收集有荧光的部分，再用超滤离心管浓缩后保存于PBS缓冲溶液中（含0.05% proclin300），4℃保存备用，即得量子点标记抗体检测液；

2）结合垫的处理：在湿度为40～60%的条件下，将1）中的检测液用稀释液稀释50～100倍（检测液等比例混合）后，喷到玻璃纤维膜上，37℃干燥1～2 h，4℃保存备用。检测稀释液成分为5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐温Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01M PBS缓冲溶液。

3）制备包被有检测指标的硝酸纤维素膜（NC膜）：检测指标为CA19-9单抗、CEA单抗、CA242单抗。以NC膜为反应膜，将检测指标和羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节浓度至0.1～2.0 mg/ml，按照1～2 ul/cm的溶液划线液量，在湿度为40～60%的条件下，将检测指标和羊抗鼠IgG喷到反应膜上对应的检测区和质控区进行包被，各个指标间隔为3～6 mm，放置20～37℃干燥1～2 h，4℃保存备用，所用包被液为0.01M PBS缓冲溶液。

4）在干燥环境下，依次在荧光专用背衬上粘贴样品垫、步骤2）所得结合垫、步骤3）制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，得量子点荧光免疫层析试纸条。

本发明试剂盒的使用方法及评测标准：

定性或定量检测：取200～500 ul样本稀释液与10～40 ul待检样本充分混匀后，取50～100 ul混合液加入到试纸条的样本垫内，反应3～10 min即可读取结果，具体操作如下：

1）定性检测或半定量检测：用激发量子点的光源范围在320～450 nm的普通激发光源照射反应膜区域，根据双抗体夹心原理，当待测样本中含有胰腺癌的相应抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，激光照射下出现2条及2条以上条带，且其中一条为C线时，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含相关抗原，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出现条带则说明检测无效，条带颜色越深说明待测样本中含有胰腺癌标记物相关抗原含量越高，反之，条带颜色越浅说明相关抗原含量越少。

2）定量检测：将加样反应后的试纸条，利用荧光定量分析仪进行免疫层析扫描，将检测线荧光强度/质控线荧光强度的比值代入同批次存贮介质中的标准曲线，根据公式得知待测抗原含量。

其中存贮介质中标准曲线制作：配备一系列不同浓度的待检抗原标准溶液，加入试纸条检测孔，然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测，通过检测线荧光强度/质控线荧光强度比值对相应抗原浓度作标准曲线。

本发明所述的量子点荧光免疫层析试纸条检测法，具体为双抗体夹心法，应用范围广，可用于胰腺癌单项指标或者多指标的高灵敏度快速检测，能够检测全血、血清、血浆等样本。

本发明所述一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒及其制备方法，用量子点取代胶体金颗粒作为信号标记物，与待测肿瘤标记物相应抗体偶联后喷涂或者直接涂布于结合物释放垫上，三种肿瘤标记物所对应的另三个位点的抗体以及羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上，分别形成 T1、T2、T3线（检测线）和 C 线（质控线）；通过将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按一定顺序组装制成免疫层析试纸条。进行临床检测时，根据 T 线和C 线上是否出现荧光条带以及荧光的强弱进行定性和定量检测。本发明的试纸条检测灵敏度和特异性高于商品化的胶体金免疫试纸条，多指标同时检测，操作简单快速，检测耗时短，结果判读容易，特别适合家庭，社区，医院等场所对于胰腺癌的筛查、诊断、判断预告和转归，评价治疗效果和高危人群的跟踪观察，市场潜力巨大。

附图说明

图1 免疫层析试纸条结构图；

图2 免疫试纸条定性或半定量检测评价标准；

图3 CA19-9抗原浓度标准曲线；

图4 CEA抗原浓度标准曲线；

图5 CA242抗原浓度标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例用以对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒

1、试剂盒结构

1.1 试剂盒组成

一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，包括试纸条、吸滴管、样本稀释液、样本稀释杯和存贮介质。

1.2 试纸条结构

图1说明试纸条结构。图1中，所述的胰腺癌量子点联检诊断试剂条，其包括依次搭接于荧光专用底衬5上的样品垫1、结合垫2、NC膜3、吸水垫4。

所述试纸条的样本垫1为可过滤红细胞的玻璃纤维膜。结合垫2为玻璃纤维膜或聚酯膜。所述NC膜3，其上具有检测线T1（即31）、检测线T2（即32）、检测线T3（即33）和质控线C（即30）。

2、试纸条制备方法

1）量子点标记抗体的制备；

2）结合垫的处理：在湿度为40～60%的条件下，将1）中的检测液用稀释液稀释50～100倍（检测液等比例混合）后，喷到玻璃纤维膜上，37℃干燥1～2 h，4℃保存备用。检测稀释液成分为5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐温Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01M PBS缓冲溶液；

