JPS58193459A - アンモニアおよび尿素の分析具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体試料、特に体液、例えば血液、血清、血漿
、唾液中のアンモニアおよび尿素の分析具に関するもの
である。

アンモニアは主として体内の蛋白質代謝の過程における
アミノ酸の脱アミノ化および食事によって摂取される蛋
白質の細菌などによる生成があり、近年こ−の血中アン
モニア濃度の測定が、肝性脳症を伴う重症肝疾患、とく
に劇症肝炎、肝硬変などの病態把握やその治療を行う際
に重要視されるとともに、先天性尿素サイクル酵素欠損
症や先天性アミノ酸代謝異常症の診断治療に欠くことの
できない検査として注目されている。

尿素は人体における蛋白質代謝の反応主生成物であり、
尿素の濃度は腎機能の指標となるし、毒性物質は尿素の
度合いに概ね比例して血液中に含まれるので、高濃度の
血中尿素は、医師にとって診断上重要な指標となる。

このようにアンモニアおよび尿素の測定は臨床的見地か
ら極めて重要である。

臨床化学でよく知られているアンモニアの測定法には、
従来からコンウェイ　（Ｃｏｎｗａｙ）やセリグソン（
Ｓｅｌｉｇｓｏｎ）らの微量拡散法、イオン交換樹脂性
、さらには、除蛋白比色法ならびに最近では酵素法があ
る。又、尿素の測定法には、従来では、尿素とジアセチ
ルモノオキシムを反応させ、新しく生成した化合物の化
合物の吸収を光度針で測定するジアセチルモノオキシム
法、近代的には、尿素をウレアーゼにて分解し、炭酸ア
ンモニウムにした後、アンモニアを公知のネスラー（ｎ
ｅｓｓｌｅｒ　）試薬又はバースロット（Ｂｅｒｔｈｅ
ｌｏｔ　）試薬にて生成した着色反応物の呈色度を調べ
る方法がある。

しかしこれらの方法は正確である反面、■多量の検体を
要する、■検量線をその度毎に作成しなければならない
、■分析に長時間を要する、■特殊な分析装置を必要と
する、■毒劇物を使用するなど、多くの欠点を有してい
る。

そこで、これらの欠点を是正し、手軽に測定するための
測定具がいくつが開発されている。

例えば、米国マイルス社より発売されているアゾスティ
ックス（商品名）で知られる尿素濃度測定用試験紙があ
る。これは濾紙の細片にウレアーゼと緩衝剤を含浸させ
てあり、全血の１滴を塗布して、１分間反応を待って全
血中の赤い血球成分を水洗除去し、表面に呈した色調を
あらかじめ作成された標準比色表を用いて肉眼判定して
血中の尿素濃度を大まかに知るものである。この試験具
は簡易性迅速性を満たしているが、検体が全血に限られ
ており、かつ、その全血のへマトクリソト値に測定結果
が大きく影響を受け、さらに血球成分を水洗除去した後
はただちに呈色度が低下するなどの分析の精密・正確さ
に重大な欠点を有している。

次に、特公昭５０−１６１９号明細書には、強酸性イオ
ン交換樹脂とバラジメルシンナムアルデヒドが反応して
生じる青色化合物による呈色を目視判定する尿素濃度測
定用組成物が開示されている。これは試料が血清又は血
漿に限られていること、試料自体のｐＨ−Ｗｉ衝能・色
調に測定値が影響され、さらにウレアーゼを使用してい
ないため尿素に対する特異性に乏しく、試料中の代謝物
や薬剤に測定値が影響されるなどの欠点を有している。

更に特開昭５４−−１５１０９４号明細書には、全血あ
る　　　　　　１１゜いは血清を測定試料とするアンモ
ニア及び酸素の分析具が開示されている。これは反応系
で発生したアンモニアをネット又はフォイルを通して指
示薬に到達させ、指示薬系での発色の度合いより試料中
のアンモニア又は尿素の濃度を調べるものであるが、指
示薬系の一部が開口しているために、試料が指示薬系に
浸み込んで呈色が不均一となり、あるいは反応系で発生
したアンモニアが指示薬系を均一に呈色せしめることが
できない欠点がある。

又、特公昭５６−１１１０８号明細書には、水溶液中の
アンモニアを反応系でアンモニアガスとなし、該アンモ
ニアガスがガス通気性膜を通って指示薬系に達すること
により指示薬系の顕色剤を変色せしめることを利用して
水溶液のアンモニア濃度を知るものであるが、指示薬系
に、顕色剤を親水性ゲルビーズに含浸させ、該ゲルビー
ズを粘着テープ上に単層に付着させたものを用いたり、
あるいは、ガス通気性フィルムを用いているために再現
性のある製造が困難である。

