JPS60259199A - グリセリンの測定試薬 - Google Patents
グリセリンの測定試薬Info
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- JPS60259199A JPS60259199A JP60074563A JP7456385A JPS60259199A JP S60259199 A JPS60259199 A JP S60259199A JP 60074563 A JP60074563 A JP 60074563A JP 7456385 A JP7456385 A JP 7456385A JP S60259199 A JPS60259199 A JP S60259199A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一定のグリセリンオキシダーゼを用（・てグリ
セリンを酵素的に測定するための試薬に関する。
セリンを酵素的に測定するための試薬に関する。
トリグリセリド（長鎖脂肪酸のグリセリンエステル）の
測定は医学的診断学にとって非常に重要である。血中の
上昇したトリグリセリド含量は動脈硬化症の主要な危険
因子である。高いトリグリセリド値、すなわち高トリグ
リセリド症の場合、低いトリグリセリド値におけるより
冠状動脈不全及び心臓砂室がしばしば起こる。
測定は医学的診断学にとって非常に重要である。血中の
上昇したトリグリセリド含量は動脈硬化症の主要な危険
因子である。高いトリグリセリド値、すなわち高トリグ
リセリド症の場合、低いトリグリセリド値におけるより
冠状動脈不全及び心臓砂室がしばしば起こる。
高トリグリセリド症により動１％硬化症及び冠状動脈症
にかかりやすくなるので、これを早期に発見し、ちょう
どよい時期に治療を開始しなければならない。従って、
迅速で信頼のできるトリグリセリドもしくはグリセリン
の測定法は大きな意義を有する。
にかかりやすくなるので、これを早期に発見し、ちょう
どよい時期に治療を開始しなければならない。従って、
迅速で信頼のできるトリグリセリドもしくはグリセリン
の測定法は大きな意義を有する。
使用可能な公知のトリグリセリド潤定法はリパーセ″／
エステラーゼを用いてのトリグリセリドの酵濃的加水分
解及び例えばグリセロキナーゼ／ピルビン酸キナーゼ／
乳酸デヒドロデナーゼな用いての又はグリセリンオキシ
ダーゼを用いての遊離グリセリン測定を基礎とする（西
ドイツ国特許公告第２８１７０８７号公報）。
エステラーゼを用いてのトリグリセリドの酵濃的加水分
解及び例えばグリセロキナーゼ／ピルビン酸キナーゼ／
乳酸デヒドロデナーゼな用いての又はグリセリンオキシ
ダーゼを用いての遊離グリセリン測定を基礎とする（西
ドイツ国特許公告第２８１７０８７号公報）。
しかしながら、この公知法は大きな欠点を示す。すなわ
ち、グリセロキナーゼ法においてのこの試薬の安定性は
多くの不安定な補酵素及び酵素が存在するので僅かであ
り、常に試料の空値屓す定を実施しなければならない。
ち、グリセロキナーゼ法においてのこの試薬の安定性は
多くの不安定な補酵素及び酵素が存在するので僅かであ
り、常に試料の空値屓す定を実施しなければならない。
公知のグリセリンオキシダーゼ法においては、この酵素
がこれを含有する公知の微生物中に全くわずかにしか存
在せず、更に３０Ｕ／ｍｇ程度の低い比活性を示すとい
う重要な欠点がある。
がこれを含有する公知の微生物中に全くわずかにしか存
在せず、更に３０Ｕ／ｍｇ程度の低い比活性を示すとい
う重要な欠点がある。
従って、本発明の課題は従来公知のグリセリンオキシダ
ーゼ法の欠点を示さず、かつその利点な保持するような
トリグリセリドもしくはグリセリンの測定試薬をみいだ
すことである。この課題は特許請求の範囲に記載したグ
リセリンの測定試薬により解決する。
ーゼ法の欠点を示さず、かつその利点な保持するような
トリグリセリドもしくはグリセリンの測定試薬をみいだ
すことである。この課題は特許請求の範囲に記載したグ
リセリンの測定試薬により解決する。
本発明は公知のグリセリンオキシダーゼ含有微生物に比
較して約数１０倍高いグリセリンオキシダーゼ含量を示
すだけでなく、更に非常に高い比活性を有するグリセリ
ンオキシダーゼをも含有する微生物アスペルギルス／５
ｐｅｃ、 ＢＭＴＵｌ ９９７−１（ＤＳＭ １７２９
）の意想外な発見に基づく。
較して約数１０倍高いグリセリンオキシダーゼ含量を示
すだけでなく、更に非常に高い比活性を有するグリセリ
ンオキシダーゼをも含有する微生物アスペルギルス／５
ｐｅｃ、 ＢＭＴＵｌ ９９７−１（ＤＳＭ １７２９
）の意想外な発見に基づく。
本発明の試薬を用いる方法では、自体公知の方法により
酸素消費量又は生じたＨ２Ｏ２を測定することが出来る
。酸素消費量は酸素電極を用いてボラロメトリーにより
測定するのが有利で−ある。それというのもこの方法が
特に自動操作に好適であるためである。これに関して西
ドイツ国特許公開第２１３０３４０号、同 第２１６０ろ０８号公報に記載された水性媒体中の酸素
消費用のボラロメ） ＩＪ−測定法が好適である。他の
好適な方法はガスクロマトグラフィーである。
酸素消費量又は生じたＨ２Ｏ２を測定することが出来る
。酸素消費量は酸素電極を用いてボラロメトリーにより
測定するのが有利で−ある。それというのもこの方法が
