KR20190006955A - 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법, 프로그램, 기억 매체 및 장치 - Google Patents

측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법, 프로그램, 기억 매체 및 장치 Download PDF

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Abstract

측정 대상 물질의 측정 시약을 이용한 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법으로서, 비교 대상 물질의 농도에 의존하지 않는 단일의 검량선(다중 검량선)을 이용함으로써, 흡광도의 측정값으로부터 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 간단하게 구할 수 있다.

Description

측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법, 프로그램, 기억 매체 및 장치
본 발명은 측정 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율의 측정 기술에 관한 것이다.
임상 검사로 이루어지는 검체 검사에서는 환자로부터 채취한 혈액, 골수액, 소변, 대변, 조직이나 세포 등을 대상으로 한 검체 중의 단백질, 효소, 전해질, 금속 이온, 지질, 당질, 비타민 등의 화학 물질을 측정함으로써, 예를 들어 장기의 이상, 세균이나 바이러스 등에 의한 감염 상태를 파악할 수 있기 때문에 병의 진단, 치료 방침의 판단 및 치료 효과의 지표를 얻기 위한 수단으로서 이용된다.
측정 대상이 되는 검체 중의 각종 화학 물질은 그 측정값의 기준값에 대한 많고 적음이 즉 대상으로 하는 장기의 이상을 나타내기 때문에 측정값은 농도로 나타내고, 단위로서 예를 들어 mg/dL나 mol/L가 이용된다. 또한, 효소나 비타민에 대해서는 활성값을 나타내고, 단위로서 효소 단위 혹은 국제 단위, 예를 들어 IU/L가 이용된다.
측정 대상의 하나인 혈당 즉 글루코오스는, 당뇨병 환자의 병태(혈당치가 높은 상태)를 파악하기 위해 측정되고, 그 단위로는 예를 들어 일본 내에서는 mg/dL가 이용된다. 혈당 검사에서는 채혈 시점에서의 정확한 혈당치는 파악할 수 있지만, 혈당치는 항상 변동되기 때문에(공복시의 기준값은 110mg/dL 미만, 식후 2시간 후의 기준값은 140mg/dL 미만) 혈당의 변동 범위(혈당 상태)를 파악할 수 없다. 즉, 당뇨병 환자의 치료로서 이루어지는 혈당 컨트롤의 효과를 파악할 수 없다.
그래서, 혈당 컨트롤의 효과를 파악하기 위해 어떤 일정 기간의 혈당 상태를 반영하는 단백질의 당화 정도를 지표로서 이용한다. 지표로서는 HbA1c나 글리코알부민이 이용된다.
우선, HbA1c에 대해 설명한다. Hb(헤모글로빈)는 적혈구 중의 색소 단백질로서 α서브유닛, β서브유닛의 각 2개로 이루어지는 헤테로 4량체이다. 적혈구 중의 Hb는 적혈구가 체내를 순환하는 동안에 비효소적, 즉 혈당 농도 의존적으로 글루코오스와 결합한다. 이렇게 하여 글루코오스와 결합한 Hb, 당화 Hb가 즉 HbA1이다. HbA1에는 β서브유닛에 결합하는 당의 종류에 따라 몇 가지 종류가 있는데, β서브유닛의 N말단에 글루코오스가 결합한 것이 HbA1c이며, 채혈 시점으로부터 과거 1~2개월의 혈당 상태를 반영하는 지표로서 이용된다. 측정값으로서 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율 즉 상대량, 단위로서 %가 이용된다.
다음으로 글리코알부민에 대해 설명한다. 알부민은 혈중 단백질의 대부분을 차지하고, 혈액과 함께 체내를 순환하는 동안에 헤모글로빈의 경우와 같이 당과 결합하여 당과 결합한 알부민, 당화 알부민이 즉 글리코알부민이다. 글리코알부민은 채혈 시점으로부터 과거 2~3주간의 혈당 상태를 반영하는 지표로서 이용된다. 측정값으로서 글리코알부민의 총 알부민에 대한 비율 즉 상대량, 단위로서 %가 이용된다.
HbA1c나 글리코알부민 외에, 측정값으로서 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율(상대량)을 이용하는 것으로서는 아이소자임(예를 들어 젖산 탈수소 효소. 그 존재하는 조직, 세포 혹은 세포 소기관, 즉 유래가 상이한 아이소자임)을 들 수 있다.
또한, 측정값에 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 이용하는 것은, 비교 대상 물질의 총량이 개인, 성별, 연령, 걸려 있는 질환 등에 따라 폭이 있기 때문에 측정 대상 물질의 농도 즉 단위 용적당 질량 등으로 표기해도 병태를 정확하게 파악할 수는 없는 것이 이유이다.
HbA1c를 예로 설명하면 인간의 혈액 중의 총 Hb농도는 남성에서는 13.1~16.6g/dL의 범위이고 여성에서는 12.1~14.6g/dL의 범위이다. 이와 같이 총 Hb농도의 기준값에는 남녀차, 개인차, 개체내 차가 있다. 또한, 총 Hb농도는 빈혈 증상을 일으키는 질환(철 결핍성 빈혈, 재생 불량성 빈혈 등)이나 적혈구 증가증, 탈수증상 등의 유무에 따라서도 크게 변동한다. 따라서, 만약 HbA1c의 농도로 나타내었다고 해도 Hb는 혈당 농도 의존적으로 당화되기 때문에 총 Hb농도를 보지 않는 한, 즉 HbA1c와 총 Hb농도의 관계를 동시에 파악할 수 있는 표시값을 이용하지 않는 한 혈당 상태를 정확하게 파악할 수는 없다. 다시 말하면, HbA1c의 농도는 동일해도 총 Hb농도가 높은 인간에서는 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율은 낮아지고, 총 Hb농도가 낮은 인간에서는 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율은 높아진다는 것이다.
측정값으로서 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법으로서 HbA1c를 예로 설명하면, 제1 방법으로서는 HPLC를 이용하는 방법이 알려져 있고, 이 방법에서는 측정 대상 물질 및 비교 대상 물질의 피크 면적으로부터 직접 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구한다.
제2 방법으로서는 면역법(응집법 혹은 응집 저지법)이 알려져 있고(예를 들어 특허문헌 1, 2, 3 참조), 시료 중의 HbA1c 농도와 총 Hb농도를 각각 구해 두고 나서 마지막으로 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구한다.
구체적으로 우선 시료 중의 HbA1c와 Hb를 변성시키고, 다음으로 면역 반응을 행하며, 면역 반응에 의해 발생하는 흡광도 변화에 따른 시료 중의 HbA1c 농도와 총 Hb농도를 각각 구해 두고, 마지막으로 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구한다. 면역법으로서는 응집법이나 응집 저지법이 알려져 있다.
제3 방법으로서는 효소법이 알려져 있고(비특허문헌 1, 2 참조), 시료 중의 HbA1c 농도와 총 Hb농도를 각각 구해 두고 나서 마지막으로 HbA1c의 비율을 구한다.
구체적으로 우선 시료 중의 HbA1c와 Hb를 변성시키고, 다음으로 흡광도로부터 총 Hb농도를 구하며, 다음으로 HbA1c를 프로테아제 처리하여 발생한 β서브유닛 N말단 유래의 당화 디펩티드에 프룩토실펩티드옥시다아제, 나아가 퍼옥시다아제를 작용시켜 발생시키는 과산화수소와 발색제에 의해 발생하는 발색 반응을 이용하여 흡광도를 측정함으로써 HbA1c 농도를 구하고 나서 마지막으로 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구한다.
특허문헌 1: 일본특허 제2596322호 공보 특허문헌 2: 일본특허 제3550614호 공보 특허문헌 3: 일본특허 제5465008호 공보
비특허문헌 1: Clin Chem. 51, A246, 2005 비특허문헌 2: 생물공학지 제92권, 제2호, 62-68. 2014
그러나, 상기 제1 방법에서는 측정 장치가 대규모이고 고가이며 소모 부품의 칼럼이 고가라는 문제가 있다. 또한, 제2, 3 방법에서는 모두 흡광도 측정값으로부터 우선 복잡한 계산식을 이용하여 HbA1c 농도를 구할 필요가 있고, 이는 즉 측정시에 시약과 검체의 비율(용적비)을 일정하게 유지할 필요가 있고, 특히 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구하는 경우의 실제 측정에서는, 검체의 전처리시(용혈 처리, 희석 처리 혹은 변성 처리시)와 측정시의 적어도 2회 이상 시약과 검체를 혼합하는 공정이 포함되기 때문에 시약 및 검체의 용적의 불균일이 발생하기 쉽고, HbA1c 농도와 총 Hb농도, 나아가서는 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율의 신뢰성은 낮아지지 않을 수 없다.