本願出願人による特願昭５６一−１７７６６０号明細書
に記載の尿素分析用具は試料の性格に影響されずに尿素
を分析できる点で非常に有用であるが、ステインク状の
用具と比較するとき、製造上の不利はまぬがれえない。

本発明は上記に鑑みなされたもので、その第１の目的と
するところは、従来技術の欠点を有さない、微普の検体
を用いて迅速・簡易・精密・正確なアンモニア及び尿・
素の分析具を提供することにある。また第２の目的は、
試料の量を厳密に定置しな（でも試料中のアンモニア又
は尿素の濃度を精密・正確に測定できる分析具を提供す
ることにある。さらに第３の目的は製造の容易なアンモ
ニア又は尿素の分析具を提供することにある。

本発明者らはこの目的を達成するために、アルカリ性側
にｐＨを保埒する緩衝剤系を含有する吸収性担体、吸収
性担体より発生したアンモニアにより変色する指示薬層
、吸収性担体より指示薬層側へアンモニアガスが拡散で
きる面積及び拡散したアンモニアと接触できる指示薬層
の面積を一定にできるスペーサー、及び吸収性担体上部
を覆うカバーシートよりなる分析具を開発した。

本発明者らは、又、この目的を達成するために、アルカ
リ性側にＰＨを保持する緩衝剤系及びウレアーゼ活性を
有する酵素系を含有する吸収性担体、吸収性担体より発
生したアンモニアにより変色する指示薬層、吸収性担体
より指示薬層側へアンモニアガスが拡散できる面積及び
拡散したアンモニアと接触できる指示薬層の面積を一定
できるスペーサー、及び吸収性担体上部を覆うカバーシ
ートよりなる分析具を開発した。

次に本発明による分析具の測定機構を尿素の測定を例に
挙げて説明する。

試料中の尿素をわずかな時間で分解できるウレアーゼ及
びアルカリ性緩衝剤を含んだ吸収性担体（１）に試料を
滴下し、吸収性担体の上部をカバーシートで覆うと、試
料中の尿素はウレアーゼによってただちに分解されてア
ンモニアとなり、吸収性担体には試料の尿素濃度に対応
するアンモニアガス分圧が発生する。発生したアンモニ
アガスは吸収性担体の側面および拡散室（５）に対向し
ている面より均一に拡散する。側面が開放系であるのに
対し、拡散室は閉じられた空間なので、両系への拡散量
及び開口部のアンモニア分圧には次第に差が生じるが、
両系間の最短距離と吸収性担体の厚みの比が大きければ
、側面からのアンモニアガスの拡散が拡散室へのアンモ
ニアガスの拡散量に与える影響は無視できる。拡散室側
へ拡散したアンモニアガスは指示薬層に達し、指示薬を
変色させるので、指示薬の変色度を調べることによって
試料中の尿素濃度を調べることができる。

以下、添付図面を参照しなから本発の分析具について詳
述する。

第２図において、（１）は試料中のアンモニアをアンモ
ニアガスにする試薬、又はウレアーゼによって試料中の
尿素が分解されて生じた炭酸アンモニウムをアンモニア
ガスにする試薬及びウレアーゼ活性を有する酵素系を含
有する試薬を含有する吸収性担体、（２）は本分析具の
支持体、（３）はアンモニアガスにより変動するｐｕの
変化に応じて変色する指示薬層であり、支持体上に塗布
乾燥することによって施されている。（４）は一方の端
が吸収性担体と指示薬層の間に接着され、かつ、吸収性
担体と指示薬層の間に拡散室（５）を設けるための透孔
を有するスペーサーであり、又、他方の端には粘着剤（
６）が施してあり、試料滴下後ただちに吸収性担体を覆
うためのカバーシートの役割をする。スペーサー（４）
は、更に、反応が所定時間経過したのち、吸収性担体と
一緒に撤去することで、指示薬層での反応を停止するこ
とができる。

試料中のアンモニアをガスにするための試薬は、試料の
ｐＨをアルカリ性に保有できるアルカリ性緩衝剤が好ま
しく、アルカリ性緩衝剤は、常温で固体であればなんで
もよく、ホウ酸とホウ砂、炭酸ナトリウムと重炭酸ナト
リウムの組合せ、トリス緩衝液などが挙げられる。アル
カリ性緩衝液のｐＨは尿素の分析具の場合８．５付近、
アンモニアの分析具の場合は１０．５付近であることが
特に好ましい。

