JPH0134034B2 - - Google Patents

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JPH0134034B2
JPH0134034B2 JP60074564A JP7456485A JPH0134034B2 JP H0134034 B2 JPH0134034 B2 JP H0134034B2 JP 60074564 A JP60074564 A JP 60074564A JP 7456485 A JP7456485 A JP 7456485A JP H0134034 B2 JPH0134034 B2 JP H0134034B2
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glycerin
glycerol oxidase
oxidase
glycerol
dsm1729
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Gauru Herumugaruto
Zaideru Hansu
Rangu Guntaa
Reedaa Aruberuto
Tsuiigenhorun Yoahimu
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグリセリンオキシダーゼの取得法に関
する。
トリグリセリド（長鎖脂肪酸のグリセリンエス
テル）の測定は医学的診断学にとつて非常に重要
である。血中の上昇したトリグリセリド含量は動
脈硬化症の主要な危険因子である。高いトリグリ
セリド値、すなわち高トリグリセリド症の場合、
低いトリグリセリド値におけるより冠状動脈不全
及び心臓硬塞がしばしば起こる。高トリグリセリ
ド症により動脈硬化症及び冠状動脈症にかかりや
すくなるので、これを早期に発見し、ちようどよ
い時期に治療を開始しなければならない。従つ
て、迅速で信頼のできるトリグリセリドもしくは
グリセリンの測定法は大きな意義を有する。
使用可能な公知のトリグリセリド測定法はリパ
ーゼ／エステラーゼを用いてのトリグリセリドの
酵素的加水分解及び例えばグリセロキナーゼ／ピ
ルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼを用い
ての又はグリセリンオキシダーゼを用いての遊離
グリセリン測定を基礎とする（西ドイツ国特許公
告第2817087号公報）。
しかしながら、この公知法は大きな欠点を示
す。すなわち、グリセロキナーゼ法においてのこ
の試薬の安定性は多くの不安定な補酵素及び酵素
が存在するので僅かであり、常に試料の空値測定
を実施しなければならない。公知のグリセリンオ
キシダーゼ法においては、この酵素がこれを含有
する公知の微生物中に全くわずかにしか存在せ
ず、更に30U／mg程度の低い比活性を示すという
重要な欠点がある。
従つて、本発明の課題は従来公知のグリセリン
オキシダーゼ法の欠点を示さず、かつその利点を
保持するようなトリグリセリドもしくはグリセリ
ンの測定法及び測定試薬をみいだすことを可能と
する、グリセリンオキシダーゼを取得する方法を
提供することである。
この課題は特許請求の範囲に記載されたグリセ
リンオキシダーゼの取得法により解決する。
本発明は公知のグリセリンオキシダーゼ含有微
生物に比較して約数10倍高いグリセリンオキシダ
ーゼ含量を示すだけでなく、更に非常に高い比活
性を有するグリセリンオキシダーゼをも含有する
微生物アスペルギルスspec.BMTU1997−１
（DSM1729）の意想外な発見に基づく。
本発明方法により得られたグリセリンオキシダ
ーゼを用いるグリセリンの測定法の範囲におい
て、自体公知の方法により酸素消費量又は生じた
H2O2を測定することが出来る。酸素消費量は酸
素電極を用いてポラロメトリーにより測定するの
が有利である。それというのもこの方法が特に自
動操作に好適であるためである。これに関して西