만약 제2, 제3과 같이 면역법이나 효소법을 이용하는 반응계에서 시약과 검체의 용적비 문제에 영향을 받지 않고 흡광도 측정값으로부터 직접 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구하고자 하는 경우, 상술한 바와 같이 총 Hb의 농도는 검체마다 불균일함이 있기 때문에 총 Hb농도마다 무수한 검량선을 준비할 필요가 있어 실제 문제로서 불가능하다.
본 발명은 상기의 사정을 감안하여 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 기술, 특히 비교 대상 물질의 농도가 검체에 따라 불균일함이 있는 경우에 흡광도 측정값으로부터 직접 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 관점에 의하면 측정 대상 물질의 측정 시약을 이용한 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법으로서, 비교 대상 물질의 농도가 상이한 측정 대상 물질의 희석 계열과 상기 측정 시약의 반응이 진행됨으로써 발생하는 상기 측정 대상 물질의 희석 계열 각각의 흡광도 변화량을 구하여 얻어지는 복수의 검량선이 하나의 검량선에 수속되는 농도 계수를 비교 대상 물질의 농도마다 구하는 과정에 있어서,
측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율(%)=[X]/(농도 계수×비교 대상 물질의 농도) (1)
을 얻는 단계와, 비교 대상 물질의 농도마다의 농도 계수와 비교 대상 물질의 농도의 관계를 나타내는 회귀식을 구하는 단계를 갖는 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법이 제공된다.
상기 흡광도 변화량을 구하는 단계는 측정 대상 물질을 포함한 검체와 상기 측정 시약에 의해 발생하는 반응이 진행됨으로써 발생하는 특징적인 단파장에서의 흡광도 증가 혹은 감소의 변화량을 구하는 단계, 혹은 측정 대상 물질을 포함한 검체와 상기 측정 시약에 의해 발생하는 반응이 진행됨으로써 발생하는 특징적인 2파장에서의 흡광도 증가 혹은 감소의 변화량으로서, 흡광도가 증가하거나 혹은 감소하는 제1 파장에서의 제1 흡광도와, 흡광도가 증가하거나 혹은 감소하는 제2 파장에서의 제2 흡광도의 차 혹은 비를 구하는 단계를 가진다.
상기 측정 시약이 면역법의 응집법이나 응집 저지법 혹은 효소법 중 어느 하나를 이용하는 측정 시약이며, 상기 식(1), 및 비교 대상 물질의 농도마다 최적화한 농도 계수와 비교 대상 물질의 농도의 회귀식과, 측정 시약을 이용하여 측정 대상 물질을 포함한 검체를 측정하여 얻는 흡광도 변화량으로부터, 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 단계를 가진다.
본 발명은 컴퓨터에 상기 어느 하나에 기재된 방법을 실행시키기 위한 프로그램이어도 된다.
또한, 상기 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체이어도 된다.
또한, 본 발명은 측정 대상 물질의 측정 시약을 이용한 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 장치로서, 상기 어느 하나에 기재된 방법을 실행시키기 위한 제어부와, 흡광도 측정부를 갖는 장치이며, 제어부와 흡광도 측정부는 일체 혹은 별도의 개체로 설치되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기에 기재된 프로그램을 내장하는 제어부를 갖는 장치이어도 되고, 상기에 기재된 프로그램을 읽어들이는 제어부를 갖는 장치이어도 된다.
또한, 본 발명은 상기에 기재된 방법을 실행하여 얻어진 회귀식을 내장하는 제어부를 갖는 장치이어도 된다.
본 발명은 상기에 기재된 방법을 실행하여 얻어진 회귀식을 읽어들이는 제어부를 갖는 장치이어도 된다.
본 명세서는 본원의 우선권 기초가 되는 일본특허출원번호 2016-096681호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명에 의하면 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 보다 간단하게 구할 수 있다.
도 1a는 면역 반응~흡광도 측정까지의 공정의 일례를 나타내는 도면이다.
도 1b는 본 발명의 제1 실시형태에 의한 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율의 측정 기술을 모식적으로 나타내는 도면이다.
도 1c는 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 측정하는 측정 장치의 일 구성예를 나타내는 기능 블록도이다.
도 2는 항원 항체 반응에 의한 금 콜로이드 응집의 흡수 스펙트럼을 분광 광도계로 측정한 결과의 일례를 나타내는 도면이다. 가로축이 파장, 세로축이 흡광도이며, 경과 시간마다의 해석 결과(측정 결과)가 나타나 있다.
도 3은 도 2의 데이터에 기초하여 얻어지는 도면으로, 파장 525nm에서의 흡광도와 파장 630nm에서의 흡광도의 비율을 구하여 반응 개시 시간(시간=0)으로부터의 경과 시간 의존성을 나타낸 도면이다.
도 4는 총 Hb농도(y)와 흡광도(x)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 5는 총 Hb농도가 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5mg/mL이고 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이 3.7~15.3%인 검체를 이용하여 측정을 행하였을 때의 반응 개시 5분 후의 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율과 파장 525nm에서의 흡광도 변화(변화량Δ)를 플롯한 그래프이다.
도 6은 가로축을 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=[x1]로 한 도면이다.
도 7a는 총 Hb농도가 1.5mg/mL일 때에 Factor가 1.00이 되고, 총 Hb농도가 낮아지면 높아지고 총 Hb농도가 높아지면 낮아지도록 농도 계수(Factor)를 설정한 도면이다.
도 7b는 총 Hb농도마다 농도 계수(Factor)를 최적화한 후의 도 7a의 회귀 곡선을 나타내는 도면이다.
도 8은 도 7b에 도시된 농도 계수를 이용하여 [x2]와 흡광도 변화(변화량Δ)의 관계를 구한 도면이다.
도 9는 도 8에 기초하여 흡광도 변화와 [x2]의 관계를 총 Hb농도에 의존하지 않도록 하여 일률적으로 구한 검량선이다.
도 10은 본 실시형태에 의한 처리의 일례를 나타내는 흐름도이다.
도 11a는 도 10에 이어지는 도면이다.
도 11b는 도 11a에 이어지는 도면으로, 측정값 산출의 순서를 정리한 흐름도이다.
도 12는 농도 계수(Factor)를 구하는 도 11a의 단계 S7의 처리예를 나타내는 흐름도이다.
도 13은 농도 계수(Factor)를 구하는 도 12의 단계 S7-4의 처리예를 나타내는 흐름도이다.
도 14는 총 Hb농도가 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5mg/mL이고 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이 3.7~15.3%인 검체를 이용하여 측정을 행하였을 때의 반응 개시 5분 후의 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율과, 파장 525nm에서의 흡광도와 파장 630nm에서의 흡광도의 비율, 즉 흡광도 비(Ratio)를 플롯한 그래프이다.
도 15는 가로축을 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=[x1]로 한 도면이다.
도 16a는 총 Hb농도가 1.5mg/mL일 때에 Factor가 1.00이 되고, 총 Hb농도가 낮아지면 높아지고 총 Hb농도가 높아지면 낮아지도록 농도 계수(Factor)를 설정한 도면이다.
도 16b는 총 Hb농도마다 농도 계수(Factor)를 최적화한 후의 도 16a의 회귀 곡선을 나타내는 도면이다.
도 17은 도 16b에 도시된 농도 계수(Factor)를 이용하여 [x2]와 흡광도 비(Ratio)의 관계를 구한 도면이다.
도 18은 도 17의 세로축과 가로축을 바꾼 검량선을 나타내는 도면이다.
도 19는 본 발명의 제3 실시형태에 의한, 총 Hb농도가 1.0, 2.0, 2.5mg/mL이고 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이 5.7~15.3%인 검체를 이용하여 측정을 행하였을 때의 반응 개시 5분 후의 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율과 파장 525nm에서의 흡광도 변화(변화량Δ)를 플롯한 그래프로서 농도가 상이한 측정 대상 물질의 희석 계열을 3종류로 한 예를 나타내는 도면이다.
도 20은 가로축을 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=[x1]로 한 도면이다.
도 21a는 Hb농도가 2.0mg/mL일 때에 Factor가 1.00이 되고, 총 Hb농도가 낮아지면 높아지고 총 Hb농도가 높아지면 낮아지도록 농도 계수(Factor)를 설정한 도면이다.