アンモニアをガス化するのにはｐＨを高くすればよいが
、高すぎると蛋白質やアミノ酸が分解してアンモニアを
副生ずるので１０．５付近が望ましい。

又、尿素分析具の場合、同一系内に存在させるウレアー
ゼの安定性を保たせるためにｐｎ　８．５付近が望まし
い。尿素を分解する試薬はウレアーゼであり、ウレアー
ゼはｐＨが高と不安定なためである。

吸収性担体は濾紙、不織布等溶液中に含浸し、溶媒を乾
燥したとき乾燥残分を保持できるものであればよい。吸
収性担体には、滴下した試料がよく浸透するよう湿潤剤
を加えてお（と有利である。

支持体の材料としては加工性・経済性からポリスチレン
、ポリエチレン、ポリエステル等のプラスチックが好適
である。指示薬系は、ｐＨの変動に対応して変色するも
のであれば微量のｐＨ１ｌ定剤を使用することによりど
れも使用でき、所望によりｐＨ調定剤としてマロン酸、
フタル酸、酒石酸のような常温で固形の酸又はこれらの
酸と核酸の塩との混合物を使用し、酸性側に変色域を有
する種々なｐＨ指示薬を単独または複合で使用するのが
好ましい。単独で用いる例としてブロムクレゾールパー
プル、クロルフェノールレッド、ブロムクレゾールグリ
ーン等が挙げられる。複合で用いる例としてブロムクレ
ゾールグリーン、ブロムキシレノールブルー、バラキシ
レノールブルーの組合せ、クロルフェノールレッド、ブ
ロムフェノールレッド。

フェノールレッド、クレゾールフタレインの組合せ、フ
ェノールフタレイン、メチルレッド、ジメチルアミノア
ゾベンゼン、ブロムチモールブルーの組合せ等を挙げる
ことができる。単一の指示薬又は類似の色相にて変色す
るｐ８指示薬群の場合は光反射率計を用いて被測定物質
濃度を測定するのに有効である。光反射率計は試料に一
定の波長を有する光を照射して、反射してくる光の量を
測定するもので、特定の波長における試料の発色の程度
を知ることができるので、あらかじめ定めた波長にセッ
トすることによってｐＨ指示薬の変色の度合いを個人差
なしで測定することができる。一方複合で用いるｐｔｌ
指示薬の中でも、例えば前述した通りフェノールフタレ
イン、メチルレッド、ジメチルアミノアゾベンゼン、ブ
ロムチモールブルー。

チモールブルーを複合して用いるボーデン（Ｂｏｇｅｎ
）の万能指示薬、或はコルソフ（Ｋｏｌｔｈｏｆｆ）の
万能指示薬等に代表される広い範囲のｐＨに渡って変色
するものは、肉眼で被測定物質濃度を測定する場合、特
に有利である。すなわち万能指示薬では赤〜燈〜衝〜縁
〜青の様にｐｏに応じて変色するので肉眼で判定するの
に好都合である。これらのｐＨ指示薬は、天然及び合成
のフィルム形成可能な重合体をバインダーとして配合し
て支持体上に塗布される。好適なバインダーは酢酸セル
ロース、ポリビニルブチラール、エチルセルロースのよ
うな非水溶性のフィルム形成重合体であり、ｐＨ指示薬
の均一な変色、均一な塗布に対して有効である。

さらに均一な変色に有効に働く物質としてポリオキシエ
チレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール、グ
リセリン等の湿潤剤を加えることも重要である。スペー
サーは拡散室を形成し、かつ、試料滴下後吸収性担体を
覆って吸収性担体上部方向へのアンモニアの拡散を防止
し、更に所定時間経過後吸収性担体を撤去する役割を持
たせるため、軟質のプラスチックフィルムの一方の端に
粘着剤（６）を施し、他方の端に透孔を設けたものがよ
い。　　　　　　１　′尚、スペーサー〇透孔の上部及
び下部はそれぞれ吸収性担体と指示薬層に接着している
ので、吸収性担体と拡散室との接触面積及び指示薬層と
拡散室との接触面積さらにこれら２面間の距離を正確に
再現することが容易である。

