JPS58175496A - 基質または酵素活性の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体液中の基質または酵素活性の定量方法に関す
るものである。

近年、臨床検査において体液中の基貿量または酵素活性
を定量する方法として、基Ｗまたは酵素反ＥＸＫより生
成した物質に酸化酵素を作用させ。

生成する過酸化水素を測定する方法が盛んに用いられて
いる・ これらの過酸化水素の測定方法として、ペルオキシター
−ｔｔの酵素作用により、（１）４−アミノアンチピリ
ン、３−メチル−２−ペンゾチアゾリノンヒドフジン等
のカップラーと（２ンフエノール誘４　体。

アニリン誘導体またはナフトール誘導体等の色原体とを
酸化縮合させて発色体とし、その光学的吸光度を測定す
る方法が用いられている。この方、法は操作が簡単であ
るという特徴を有している。

ところが、最近、この測定方法を用いたコレステロール
エステル、トリグリセライド、アミラーゼ、ＧＯＴ、Ｇ
ＰＴ等の臨床診断において、体液０中の遊離コレステロ
ール、遊離グリセロール、ブドウ糖、ピルビン酸等を課
長として計り込むことが問題になっている＠ 本発明者等は体液中の遊離コレステロール、遊離グリセ
ロール、ブドウ糖、ピルビン酸等の計妙込みを防止し、
正確に目的とするコレステロールエステル、トリグリセ
フィト等の基質またはアミラーゼ、グルタミン酸ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、グルタミン酸オギ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素活性を
定量することを目的として、種々鋭意検討したところ。

本発明に到達した。すなわち本発明は基質又は酵素反応
により生成し友物貿に酸化酵素を作用させ。

生成する過酸化水素を測定することにより、試料中の基
質ま九は酵素活性を定量する方法において。

（１）酸化酵素と（１）ペルオキシダーゼと（Ｉｆ）下
記一般式（Ｉ）で表わされるフェノール誘導体を含む試
液を第１試液としｓ　　（ｔｖ）カップラーを含む試液
を第２試液とし、試料に第１試液を加えた後、第２試液
を加えることを特徴とする基質又は酵素活性の定量方法
である。

■ １ （式中、Ｒ１は■炭素原子数が１〜５である低級アルキ
ル基、■炭素原子数が１〜５である低級アシル基、■炭
素原子数が１〜５である低級アルキルエーテル基、■炭
素原子数が１〜５である低級アルコキシカルボニル基あ
るいは■水酸基またはスルホシ酸基を有する上記■〜■
の基または■ハロゲン（ただし、この場合ｎ≧１であり
ｓ　Ｒ２のうち少なくとも１つは上記■〜■の基である
。）を示す。Ｒ２は水素、ハロゲンまたは上記■〜■の
基を示す。ｎ＝０〜４である。） 本発明では、上記第１試液を加えた後、第２試液を加え
ることにより、体液中の遊離コレステロール、遊離グリ
セロール、ブドウ糖、ピルビン酸等の計り込みを防止し
、簡便且つ正確に目的とする基質又は酵素活性を測定す
ることが可能となった。体液中の遊離コレステロール、
遊離グリ−ｈａミールブドウ糖、ピルビン酸等はフェノ
ール誘導体、アニリン誘導体またはナフトール誘導体色
反応（自己縮合反応）して可視部に吸収を示さない化学
物質に変換され、目的とする基質又は酵素活性を測定す
る反応系に関与しないものと考えられる。逆に第２試液
を加えてから第１試液を加えると、目的が達成されない
。また４−アミノアンチピリンを酸化酵素、ペルオキシ
ダーゼとともに含む試液を第１試液とし、フェノール誘
導体を含む試液を第２試液とし、第１試液を加えてから
第２試液を加えてもし的は達成されない−例えばトリグ
リセライド測定４Ｃ！？いて、グリセロキナーゼとグリ
セロリン酸オキシダーゼを用いて生成し九過酸化水素を
ペルオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンと
反応（自己縮合反応）させた後。

リパーゼとフェノール誘導体を加え発色体を生成して、
真のトリグリセフィトのみを比色測定しようと試みた。

しかし、この方法では第１反応である４−アミノアンチ
ピリンと遊離グリセロールとの反５（自己縮合度ｗ５）
で可視部に吸収を有する物質（測定波長に影響を与える
物質）が生成し。