特に自動操作に好適であるためである。これに関して西
ドイツ国特許公開第２１３０３４０号、同 第２１６０ろ０８号公報に記載された水性媒体中の酸素
消費用のボラロメ） ＩＪ−測定法が好適である。他の
好適な方法はガスクロマトグラフィーである。
形成されたＨ２Ｏ２は滴定法によっても、ボテンシオメ
トリー１、ポーラログラフイー及び比色定限法並びに酵
素法によっても測定できる。カタラーゼ及びペルオキシ
ダーゼな使用しての酵素法は有利である。それというの
もこれは非常に特異的であり、かつ信頼出来るものであ
るだけでなく、過酸化水素を形成する主反応と最も簡単
な方法で組合わせることができる。特にβ−ジケトン、
例えばアセチルアセトン及びメタノールもしくはエタノ
ール又はメチレングリコールの存在下でのカタラーゼを
用いての測定並びに１個以上の色原体の存在下でのペル
オキシダーゼを用いての測定が好適であることが判明す
る。カタラーゼ、アセチルアセトン及びメタノールを用
いての測定においで、メタノールはアセチルアセトンと
共に呈色反応を起こすホルムアルデヒドに酸化され、こ
れを測定することができる。ペルオキシダーゼを用いて
測定を行なう場合、反応後、測光法により測定すること
ができろ化合物を色原体として使用する。
トリー１、ポーラログラフイー及び比色定限法並びに酵
素法によっても測定できる。カタラーゼ及びペルオキシ
ダーゼな使用しての酵素法は有利である。それというの
もこれは非常に特異的であり、かつ信頼出来るものであ
るだけでなく、過酸化水素を形成する主反応と最も簡単
な方法で組合わせることができる。特にβ−ジケトン、
例えばアセチルアセトン及びメタノールもしくはエタノ
ール又はメチレングリコールの存在下でのカタラーゼを
用いての測定並びに１個以上の色原体の存在下でのペル
オキシダーゼを用いての測定が好適であることが判明す
る。カタラーゼ、アセチルアセトン及びメタノールを用
いての測定においで、メタノールはアセチルアセトンと
共に呈色反応を起こすホルムアルデヒドに酸化され、こ
れを測定することができる。ペルオキシダーゼを用いて
測定を行なう場合、反応後、測光法により測定すること
ができろ化合物を色原体として使用する。
好適な色原体の例は２．クーアミノベンズチアゾリン−
スルホン酸である。他の有利な例はトリンダー（Ｔｒｉ
ｎｄｅｒ ）による指示薬システムであり（Ａｎｎ、
Ｃ１１ｎ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、第６巻（１９６９年）、
第２４〜２７頁）、ここではフェノールを４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＡｐ ）とペルオキシダーゼ（ＰＯ
，Ｄ ）の存在下に、Ｈ２Ｏ２の作用下に酸化的に結合
させ色素とする。フエノールのかわりにフェノール誘導
体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、
ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリ
ン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及
び同じように反応する物質を使用することができろ。４
−アミノアンチピリンの代わりに４−アミノアンチピリ
ン誘導体、フェニレンジアミンスルホン酸、ＭＢＴＨ（
メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、Ｓ −ＭＢＴＨ
（スルホン化メチルベンゾチアゾロンヒ′ドラグン）、
ＭＢＴＨ誘導体、Ｓ−ＭＢＴＨ誘導体並びに同様に反応
する物質を使用することができる。
スルホン酸である。他の有利な例はトリンダー（Ｔｒｉ
ｎｄｅｒ ）による指示薬システムであり（Ａｎｎ、
Ｃ１１ｎ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、第６巻（１９６９年）、
第２４〜２７頁）、ここではフェノールを４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＡｐ ）とペルオキシダーゼ（ＰＯ
，Ｄ ）の存在下に、Ｈ２Ｏ２の作用下に酸化的に結合
させ色素とする。フエノールのかわりにフェノール誘導
体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、
ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリ
ン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及
び同じように反応する物質を使用することができろ。４
−アミノアンチピリンの代わりに４−アミノアンチピリ
ン誘導体、フェニレンジアミンスルホン酸、ＭＢＴＨ（
メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、Ｓ −ＭＢＴＨ
（スルホン化メチルベンゾチアゾロンヒ′ドラグン）、
ＭＢＴＨ誘導体、Ｓ−ＭＢＴＨ誘導体並びに同様に反応
する物質を使用することができる。
本発明の課題はグリセリンの測定試薬であり、これはア
スペルギ／ｌ／ ス５ｐｅｃ、ＢＭＴＵ １９９７−１
（ＤＳＭ １７２９ ）からのグリセリンオキシダーゼ
及びＨ２Ｏ２の測定システムから成る。有利にこの試薬