測定に際しては、吸収性担体に試料を滴下し、ただちに
、スペー号−粘着剤部にて吸収性担体上部を覆う。吸収
性担体では試料中のアンモニア又は尿素の濃度に対応し
たアンモニアガス分圧が発生し、アンモニアガスは拡散
室を通って指示薬層に達する。アンモニアガスは最終的
には試料中のアンモニア又は尿素の濃度に対応する指示
薬の変色を生しさせる。尚、試料中の水、血球などは吸
収性担体に保持されるので、指示薬層の変色の度合は拡
散室を通過したアンモニアガスのみに依存す丞。しかし
て、その変色の程度をスペーサー及び吸収性担体を撤去
したのち第２図Ａ方向から眺めて色見本と比較するか、
又は、光反射率と被測定物質濃度との検量線をあらかじ
め作成しておくことにより、光反射率計により容易に試
料中の被測定物質濃度を知ることができる。

次に、本発明を一層よく理解させるために実施例を掲げ
るが、本実施例によって本発明を制限するものではない
。

実施例　ｌ アンモニア分析具 Ａ〕アンモニア分析具の製造 ｏ）準備 （ａ）　　吸収性担体 １５ｃｍ平方の濾紙〔東洋濾紙■製＃１０２６）を下記
の組成の溶液に含浸し、５０℃で乾燥したのち、１ｃｍ
角に切断する。

０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１０，５）　　２５　ａｔｔ
ｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１０００，１ｇ（ｂ）　　指示薬
層形成用塗布液 下記組成の溶液を指示薬層形成のための塗布液とする。

フェノールフタレイン　　　　　２０−ｇメチルレッド
　　　　　　　　４０　ｔＩ１ｇジメチル了ミノアミノ
アゾベンゼン　ｍｇブロムチモールブルー　　　　８０
　ｓｉｇグリセリン　　　　　　　　　１ｇ チモールブルー　　　　　　　１００−ｇエチルセルロ
ース　　　　　　　８ｇ エチルアルコール　　　　　　５０−１アセトン　　　
　　　　　　　５０献 精製水　　　　　　　　　　　　２−九（Ｃ）　　支持
体と指示薬層 １０ｃｍ１ｌｌｉの白色ポリエステルシート〔東し■製
、厚さ０．２ｍｍ）の一方の端から１０ｍ−〜２０−鴎
の部分に、上記（ｂ）で作製した塗布液を塗布厚０　、
２５ｍｍで施し、５０℃で乾燥した後、塗布方向と直角
の方向にｌｃ−幅で裁断する。

（ｄ）　　スペーサー １０ｓＩＩ＋×８０１１１１のポリエステルシート〔東
し部製、厚さ０．１＋＊ｍ）の一方の端から２０ｍ５＋
のところを中心とする直径６ｓｏ＋の透孔を設け、他方
の端より３ｃｍの部分に１０■−×３０−の両面テープ
を貼る。

（２）　　組立て ｌａ）、（ｄｌ、（Ｃ１をこの順に第３図のように接着
する。

Ｂ〕測測 定収性担体にアンモニア水溶液３０μｌを滴下し、直ち
にスペーサーの粘着剤部で吸収性担体を覆う。１０分経
過後、スペーサーと吸収性担体を撤去し、指示薬層の色
調を肉眼で観察した結果を表１に示す。

表１ 実施例　２ 尿素分析具 Ａ〕尿素分析具の製造 ＋１１　　準備 （ａ）　　吸収性担体 １５ｃｍ平方の濾紙〔東洋濾紙■製＃１０２６）を下記
組成の溶液に含浸し、５０’Ｃで乾燥したのち、１ｃｍ
角に切断する。

ウレアーゼ　　　　　　　　　　３０００　Ｕｌ、ＯＭ
　）リス緩衝液（ｐＨ８，５）　　　２５　ａｔポリエ
チレングリコール　　　　　ｔｇ（ｂ）　　指示薬層形
成用塗布液 下記組成の溶液を指示薬層形成用の塗布液とする。

ブロムクレゾールグリーン　　　４０■グリセリン　　
　　　　　　　０．４ｇ酢酸セルロース　　　　　　　
　４．０ｇアセトン　　　　　　　　　　　２０−エタ
ノール　　　　　　　　　　　２０　ｍ１１．０Ｍり１
　’／酸緩南液（ｐＨ３，０）　　　０．３ｍ１（Ｃ）
　　支持体と指示薬層 実施例１と同じ （ｄ）　　スペーサー 実施例１と同じ （２）組立て 実施例１と同じ Ｂ〕測測 定１１　　吸収性担体に尿素水溶液３０μｌを滴下し、
直ちにスペーサーの粘着剤部で吸収性担体を覆う。１０
分経過後、吸収性担体とスペーサーを撤去し、光反射重
重（測定波長６２００ｓ）にて、指示薬層の光反射率を
測定した結果を表２に示す。