第２反応で生成した発色体の比色測定に正誤差となり１
問題が生じた。

ま九、真のトリグリセフィトを測定する方法として、遊
離グリセロール値を計り込んだ総トリグリセライド値と
遊離グリセロール値を各々測定し。

その差を求める方法があるが、簡易性の点で問題があっ
た。本発明は上記方決より簡易性の点で優れる。

本発明方法は基質又は酵素反応により生成した物質に酸
化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定すること
により、試料中の基質又は酵素活性を定量する方法であ
る。

定量する基質としては１体液中のコレステロールエステ
ル、トリグリセツイド、クレアチニン、クレアチンなど
がある。

定量する酵素としては、体液中のアミノトランスアミナ
ーゼ、例えばグルタミン酸オギザロ酢酸トランスアミナ
ーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミ
ナーゼ（ＧＰＴ）、アミラーゼなどがある。

酵素反応により生成した物質としては、コレステロール
エステルにコレステロールエステラーゼを作用させて生
成したコレステロール、トリグ９セフイドにリパーゼを
作用させて生成し九グリセロール、グリセロールにグリ
セロキナーゼを作用させて生成したグリセロール−３−
リン酸、ｃｔ−ケトグルタル酸とアブシフにグルタミン
酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を作用させ
て生成したピルビン酸、デンプンまたはｒ−サイクロデ
キストリンを基質として、アミラーゼ、グルコアミフー
ゼを作用させ生成したブドウ糖などが上記基質又は上記
酵素反応に−り生成した物質に作用させる酸化酵素とし
ては、コレステロールエステラ−ゼ、グリセロールオキ
シダーゼ、グリ七ロリン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オ
キシダーゼ、ザルコシンオキシタ−セ、グルコースオキ
シダーゼなどがある。

本発明に用いる一般式（ｒ）で表わされるフェノール誘
導体としては、たとえば ■　ｐ−ルゾール、ｐ−エチルフエ／−／Ｌ／、４−ｎ
−フロビルフェノール、ｐ−イソプロピルフェノールな
ど、 ■　ｐ−アセデルフェノール、ｐ−エチルカルボニルフ
ェノールｓ　４−　ｎ−７”ロビルカルポニルフェノー
ル、ｐ−イソプロピルカルボニルフェノールなど。

■　ｐ−メトキリフェノール、ｐ−エトキシフェノール
ｈ　４−　ｎ　−フロビルオキシフェノール、ｐ−イソ
プロピルオキシフェノール、３，４−ジメトキＶフェノ
ールなど。

■　ｐ−オキシ安息香酸メチル、ｐ−オキシ安息香酸エ
チル、ｐ−オキシ安息香酸−ｎ−プロヒル、ｐ−オキＶ
安息香酸ブチルなど、 ■　ｐ−ヒドロキシメチルフェノール％ｐ−ヒドロキシ
エチルフェノールｓｐ−スルホキシメチルフェノール、
ｐ−スルホキシメチルフェノール、ｐ−オキシアセチル
フェノール、ｐ−オキシプロピオフェノンなト。

■　３−メチル−４−クロロフェノール、３−エチル−
４−クロロフェノール％３−ブチル−４−クロロフェノ
ール、３−ヒドロキシメチル−４−クロロフェノール、
３−ヒドロキンエチル−４−クロロフェノール、３−ヒ
ドロキシプロピル−４−クロロフェノール、３−アセチ
ル−４−クロロフェノールなどがアル。

本発明に用いるカップラーとしては、４−アミノアンチ
ピリン、３−メチル−２−ベノゾチアゾリンヒドヲゾン
等がある。

本発明に用いる試薬＃′１（１）酸化酵素と（１）ペル
オキシダーゼと（ＩＩ）フェノール誘導体を含む試液を
第１試液とし＆　（ＩＶ）カップラーを含む試液を第２
試液とする。第２試液にはアニリン誘導体が含まれてい
てもよい。

アニリン誘導体としては、アニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル
アニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、　Ｎ、Ｎ−ジエ
チル−ｍ−）ルイジン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−アニン
ジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′
−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチルーＮ−（β−
ヒドロキシエチル）　−ｍ　−トルイジン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
）シイジン。Ｎ−エチルーＮ−スルホプロピル−ｍ−ト
ルイジン。

Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ
アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）　−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−アニンジン等力するＯ 第１試液および第２試液には前記成分に加えて。