ドイツ国特許公開第2130340号、同第2130308号公
報に記載された水性媒体中の酸素消費量のポラロ
メトリー測定法が好適である。他の好適な方法は
ガスクロマトグラフイーである。
形成されたH2O2は滴定法によつても、ポテン
シオメトリー、ポーラログラフイー及び比色定量
法並びに酵素法によつても測定できる。カタラー
ゼ及びペルオキシダーゼを使用しての酵素法は有
利である。それというのもこれは非常に特異的で
あり、かつ信頼出来るものであるだけでなく、過
酸化水素を形成する主反応と最も簡単な方法で組
合わせることができる。特にβ−ジケトン、例え
ばアセチルアセトン及びメタノールもしくはエタ
ノール又はメチレングリコールの存在下でのカタ
ラーゼを用いての測定並びに１個以上の色原体の
存在下でのペルオキシダーゼを用いての測定が好
適であることが判明する。カタラーゼ、アセチル
アセトン及びメタノールを用いての測定におい
て、メタノールはアセチルアセトンと共に呈色反
応を起こすホルムアルデヒドに酸化され、これを
測定することができる。ペルオキシダーゼを用い
て測定を行なう場合、反応後、測定法により測定
することができる化合物を色原体として使用す
る。
好適な色原体の例は２，2′−アミノベンズチア
ゾリン−スルホン酸である。他の有利な例はトリ
ンダー（Trinder）による指示薬システムであり
（Ann.Clin.Biochem.第６巻（1969年）、第24〜27
頁）、ここではフエノールを４−アミノアンチピ
リン（４−AAp）とペルオキシダーゼ（POD）
の存在下に、H2O2の作用下に酸化的に結合させ
色素とする。フエノールのかわりにフエノール誘
導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール
誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導
体、アミノキノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒ
ドロキシフエニル酢酸及び同じように反応する物
質を使用することができる。４−アミノアンチピ
リンの代わりに４−アミノアンチピリン誘導体、
フエニレンジアミンスルホン酸、MBTH（メチル
ベンゾチアゾロンヒドラゾン）、Ｓ−MBTH（ス
ルホン化メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、
MBTH誘導体、Ｓ−MBTH誘導体並びに同様に
反応する物質を使用することができる。
本発明方法により得られたグリセリンオキシダ
ーゼを含有するグリセリンの測定試薬としてはア
スペルギルスspec.BMTU1997−１（DSM1729）
からのグリセリンオキシダーゼ及びH2O2の測定
システムから成る試薬を挙げることができる。有
利にこの試薬はエステル化グリセリンの鹸化のた
めの付加的な薬剤、特にリパーゼ／エステラーゼ
又はエステラーゼを含有する。このために好適な
試薬は専門家に公知であり、ここで更に詳細に説
明する必要はない。
有利な実施形式によれば、この試薬は主にグリ
セリンオキシダーゼ、カタラーゼ、アセチルアセ
トン、メタノール及び緩衝剤から、個別に又は混
合してなる。もう１つの有利な実施形式は主にグ
リセリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、少な
くとも１種の色原体及び緩衝剤から、個別に又は
混合してなる。グリセリンオキシダーゼとは以下
常にアスペルギルスspec.BMTU1997−１
（DSM1729）からのグリセリンオキシダーゼのこ
とを示す。色指示システムはトリンダーによるシ
ステムが有利である。
前記の有利な試薬組成物は前記の必須成分の他
に付加的に常用の溶剤、安定剤又は／及び界面活
性物質を含有してよい。これら添加物すべては専
門家に公知であり、過酸化水素のための検出シス
テムにおいて常用である、緩衝剤としてはPH５〜
10、有利にPH６〜９を緩衝する物質が好適であ