3）制备包被有检测指标的硝酸纤维素膜（NC膜）：检测指标为CA19-9单抗、CEA单抗、CA242单抗。以NC膜为反应膜，将检测指标和羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节浓度至0.1～2.0mg/ml，按照1～2 ul/cm的溶液划线液量，在湿度为40～60%的条件下，将检测指标和羊抗鼠IgG喷到反应膜上对应的检测区和质控区进行包被，各个指标间隔为3～6 mm，放置20～37℃干燥1～2 h，4℃保存备用，所用包被液为0.01M PBS缓冲溶液。

实施例2 试剂盒检测方法及评价标准

用样本稀释液将待检样本稀释到样本稀释杯中，用吸滴管吸取待测样本稀释液滴加到试纸条的上样处，等候约3~10 min后，待样本沿试纸条层析后，对其进行鉴定。

定性或半定量检测：用激发量子点的光源范围在320~450 nm的普通激发光源照射反应膜区域，根据量子点标记的对应抗体的荧光的颜色进行鉴定，自吸水垫至样品垫分别为检测CA19-9、CEA、CA242的条带，相对应荧光颜色为绿色、橙色、红色，且靠近吸水垫端的质控线始终有荧光。则可以根据不同组合颜色变化对应胰腺癌的机率，见图2所示。

定量检测：利用荧光定量分析仪进行免疫层析扫描加样反应后的试纸条，自吸水垫至样品垫分别为C、T1、T2、T3对应的荧光谱图，将所得检测线荧光强度/质控线荧光强度的比值代入同批次存贮介质中的相对应标准曲线，根据公式得知待检抗原含量。

实施例3 试纸标准曲线建立

（a）取CA199、CEA、CA242标准品配制一系列浓度梯度的标准液，如表1所示，将标准液CA199、CEA、CA242的1号标准液混合均匀，标记为B1，同理，配制标号为B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10系列浓度梯度的标准使用液。

表1

标准液类别	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											CA199(U/mL)	1	5	10	50	100	250	500	1000	1500	2000
CEA(ng/mL)	0.3125	0.625	1.25	2.5	5	10	20	50	75	100
											CA242(U/mL)	1	5	10	50	100	250	500	750	1000	1500

（b）将1-10标准品浓度分别滴加在 10条量子点免疫层析试条上，相同条件下用检测仪进行检测（即：每一标准品浓度分别用 10 条量子点免疫层析试条在相同条件下用检测仪检测 10 次），分别读得其T1、T2、T3带荧光强度（FL1、FL 2、FL 3）与 C 带荧光强度（FL c），得到平均值和FL1/FLc、FL2/FLc、FL3/FLc比值。

（c）以标准品系列浓度作 X 轴，分别以FL1/FLc、FL2/FLc、FL3/FLc比值作 Y 轴，得到同批次量子点检测CA19-9、CEA、CA242抗原试纸条的标准曲线，如图 3、图4、图5。

（d）将（c）所得标准曲线采用二维码、条码、或 IC 卡芯片等存贮介质进行储存，用于同批次试纸条的参照标准曲线。

Claims

1.一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，包括试纸条、吸滴管、样本稀释液、样本稀释杯和存贮介质,其特征在于：所述的反应卡自下而上依次由样品垫、量子点标记的结合垫、反应膜和吸水垫连接在一起后固定于背衬上而组成；其中，所述的反应膜上含有由CA19-9单克隆抗体、CEA单克隆抗体、CA242单克隆抗体分别包被而成的3条T线即检测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的C线即质控线。

2.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述反应膜为硝酸纤维素膜。

3.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述的量子点标记的结合垫按照以下方法制备得到：将检测液用检测稀释液将其等比例稀释混匀后，包被于玻璃纤维膜上，即得。

4.根据权利要求3所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述结合垫上的检测液按照以下方法制备得到：将CA19-9单克隆抗体用Em=530nm的量子点标记、CEA单克隆抗体用Em=610nm的量子点标记、CA242单克隆抗体用Em=652nm的量子点标记，即得检测液。

5.根据权利要求3所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述检测稀释液的组分为5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐温Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01M PBS缓冲溶液。

6.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述反应膜上的3条检测线和1条对照线分别按照以下次序排列而成：从靠近吸水垫一端到靠近量子点结合垫一端依次为IgG质控线（C）、CA19-9单克隆抗体（T1）检测线、CEA单克隆抗体（T2）检测线、CA242单克隆抗体（T3）检测线。

7.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述背衬为各种硬质的支持物，在紫外照射下无荧光且具有负载和支持的功能。

8.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述存贮介质包括RFID标签、IC芯片、磁码、或条码；所述存贮介质储存有同批次量子点免疫试纸条定量检测样品用的被检物标准曲线。

9.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：用于激发量子点的光源范围在320-450 nm的普通激发光源；根据双抗体夹心原理，当待测样本中含有胰腺癌的相关抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，激发光照射下出现2条及2条以上条带，且其中一条为C线时，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含相关抗原，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出现条带则说明检测无效，条带颜色越深说明待测样本中含有胰腺癌标记物相关抗原含量越高，反之，条带颜色越浅说明相关抗原含量越低。

10.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：量子点作为信号标记物将肿瘤标记物抗原和抗体的免疫反应则转化为可被识别的荧光信号，检测线/质控线比值的大小与免疫反应的量成正比。