緩衝剤、および必要により界面活性剤、安定化剤等を含
む。緩衝剤としては通常のものが使用され。

第１試液および第２試液のｐＨを通常５〜ＩＯＫ調製す
るものが好ましい。

フェノール誘導体の含有量は第１試液忙おいて１×１０
〜ｌＸｌ０　　Ｍである。カップツーの含有量は第２試
液においてＩ　Ｘ　Ｉ　Ｆ’〜Ｉ　Ｘ　１０−”Ｍであ
る。

本発明に用いる試薬には、他の酵素、基質、各種安定剤
、妨害物質除去のための試薬、界面活性剤等を含んでい
てもよい。

次に基質又は酵素活性について具体的に説明する。本発
明はこれらの具体的に説明されるものく限定されない。

基質として例えばコレステロールエステルを測定するに
は、第１試液として、コレステロールオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼとフェノール誘導体と緩衝剤を含む試液
を調製し、第２試液としてコレステロールエステフーゼ
と４−アミノアンチピリンと緩衝剤を含む試液を調製す
る。試料に第１試液を作用させ、遊離コレステロールか
ら生ｈ′ｃした過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下
、フェノール誘導体と反応（自己組合）させた後、第２
試液を作用させ、コレステロールエステルカラ生成した
コレステロールのみから生成し九過酸化水＊にペルオキ
シダーゼの存在下、フェノール誘導体と４−アミノアン
チピリンを作用させて発色体を得、これを比色定置する
。

基質として例えばトリグリセライドを測定する１ｃｔ−
１，第１試液としてグリセロールオキシダーゼ。

ペルオキシダーゼとフェノール誘導体と緩衝剤ヲ含む試
液、又はグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼと（フェノール誘導体と緩衝
剤を含む試液を調製し、第２試液としてリボプロティン
リパーゼと４−７ミノアンテピリンと緩衝剤を含む試液
を調製する。試料に＠１試液を作用させて、遊離グリセ
ロールかう生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在下、フェノール誘導体と反応（自己縮合）させた後。

第２試液を作用させ、トリグリセフィトから生成したグ
リセロールのみから生成した過酸化水素を比色定置する
。

酵素として、例えばグルタミン酸ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（ＧＰＴ）の活性を測定するＫは、第１試液と
してピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼとフェ
ノール誘導体と緩衝剤を含む試液を調製し、第２試液と
してα−ケトグルタル酸、ＤＬ−アニリンと４−アミノ
アンチピリンと緩衝剤を含む試液を調製し、試料に第１
試液を作用させ゛て遊離ピルビン酸から生成した過酸化
水素ラベルオキシダーゼの存在下、フエ／−ル誘４体と
反応（自己縮合）させ九後、第２試液を作用させ、ＧＰ
Ｔの作用により生成したピルビン酸のみから生成した過
酸化水素を比色定置する。

本発明方法は上記基質、酵素活性の測定のほかに、他の
酸化酵素による過酸化水素の測定にも利用し得る。

本発明方法は第１試液とｗ！、２試液との混合液を用い
る定量法に比べＣ１試料中に共存する測定誤差を生ずる
物質の計り込みを減少させ、真の基質又は酵素活性を簡
単ＫＲ定することが可能となっ友。

次に本発明を実施例を用いて説明する。

実施例１゜ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用い、下記
方法により測定した。

１、サンプル：グリセリンＣ２６’９７ｄｌ）溶液　　
　■グリセリン（５２Ｊｌｖ／　ｄ　ｌ　）ｇ液　　　
■グリセリン（１０４キ／ｄｉ）溶液　　■血清ａ：水
＝９＝１　　　　　　　　０血清ａ：グリセリン水溶液
　　　　　　■（１，０４０キ／ｄ））＝９　：　１ 血清ｂ：水＝９：１　　　　　　　　　■血清ｂ；グリ
セリン水溶液　　　　　　■（１，０４０■／ｄｊ　）
＝９　：　１２、試薬： フェノール誘導体が下記第１表に示される化合物である
試薬Ａ−Ｃおよび試薬ａ　−ｅを調製した。