る。好適な緩衝剤の典型的な例は燐酸塩緩衝剤、
トリス−緩衝剤、TRA−緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、
クエン酸塩緩衝剤及びHepes−緩衝剤（Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタン−スル
ホン酸）である。
前記の試薬配合物は次の量比で主なる成分を含
有する： グリセリンオキシダーゼ ２〜150U／ml、 ペルオキシダーゼ 0.5〜100U／ml、 少なくとも１種の色原体0.05〜20ミリモル／、 並びに 少なくとも１種の界面活性剤 0.001〜0.1g／ml、 緩衝剤 PH６〜９。
動力学的測定のために試薬配合物を使用すべき
場合、次の量比が有利である： グリセリンオキシダーゼ 100〜250KU／、 ペルオキシダーゼ ５〜50KU／、 色原体 0.2〜５ミリモル／ 及び場合により 少なくとも１種の界面活性剤 １〜5g／ 又はこれらの数倍量、及び緩衝剤 PH6.8〜8.0 グリセリンオキシダーゼを獲得するために使用
した微生物アスペルギルスspec.BMTU1997−１
（DSM1729）の培養は主成分としてグリセリン、
麦芽エキス及び酵母エキス、その他に緩衝剤、塩
及び微量元素を含有する培地を使用して自体公知
法で行なう。予培地としては有利にグリセリン１
〜100g／、麦芽エキス１〜50g／、酵母エキ
ス１〜10g／、綿の実粉１〜100g／並びに
K2HPO4・3H2O0.2〜5g／（又は他のK2HPO4
−調剤の当量）、KNO30.2〜5g／、CaCO30.1〜
5g／、NaCl0.1〜1g／、FeSO40.001〜0.1g／
（７水和物として測定）及びMgSO40.1〜5g／
（７水和物として測定）を有する培地を使用す
る。
主培地にはグリセリン20〜200g／、麦芽エ
キス５〜100g／、酵母エキス0.5〜5g／、燐
酸一水素カリウム0.2〜5g／、KNO30.2〜5g／
、CaCO30.1〜5g／、NaCl0.1〜1g／、硫
酸第１鉄0.001〜0.1g／及び硫酸マグネシウム
0.1〜5g／を有する培地を使用するのが有利で
ある。個々の塩は前記予培地で記載したものと相
応するものである。
予培地は通気下に25〜40℃の温度で振盪培地と
して行なうのがよい。培養期間は一般に20〜60時
間である。
温度及び培養期間は主培地においても同様であ
る。小さな発酵器中で空気0.5〜１／分／培
地を導入する際特に良好な結果が得られる。
培養終了後、この生物塊を常法で分離し、この
細胞を砕解する。常用の砕解法を使用することが
できるが、機械的に砕解するのが有利である。砕
解溶液から不溶部を例えば遠心分離又は吸引濾過
することにより除去する。この得られた溶液をそ
のまま直接グリセリン測定に使用することができ
る。しかし更にこの酵素を精製するのが有利であ
る。
精製は酵素分割のために常用の生物学的方法に
より行なうことができる。しかし特に好適である
のは酵素分割において常用されない方法、つまり
トリクロル酢酸での沈殿であることが判明した。
通常、トリクロル酢酸添加は、蛋白質を有さない
溶液にのみ興味がある場合、蛋白質の完全な沈
殿、すなわち蛋白質除去のためのみ行なわれる。
意想外にも、本発明による酵素がトリクロル酢酸
により活性損失なしに、かつ高い濃縮効率で沈殿
するということが判明した。この際、この沈殿
を、PH5.4〜4.6の範囲のPH値までトリクロル酢酸
を添加することにより行なう。分離した沈殿中に
比活性約300U／mgを有する所望の酵素が見い出
された。
更に精製が所望の場合には、アセトン沈殿、引
き続き硫酸アンモニウム分割並びに弱塩基性交換
樹脂での最後の処理により行なうのが有利であ
る。アセトン沈殿の際、この溶液にアセトン0.25
〜0.35容量を加える。硫酸アンモニウム分割を
0.5〜2.0モル濃度で実施するのが有利である。こ
の操作はすでに800U／mgより高い比活性に導び