도 21b는 총 Hb농도마다 농도 계수(Factor)를 최적화한 후의 도 21a의 회귀 곡선을 나타내는 도면이다.
도 22는 도 21b에 도시된 농도 계수를 이용하여 [x2]와 흡광도 변화(변화량Δ)의 관계를 구한 도면이다.
도 23은 도 22에 기초하여 흡광도 변화와 [x2]의 관계를 총 Hb농도에 의존하지 않도록 하여 일률적으로 구한 검량선이다.
면역법이란 항원 항체 반응을 이용하는 방법이며, 검출 원리는 응집법, 응집 저지법 어느 것으로도 되고, 또한 항체 혹은 항원을 담지시키는 담체를 이용해도 되고, 이용하는 항체로서는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 어느 것으로도 되고, 이용하는 담체로서는 라텍스, 금 콜로이드, 젤라틴 입자 등 일반적으로 이용되는 소재의 것이면 인공 담체 소재, 천연 소재 어느 것으로도 된다. 응집법에서의 흡광도 변화는 측정 대상 물질이 존재하는 경우에는 응집 반응이 발생하여 흡광도가 상승하는 것이고, 응집 저지법에서는 측정 대상 물질이 존재하는 경우에는 응집 반응이 저해되기 때문에 흡광도 상승이 억제된다는 것이다. 또한, 흡광도 변화의 속도나 정도는 반응계 내에서의 측정 대상 물질이 양에 따라 다르다. 따라서, 본 발명에서는 면역법을 이용한 반응에 의해 발생하는 흡광도의 증가 혹은 감소를 흡광도 변화량으로서 이용할 수 있다.
효소법이란 측정 대상물을 측정하기 위해 효소와 발색 시약을 이용하여 효소 반응의 결과 발생하는 발색에 특이적인 흡광도를 측정함으로써 반응을 검출하는 것이고, 사용하는 효소는, 예를 들어 HbA1c나 글리코알부민의 총 헤모글로빈이나 총 알부민에 대한 비율을 구하기 위한 측정에서 통상 이용되고 있는 효소(예를 들어 프로테나아제, 프룩토실펩티드옥시다아제 및 퍼옥시다아제)이면 되고, 또한 퍼옥시다아제의 기질로서 일반적으로 이용되는 발색 시약(예를 들어 4-AA, DMA, OPD, ADOS, TBHBA)이면 모두 사용할 수 있다.
흡광도 변화량이란 측정 대상을 측정하기 위해 이용하는 면역법 혹은 효소법에서 발생하는 반응에 특이적인 흡수 파장에서의 흡광도 측정값이며, 예를 들어 단파장의 변화량(Δ값), 2파장(주파장과 부파장)의 차이나 비(주파장을 분자, 부파장을 분모로 한 흡광도 비, 이하 흡광도 비 혹은 Ratio라고 부름) 어느 것으로도 된다. 2파장을 이용하는 경우의 이점으로서는 전압의 변화에 따른 흡광도 분석 장치의 드리프트 현상에 의한 흡광도 측정값에 대한 영향을 회피할 수 있다는 것을 들 수 있다.
비교 대상 물질이란 측정 대상물을 포함한 물질군이며, 예를 들어 HbA1c에 대해서는 Hb, 글리코알부민에 대해서는 알부민, 특정 형태의 아이소자임에 대해서는 동일한 촉매 반응을 행하는 모든 아이소자임을 가리킨다.
또한, 비교 대상 물질의 농도 측정 방법으로서는 비교 대상 물질을 측정하기 위한 반응에 의해 발생하는 흡광도 변화를 이용하는 방법이면 되고, 예를 들어 Hb의 경우는, Hb에 특유한 흡광도(예를 들어 420~430nm, 540nm, 570nm 근방의 흡수 파장)의 측정값을 이용하는 방법, 면역법(예를 들어 응집법, 응집 저지법)에 의한 반응으로 발생하는 흡광도 변화량을 이용하는 방법, 혹은 Hb를 예를 들어 계면활성제, 아지화나트륨이나 시안 화합물 등으로 처리함으로써 완전히 산화 혹은 환원한 상태로 하고, 산화 혹은 환원 상태에서 특유의 흡광도 측정값을 이용하는 방법이 이용되고 있다. 또한, 알부민의 경우는 Hb와 같이 면역법을 이용하는 방법 외에 고전적인 방법으로서 색소 결합법(혹은, 단백 오차법이라고도 함)을 이용하여 흡광도(발색 특이적 흡수 파장)의 측정값을 이용하는 방법이 이용되고 있다. 색소 결합법이란 예를 들어 브롬크레졸퍼플, 브롬크레졸그린, pH 지시약이 pH 변화와는 관계없이 단백질의 존재에 따라 발색하는 반응을 이용하는 방법이다.
비교 대상 물질의 농도가 상이한 측정 대상 물질의 희석 계열은, 2종류에서는 농도 계수의 회귀식은 2점을 연결한 직선밖에 될 수 없어 그 정밀도는 낮고, 반대로 그 종류가 많으면 많을수록 본 발명에 의해 얻어지는 농도 계수의 회귀식의 정밀도는 높아지지만, 그만큼 흡광도 변화량을 구하는 작업에 있어서 노력이 늘어나기 때문에 실제적이지 않다. 따라서, 본 발명을 실시하기 위해서는, 비교 대상 물질의 농도가 상이한 측정 대상 물질의 희석 계열을 적어도 3종류 이상, 보다 바람직하게는 5종류 이상 준비하면 된다.
또한, 비교 대상 물질의 농도나 측정 대상 물질의 희석 계열에 대해서는, 측정 대상에 의해, 또한 면역법이나 효소법을 이용한 측정계에 의해 각각의 측정 범위에 따라 설정하면 된다.
발명자들은 면밀히 검토를 하여 다음과 같은 순서를 밟아 본 발명의 완성에 이르렀다.
우선, 상이한 비교 대상 물질의 농도에 있어서 측정 대상 물질의 희석 계열을 준비하고, 각각에 대해 면역법 혹은 효소법을 이용하는 반응에 의해 발생하는 흡광도 변화량을 구하였다.
다음으로 x축을 비교 대상 물질의 농도마다 측정하여 얻어진 측정 대상 물질의 희석 계열, y축을 흡광도 변화량으로서 플롯한 검량선을 작성하였다. 예를 들어 면역 응집법의 경우에는 비교 대상 물질의 농도마다 점점 올라가는 시그모이드 곡선을 취하는 검량선이 된다. 그러나, 그대로는 비교 대상 물질의 농도마다 측정 대상 물질의 희석 계열과 흡광도의 관계를 나타내는 개개의 검량선으로서 각각 독립적으로 존재할 뿐, 검량선끼리의 관계를 파악할 수는 없다.
그래서, x축을 [x1]=비교 대상 물질의 농도와 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율의 곱, y축을 측정 대상 물질의 흡광도 변화량과의 함수로 함으로써, 비교 대상 물질의 농도에 따르지 않는 측정 대상 물질의 절대량과 흡광도 변화량의 관계가 명확화되는 것, 나아가 도 5에서는 각각이 뿔뿔이 흩어져 존재한 복수의 검량선이 하나의 검량선으로 수속되는 경향이 명백해졌다. 즉, 비교 대상 물질의 농도 의존이 작은 제1 검량선이 얻어지는 것을 발견하였다.
또한, 이는 비교 대상 물질의 농도마다의 검량선 각각에서 계수를 임의의 정수, 예를 들어 1로 설정할 때, 각각의 검량선이 하나의 검량선으로 수속되는 경향을 나타내었다고도 바꾸어 말할 수 있다.
나아가 이로부터 비교 대상 물질의 농도마다의 검량선 각각을 하나의 검량선으로 수속시키도록 비교 농도 대상 물질의 농도마다의 검량선 각각에 대해 최적화한 계수(이하, 농도 계수 혹은 Factor라고 부름)를 구함으로써, x축을 [x2]=비교 대상 물질의 농도와 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율과 비교 대상 물질의 농도마다 구한 각각의 농도 계수의 곱, y축을 흡광도 변화량과의 함수로 나타낸 바, 비교 대상 물질의 농도마다의 복수의 검량선은 하나의 검량선에 수속되었다. 즉, 비교 대상 물질의 농도에 대한 의존이 제1 검량선보다 작은 제2 검량선(다중 검량선)이 얻어지는 것을 발견하였다.
나아가 y축을 구한 비교 대상 물질의 농도마다의 농도 계수, x축을 비교 대상 물질의 농도로서 플롯하면 이들 플롯은 회귀식으로 나타낼 수 있고, 또한 이 회귀식을 이용함으로써 실측값이 없는 플롯 간의(총 헤모글로빈 농도에서의) 농도 계수도 구하는 것이 가능하게 되었다.