はエステル化グリセリンの鹸化のための付加的な薬剤、
特にリパーゼ／エステラーゼ又はエステラーゼを含有す
る。このために好適な試薬は専門家に公知であり、ここ
で更に詳細に説明する必要はない。
スペルギ／ｌ／ ス５ｐｅｃ、ＢＭＴＵ １９９７−１
（ＤＳＭ １７２９ ）からのグリセリンオキシダーゼ
及びＨ２Ｏ２の測定システムから成る。有利にこの試薬
はエステル化グリセリンの鹸化のための付加的な薬剤、
特にリパーゼ／エステラーゼ又はエステラーゼを含有す
る。このために好適な試薬は専門家に公知であり、ここ
で更に詳細に説明する必要はない。
有利な実施形式によれば、本発明による試薬は主にグリ
セリンオキシダーゼ、カタラーゼ、アセチルアセトン、
メタノール及び緩衝剤から、個別に又は混合してなる。
セリンオキシダーゼ、カタラーゼ、アセチルアセトン、
メタノール及び緩衝剤から、個別に又は混合してなる。
もう１つの有利な実施形式は主にグリセリンオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、少なくとも１種の色原体及び緩
衝剤から、個別に又は混合してなる。グリセリンオキシ
ダーゼとは以下常にアスペルギルス５ｐｅｃ、 ＢＭＴ
Ｕ １９９７−１ （ＤＳＭ １７２９ ）からのグリ
セリンオキシダーゼのことな示す。色指示システムはト
リンダーによるシステムが有利である。
ゼ、ペルオキシダーゼ、少なくとも１種の色原体及び緩
衝剤から、個別に又は混合してなる。グリセリンオキシ
ダーゼとは以下常にアスペルギルス５ｐｅｃ、 ＢＭＴ
Ｕ １９９７−１ （ＤＳＭ １７２９ ）からのグリ
セリンオキシダーゼのことな示す。色指示システムはト
リンダーによるシステムが有利である。
前記の有利な試薬組成物は＠記の必須成分の他に付加的
に常用の溶剤、安定剤又は／及び界面活性物質を含有し
てよい。これら添加物すべては専門家に公知であり、過
酸化水′素のための検出システムにおいて常用である、
緩衝剤としてはｐＨ５〜１０、有利にｐＨ６〜９な緩衝
する物質が好適である。好適な緩衝剤の典型的な例は燐
酸塩緩衝剤、トリス−緩衝剤、ＴＲＡ−緩衝剤、酢酸塩
緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤及びＨｅｐｅｓ −緩ｉ剤（
Ｎ −２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタン−
スルホンｌ！９）である。
に常用の溶剤、安定剤又は／及び界面活性物質を含有し
てよい。これら添加物すべては専門家に公知であり、過
酸化水′素のための検出システムにおいて常用である、
緩衝剤としてはｐＨ５〜１０、有利にｐＨ６〜９な緩衝
する物質が好適である。好適な緩衝剤の典型的な例は燐
酸塩緩衝剤、トリス−緩衝剤、ＴＲＡ−緩衝剤、酢酸塩
緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤及びＨｅｐｅｓ −緩ｉ剤（
Ｎ −２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタン−
スルホンｌ！９）である。
前記の試薬配合物は次の（１（比で主なる成分を含有す
る。
る。
グリセリンオキシダーゼ ２〜１５０Ｕ／ｍ４ペルオキ
シダーゼ ０．５〜１０ ［］ Ｕ／ＷＬｅ。
シダーゼ ０．５〜１０ ［］ Ｕ／ＷＬｅ。
少なくとも１神の色原体 ０．０５〜２０ミリモル／ｌ
。
。
並びに
少なくとも１神の界面活性剤 ０．００１〜０．１ ｇ
／ｍｅ、緩１’ｌｊｉ剤 ｐＨ６〜９゜ 動力学的測定のために試薬配合物を使用すべき場合、次
の）ｊ１比が右利である： グリセリンオキシダーゼ １００〜２５０．１ＫＵ／１
％ベルオキシダーセ″ ５〜５ ［］ ＫＵ／ｌ＼色原
体 ０．２〜５ミリモル／を 及び場合により 少なくとも１神の界面活性剤 １〜５ｇ／を又はこれら
の数倍量、及び緩衝剤ＰＨ６゜ｈ８．０グリセリンオキ
シダーゼな獲得するために使用した微生物アスペルギル
ス５ｐｅｃ、 ＢＭＴＵ １９９７−１（ＤＳ７−１（
ＤＳの培養は主成分としてグリセリン、麦芽エキス及び
酵母エキス、その他に・緩衝剤、塩及び微量元素を含有
する培地を使用して自体公知法で行なう。予培地として
は有利にグリセリン１〜１００５＋／ｚ、 麦芽エキス
ト５０ 綿の実粉１〜１００ｇ／を並びにに２）ＩＰＯ４・３Ｈ
２”０、２〜５．！ｌｉ’／ｌ（又は他のに２ＨＰ０４
−調剤の当量）、ＫＮＯ３ ０．２ 〜’５ ｇ ／
ｔ 、 ｃａｃｏ３０．１ 〜５ｊｊ ／ Ｚ ％ Ｎ
ａＣ１ Ｏ − １ 〜’１ ｇ／ Ｚ ％ ＦｅＳＯ
４０−０ ０ １〜０．１ ｇ／ｌ （ ７水和物とし
て測定）及びＭｇ”４０．１〜５９／ｌ（７永和物とし
て測定）を有する培地を使用する。
／ｍｅ、緩１’ｌｊｉ剤 ｐＨ６〜９゜ 動力学的測定のために試薬配合物を使用すべき場合、次
の）ｊ１比が右利である： グリセリンオキシダーゼ １００〜２５０．１ＫＵ／１
％ベルオキシダーセ″ ５〜５ ［］ ＫＵ／ｌ＼色原
体 ０．２〜５ミリモル／を 及び場合により 少なくとも１神の界面活性剤 １〜５ｇ／を又はこれら
の数倍量、及び緩衝剤ＰＨ６゜ｈ８．０グリセリンオキ
シダーゼな獲得するために使用した微生物アスペルギル
ス５ｐｅｃ、 ＢＭＴＵ １９９７−１（ＤＳ７−１（
ＤＳの培養は主成分としてグリセリン、麦芽エキス及び