表２ （３）４抛ｇ／ａの尿素水溶液の滴下量を変えて、上記
と同様に測定した結果を表３に示す。

表３ 実施例　３ だ液中尿素濃度の測定 実施例２において製造した尿素分析具、光反射串杆、表
２より得た検量をを使ってヒトだ液の尿素濃度測定を行
ない、ウレアーゼインドフェノール法との相関を調べた
。結果を以下に示す。

試料の数　　　　　　４８ 相関係数　　　　　　０．９８２ 回帰直線の式　　　ｙ＝０．９９ｘ　＋１．７回帰直線
の式において、Ｘはウレアーゼインドフェノール法によ
る測定値、ｙは本発明の尿素分析具による測定値である
。測定結果をよりわかりやすくするため第７図に表わし
た。この結果より本発明は試料の性格（ヘマトクリット
値による影響、粘度、　ｐＨ）に影響なく、水溶液での
標準曲線により、検体中の尿素濃度を測定できることが
わかる。

以上、本発明の好適な実施例について述べたが、本発明
の技術思想の範囲内において種々の変更が加えられる。

以下に実施例で示したものとおきかえられる変更手段を
いくつか挙げる。吸収性担体中に保持するアルカリ性緩
衝剤はｐｕ　７．’５〜１１．０の範囲に緩ｉｆ］能を
示すものであればなんでもよい。

指示薬は酸性側変色域を有するｐｔ＋指示薬であればな
んでも使用できる。この他、所望により、湿潤剤、界面
活性剤を吸収性担体、指示薬層に加えられる。又、本発
明の構造についても第４図、第５図、第６図に示した形
態が通用可能である。尚、第５図の（２６）、第６図の
（３７）は、測定時に、吸収性担体及びスペーサーを撤
去したのち、指示薬層からのアンモニアガスの再拡散を
防止するためのものであり、吸収性担体及びスペーサー
を撤去し　　　　　　、［。

たのち、ただちに測定ができない場合に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る分析具の斜視図、第２図は第１図
におけるＸ　−Ｘ線断面図、第３図は分解斜視図である
。第４図から第６図は本発明における応用例の断面図で
ある。第７図は実施例３にて行なった測定の相関図で、
横軸はウレアーゼインドフェノール法による測定値、縦
軸は本分析具による測定値で、単位はいずれも（ｍｇ、
／ｄ１）である。 １．１１．２Ｌ　３１　　　　　　吸収性担体２．１２
．２２．３２　　　　　　指示体３．１３．２３．３３
　　　　　　指示薬層４．１４．２４．３４　　　　　
　スペーサー５．１５．２５．３５　　　　　　拡散室
６．１７．２７．２８．３８．３９　　粘着剤１６．３
６、　　　　　　　　指示薬担体２６．３７、　　　　
　　　　　再拡散防止用シート特許出願人　　　　　株
式会社　京都第一科学３ 図面の浄、ｖＩ（内容上変更なし） Ｘ ＼＼ 第２回 第３回 第４５Ｊ 第７図 ２０　　４０　　６０　　８ｏ　　　１００　１２０手
続補正書（自船 昭和５８年６月１７日 １、事件の表示 昭和５７年特許願第０６６１２７号 ２、発明の名称 アンモニアおよび尿素の分析具 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　京都市南区東九条西明田町５７番地名称　株式会
社　京都第一科学 代表者　田村弘三部 ４、代理人 住所　大阪市北区天神橋二丁目３番１０号明細書のタイ
プ浄書（内容に変更なし）図面を濃墨で描く　（内容に
変更なし）８、添付書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中のアンモニア又は尿素が分解して生じたアン
   モニアをガス化するアルカリ性緩衝剤を含む担体、アン
   モニアガスを検出する指示薬層及び、担体と指示薬層の
   間に位置するスペーサーよりなる分析具において、該ス
   ペーサーが担体より指示薬層側へアンモニアガスが拡散
   できる面積及び拡散したアンモニアガスと接触できる指
   示薬層の面積を一定にできる透孔を有することを特徴と
   するアンモニアおよび尿素の分析具」 ２、担体の上面を覆うカバーシートを有することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載のアンモニアおよび尿
   素の分析具。