또한, [x2]는 즉 흡광도 변화량[X]이며, 흡광도 변화량[X]은 [X]=(비교 대상 물질의 농도)×(측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율)×(비교 대상 물질의 농도마다 구한 농도 계수)의 관계식으로 나타낼 수 있기 때문에 추가적으로 이하의 식으로 나타낼 수 있다.
측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율(%)=[X]/(농도 계수×비교 대상 물질의 농도) (1)
따라서, 비교 대상 물질의 농도를 얻는 것, 본 발명에 의해 구한 농도 계수의 회귀식과 식(1)을 이용하는 것, 및 측정 대상 물질의 흡광도 변화량을 측정함으로써 직접 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구할 수 있다.
이하, 본 발명의 몇 가지 실시형태를 도면을 참조하면서 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시형태에 기재된 구체예로 한정되지 않는다.
또한, 총 Hb농도, HbA1c, 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)는 구체예로서 설명한 것이며, 이들을 상위 개념으로 표현하면 각각 비교 대상 물질의 농도, 측정 대상 물질, 흡광도 변화량이다. 즉, 이하의 설명(도면을 포함함)에서의 용어는 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
(제1 실시형태)
도 1a는 면역 반응~흡광도 측정까지의 공정의 일례를 나타내는 도면이다. 도 1a의 (a)에 나타내는 담체에 항체가 결합되어 있는 상태에서 시료인 항원을 첨가하면 도 1a의 (b)에 나타내는 바와 같이 항원 항체 반응이 발생한다. 도 1a의 (c)에 도시된 바와 같이 면역 응집 반응이 발생한 상태에서, 도 1a의 (d)에 도시된 바와 같이 흡광도 측정을 행한다. 이러한 일반적인 항원 항체 반응과 흡광도 측정을 이용하여 마찬가지로 HbA1c의 농도를 구할 수도 있다. 또한, 도면에서는 담체에 2종류의 항체를 담지시켜 1종류의 항원과 반응하는 예를 나타내었지만, 항원과 항체가 역으로 되어도 된다.
이하, HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구하는 방법에 대해 설명한다.
도 1b는 본 발명의 제1 실시형태에 의한 HbA1c 농도의 측정 기술을 모식적으로 나타내는 도면이고, 도 1c는 HbA1c 농도의 측정 장치의 일 구성예를 나타내는 기능 블록도이다.
본 실시의 하나의 형태로서 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구하기 위한 시약에 항HbA1c 항체 및 항HbA0 항체를 담지시킨 금 콜로이드를 이용하는 응집 반응에 기초한 HbA1c 측정 시약이 사용될 수 있다.
도 1b에 나타내는 바와 같이 금 콜로이드를 이용하는 응집 반응에서는, 예를 들어 HbA1c를 포함한 검체(혈액)(1)와, 항HbA1c 항체 및 항HbA0 항체에 의한 금 콜로이드 응집 반응을 발생시키기 위한 HbA1c 측정 시약(2)을 혼합하여 반응시킨다. HbA1c 측정 시약(2)은, 항HbA1c 항체를 담지시킨 금 콜로이드(3)와, 항HbA0 항체를 담지시킨 금 콜로이드(5)를 포함한다. 검체(1)와 HbA1c 측정 시약(2)에 의해, 검체(1) 중의 HbA1c와의 항원 항체 반응에 의한 응집괴(7)의 생성을 예를 들어 광학적 수법에 의해 검출할 수 있다.
금 콜로이드는 콜로이드 입자의 표면 플라즈몬 공명에 의해 색을 나타내며, 입경의 변화에 의해 색조가 변화하는 것이 알려져 있고, 금 콜로이드를 이용하는 응집 반응에서는 이를 이용하여 응집괴(7)의 생성을 반응액의 색조 변화(적색에서 청색, 최종적으로 금색으로의 변화), 즉 흡수 스펙트럼의 경시 변화로서 관찰, 측정할 수 있다.
도 1c에 나타내는 바와 같이 예시적으로 나타내는 본 실시형태에 의한 HbA1c 농도의 측정 장치(A)는 발광부(11)와 반응 셀(15)과 수광부(21)와, 발광부(11), 수광부(21)를 제어하는 제어부(23)를 가지고 있다. 발광부(11)로부터의 발광이 검체(1)에 조사되고, 그 투과광이 수광부(21)에 수광된다. 제어부(23)에 의해 제어되는 발광과 수광의 관계에 기초하여 검체(1)의 광학적 특성을 평가할 수 있다. 이 예에서는 발광부(11)에는 발광 파장이 상이한 2개의 LED(11a, 11b)가 설치되어 있다. 도 2 이하에서는 분광 분석을 행하고 있지만, 실제 장치로서는 도 1c에 나타내는 바와 같은 간단한 장치를 이용하는 것이 바람직하다.
제어부(23)는 비교 대상 물질의 농도가 상이한 측정 대상 물질의 희석 계열과 상기 측정 시약의 반응이 진행됨으로써 발생하는 상기 측정 대상 물질의 희석 계열 각각의 흡광도 변화량을 구하여 얻어지는 복수의 검량선이 하나의 검량선에 수속되는 농도 계수를 비교 대상 물질의 농도마다 구하는 과정에 있어서,
측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율(%)=[X]/(농도 계수×비교 대상 물질의 농도) (1)
을 얻는 제1 처리부(23a)(도 11b 등 참조)와, 비교 대상 물질의 농도마다의 농도 계수와 비교 대상 물질의 농도의 관계를 나타내는 회귀식을 구하는 제2 처리부(23b)(도 12 등 참조)를 가진다.
제1 처리부(23a)와 제2 처리부(23b)의 처리의 상세에 대해서는 후술한다.
또, 측정 장치는 흡광도 측정(분광 분석 장치)이 가능한 것이면 되고, 광원은 LED나 특정의 2파장으로 한정되는 것은 아니다.
도 2는 항체를 담지시킨 금 콜로이드 응집 반응의 흡수 스펙트럼을 분광 광도계로 측정한 결과의 일례를 나타내는 도면이다. 가로축이 파장, 세로축이 흡광도이며, 경과 시간마다의 해석 결과(측정 결과)가 나타나 있다.
도 2에 나타내는 바와 같이 검체와 시약을 이용하여 반응시킨 시료에 조사한 광의 파장 525nm 부근의 흡광도 감소 및 시료에 조사한 광의 630nm 부근의 흡광도 상승을 볼 수 있다. 이 흡광도의 변화는 금 콜로이드 응집 반응에 기인하는 것이며, 흡광도는 응집 정도의 기준이 된다.
파장 525nm 부근은 금 콜로이드 응집 반응의 경시 변화에 있어서 흡광도가 저하되는 파장 범위 내이면 이 파장에 한정되지 않는다. 또한, 파장 630nm 부근은 금 콜로이드 응집 반응의 경시 변화에 있어서 흡광도가 상승하는 파장 범위 내이면 이 파장에 한정되지 않는다.
따라서, 이 흡광도의 변화(감소, 증가 중 적어도 어느 한쪽)에 기초하여 HbA1c의 양을 구할 수 있다. 단, 흡광도의 경시 변화의 변화량(절대값)이 미소한 경우, 예를 들어 앰프 등을 이용하여 신호를 증폭하여 흡광도의 경시 변화를 정밀도 높게 구할 수도 있다. 혹은, 2개의 파장을 이용하는 방법도 생각할 수 있다.
예를 들어, 도 3은 도 2의 데이터에 기초하여 얻어지는 도면으로, 파장 525nm에서의 흡광도와 파장 630nm에서의 흡광도의 비율, 흡광도 525nm/흡광도 630nm(이하, 「흡광도 비(Ratio)」라고 부름)를 구하고, 반응 개시 시간(시간=0)으로부터의 경과 시간 의존성을 나타낸 도면이다. 도 3에 나타내는 바와 같이 흡광도의 경시적인 감소(흡광도 비(Ratio)의 감소 속도)는 HbA1c 농도에 의존하는 것을 알 수 있다.
또, 이 경우도 파장 525nm 부근은 금 콜로이드 응집 반응의 경시 변화에 있어서 흡광도가 저하되는 파장 범위 내이면 측정 파장은 이 파장에 한정되지 않는다. 또한, 파장 630nm 부근은 금 콜로이드 응집 반응의 경시 변화에 있어서 흡광도가 커지는 파장 범위 내이면 이들 파장에 한정되는 것이 아니다.