酵母エキス、その他に・緩衝剤、塩及び微量元素を含有
する培地を使用して自体公知法で行なう。予培地として
は有利にグリセリン１〜１００５＋／ｚ、 麦芽エキス
ト５０ 綿の実粉１〜１００ｇ／を並びにに２）ＩＰＯ４・３Ｈ
２”０、２〜５．！ｌｉ’／ｌ（又は他のに２ＨＰ０４
−調剤の当量）、ＫＮＯ３ ０．２ 〜’５ ｇ ／
ｔ 、 ｃａｃｏ３０．１ 〜５ｊｊ ／ Ｚ ％ Ｎ
ａＣ１ Ｏ − １ 〜’１ ｇ／ Ｚ ％ ＦｅＳＯ
４０−０ ０ １〜０．１ ｇ／ｌ （ ７水和物とし
て測定）及びＭｇ”４０．１〜５９／ｌ（７永和物とし
て測定）を有する培地を使用する。
主培地にはグリセリン２０〜２００９／ｌ。
麦芽エキス５〜１００Ｆｊ／Ａｓ 酵母エキス０．５〜
５ｇ／ｌ，燐酸ー水素カリウム［１．２〜５ｇ／７、
ＫＮＯ３０．２ 〜５ ｇ／ｌ， ｃａｃｏ３０，１
〜５ 、！ｉ’７ Ｌ， ｔＪａｃＩ ３．１ 〜１
ｇ／ ｔ％硫酸第１鉄０．０ Ｄ １〜ｏ、１ｇ／を及
び硫酸マグネシウム０．１〜５ｇ／ｌを有する培地を使
用するのが有利である。個々の塩は前記予培地で記載し
たものと相応するものである。
５ｇ／ｌ，燐酸ー水素カリウム［１．２〜５ｇ／７、
ＫＮＯ３０．２ 〜５ ｇ／ｌ， ｃａｃｏ３０，１
〜５ 、！ｉ’７ Ｌ， ｔＪａｃＩ ３．１ 〜１
ｇ／ ｔ％硫酸第１鉄０．０ Ｄ １〜ｏ、１ｇ／を及
び硫酸マグネシウム０．１〜５ｇ／ｌを有する培地を使
用するのが有利である。個々の塩は前記予培地で記載し
たものと相応するものである。
予培地は通気下に２５〜４０℃の温度で振盪培地として
行なうのがよい。培養期間は一般に２０〜６０時間であ
る。
行なうのがよい。培養期間は一般に２０〜６０時間であ
る。
温度及び培養期間は主培地においても同様である。小さ
な発酵話中で空気０．５〜１ｔ／分／を培地を導入する
際特に良好な結果が得られる。
な発酵話中で空気０．５〜１ｔ／分／を培地を導入する
際特に良好な結果が得られる。
培養終了後、この生物塊な常法で分離し、この細胞を砕
解する。常用の砕解法な使用することができるが、機械
的に砕解するのが有利である。砕解溶液から不溶部を例
えば遠心分離又は吸引濾過することにより除去する。こ
の得られた溶液をそのまま直接グリセリン測定に使用す
ることができる。しかし更にこの酵素を精製するのが有
利である。
解する。常用の砕解法な使用することができるが、機械
的に砕解するのが有利である。砕解溶液から不溶部を例
えば遠心分離又は吸引濾過することにより除去する。こ
の得られた溶液をそのまま直接グリセリン測定に使用す
ることができる。しかし更にこの酵素を精製するのが有
利である。
精製は酵素分割のために常用の生物学的方法により行な
うことができる。しかし特に好適であるのは酵素分割に
おいて常用されない方法、つまりトリクロル酢酸での沈
殿であることが判明した。通常、トリクロル酢酸添加は
、蛋白質を有さない溶液にのみ興味がある場合、蛋白質
の完全な沈殿、すなわち蛋白質除去のためのみ行なわれ
る。意想外にも、本発明による酵素がトリクロル酢酸に
より活性損失なしに、かつ亮い濃縮効率で沈殿するとい
うことが判明した。
うことができる。しかし特に好適であるのは酵素分割に
おいて常用されない方法、つまりトリクロル酢酸での沈
殿であることが判明した。通常、トリクロル酢酸添加は
、蛋白質を有さない溶液にのみ興味がある場合、蛋白質
の完全な沈殿、すなわち蛋白質除去のためのみ行なわれ
る。意想外にも、本発明による酵素がトリクロル酢酸に
より活性損失なしに、かつ亮い濃縮効率で沈殿するとい
うことが判明した。
この際、この沈殿を、ｐｔ（５，４〜４．６の範囲のｐ
Ｈ値までトリクロル酢酸を添加することにより行なう。
Ｈ値までトリクロル酢酸を添加することにより行なう。
分離した沈殿中に比活性約３００Ｕ／ｍ９を有する所望
の酵素が見い出された。
の酵素が見い出された。
更に精製が所望の場合には、アセトン沈殿、引き続き硫
酸アンモニウム分割並びに弱塩基性交換樹脂での最後の
処理により行なうのが有利である。アセトン沈殿の際、
この溶液にアセトン０．２５〜０．６５容量を加える。
酸アンモニウム分割並びに弱塩基性交換樹脂での最後の
処理により行なうのが有利である。アセトン沈殿の際、
この溶液にアセトン０．２５〜０．６５容量を加える。
硫酸アンモニウム分割を０．５〜２．０のモル濃度で実
施するのが有利である。この操作はすでに８００Ｕ／ｍ
９より高い比活性に導びく。弱塩基性イオン交換樹脂、
有利にジエチルアミノエタノール基含有網状デ＃ ス）
７ ン（ＤＫＡＥ ５ｅｐｈａｄｅｘ ）での処理は
更に６〜１０倍の精製な与え、約２５００〜８０００Ｕ
／Ｉｎ９の比活性を有するグリセリンオキシダーゼに導
びく。本発明により使用した微生物をもちいて、すでに
１５００００〜２００００１］Ｕ ／ を培地の活性が
得られるので、この方法でグリセリン測定に必要なグリ
セリンオキシダーゼ量が急激に減少し、この製造は著し
く安くなる。
施するのが有利である。この操作はすでに８００Ｕ／ｍ
９より高い比活性に導びく。弱塩基性イオン交換樹脂、
有利にジエチルアミノエタノール基含有網状デ＃ ス）
７ ン（ＤＫＡＥ ５ｅｐｈａｄｅｘ ）での処理は
更に６〜１０倍の精製な与え、約２５００〜８０００Ｕ
／Ｉｎ９の比活性を有するグリセリンオキシダーゼに導
びく。本発明により使用した微生物をもちいて、すでに