第１試液　　トリス緩衝液（ｐＨ７，０）グリセロキナ
ーゼ　　　　　　　２．０単位／ｍｌグリセロリン酸オ
キシダーゼ　　６．０単位／ｄペルオキシダーゼ　　　
　　　１０．０単位／ｇｄフェノール誘導体　　　　　
　　　５１１Ｆ／ｄｊ第２試液　　トリス緩衝液（ｐＨ
７，０）リボプロティンリパーゼ　　　６００単位／ｇ
ｌｔ４−アミノアンチピリン　　　　１０１１Ｆ／ｄ　
ＪＮ−エチル−Ｎ−（３−スル　　９０〜／ｄＪホプロ
ビル）−ｍ−アニシジン 第　　　　１　　　　表 ３、！［１定法 各サンプル２０μｊに第１試液２　ｍｌを加え、３７℃
にて５分間反応させた後、第２試液を１−加えて３７℃
にて１０分間反応させ、４−アミノアンチピリンとＮ−
エチル−Ｎ−（３−、Ｘルホプロビル）−ｍ−アニンジ
ンとの発色体ヲ波長５４０　ｎｍで測定した。その結果
を第２表に示す。

第２表 試薬Ａ、Ｂ、Ｃで用いたｐ−クレゾール％ｐ−アセチル
フェノール、ｍ−ヒドロキシアセトフェノンｆ′ｉ、他
の試薬で用い九ｍ−ブロムフェノール。

ｐ−クロルフェノール、フェノール、　２．４−ジクロ
ロフェノールと比較してグリセロール消去能力において
優れている。

実施例２゜ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用い、下記
方法により測定した。

１、サンプル：グリセリン（２６岬／ｄｊＢｓ液　　　
■グリセリン（５２ｑ／ｄｊ）溶液　　　■グリセリン
（１０４キ／ｄｌ）溶液　　■血清ａ：水＝９：１　　
　　　　　　０血清ａ：グリセリン水溶液　　　　　　
■（１，０４０ｑ／ｄ　ｊ　）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１　　　　　　　　０血清ｂ：グリセ
リン水溶液　　　　　　■（１，０４０”ｆ／ｄＪ　）
＝９　：　１２、試薬： フェノール誘導体が下記第３表に示される化合物である
試薬Ａ−Ｄおよび試薬ａ　−ｅを調製した。

第１試液　　トリス緩衝液（ｐＨ７，０）グリセロキナ
ーゼ　　　　　　　２．０単位／ｌｒｌグリセロリン酸
オキシダーゼ　　６．０単位／ｗｌペルオキシダーゼ　
　　　　　１０．０単位／はフェノール誘導体　　　　
　　　　５”ｌｉ／ｄｉ第２試液　　トリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）リボプロティンリパーゼ　　　６００単位／
５ｔ４−アミノアンチピリン　　　　１０１１＃Ｉ／ｄ
　ｌＮ、Ｎ−ジエチル−ｍ−９０ｑ／ｄ　ｌトルイジン 以下余白 第　　　　３　　　　表 ３．測定法 各サンプル２０μｊＫ第１試液２耐を加え、３７℃にて
５分間反応させ九後、第２試液を１゛ｄ加えて３７℃に
て１０分間反応させ、４−アミノアンチピリントＮ、Ｎ
−ジエチル−ｍ−トルイジンとの発色体を波長５４０　
ｎｍで測定しな。

その結果を第４表に示す。

第４表 ％薬Ａ、Ｂ、Ｃ１Ｄで用いたｐ−メトキシフェノール、
４−クロロ−ｍ−クレゾール、ｐ−オキンプロビオフエ
ノン、４−クロロ−ｍ−クレゾールｉｊ　ｓ　ａの試薬
で用い九〇−クロロフェノール。

３．４−ジメトキシ、フェノール、０−イソプロピルフ
ェノール、２，６−シメトキシフエノールと比較してグ
リセロール消去能力において優れている。

特許出願人　東洋紡績株式会社 手　　続　　補　　正　　書　（自発）昭和５７年　５
・月２４１ｊ 特許庁長官　島　［Ｊ（春　樹　　殿 １、　・ｆＧ　’ｆ’ｌ’の表示 昭和５７年特許願第５９２８５号 ２　発明の名称 基質または酵素活性の定量方法 洩　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 ４　補正の対象 （２）明細書第４頁末行 「基である。」の次に「ただし％　Ｒ２はフェノールＭ
Ｊ体のオルト位の少なくとも１個所には欽ｐｋされてい
ない。」を挿入する。

（３）　　同第５頁第１０行目 ［、アニリン誘導体またはナフトール誘導体ｊを削除す
る。

別　　　　　　　紙 特許請求の範囲 ［基質又は酵素反応により生成した物質に酸化酵素な作
用させ、生成する過酸化水素を測定することにより、試
料中の基質または酵素活性を定量する方法において、（
１）酸化酵素と（１ｉ）ペルオキシダーゼと（（社）下
記一般・・式（１）で表わされるフェノール誘導体を含
む試液を第１試液とし、（ｌψカップラーを含む試液を
第２試液とし１試料に第１試液を加えた後、第２試液を
加えることを特徴とする基質又は酵素活性の定量方法。