도 3으로부터 흡광도 비(Ratio)의 경시 변화를 현저하게 관측할 수 있기 때문에 흡광도 비(Ratio)를 이용함으로써 측정 대상인 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 간단하게 계측할 수 있을 가능성이 있음을 이해할 수 있다.
측정 대상인 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율은 적혈구 중에 포함되는 총 Hb에서 차지하는 안정형 β쇄 monoglycated Hb(Hb의 β쇄에 글루코오스가 1분자 안정적으로 결합한 Hb)의 비율로 정의된다. 따라서, HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 산출하기 위해서는 분모가 되는 총 Hb농도의 산출도 필요하다.
그래서, 이 점도 고려한 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율의 측정 기술에 대해 이하에 상세하게 설명한다.
(용혈 희석 후의 총 Hb농도 측정)
도 10은 본 실시형태에 의한 처리의 일례를 나타내는 흐름도이다.
우선, 검체의 전처리로서 전혈을 용혈(적혈구를 붕괴시켜 Hb를 혈구 밖으로 용출시키는 처리)시킨다(단계 S1).
다음으로 총 Hb농도 측정용 검량선을 이하와 같이 하여 작성하였다.
용혈에 이용한 전처리액을 희석액으로서 사용하여 단계 희석한 Hb농도를 이미 알고 있는(종농도 0.5~2.5mg/mL) 캘리브레이터를 측정하였을 때의 파장 405nm에서의 흡광도를 측정한다(단계 S2). Hb의 특징적인 흡수 파장(부근)인 405nm에서의 흡광도를 가로축, 이미 알고 있는 총 Hb농도를 세로축에 취하였다.
도 4는 총 Hb농도(y)와 흡광도(x)의 관계를 나타내는 도면이며, 이 상관도로부터 총 Hb농도 측정용 검량선을 구할 수 있다.
이하의 식으로 나타나고 도 4에 예시되는 검량선이 구해지고(단계 S3), 이 예에서는 3차 회귀선으로 되어 있다.
y=201.67x3+47.65x2+15.059x-0.3409, R2=0.9973 (2)
이 검량선에 의해 총 Hb농도를 구할 수 있다(단계 S4).
(HbA1c의 정량 측정)
총 Hb농도는 단순한 흡광도 측정에 의해 측정하는 것이 가능하다. 그러나, 항원 항체 반응에 의한 HbA1c 정량 측정은 항원과 항체의 양적 균형 중에서 이루어진다. 또한, 상기와 같이 HbA1c의 농도(즉, 측정 반응계 내의 HbA1c의 절대량)는 가변값인 총 Hb농도에 따라서도 변동한다.
그래서, 이하와 같이 총 Hb농도가 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5mg/mL이고 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이 3.7~15.3%인 검체를 이용하여 측정을 행하였다.
도 5는 반응 개시 5분 후의 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율과 파장 525nm에서의 흡광도 변화(변화량Δ)를 플롯한 그래프이다. 도 5에 나타내는 바와 같이 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율과 흡광도 변화의 사이에 측정 반응계 내의 HbA1c의 절대량에 대한 의존이 인정된다. 흡광도 변화는 측정 반응계 내의 HbA1c의 절대량에 의존하고 있기 때문에 동일한 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율에서도 총 Hb농도에 따라 다른 흡광도 변화를 나타내는 것을 알 수 있다.
도 5에서의 가로축은 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율인데 도 5를 보면 알 수 있는 바와 같이 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율에 대한 흡광도 변화(변화량Δ)는 소정의 HbA1c 범위(도면에서는 6%에서 12% 정도)에서 총 Hb농도에 거의 비례하게 되어 있는 것을 알 수 있다.
도 5로부터 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 결정한다(도 10, 단계 S5).
이상 설명한 바와 같이 본 실시형태에서는 도 5에 나타내는 바와 같은 총 Hb농도에 의존하는 검량선에 기초하여 흡광도 변화(변화량Δ)에 의존하는 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 구할 수 있다.
또, 이러한 검량선으로서 후술하는 도 14에 나타내는 검량선을 이용할 수도 있다.
(제2 실시형태)
이하, 본 발명의 제2 실시형태에 대해 상세하게 설명한다.
제1 실시형태에서는 도 5와 같이 총 Hb농도마다 망라적으로 검량선을 설정할 필요가 있어 HbA1c의 농도 결정을 위한 처리가 번잡해진다.
이하, 상기와 같은 과제를 해결하기 위한 제1 실시형태의 단계 S5 대신에 행하는 처리 방법에 대해 상세하게 설명한다.
본 실시형태에서는 흡광도 변화(변화량Δ), 예를 들어 파장 525nm(도 2 참조)에서의 흡광도의 경시 변화에 기초한 수법에 대해 설명한다.
도 5는 제1 실시형태에서도 설명한 바와 같이 반응 개시 5분 후의 HbA1c 농도와 파장 525nm에서의 흡광도 변화(변화량Δ)를 플롯한 그래프이다. 도 5에 나타내는 바와 같이 흡광도 변화가 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율에 의존하는 관계가 인정된다. 흡광도 변화(변화량Δ)는 HbA1c의 농도(측정 반응계 내의 HbA1c의 절대량)에 의존하고 있기 때문에 동일한 HbA1c의 비율이어도 총 Hb농도에 따라 다른 흡광도 변화를 나타내는 것을 알 수 있다.
도 11a는 도 10에 이어지는 도면이다.
우선, 도 5에서의 가로축은 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율인데, 도 5에 볼 수 있는 바와 같이 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율에 대한 흡광도 변화(변화량Δ)는 총 Hb농도에 거의 비례하게 되어 있는 것을 알 수 있다.
여기서, 도 6에 나타내는 바와 같이 가로축을 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=[x1]로 하면 도 5에서는 총 Hb농도에 크게 의존하고 있던 흡광도 변화(변화량Δ)와 HbA1c의 비율의 관계가 흡광도 변화(변화량Δ)와 [x1]는 하나의 관계로서 수속되어 가는 경향을 갖는 것을 알 수 있었다. [x1]은 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율로서 총 Hb농도를 고려한 제1 HbA1c 농도라고 할 수 있다.
단, 도 6에 나타내는 바와 같이 흡광도 변화(변화량Δ)가 큰 [x1]의 범위에서는 총 Hb농도 의존이 남아 있어 수속이 그다지 양호하지 않은 것을 알 수 있다. 그래서, 도 6의 수속이 양호해지도록, 즉 흡광도 변화(변화량Δ)와 [x1]의 관계가 총 Hb농도에 의존하지 않고 상관성이 높아지도록 총 Hb농도에 의존하는 보정 계수(농도 계수: Factor)를 갖게 하였다.
여기서는 예시적으로 도 7a에 나타내는 바와 같이 총 Hb농도가 1.50mg/mL일 때에 Factor가 1.00이 되고, 총 Hb농도가 낮아지면 높아지고 총 Hb농도가 높아지면 낮아지도록 농도 계수(Factor)를 설정하였다(단계 S6).
그리고, 도 6에 관해 가로축을 [x2]=총 Hb농도×Factor×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=농도 계수(Factor)×[x1]로 한다. 그리고, 흡광도 변화(변화량Δ)와 [x2]의 관계가 하나에 수속되도록 총 Hb농도마다 농도 계수(Factor)를 구한다(단계 S7).
그러면, 도 7b에 나타내는 바와 같이 Hb농도에 관해 거의 단조 감소가 되는 농도 계수(Factor)를 구할 수 있다.
도 7b는 총 Hb농도(y)와 농도 계수(z)의 회귀 곡선을 나타내는 도면이며, 이하의 회귀식으로 나타낼 수 있다. 이 예에서는 3차 회귀식으로 되어 있다.
y=-0.1892z3+1.014z2-2.0729z+2.492, R2=0.9792 (3)
이 회귀식에 의해 총 Hb농도로부터 그 총 Hb농도에서의 농도 계수를 구할 수 있다.
도 8은, 도 7b에 나타내는 농도 계수(Factor)를 이용하여 [x2]와 흡광도 변화(변화량Δ)의 관계를 구한 도면이다. 도 8에 나타내는 바와 같이 [x2]의 모든 범위에서 총 Hb농도에 의존하지 않는 [x2]와 흡광도 변화(변화량Δ)의 관계를 구할 수 있다.
[x2]는 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율×농도 계수(Factor)이며, 총 Hb농도와 그 농도 계수를 고려한 제2 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이라고 할 수 있다.