１５００００〜２００００１］Ｕ ／ を培地の活性が
得られるので、この方法でグリセリン測定に必要なグリ
セリンオキシダーゼ量が急激に減少し、この製造は著し
く安くなる。
前記培養法及び精製法は酵素を培養の間培地に放出しな
いということを前提とする。しかしながや、界面活性剤
の存在下に培養することにより培地中に少なくとも活性
の１部が移る。同様に、得られた細胞からの界面活性剤
での抽出も可能である。しかしながら、この結果は機械
的砕解、例えば高圧分散における結果より劣っている。
いということを前提とする。しかしながや、界面活性剤
の存在下に培養することにより培地中に少なくとも活性
の１部が移る。同様に、得られた細胞からの界面活性剤
での抽出も可能である。しかしながら、この結果は機械
的砕解、例えば高圧分散における結果より劣っている。
本発明に使用する酵素は従来公知のグリセリンオキシダ
ーゼと特に著しく低い分子量により異なっている。例え
ば従来グリセリン測定に使用したグリセリンアルデヒド
形成グリセリンオキシダーゼが分子量少なくとも３００
０００を示すのに対し、本発明に使用する酵素はわずが
約９００００の分子量を示す。更に、酵素の活性は硫酸
銅又は酢酸鉛により抑制されず、一方Ｓ’ Ｈ−試薬は
阻止する。それに反し、前記の公知グリセリンオキシダ
ーゼの場合はＳＨ−試薬は安定化させ、硫酸銅及び酢酸
鉛は活性を約９゜％まで抑制する。その他の主な差は公
知の酵素の比活性が約３［ＩＵ／Ｉｎ９であるのに対し
本発明に使用する酵素の比活性は２０００〜８０００Ｕ
／ｍ９であるということである。更に、該酵素の安定性
はｐＨ５，０もしくはｐＨ１０，０で著しくより良好で
あり、′５７°Ｃにおける１０分後の活性はこの条件下
でなお５０〜５５％を有し、それに対し公知の酵素は６
もしくは３％を示す。
ーゼと特に著しく低い分子量により異なっている。例え
ば従来グリセリン測定に使用したグリセリンアルデヒド
形成グリセリンオキシダーゼが分子量少なくとも３００
０００を示すのに対し、本発明に使用する酵素はわずが
約９００００の分子量を示す。更に、酵素の活性は硫酸
銅又は酢酸鉛により抑制されず、一方Ｓ’ Ｈ−試薬は
阻止する。それに反し、前記の公知グリセリンオキシダ
ーゼの場合はＳＨ−試薬は安定化させ、硫酸銅及び酢酸
鉛は活性を約９゜％まで抑制する。その他の主な差は公
知の酵素の比活性が約３［ＩＵ／Ｉｎ９であるのに対し
本発明に使用する酵素の比活性は２０００〜８０００Ｕ
／ｍ９であるということである。更に、該酵素の安定性
はｐＨ５，０もしくはｐＨ１０，０で著しくより良好で
あり、′５７°Ｃにおける１０分後の活性はこの条件下
でなお５０〜５５％を有し、それに対し公知の酵素は６
もしくは３％を示す。
本発明の試薬はすべての種類の水性媒体、例えば食品抽
出物、体液及び特に血清中のグリセリンもしくはグリセ
リンエステル（トリグリセリド）の測定に好適である。
出物、体液及び特に血清中のグリセリンもしくはグリセ
リンエステル（トリグリセリド）の測定に好適である。
この方法の大きな特異性により遊離のグリセリンだけが
測定される。先ず第１に興味のあるエステル化グリセリ
ンの測定は、この化合物の鹸化により行なわれる。鹸化
を酵素により行なうのが有利である。
測定される。先ず第１に興味のあるエステル化グリセリ
ンの測定は、この化合物の鹸化により行なわれる。鹸化
を酵素により行なうのが有利である。
それというのも、こうして鹸化を本来のグリセリン測定
と同時に行なうことができる。
と同時に行なうことができる。
次に実施例につき本発明の詳細な説明する。
例 １
１）微生物の培養
グリセリン１０９／ｌ、麦芽エキス１註に２Ｐ０４・３
Ｈ２０１ 、５ ｇ ／ ｔ ％ ＫＮＯ３ １ ｇ／
４％ＣａＣｏ３２．Ｏ ｇ／ ｔ， ＮａＣ１ Ｏ．
５ ｇ／ ｔ， ＦｅＳＯ４。
Ｈ２０１ 、５ ｇ ／ ｔ ％ ＫＮＯ３ １ ｇ／
４％ＣａＣｏ３２．Ｏ ｇ／ ｔ， ＮａＣ１ Ｏ．
５ ｇ／ ｔ， ＦｅＳＯ４。
７ Ｈ２Ｏ ［１．０ １ ｊｊ ／ Ｌ及びＭｇ５Ｃ
１，・７Ｈ２０ １．Ｏ ｇ ／ｌを含有する予培地６
０ａｌｌをアスペルギルス５ｐｅｃ．ＢＭＴＵ １ ９
９ ７− １ （ＤＳＭ １ ７２９ ）の胞子で接種
し、３０’Ｃで４８時間通気下に振盪する。
１，・７Ｈ２０ １．Ｏ ｇ ／ｌを含有する予培地６
０ａｌｌをアスペルギルス５ｐｅｃ．ＢＭＴＵ １ ９
９ ７− １ （ＤＳＭ １ ７２９ ）の胞子で接種
し、３０’Ｃで４８時間通気下に振盪する。
このようにして得られた予培地ろ６０ｒｔｔｅをグリセ
９シ１００ 酵母：ｒ−キス２．５ 、！ｉ’／ ｔｓ Ｋ２ＨＰＯ
４・３Ｈ２０ １．５ ｇ／ｌｓ ＫＮ”３ １．０
ｇ／ ｔｓ ０ａＯ０３ ２．０ ９ ／ ｔ。
９シ１００ 酵母：ｒ−キス２．５ 、！ｉ’／ ｔｓ Ｋ２ＨＰＯ
４・３Ｈ２０ １．５ ｇ／ｌｓ ＫＮ”３ １．０
ｇ／ ｔｓ ０ａＯ０３ ２．０ ９ ／ ｔ。
ＮａＣ１ Ｏ．５ ＆ ／ ｔ 、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ
２０ ０．０ １ 、！ｉ’ ／ Ｌ及びＭｇ””０４
・７ Ｈ２Ｏ １ 、０ ９ ／ Ｌヲ含有スル主培地
１５を中に加える。６ Ｄ Ｏ ｒ．ｎ．ｍ．で攪拌し
、空気１０ｔ／分で通気された２５１発酵器中話中０°
Ｃで主培養を行なった。培養期間２２時間後、活性は１