１ （式中、Ｒ２は■炭素原子数が１−５である低級アルキ
ル基、■炭素原子数が１〜５である低級アシル基、■炭
素原子数が１〜５で″ある低級アルキルエーテル基〜■
炭素原子数がｌ−ａである低級アルフキジカルボニル基
あるいは■水酸基またはスルホン酸基を有する上記■〜
■の基または■〕為７ゲン（ただし１この場合ｎ≧１で
、あり、　Ｅ２のうち少なくとも１つは上記■〜■の基
である。）を示す。Ｒ重は水素１ハロゲンまたは上記■
〜■の基を示す。Ｈ＝Ｑ一番である。鼾だしＳ８２はフ
ェノ−手　続　補　正　書（自発） Ｌ　事件の表示 昭和５７年特許願第５９２８５号 ２　発明の名称 基質または酵素活性の定量方法 ＆　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 表　補正の対象 ＼ （２）明細書第４貞下から第８行目〜末行「■炭素原子
数が１−５である低級アルキル基、・・・パ上記■〜０
の基である。」を「０炭素原子数１〜５である一級アル
キル基あるいは＠水酸ｊ′丁　・ 基またはスルホン酸基を有する上記■の基」に訂正する
。

（８）　　同第４貞末行 昭和６７年５月２４日提出の手続補正書簡２頁（２）「
ただし１Ｒ＊は７エ／−ル誘導体のオルト位の少なくと
も１個所には置換されてψない。」を削除する。

（４）同第４頁末行 「）」を削除する。

（５１同第５頁第１行目 「上記■〜■の基」を「■炭素Ｗ、″ｆ”数が１，５で
ある低級アルキル基１■炭素原子数が１，５である低級
アシル基嘱■炭素原子数がｌ−５である低級アルキルエ
ーテル基、■炭素原子数が１〜５である低級アルコキシ
カルボニルあるいは０水酸基またはスルホン版基を有す
る上記■〜■の基」に訂正する。

（６１同第ｓｊＬ第１第１ニ〜１２ ルフェノールなど１」を「Ｏｐ−クレゾール、ｐ−エチ
ルフェノール１４−ｎ−プロピルフェノール、ｐ−イソ
プロピルフェノール、０−クロロ−ｐ−タレ’ｌ−ル、
ｍ−クロ四ーｐークレゾール為２、４−ジメチルフェノ
ール％３．４ージエチルフェノール、２，４．６　−　
）リメチルフェノール、ｍ−ヒドロキシメチル−ｐ−ク
レゾール、３−スルホプロピル−４−エチルフェノール
など飄」に訂正する。

（７）　　同第８頁第１３行目〜第９頁第３行目「■ｐ
ルーアチルフェノールト・・・・ｐ−オキシ安ｍ香酸ブ
チルなど１」を削除する。

（８１　　同第９頁第４〜８行目 「■ｐーヒドロキシメチルフェノール、φ０．。

・ｐ−オキシプロピオフェノンなど、」を［Ｏｐ−ヒド
ロキシメチルフェノール％Ｐーヒドロキシエチルフェノ
ール、ｐ−スルホキシメチルフェノール１ｐ−スルホキ
シエチルフェノール、３−クロロ−４−ヒドロキシメチ
ルフェノール、宇メヂ羊清耳２ーメチルー４ーヒドロキ
シメチルフェノールＳ３．４−ジヒドロキシメチルフェ
ノール、２−ア七千ルー４−ヒドロキシメチル７エ／−
ル１３ーメトキシー４ーヒドロキシメチルフェノール３
−メトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェノー
ルなど」に訂正する０ （９）　　同第９頁第９〜１５行目 「０３−メチル−４−クロロフェノ塙どかある。」を削
除する。

叫　同第ム５頁第１表を次の通り訂正する。

第　　１　　表 ０１）　　同第１６頁第２表を次の通り訂正する。

＃１２表 に）同第１６負第２表の下に１次の文を挿入する。

「第２表において）蒸留水はサンプル■，■．■の対照
例であり１サンプルΦはサンプル■の対照例であり、サ
ンプル０はサンプル■の対照例である。」 「試薬Ａ，Ｂ，Ｇで用いたｐ−クレゾールｓｐーアセチ
ルフェノール、ｍ−ヒドロキシアセトフェノン」を「試
薬人で用いたｐ−クレゾール」に訂正する。