또한, 도 8의 x축과 y축을 바꾸면 도 9에 나타내는 바와 같이 흡광도 변화(변화량Δ)와 [x2]의 관계를 총 Hb농도에 의존하지 않도록 하여 일률적으로 구할 수 있다(단계 S8).
즉, 도 9에 나타내는 검량선을 이용함으로써 하기의 식(4)으로부터 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 종래보다 간단한 처리에 의해 구할 수 있다. [x2]는 즉 흡광도 변화량[X]이다.
Figure pct00001
이상과 같이 본 실시형태에 의하면 검량선을 하나로 하여 HbA1c의 농도를 간단하게 구할 수 있다.
또, 농도 계수(Factor)는 시약에 의존하기 때문에 상이한 로트의 시약을 이용하는 경우에는 도 7b의 관계를 새로 구하는 것이 바람직하다.
도 12, 도 13은 농도 계수(Factor)를 구하는 상기 도 11a의 S7의 처리예를 나타내는 흐름도이다.
우선, 단계 S7-1에서 다른 총 Hb농도마다 HbA1c의 희석 계열(희석한 시료)에 대해 흡광도를 측정한다.
단계 S7-2에서 모든 희석 계열에 대해 측정한 흡광도로부터 흡광도 변화로서 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 제3 실시형태에서 후술하는 흡광도 비(Ratio)를 구한다.
단계 S7-3에서, 상이한 총 Hb농도 각각의 농도 계수(Factor)를 모두 임의의 정수로 고정할 때 [x2]와 흡광도 변화량 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2를 구한다.
단계 S7-4에서, 다른 총 Hb농도마다 농도 계수(Factor)를 최적화한다.
최적화의 순서는 도 13을 참조하여 예시한다.
단계 S7-5에서, 총 Hb농도와 농도 계수(Factor)의 n차 회귀식을 작성한다. 이 도면이 예를 들어 도 7b이다.
도 13에 나타내는 바와 같이 단계 S7-4에서의 다른 총 Hb농도마다 농도 계수(Factor)를 최적화하는 처리에 대해 이하에 설명한다.
도 13에서, 한 바퀴째, 즉 n=1에서는 이하와 같다.
단계 S21-1: 최적화 대상의 총 Hb농도 이외의 각각의 농도에서의 농도 계수(Factor)를 임의의 정수로 고정하고, 최적화 대상의 총 Hb농도에 있어서 [x]와 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2가 최대가 되는 농도 계수(Factor)를 구한다.
단계 S21-2: 단계 S21-1에서 최적화 대상으로 한 농도에서 구한 농도 계수(Factor)를 이용하여 새로 최적화 대상으로 하는 농도를 제외한 나머지 각 농도에서의 농도 계수(Factor)를 단계 S21-1에서 이용한 임의의 정수로 고정하고, 최적화 대상의 총 Hb농도에 있어서 [x]와 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2가 최대가 되는 농도 계수(Factor)를 구한다.
단계 S21-3: 단계 S21-1, 2에서 최적화 대상으로 한 각각의 농도에서 구한 Factor를 이용하여 새로 최적화 대상으로 하는 농도를 제외한 나머지 각 농도에서의 Factor에 단계 S21-1에서 이용한 임의의 정수로 고정하고, 최적화 대상의 총 Hb농도에 있어서 [x]와 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2가 최대가 되는 농도 계수(Factor)를 구한다.
단계 S21-4 이후: 나머지 각 농도에 대해서도 순차적으로 동일하게 이전 단계에서 구한 농도 계수(Factor)를 이용하여 각 농도에 있어서 [x]와 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2가 최대가 되는 농도 계수(Factor)를 구한다.
2바퀴째 이후, 즉 n≥2에서는 이하의 처리를 행한다.
단계 S22-1: 최적화 대상의 총 Hb농도 이외의 각각의 농도에서의 농도 계수(Factor)에 한 바퀴 전에 구한 각각의 농도 계수(Factor)를 이용하여 최적화 대상의 총 Hb농도에 있어서 [x]와 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2가 최대가 되는 농도 계수(Factor)를 구한다.
단계 S22-2: 단계 S22-1에서 최적화 대상으로 한 농도에서 구한 농도 계수(Factor)를 이용하여 새로 최적화 대상으로 하는 농도를 제외한 나머지 각 농도에서의 농도 계수(Factor)에 한 바퀴 전에 구한 각각의 농도 계수(Factor)를 이용하여 최적화 대상의 총 Hb농도에 있어서 [x]와 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2가 최대가 되는 농도 계수(Factor)를 구한다.
단계 S22-3: 단계 S22-1, 단계 S22-2에서 대상으로 한 각각의 농도에서 구한 농도 계수(Factor)를 이용하여 새로 최적화 대상으로 하는 농도를 제외한 나머지 각 농도에서의 농도 계수(Factor)에 한 바퀴 전에 구한 각 농도에서의 각각의 농도 계수(Factor)를 이용하여 최적화 대상의 총 Hb농도에 있어서 [x]와 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2가 최대가 되는 농도 계수(Factor)를 구한다.
단계 S22-4 이후: 나머지 각 농도에 대해서도 순차적으로 동일하게 이전 단계에서 구한 농도 계수(Factor)를 이용하여 각 농도에 있어서 [x]와 흡광도 변화(변화량Δ) 혹은 흡광도 비(Ratio)의 R2가 최대가 되는 농도 계수(Factor)를 구한다.
단계 S22-1부터 단계 S22-4의 처리를 반복한다.
단계 S23에서, 최종 단계로서 각 총 Hb농도에서의 농도 계수(Factor)가 한 바퀴 전의 값과 동일해질 때 Factor의 최적화 처리는 종료된다.
이상과 같이 상이한 총 Hb농도마다 농도 계수(Factor)의 최적화 처리를 행하여 도 7b에 도시된 바와 같은 농도 계수(Factor)가 Hb농도에 의존하는 관계를 구할 수 있다. 또, 도 12, 13에 나타낸 최적화 수법 이외의 수법이어도 다른 총 Hb농도마다 농도 계수(Factor)를 최적화할 수 있는 처리이면 이용할 수 있다.
이하에 측정값 산출의 순서를 정리한다.
도 11b는 도 11a에 이어지는 도면으로, 측정값 산출의 순서를 정리한 흐름도이다.
1) 총 Hb농도를 측정한다(검량선: 흡광도 405nm vs 총 Hb농도)(단계 S11).
2) HbA1c를 포함한 시료의 금 콜로이드 응집 반응에 의한 흡광도 변화량(본 실시형태에서는 흡광도 변화(변화량Δ))을 측정한다(단계 S12).
3) 1)(단계 S11)에서 얻어진 총 Hb농도와, 총 Hb농도와 농도 계수의 관계를 나타내는 회귀식(3)으로부터 Factor를 산출한다(검량선: 총 Hb농도 vs Factor)(단계 S13).
4) 상기의 식(4)에 각 값을 대입하여 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 산출한다(단계 S14).
이상과 같이 하여 본 실시형태에 의하면 총 Hb농도에 의존하지 않는 단일의 검량선(다중 검량선)을 이용함으로써 흡광도의 측정값으로부터 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 간단하게 구할 수 있다.
이상과 같이 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율 vs 흡광도 변화량은 총 Hb농도마다 독립적인 곡선을 그리지만, 본 실시형태에 의하면 총 Hb농도 의존적인 계수(Factor)를 설정하면 총 Hb농도에 따르지 않고 흡광도 변화량 vs [X]는 하나의 곡선에 수속된다. 따라서, 총 Hb농도마다 몇 개씩 망라적으로 검량선을 작성하지 않아도 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율의 측정이 가능해진다.
(제3 실시형태)
이하, 본 발명의 제3 실시형태에 대해 상세하게 설명한다.
본 실시형태에서는 흡광도 변화의 지표로서 흡광도 비(흡광도 525nm/흡광도 630nm)를 변수로 하여 HbA1c의 농도를 구하기 위한 검량선을 구하였다.
도 14는 총 Hb농도가 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5mg/mL이고 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이 3.7~15.3%인 검체를 이용하여 측정을 행하였을 때의 반응 개시 5분 후의 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율과, 파장 525nm에서의 흡광도와 파장 630nm에서의 흡광도의 비율, 즉 흡광도 비(Ratio)를 플롯한 그래프이다.
우선, 도 14에서의 가로축은 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율인데 도 14를 보면 알 수 있는 바와 같이 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율에 대한 흡광도 비(Ratio)는 총 Hb농도에 거의 반비례하게 되어 있는 것을 알 수 있다.