’７ ４ ８０ ０ Ｕ／ ｔであった。活性測定を０
．１モルＴＲＡ−緩衝剤中、ｐＨ ８で、湿度２５°σ
でｐ−クロルフェノール及び４−アミノアンチピリンを
用いて５ ４ ６ ｎｍで行なった。
２０ ０．０ １ 、！ｉ’ ／ Ｌ及びＭｇ””０４
・７ Ｈ２Ｏ １ 、０ ９ ／ Ｌヲ含有スル主培地
１５を中に加える。６ Ｄ Ｏ ｒ．ｎ．ｍ．で攪拌し
、空気１０ｔ／分で通気された２５１発酵器中話中０°
Ｃで主培養を行なった。培養期間２２時間後、活性は１
’７ ４ ８０ ０ Ｕ／ ｔであった。活性測定を０
．１モルＴＲＡ−緩衝剤中、ｐＨ ８で、湿度２５°σ
でｐ−クロルフェノール及び４−アミノアンチピリンを
用いて５ ４ ６ ｎｍで行なった。
２）酵素の精製
前記のよ５にして得られた乾燥塊１００ｇを０、０２モ
ル酢酸塩緩衝剤、ＰＨ ６．０％ ５ Ｌ中に懸濁させ
高圧分散により砕解する。引き続き、遠心分離を行ない
、沈殿をすてる。
ル酢酸塩緩衝剤、ＰＨ ６．０％ ５ Ｌ中に懸濁させ
高圧分散により砕解する。引き続き、遠心分離を行ない
、沈殿をすてる。
上澄に０．１モルトリクロル酢酸溶液を加え、ｐＨ値を
４．８とする。この沈殿を遠心分離する。
４．８とする。この沈殿を遠心分離する。
これは比活性３００Ｕ／〜を示す。
６）精密な精製
上リクロル酢酸沈殿による沈殿を０．１モル酢酸塩緩衝
剤、ｐ”６．０ｓ ５ ０ ０ｒｒｔｌＫｆａｆｐシ、
０℃でアセトンＯ０ろ容醒を加える。生じた沈殿を遠心
分離し、新たに０．１モル酢酸塩緩衝剤， ｐＨ６．０
に溶かす。このようにして得られた酵素溶液に一硫酸ア
ンモニウムをモル濃度１．０まで添加する。
剤、ｐ”６．０ｓ ５ ０ ０ｒｒｔｌＫｆａｆｐシ、
０℃でアセトンＯ０ろ容醒を加える。生じた沈殿を遠心
分離し、新たに０．１モル酢酸塩緩衝剤， ｐＨ６．０
に溶かす。このようにして得られた酵素溶液に一硫酸ア
ンモニウムをモル濃度１．０まで添加する。
この沈殿を遠心分離する。その比活性は約８００Ｕ／〜
である。
である。
この沈殿を新たに硫酸アンモニウム分割におけろと同じ
緩衝剤中に〜溶かし、同じ緩衝剤に対し透析し、次いで
ＤＫＡＥ−セファデックス（ ５ｅｐｈａｄｅｘ 、同
じ緩衝剤に対し平衡にする）と混合し、１時間攪拌する
。次いで、交換樹脂を同じ緩衝剤で洗浄し、０．２モル
酢酸塩緩衝剤、ｐＨ ６．０で分別溶離する。活性のフ
ラクションを合併する。このようにして得られた生成特
の比活性は個々のフラクションにおいて２５００〜８０
００Ｕ／ｍｇの間である。
緩衝剤中に〜溶かし、同じ緩衝剤に対し透析し、次いで
ＤＫＡＥ−セファデックス（ ５ｅｐｈａｄｅｘ 、同
じ緩衝剤に対し平衡にする）と混合し、１時間攪拌する
。次いで、交換樹脂を同じ緩衝剤で洗浄し、０．２モル
酢酸塩緩衝剤、ｐＨ ６．０で分別溶離する。活性のフ
ラクションを合併する。このようにして得られた生成特
の比活性は個々のフラクションにおいて２５００〜８０
００Ｕ／ｍｇの間である。
例 ２
Ｈ２Ｏ。−形成を介してのグリセリンの測定；２種類の
試薬を製造する： 試薬１ニ トリエタノールアミ ン／ ｐＨ ８．０ ０．１モル
／ｌｓＭｏｌ−緩衝剤 イ ソ ト リ デシルエーテル ６．６ミリモル／ｌ
もしくは２ｇ／ｉｓ コール酸す ト リ ラム ４．７ミリモル／ｌもしく
は２ ｇ／Ｌ ％ Ｄ−クロルフェノール １０ミリモル／ｌ。
試薬を製造する： 試薬１ニ トリエタノールアミ ン／ ｐＨ ８．０ ０．１モル
／ｌｓＭｏｌ−緩衝剤 イ ソ ト リ デシルエーテル ６．６ミリモル／ｌ
もしくは２ｇ／ｉｓ コール酸す ト リ ラム ４．７ミリモル／ｌもしく
は２ ｇ／Ｌ ％ Ｄ−クロルフェノール １０ミリモル／ｌ。
アミノ置換 ４−アミノ
アンチピリン ０．５ミリモル／ｌ。
ペルオキシダーゼ ＩＯＵ／ａ（！。
試薬２：
グリセリンオキシダーゼ ５ ０ ０ Ｕ ／ｒｕｅ。
測定を実施するために試薬１２ｍｇ試薬２０、２コをタ
ペット中に測り入れる。吸光度Ｅ□、を測光器を用いて
５ ４ ６ ｎｍで読み取る。引き紐き、試料２０μｔ
を添加茅し、反応を開始する。
ペット中に測り入れる。吸光度Ｅ□、を測光器を用いて
５ ４ ６ ｎｍで読み取る。引き紐き、試料２０μｔ
を添加茅し、反応を開始する。
遊離のグリセリンを測定するために、試料としてすべて
の種類の水性媒体、例えば食品抽出物、体液及び特に血
清を使用することができ、トリグリセリドの測定のため
には鹸化の後、使用することができる。
の種類の水性媒体、例えば食品抽出物、体液及び特に血
清を使用することができ、トリグリセリドの測定のため
には鹸化の後、使用することができる。
２０分間の反応時間後、吸光度Ｅ２を読みとる。恒温保
持温度は２５°Ｃである。
持温度は２５°Ｃである。
評価は、グリセリン標準容液の測定吸光度差△Ｅ ＝−
Ｂ２− Ｅ］をグリセリン濃度もしくはトリグリセリド
濃度に関連させた検量線により行なう（第２図参照）。
Ｂ２− Ｅ］をグリセリン濃度もしくはトリグリセリド
濃度に関連させた検量線により行なう（第２図参照）。
試験配合物中の濃度は次のようであるニトリエタノ−”
ルアミン／ ＨＣｌ−緩衝剤、ｐＨ８，Ｄ Ｏ，０９モル／ｌ、。
ルアミン／ ＨＣｌ−緩衝剤、ｐＨ８，Ｄ Ｏ，０９モル／ｌ、。
イントリデシルエーテル １．８ Ｖｌ＝ （３，２ミ
リモル／１）、コール酸ナトリウム ４．３ミリモル／
ｌ。
リモル／１）、コール酸ナトリウム ４．３ミリモル／