く。弱塩基性イオン交換樹脂、有利にジエチルア
ミノエタノール基含有網状デキストラン（DEAE
Sephadex）での処理は更に３〜10倍の精製を与
え、約2500〜8000U／mgの比活性を有するグリセ
リンオキシダーゼに導びく。本発明により使用し
た微生物をもちいて、すでに150000〜200000U／
培地の活性が得られるので、この方法でグリセ
リン測定に必要なグリセリンオキシダーゼ量が急
激に減少し、この製造は著しく安くなる。
前記培養法及び精製法は酵素を培養の間培地に
放出しないということを前提とする。しかしなが
ら、界面活性剤の存在下に培養することにより培
地中に少なくとも活性の１部が移る。同様に、得
られた細胞からの界面活性剤での抽出も可能であ
る。しかしながら、この結果は機械的砕解、例え
ば高圧分散における結果より劣つている。
本発明による酵素は従来公知のグリセリンオキ
シダーゼと特に著しく低い分子量により異なつて
いる。例えば従来グリセリン測定に使用したグリ
セリンアルデヒド形成グリセリンオキシダーゼが
分子量少なくとも300000を示すのに対し、本発明
の酵素はわずか約90000の分子量を示す。更に、
本発明による酵素の活性は硫酸銅又は酢酸鉛によ
り抑制されず、一方SH−試薬は阻止する。それ
に反し、前記の公知グリセリンオキシダーゼの場
合はSH−試薬は安定化させ、硫酸銅及び酢酸鉛
は活性を約90％まで抑制する。その他の主な差は
公知の酵素の比活性が約30U／mgであるのに対し
本発明による酵素の比活性は2000〜8000U／mgで
あるということである。更に、本発明による酵素
の安定性はPH5.0もしくはPH10.0で著しくより良
好であり、37℃における10分後の活性はこの条件
下でなお50〜55％を有し、それに対し公知の酵素
は６もしくは３％を示す。
本発明方法により得られたグリセリンオキシダ
ーゼを使用する前記方法及び試薬はすべての種類
の水性媒体、例えば食品抽出物、体液及び特に血
清中のグリセリンもしくはグリセリンエステル
（トリグリセリド）の測定に好適である。この方
法の大きな特異性により遊離のグリセリンだけが
測定される。先ず第１に興味のあるエステル化グ
リセリンの測定は、この化合物の鹸化により行な
われる。鹸化を酵素により行なうのが有利であ
る。それというのも、こうして鹸化を本来のグリ
セリン測定と同時に行なうことができる。
次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
例 １ １） 微生物の培養 グリセリン10g／、麦芽エキス10g／、
酵母エキス5g／、綿実粉10g／、K2PO4・
3H2O1.5g／、KNO31g／、CaCO32.0g／
、NaCl0.5g／、FeSO4・7H2O0.01g／
及びMgSO4・7H2O1.0g／を含有する予培地
60mlをアスペルギルスspec.BMTU1997−１
（DSM1729）の胞子で接種し、30℃で48時間通
気下に振盪する。
このようにして得られた予培地360mlをグリ
セリン100g／、麦芽エキス40g／、酵母エ
キス2.5g／、K2HPO4・3H2O1.5g／、
KNO31.0g／、CaCO32.0g／、NaCl0.5g／
、FeSO4・7H2O0.01g／及びMgSO4・
7H2O1.0g／を含有する主培地15中に加え
る。600r.p.m.で撹拌し、空気10／分で通気
された25の発酵器中で30℃で主培養を行なつ
た。培養期間22時間後、活性は174800U／で
あつた。活性測定を0.1モルTRA−緩衝剤中、
PH８で、温度25℃でｐ−クロルフエノール及び
４−アミノアンチピリンを用いて546nmで行な
つた。
２） 酵素の精製 前記のようにして得られた乾燥塊100gを0.02
モル酢酸塩緩衝剤、PH６、５中に懸濁させ高
圧分散により砕解する。引き続き、遠心分離を
行ない、沈殿をすてる。
上澄に0.1モルトリクロル酢酸溶液を加え、
PH値を4.8とする。この沈殿を遠心分離する。
これは比活性300U／mgを示す。