그래서, 도 15에 나타내는 바와 같이 가로축을 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=[x1]로 하면 도 5에서는 총 Hb농도에 크게 의존하고 있던 흡광도 비(Ratio)와 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율의 관계가 흡광도 비(Ratio)와 [x1]은 하나의 관계로서 수속되어 가는 경향을 갖는 것을 알 수 있었다. [x1]은 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율로서 총 Hb농도를 고려한 제1 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이라고 할 수 있다.
단, 도 15에 나타내는 바와 같이 흡광도 비(Ratio)의 변화가 큰 [x1]의 범위에서는 총 Hb농도 의존이 남아 있어 수속이 그다지 양호하지 않은 것을 알 수 있다. 그래서, 도 15의 수속이 양호해지도록, 즉 흡광도 비(Ratio)와 [x1]의 관계가 총 Hb농도에 의존하지 않고 상관성이 높아지도록 제2 실시형태와 마찬가지로 총 Hb농도에 의존하는 보정 계수(농도 계수: Factor)를 갖게 하였다.
여기서는 예시적으로 도 16a에 나타내는 바와 같이 총 Hb농도가 1.50mg/mL일 때에 Factor가 1.00이 되고, 총 Hb농도가 낮아지면 높아지고 총 Hb농도가 높아지면 낮아지도록 농도 계수(Factor)를 설정하였다(도 11a, 단계 S6).
그리고, 도 15에 관해 가로축을 [x2]=총 Hb농도×Factor×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=농도 계수(Factor)×[x1]로 한다. 그리고, 흡광도 비(Ratio)와 [x2]의 관계가 하나에 수속되도록 농도 계수(Factor)를 구한다(도 11a, 단계 S7).
그러면, 도 16b에 나타내는 바와 같이 Hb농도에 관해 단조 감소가 되는 농도 계수(Factor)를 구할 수 있다.
도 16b는 총 Hb농도(y)와 농도 계수(z)의 회귀 곡선을 나타내는 도면이며, 이하의 회귀식으로 나타낼 수 있다. 이 예에서는 3차 회귀식으로 되어 있다.
y=-0.0871z3+0.5819z2-1.508z+2.2185, R2=0.9984 (5)
이 회귀식에 의해 총 Hb농도로부터 그 총 Hb농도에서의 농도 계수를 구할 수 있다.
도 17은 도 16b에 도시된 농도 계수(Factor)를 이용하여 [x2]와 흡광도 비(Ratio)의 관계를 구한 도면이다. 도 17에 나타내는 바와 같이 [x2]의 모든 범위에서 총 Hb농도에 의존하지 않는 [x2]와 흡광도 비(Ratio)의 관계를 구할 수 있다.
[x2]는 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율×농도 계수(Factor)로서, 총 Hb농도와 그 농도 계수를 고려한 제2 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이라고 할 수 있다.
또한, 도 17의 x축과 y축을 바꾸면 도 18에 나타내는 바와 같이 흡광도 비(Ratio)와 [x2]의 관계를 총 Hb농도에 의존하지 않도록 하여 일률적으로 구할 수 있다(도 11a, 단계 S8).
즉, 도 18에 도시된 검량선을 이용함으로써 하기의 식(6)으로부터 HbA1c의 농도를 종래보다 간단한 처리에 의해 구할 수 있다. [x2]는 즉 흡광도 변화량[X]이다.
Figure pct00002
본 실시형태에서는 흡광도 변화량으로서 흡광도 비(Ratio)를 파라미터로서 이용하였기 때문에 흡광도의 변화량이 작은 경우에도 변화량을 크게 하여 검량선을 작성할 수 있다. 또한, HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 정밀도 높게 측정할 수 있다.
1) 총 Hb농도를 측정한다(검량선: 흡광도 405nm vs 총 Hb농도)(도 11b, 단계 S11).
2) HbA1c를 포함한 시료의 금 콜로이드 응집 반응에 의한 흡광도 변화량으로서 흡광도 비(Ratio)를 측정한다(도 11b, 단계 S12).
3) 1)(도 11b, 단계 S11)에서 얻어진 총 Hb농도와, 총 Hb농도와 농도 계수의 관계를 나타내는 회귀식(5)으로부터 Factor를 산출한다(검량선: 총 Hb농도 vs Factor)(도 11b, 단계 S13).
4) 상기의 식(6)에 각 값을 대입하여 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 산출한다(도 11b, 단계 S14).
이상과 같이 하여 본 실시형태에 의하면 총 Hb농도에 의존하지 않는 단일의 검량선(다중 검량선)을 이용함으로써 흡광도의 측정값으로부터 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 간단하게 구할 수 있다.
이상과 같이 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율 vs 흡광도 변화량은 총 Hb농도마다 독립적인 곡선을 그리지만, 본 실시형태에 의하면 총 Hb농도 의존적인 계수(Factor)를 설정하면 총 Hb농도에 따르지 않고 흡광도 변화량 vs [X]는 하나의 곡선에 수속된다. 따라서, 총 Hb농도마다 몇 개씩 망라적으로 검량선을 작성하지 않아도 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율의 측정이 가능해진다.
(제4 실시형태)
제2 실시형태와 같이 본 발명의 제4 실시형태에서는 흡광도의 변화(변화량Δ), 예를 들어 파장 525nm(도 2 참조)에서의 흡광도의 경시 변화에 기초한 수법에 대해 설명한다. 단, 농도가 상이한 측정 대상 물질의 희석 계열을 3종류로 한 예를 나타내고 있다.
도 19는 총 Hb농도가 1.0, 2.0, 2.5mg/mL이고 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이 5.7~15.3%인 검체를 이용하여 측정을 행하였을 때의 반응 개시 5분 후의 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율과 파장 525nm에서의 흡광도 변화(변화량Δ)를 플롯한 그래프이다.
우선, 도 19에서의 가로축은 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율인데, 도 19에서 볼 수 있는 바와 같이 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율에 대한 흡광도 변화(변화량Δ)는 총 Hb농도에 거의 비례하게 되어 있는 것을 알 수 있다.
그래서, 도 20에 나타내는 바와 같이 가로축을 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=[x1]로 하면 도 19에서는 총 Hb농도에 크게 의존하고 있던 흡광도 변화(변화량Δ)와 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율의 관계가 흡광도 변화(변화량Δ)와 [x1]은 하나의 관계로서 수속되어 가는 경향을 갖는 것을 알 수 있었다. [x1]은 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율로서 총 Hb농도를 고려한 제1 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이라고 할 수 있다.
단, 도 20에 나타내는 바와 같이 흡광도 변화(변화량Δ)가 큰 [x1]의 범위에서는 총 Hb농도 의존이 남아 있어 수속이 그다지 양호하지 않은 것을 알 수 있다. 그래서, 도 20의 수속이 양호해지도록, 즉 흡광도 변화(변화량Δ)와 [x1]의 관계가 총 Hb농도에 의존하지 않고 상관성이 높아지도록 제2, 3 실시형태와 마찬가지로 총 Hb농도에 의존하는 보정 계수(농도 계수: Factor)를 갖게 하였다.
여기서는 예시적으로 도 21a에 나타내는 바와 같이 총 Hb농도가 2.00mg/mL일 때에 Factor가 1.00이 되고, 총 Hb농도가 낮아지면 높아지고 총 Hb농도가 높아지면 낮아지도록 농도 계수(Factor)를 설정하였다(도 11a, 단계 S6).
그리고, 도 20에 관해 가로축을 [x2]=총 Hb농도×Factor×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율=농도 계수(Factor)×[x1]로 한다. 그리고, 흡광도 변화(변화량Δ)와 [x2]의 관계가 하나에 수속되도록 농도 계수(Factor)를 구한다(도 11a, 단계 S7).
그러면, 도 21b에 나타내는 바와 같이 Hb농도에 관해 단조 감소가 되는 농도 계수(Factor)를 구할 수 있다.
도 21b는 총 Hb농도(y)와 농도 계수(z)의 회귀 곡선을 나타내는 도면이며, 이하의 회귀식으로 나타낼 수 있다. 이 예에서는 2차 회귀식으로 되어 있다.
y=0.18z2-0.93z+2.18, R2=1 (7)
이 회귀식에 의해 총 Hb농도로부터 그 총 Hb농도에서의 농도 계수를 구할 수 있다.
도 22는 도 21b에 나타내는 농도 계수(Factor)를 이용하여 [x2]와 흡광도 변화(변화량Δ)의 관계를 구한 도면이다. 도 22에 나타내는 바와 같이 [x2]의 모든 범위에서 총 Hb농도에 의존하지 않는 [x2]와 흡광도 변화(변화량Δ)의 관계를 구할 수 있다.