ｌ。
ｐ−り°／Ｌ７７ ：ｆ−／ −／Ｌｌ ９ミリモル／
ｌ、アミノ置換４−アミノ アンチピリン ０．４５ミリモル／１１ペルオキシダー
ゼ ９Ｕ／尻ｅ。
ｌ、アミノ置換４−アミノ アンチピリン ０．４５ミリモル／１１ペルオキシダー
ゼ ９Ｕ／尻ｅ。
グリセリンオキシダーゼ ４５Ｕ／ａｇ。
例 ６
酸素消費量を用いてのグリセリンの測定第１図に示した
装置を使用する。この装置は内径１４６ｍｍ及び内高２
２０朋を有する透明なプラスチック製の円筒状の室のか
たちの反応容器１からなる。この室は０．２モルカリウ
ム燐酸緩衝剤、ｐＨ６，８中の沃化カリウム１８ミリモ
ル、化モリブデン酸アンモニウム７．５ミリモル、塩化
ナトリウム８００ミリモル及びグリセリンオキシダーゼ
５０Ｕの溶液１．８ｍ／！を含有する。反応容器中には
、酸素感受性電極から成るディテクタ３ （ＷＴＷ ：
ｏｘ■−Ｅ１ｅｋｔｒｏａｅｇ０１６）が突出してい
る。このディテクタは分析器４と結合している（ＷＴＷ
：挿入物０ＸＩ６１０Ｄを有するヂイゾタルメーターＤ
ＩＧ工６１ ［１）。
装置を使用する。この装置は内径１４６ｍｍ及び内高２
２０朋を有する透明なプラスチック製の円筒状の室のか
たちの反応容器１からなる。この室は０．２モルカリウ
ム燐酸緩衝剤、ｐＨ６，８中の沃化カリウム１８ミリモ
ル、化モリブデン酸アンモニウム７．５ミリモル、塩化
ナトリウム８００ミリモル及びグリセリンオキシダーゼ
５０Ｕの溶液１．８ｍ／！を含有する。反応容器中には
、酸素感受性電極から成るディテクタ３ （ＷＴＷ ：
ｏｘ■−Ｅ１ｅｋｔｒｏａｅｇ０１６）が突出してい
る。このディテクタは分析器４と結合している（ＷＴＷ
：挿入物０ＸＩ６１０Ｄを有するヂイゾタルメーターＤ
ＩＧ工６１ ［１）。
反応容器１の底には磁気攪拌器５を有する。
充填口６を介してグリセリン含有水溶液２０μｔを試料
として加える。磁気攪拌器で強力な攪拌下に溶液の酸素
濃度の減少を測定する。観測された酸素消費量をグリセ
リン濃度に対して記載する。
として加える。磁気攪拌器で強力な攪拌下に溶液の酸素
濃度の減少を測定する。観測された酸素消費量をグリセ
リン濃度に対して記載する。
例 ４
動力学的測定
試料：
水性標準液（グリセリン含有＠１０〜１００ダ／ｄ１）
試薬ニ
ア１ｐｅｓ−緩衝剤０．１モル／４ｓ Ｈ２ＢＯ３１，
７モル／ Ｌ ％ ＰＨ＝ ７．０ イソトリデシルエーテル ろ、ｏ ｇ ／ ｔ ％コー
ル酸ナトリウム ろ、ｏ ｇ／ ｔｓアミノ置換４−ア
ミノ アンチピリン ０．５ミリモル／１％ ｐ−クロルフェノール １０−０ ミ’Ｊモル／１５ペ
ルオキシダーゼ １０．ＯＫＵ／１１グリセリンオキシ
ダーゼ １２１．０ ＫＵ／ ｉ。
７モル／ Ｌ ％ ＰＨ＝ ７．０ イソトリデシルエーテル ろ、ｏ ｇ ／ ｔ ％コー
ル酸ナトリウム ろ、ｏ ｇ／ ｔｓアミノ置換４−ア
ミノ アンチピリン ０．５ミリモル／１％ ｐ−クロルフェノール １０−０ ミ’Ｊモル／１５ペ
ルオキシダーゼ １０．ＯＫＵ／１１グリセリンオキシ
ダーゼ １２１．０ ＫＵ／ ｉ。
ケ９ムゼクーファストーアナリューザ゛−（Ｇｅｍ５ａ
ｅｃ−Ｆａｓｔ−Ａｎａｌｙｚｅｒ ）自動分析器で実
施。
ｅｃ−Ｆａｓｔ−Ａｎａｌｙｚｅｒ ）自動分析器で実
施。
温度 −２５°Ｃ
測定波長 ’ ５４６ ｎｍ
・試料容量 ゛ １０μを
希釈剤（水）： ５０μを
試薬容量 ＝ ５００μを
測定時間
１回目の測定：開始後ろ５秒
２回目の測定：開始後３１５秒。
次の結果が得られた：
試料：水性標準液
グリセリン（ＵＶ−試験） 再び検出された％１１ １
’０５ ２１ １０１ ろ２ １００ ４３ １０１ ５４ １００ ６５ ９９ ７６ ９９ ８７ ９９ ９６ １０２ 動力学的測定において試薬中の次の量比で作業するのが
有利である： Ｐｉｐｅｓ−緩衝剤０．０５〜０．５モル／ Ｌ 、
’ Ｈ３ＢＯ３０．５〜２．０モル／ ｔｓ ｐＨ６，
８〜８．０イソトリデシルエーテル １〜ｓ ｇ／ ｔ
ｚコール酸ナトリウム １〜”ｒｇ／ｌｓアミノ置換４
−アミノ アンチピリン ０．２〜５ミリモル／１５Ｄ−クロルフ
ェノール ５〜５０ミリモル／１１ペルオキシダーゼ
５〜５ＤＫＵ／ｌ。
’０５ ２１ １０１ ろ２ １００ ４３ １０１ ５４ １００ ６５ ９９ ７６ ９９ ８７ ９９ ９６ １０２ 動力学的測定において試薬中の次の量比で作業するのが
有利である： Ｐｉｐｅｓ−緩衝剤０．０５〜０．５モル／ Ｌ 、
’ Ｈ３ＢＯ３０．５〜２．０モル／ ｔｓ ｐＨ６，
８〜８．０イソトリデシルエーテル １〜ｓ ｇ／ ｔ
ｚコール酸ナトリウム １〜”ｒｇ／ｌｓアミノ置換４
−アミノ アンチピリン ０．２〜５ミリモル／１５Ｄ−クロルフ
ェノール ５〜５０ミリモル／１１ペルオキシダーゼ
５〜５ＤＫＵ／ｌ。
グリセリンオキシダーゼ １００〜２５０ ＫＯ／／１
．０この例は、本発明を臨床化学的慣用診断実験室中に
ある重要な字動分析器で実施することができろことを示
す。
．０この例は、本発明を臨床化学的慣用診断実験室中に
ある重要な字動分析器で実施することができろことを示
す。
第１図は酸素消費量によりグリセリンを測定する装置を
示す略図である。 １・・・反応容器、３・・・ディテクタ、４・・・分析
器、５・・・磁気柳拌器 第２図はＨ２Ｏ２−形成によりグリセリンを測定する際
の、グリセリン標準液の測定吸光度差ΔＥ ：＝ Ｅ２