（６）同第１７頁第７行目〜第２０頁末行「実施例　２ サンプル中のトリグリセリドを．・００．グリセロール
消去能力において優れている。」を削除し１次の実施例
２を挿入する。

「実施例　２ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用い１下記
方法により測定した。

１サンプル：グリセリン（２６ｗＩｇ／＃）溶液　　■
グリセリン（５２岬／，＆）溶液　　■グリセリン（１
ｏ＋ｗ９／１ｔｔ）溶液　■血清ａ；水ー９：ｌ　　　
　　　　■ 血清＆：グリセリン水溶液　　　　■ （　１４ｏ　４ｏｗｑ／ａ　）−ｅ　：　１血清ｂ：水
Ｉ９：１・　　　　　　■ 血清ｂ＝グリセリン水溶液　　　　■ （　ＬＯ　４　ｏｑ／ａ　）−ｅ　：　１１試薬： 製した。

＃！ｌ試液　Ｆリス緩衝液（ｐＨ７，０）グリセロキナ
ーゼ　　　　　　　ｚＯ単単位−グリ七ロリン酸オキシ
ダーゼ　６−０単位／−ペルオキシダーゼ　　　　　１
００単位／−７工ノール誘導体　　　　　　　　５　＊
　／　ａ第２試液　Ｆリス緩衝液（１１４７，０）す〆
プロテインリパーゼ　　６００単位／−４−アミノアン
チピリン　　　　１０　ＴＱ　／　ｄｌＮ、Ｎ−ジエチ
ル−、−９０岬／ｄｔ トルイジン ＃Ｉ３表 ＆測定法 各サンプルｇｏμノに第１試液２−を加え、ｓ？℃＆ｃ
て５分間反応させた後Ｓｆｓｇ試液を１−加えて３７℃
にて１０分間反応させ１４−アミノアンチピリンとＭ、
Ｍ−ジエチル−ｍ−トルイジンとの発色体を波長＋５４
０ｎｍで測定した。

その結果をｊＩ４表に示す０ 試薬ム％Ｂ％Ｏで用−たｐ−エチＡ／フェノール、ｐ−
スルホキシメチルフェノール、ｐ−ヒドロキシメチルフ
ェノールは１他の試薬で用いたＯ−り０ロフェノール５
３４−ジフト中ジフェノール、０−イソプロピルフエ／
−ル１２，６−シメトキシフエノールと比較してグリ七
四−ル消来能力において優れている。」 よ 別　　　　　紙 「東　特許請求の範囲 基質又は酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作成
させ１生成する過酸化水素を測定することにより）試料
中の基質または酵素活性を定量する方法において５（１
）ｆｉ化酵素と（リペルオキシダーゼと（１）下記一般
式（１）で表わされるフェノール誘導体を含む試液を第
１試液とし１欽）カップラーを含む試液を第２試液とし
１試料に第１試液を加えた後１第２試液を加えることを
特徴とする基質又は鮭嵩活性の定量方法。

爪！

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 基質又は酵素反応により生成し九物買に酸化酵素を作用
   させ、生成する過酸化水素を測定することＫより、試料
   中の基質または酵素活性を定量する方法において、（１
   ）酸化酵素と（易）ペルオキシダーゼと（１１）下記一
   般式（１）で表わされるフェノール誘導体を含む試液を
   第１試液とし％　　（ＩＶ）カップラーを含む試液を第
   ２試液とし、試料に第１試液を加えた後、第２試液を加
   えることを特徴とする基質又は酵素活性の定量方法。 一般式（Ｉ）：　　　ＯＨ １ （式中ｍＲ１は■炭素原子数が１〜５である低級アルキ
   ル基、■置素原子数が１〜５である低級アシル基、■炭
   素原子数が１〜５である低級アルキルエーテル基、■炭
   素原子数が１〜５である低級アルコキンカルボニル基あ
   るいは■水酸基またはスルホン酸基を有する上記■〜■
   の基また＃ｉ０ハロゲン（ただし、この場合ｎ≧１であ
   りａＲ２のうち少なくとも１つは上記■〜■の基である
   。）を示す。Ｒｘｔ′ｉ水素、ハロゲンまたは上記■〜
   ■の基を示す。ｎ＝ｏ〜４である。）