３） 精密な精製 トリクロル酢酸沈殿による沈殿を0.1モル酢
酸塩緩衝剤、PH６、500mlに溶かし、０℃でア
セトン0.3容量を加える。生じた沈殿を遠心分
離し、新たに0.1モル酢酸塩緩衝剤、PH6.0に溶
かす。このようにして得られた酵素溶液に硫酸
アンモニウムをモル濃度1.0まで添加する。こ
の沈殿を遠心分離する。その比活性は約
800U／mgである。
この沈殿を新たに硫酸アンモニウム分割にお
けると同じ緩衝剤中に溶かし、同じ緩衝剤に対
し透析し、次いでDEAE−セフアデツクス
（Sephadex、同じ緩衝剤に対し平衡にする）と
混合し、１時間撹拌する。次いで、交換樹脂を
同じ緩衝剤で洗浄し、0.2モル酢酸塩緩衝剤、
PH6.0で分別溶離する。活性のフラクシヨンを
合併する。このようにして得られた生成物の比
活性は個々のフラクシヨンにおいて2500〜
8000U／mgの間である。
例 ２（参考例） H2O2−形成を介してのグリセリンの測定；２
種類の試薬を製造する： 試薬１： トリエタノールアミン／ PH8.0 0.1モル／、 HCl−緩衝剤 イソトリデシルエーテル
3.6ミリモル／もしくは2g／、 コール酸ナトリウム
4.7ミリモル／もしくは2g／、 ｐ−クロルフエノール 10ミリモル／、 アミノ置換 ４−アミノ アンチピリン 0.5ミリモル／、 ペルオキシダーゼ 10U／ml。
試薬２： グリセリンオキシダーゼ 500U／ml。
測定を実施するために試薬１ ２ml試薬２
0.2mlをクベツト中に測り入れる。吸光度E1、を
測光器を用いて546nmで読み取る。引き続き、試
料20μを添加し、反応を開始する。遊離のグリ
セリンを測定するために、試料としてすべての種
類の水性媒体、例えば食品抽出物、体液及び特に
血清を使用することができ、トリグリセリドの測
定のためには鹸化の後、使用することができる。
20分間の反応時間後、吸光度E2を読みとる。
恒温保持温度は25℃である。
評価は、グリセリン標準溶液の測定吸光度差△
Ｅ＝E2−E1をグリセリン濃度もしくはトリグリ
セリド濃度に関連させた検量線により行なう（第
２図参照）。
試験配合物中の濃度は次のようである： トリエタノールアミン／ HCl−緩衝剤、PH80 0.09モル／、 イソトリデシルエーテル
1.8g／（3.2ミリモル／）、 コール酸ナトリウム 4.3ミリモル／、 ｐ−クロルフエノールアミノ置換４−アミノ
９ミリモル／、 アンチピリン 0.45ミリモル／、 ペルオキシダーゼ 9U／ml、 グリセリンオキシダーゼ 45U／ml。
例 ３（参考例） 酸素消費量を用いてのグリセリンの測定 第１図に示した装置を使用する。この装置は内
径143mm及び内高220mmを有する透明なプラスチツ
ク製の円筒状の室のかたちの反応容器１からな
る。この室は0.2モルカリウム燐酸緩衝剤、PH6.8
中の沃化カリウム18ミリモル、七モリブデン酸ア
ンモニウム7.5ミリモル、塩化ナトリウム800ミリ
モル及びグリセリンオキシダーゼ50Uの溶液1.8
mlを含有する。反応容器中には、酸素感受性電極
から成るデイテクタ３（WTW：OXI−
Elektrode E016）が突出している。このデイテ
クタは分析器４と結合している（WTW：挿入物
OXI610Dを有するデイジタルメーターDIGI610）。
反応容器１の底には磁気撹拌器５を有する。
充填口６を介してグリセリン含有水溶液20μ
を試料として加える。磁気撹拌器で強力な撹拌下
に溶液の酸素濃度の減少を測定する。観測された
酸素消費量をグリセリン濃度に対して記載する。
例 ４（参考例） 動力学的測定 試料： 水性標準液（グリセリン含有量10〜100mg／dl） 試薬： Pipes−緩衝剤0.1モル／、H3BO31.7モル／
、PH＝7.0 イソトリデシルエーテル 3.0g／、 コール酸ナトリウム 3.0g／、 アミノ置換４−アミノ アンチピリン 0.5ミリモル／、 ｐ−クロルフエノール 10.0ミリモル／、 ペルオキシダーゼ 10.0KU／、 グリセリンオキシダーゼ 121.0KU／。