− Ｅｌをグリセリンもしくはトリグリセリド濃度に関
連させた検量線を示す。 第２図
示す略図である。 １・・・反応容器、３・・・ディテクタ、４・・・分析
器、５・・・磁気柳拌器 第２図はＨ２Ｏ２−形成によりグリセリンを測定する際
の、グリセリン標準液の測定吸光度差ΔＥ ：＝ Ｅ２
− Ｅｌをグリセリンもしくはトリグリセリド濃度に関
連させた検量線を示す。 第２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 アスペルギルス５ｐｅｃ、 （Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ５ｐｅｃ、 ）ＢＭＴＵ １９９７−１ （Ｄ
ＳＭ １７２９ ） （微工研菌寄第５８６０号）から
のグリセリンオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２を測定するため
、のシステムから成ることを特徴とするグリセリンの測
定試薬。 ２ エステル化グリセリンを鹸化するための薬剤な伺加
的に含有する特許請求の範囲第１単記・１＆の試薬。 ３、Ｈ２Ｏ２測定システムがカタラーゼ、アセチルアセ
トン、メタノール及び緩衝剤よりなる特、請求の准四節
１項又は第２珀記載の試薬。 ” ２０２１１１１１定システムがペルオキシダーゼ、
少なくとも１種の色原体及びＬ’？ ＱＪ剤よりなる特
、ｉ′１精求の範、四節１項又は第２項記載の試薬。 ５ グリセリンオキシダーゼ２〜１５０ Ｕ／ｍｉペル
オキシダーゼ０．５〜１００Ｕ／尻ｌ１色原体０．０５
〜２０ミリモル／を及び場合により少なくとも一種の界
面活性剤０．００１〜０．１ｊｊ ／ ｒｎｌ又はこれ
らの数倍量及び緩衝剤、ｐＨ６〜９、を含有する特許請
求の範囲第４項記載の試薬。 ６、グリセリンオキシダーゼ１００〜２５０ＫＵ／ ｔ
ｓペルオキシダーゼ５〜５０ＫＵ／ｌ。 色原体０．２〜５ミリモル／を及び場合により少なくと
も一種の界面活性剤１〜５ｇ／を又はこれらの数倍量及
び緩衝剤、ｐＨ６，８〜８．０、を含有する特許請求の
範囲第４項記載の試薬。 ス 担持材料、例えば紙上に含浸されている特許請求の
範囲第１項から第６項までの（・ずれか１項に記載の試
薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3004129.3 | 1980-02-05 | ||
| DE3004129 | 1980-02-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60259199A true JPS60259199A (ja) | 1985-12-21 |
| JPH0254079B2 JPH0254079B2 (ja) | 1990-11-20 |
Family
ID=6093779
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56014455A Expired JPS6036754B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | グリセリンの測定法 |
| JP56014456A Expired JPS6036756B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | 酸素反応におけるｈ↓２ｏ↓２−形成の測定法 |
| JP60074564A Granted JPS60259185A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンオキシダ−ゼの取得法 |
| JP60074563A Granted JPS60259199A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンの測定試薬 |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56014455A Expired JPS6036754B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | グリセリンの測定法 |
| JP56014456A Expired JPS6036756B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | 酸素反応におけるｈ↓２ｏ↓２−形成の測定法 |
| JP60074564A Granted JPS60259185A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンオキシダ−ゼの取得法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4399218A (ja) |
| EP (1) | EP0033540B1 (ja) |
| JP (4) | JPS6036754B2 (ja) |
| AR (1) | AR224669A1 (ja) |
| AT (1) | ATE10013T1 (ja) |
| AU (1) | AU522705B2 (ja) |
| CA (1) | CA1149712A (ja) |
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