[x2]는 총 Hb농도×HbA1c의 총 Hb에 대한 비율×농도 계수(Factor)로서, 총 Hb농도와 그 농도 계수를 고려한 제2 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율이라고 할 수 있다.
또한, 도 22의 x축과 y축을 바꾸면 도 23에 도시된 바와 같이 흡광도 변화(변화량Δ)와 [x2]의 관계를 총 Hb농도에 의존하지 않도록 하여 일률적으로 구할 수 있다(도 11a, 단계 S8).
즉, 도 22에 도시된 검량선을 이용함으로써 하기의 식(8)으로부터 HbA1c의 농도를 종래보다 간단한 처리에 의해 구할 수 있다. [x2]는 즉 흡광도 변화(변화량Δ)[X]이다.
Figure pct00003
이상과 같이 하여 본 실시형태에 의하면 농도가 상이한 측정 대상 물질의 희석 계열을 3종류로 하여 구한 총 Hb농도에 의존하지 않는 단일의 검량선(다중 검량선)을 이용함으로써 흡광도의 측정값으로부터 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 간단하게 구할 수 있다.
1) 총 Hb농도를 측정한다(검량선: 흡광도 405nm vs 총 Hb농도)(도 11b, 단계 S11).
2) HbA1c를 포함한 시료의 금 콜로이드 응집 반응에 의한 흡광도 변화량(본 실시형태에서는 흡광도 변화(변화량Δ))을 측정한다(도 11b, 단계 S12).
3) 1)(도 11b, 단계 S11)에서 얻어진 총 Hb농도와, 총 Hb농도와 농도 계수의 관계를 나타내는 회귀식(7)으로부터 Factor를 산출한다(검량선: 총 Hb농도 vs Factor)(도 11 B, 단계 S13).
4) 상기의 식(8)에 각 값을 대입하여 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율을 산출한다(도 11b, 단계 S14).
이상과 같이 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율 vs 흡광도 변화량은 총 Hb농도마다 독립적인 곡선을 그리지만, 본 실시형태에 의하면 총 Hb농도 의존적인 계수(Factor)를 설정하면 총 Hb농도에 따르지 않고 흡광도 변화량 vs [X]는 하나의 곡선에 수속된다. 따라서, 총 Hb농도마다 몇 개나 망라적으로 검량선을 작성하지 않아도 HbA1c의 총 Hb에 대한 비율의 측정이 가능해진다.
처리 및 제어는 CPU(Central Processing Unit)나 GPU(Graphics Processing Unit)에 의한 소프트웨어 처리, ASIC(Application Specific Integrated Circuit)나 FPGA(Field Programmable Gate Array)에 의한 하드웨어 처리에 의해 실현할 수 있다.
또한, 상기 실시형태에 있어서 첨부 도면에 도시되어 있는 구성 등에 대해서는 이들에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 효과를 발휘하는 범위 내에서 적절히 변경하는 것이 가능하다. 그 밖에 본 발명의 목적의 범위를 벗어나지 않는 한에서 적절히 변경하여 실시하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 각 구성요소는 임의로 취사선택할 수 있고, 취사선택한 구성을 구비하는 발명도 본 발명에 포함되는 것이다.
예를 들어, 흡광도 측정부와 제어부가 일체인 장치이어도 된다. 혹은, 개별적인(독립적인) 장치로도 된다.
또한, 제어부는 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법을 실행하는 프로그램 혹은 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법에 의해 얻어진 회귀식을 내장하도록 해도 되고, 장치의 외부로부터 읽어들여 실행하도록 해도 된다.
예를 들어, 도 1c 중에서 발광부(11)와 반응 셀(15)과 수광부(21)를 갖는 휴대 형태 가능한 검사용 단말(검사 장치)을 제어부와는 별도로 형성해도 된다. 그리고, 검사용 단말에 의해 측정된 측정값을 도시하지 않은 유선 또는 무선 통신부에 의해 관리 센터 등에 설치되는 제어부(23)로 보내고, 검사 결과를 관리 센터 측에서 구하도록 해도 된다. 혹은, 검사 결과를 검사용 단말에 회신하도록 해도 된다.
이와 같이 하면 검사용 단말(검사 장치)만을 이용하여 검체의 검사를 행하는 것도 가능하다.
나아가 회귀식의 정보는 측정(시험)용 칩에 내장되는 시약의 제조 로트마다 변화하기 때문에 미리 본 발명의 방법에 의해 얻어진 회귀식의 정보를 측정(시험)용 칩에 기억시키도록 해도 된다.
또한, 본 실시형태에서 설명한 기능을 실현하기 위한 프로그램을 컴퓨터 판독 가능한 기록매체에 기록하고, 이 기록매체에 기록된 프로그램을 컴퓨터 시스템에 읽어들이게 하여 실행함으로써 각 부의 처리를 행해도 된다. 또, 여기서 말하는 「컴퓨터 시스템」이란 OS나 주변 기기 등의 하드웨어를 포함하는 것으로 한다.
본 발명은 HbA1c, 글리코알부민 혹은 아이소자임 등의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법으로서 이용 가능하다.
1…검체, 2…HbA1c 측정 시약, 3…항HbA1c 항체 감작 금 콜로이드, 5…항HbA0 항체 감작 금 콜로이드, 7…응집괴, 11…발광부, 15…반응 셀, 21…수광부, 23…제어부.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.

Claims (10)

  1. 측정 대상 물질의 측정 시약을 이용한 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법으로서,
    비교 대상 물질의 농도가 상이한 측정 대상 물질의 희석 계열과 상기 측정 시약의 반응이 진행됨으로써 발생하는 상기 측정 대상 물질의 희석 계열 각각의 흡광도 변화량을 구하여 얻어지는 복수의 검량선이 하나의 검량선에 수속되는 농도 계수를 비교 대상 물질의 농도마다 구하는 과정에 있어서,
    측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율(%)=[X]/(농도 계수×비교 대상 물질의 농도) (1)
    을 얻는 단계와,
    비교 대상 물질의 농도마다의 농도 계수와 비교 대상 물질의 농도의 관계를 나타내는 회귀식을 구하는 단계를 갖는 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 흡광도 변화량을 구하는 단계는,
    측정 대상 물질을 포함한 검체와 상기 측정 시약에 의해 발생하는 반응이 진행됨으로써 발생하는 특징적인 단파장에서의 흡광도 증가 혹은 감소의 변화량을 구하는 단계, 혹은
    측정 대상 물질을 포함한 검체와 상기 측정 시약에 의해 발생하는 반응이 진행됨으로써 발생하는 특징적인 2파장에서의 흡광도 증가 혹은 감소의 변화량으로서, 흡광도가 증가하거나 혹은 감소하는 제1 파장에서의 제1 흡광도와, 흡광도가 증가하거나 혹은 감소하는 제2 파장에서의 제2 흡광도의 차 혹은 비를 구하는 단계를 갖는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 측정 시약이, 면역법의 응집법이나 응집 저지법 혹은 효소법 중 어느 하나를 이용하는 측정 시약이며,
    상기 식(1), 및 비교 대상 물질의 농도마다 최적화한 농도 계수와 비교 대상 물질의 농도의 회귀식과, 측정 시약을 이용하여 측정 대상 물질을 포함한 검체를 측정하여 얻는 흡광도 변화량으로부터, 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 단계를 갖는 방법.
  4. 컴퓨터에,
    청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 방법을 실행시키기 위한 프로그램.
  5. 청구항 4에 기재된 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체.
  6. 측정 대상 물질의 측정 시약을 이용한 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 장치로서,
    청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 방법을 실행시키기 위한 제어부와,
    흡광도 측정부를 갖는 장치이며,
    제어부와 흡광도 측정부는 일체 혹은 별도의 개체로 설치되어 있는 장치.
  7. 청구항 4에 기재된 프로그램을 내장하는 제어부를 갖는 장치.
  8. 청구항 4에 기재된 프로그램을 읽어들이는 제어부를 갖는 장치.
  9. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 방법을 실행하여 얻어진 회귀식을 내장하는 제어부를 갖는 장치.
  10. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 방법을 실행하여 얻어진 회귀식을 읽어들이는 제어부를 갖는 장치.
KR1020187032054A 2016-05-13 2017-05-10 측정 대상 물질의 비교 대상 물질에 대한 비율을 구하는 방법, 프로그램, 기억 매체 및 장치 KR20190006955A (ko)

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