ゲムゼク−フアスト−アナリユーザー （Gemsaec−Fast−Analyzer）自動分析器で実
施。
温 度 ：25℃ 測定波長 ：546nm 試料容量 ：10μ 希釈剤（水） ：50μ 試薬容量 ：500μ 測定時間 １回目の測定：開始後35秒 ２回目の測定：開始後315秒。
次の結果が得られた： 試料：水性標準液 グリセリン（UV−試験） 再び検出された％ （mg／dl）
（本発明によるグリセリンオキシダーゼ） 11 105 21 101 32 100 43 101 54 100 65 99 76 99 87 99 96 102 動力学的測定において試薬中の次の量比で作業
するのが有利である： Pipes−緩衝剤0.05〜0.5モル／、H3BO30.5〜
2.0モル／、PH6.8〜8.0 イソトリデシルエーテル １〜5g／、 コール酸ナトリウム １〜5g／、 アミノ置換４−アミノ アンチピリン 0.2〜５ミリモル／、 ｐ−クロルフエノール ５〜50ミリモル／、 ペルオキシダーゼ ５〜50KU／、 グリセリンオキシダーゼ 100〜250KU／。
この例は、本発明を臨床化学的慣用診断実験室
中にある重要な自動分析器で実施することができ
ることを示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は酸素消費量によりグリセリンを測定す
る装置を示す略図である。 １……反応容器、３……デイテクタ、４……分
析器、５……磁気撹拌器。 第２図はH2O2−形成によりグリセリンを測定
する際の、グリセリン標準液の測定吸光度差△Ｅ
＝E2−E1をグリセリンもしくはトリグリセリド
濃度に関連させた検量線を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ アスペルギルスspec.（Aspergillus spec.）
    BMTU1997−１（DSM1729）（微工研菌寄第5860
    号）からグリセリンオキシダーゼを取得するため
    に、アスペルギルスspec.BMTU1997−１
    （DSM1729）（微工研菌寄第5860号）を好適な培
    地で培養し、グリセリンオキシダーゼを細胞群又
    は培地から取得し、場合により精製することを特
    徴とするグリセリンオキシダーゼの取得法。 ２ グリセリン20〜200g／、麦芽エキス５〜
    100g／、酵母エキス0.5〜5g／、燐酸−水素
    カリウム0.2〜5g／、硝酸カリウム0.2〜5g／
    、炭酸カルシウム0.1〜5g／、塩化ナトリウ
    ム0.1〜1g／、硫酸第１鉄0.001〜0.1g／（７
    水和物として測定）、硫酸マグネシウム0.1〜5g／
    （７水和物として測定）を含有する培地を使用
    する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 細胞群を砕解し、不溶性のものから分離し、
    グリセリンオキシダーゼをトリクロル酢酸を用い
    て上澄から沈殿させる特許請求の範囲第１項又は
    第２項記載の方法。 ４ 沈殿をPH4.6〜5.4で実施する特許請求の範囲
    第３項記載の方法。 ５ 引き続き、アセトン沈殿、硫酸アンモニウム
    分割及び弱い塩基性イオン交換樹脂への吸着を実
    施する特許請求の範囲第３項又は第４項記載の方
    法。 ６ アスペルギルスspec.BMTU1997−１
    （DSM1729）（微工研菌寄第5860号）からのグリ
    セリンオキシダーゼが分子量約90000、比活性
    2000〜8000U／mgを有し、かつSH−試薬により
    抑制され、硫酸銅及び酢酸鉛により抑制されない
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
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