RU1788466C - Способ определени холестерина - Google Patents

Способ определени холестерина

Info

Publication number
RU1788466C
RU1788466C SU904850152A SU4850152A RU1788466C RU 1788466 C RU1788466 C RU 1788466C SU 904850152 A SU904850152 A SU 904850152A SU 4850152 A SU4850152 A SU 4850152A RU 1788466 C RU1788466 C RU 1788466C
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cholesterol
concentration
sodium chlorate
buffer
peroxidase
Prior art date
Application number
SU904850152A
Other languages
English (en)
Inventor
Юрий Владимирович Родионов
Наталия Юрьевна Филиппова
Алексей Феликсович Духович
Наталия Николаевна Угарова
Original Assignee
МГУ им.М.В.Ломоносова
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by МГУ им.М.В.Ломоносова filed Critical МГУ им.М.В.Ломоносова
Priority to SU904850152D priority Critical patent/RU1788467C/ru
Priority to SU904850152A priority patent/RU1788466C/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU1788466C publication Critical patent/RU1788466C/ru

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Использование: медицина, ферментативный анализ. Цель изобретени  - повышение точности способа. Сущность изобретени : процесс осуществл ют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20-55°С в течение 2-20 минут реагентом, содержащим холе- стеринэстеразу, буферную смесь и детергент , при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина. На второй стадии осуществл ют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образовани  перок- сида водорода. Регистрацию ведут фотометрическим методом.

Description

Изобретение относитс  к области ферментативного анализа и может быть использовано в клинических исследовани х при диагностике атеросклероза, диабета, мочекаменной болезни, функциональных расстройств печени и некоторых инфекционных заболеваний.
Известен способ определени  холестерина , основанный на измерении скорости выделени  пероксида водорода. Определение холестерина данным способом, которой по своей сути наиболее близок к за вл емому изобретению, выполн етс  следующим образом, Аликвота исследуемого образца, например, сыворотки крови, вноситс  в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую реакционную смесь следующего состава:
Буферна  смесь 0,1 М, рН 5-9 Субстраты пероксидазы Соли желчных кислот 1-20 мМ, Неиснные детергенты - 0,1 - 10 г/л Холестеринэстераза 100 - 30000 ед/л Холестериноксидаза 100 - 30000 ед/л
Пероксидаза 2500 ед/л. Далее провод т регистрацию изменени  оптической плотности при температуре 20- 40°С в течение 2-15 мин,
Недостатки рассматриваемого способа определени  холестерина заключаютс  в следующем.
Оптимальные услови  проведени  реакций гидролиза и окислени  не идентичны (не совпадают оптимум рН, температурный оптимум, концентрации детергентов), что приводит к использованию больших количеств ферментов.
Проведение определени  холестерина рассматриваемым способом основано на одновременном проведении 3-х последовательных реакций. Исходно в исследуемых образцах содержитс  как этерифицирован- ный. так и неэтерифицированный холестерин , причем соотношение этих форм холестерина может мен тьс  в зависимости от сыворотки. Кроме того, скорость гидролиза этерифицированного холестерина холе- стеринэстеразой зависит от длины и
00
С
Ivl
iOO
ioo
i.N О О
степени насыщенности остатка жирной кислоты . Поэтому начальна  скорость образовани  пероксида водорода зависит не Только от общей концентрации холестерина , но и от соотношени  разных форм холе- стерина в образце, что приводит к снижению достоверности определени .
Целью изобретени   вл етс  повышение точности определени .
Поставленна  цель достигаетс  предложенным способом, заключающимс  в том, что исследуемую пробу добавл ют в водную среду инкубации состава: не менее 0,01 М буфера с рН 6,5-8, не менее 5 г/л холевокис- лого натри  и не менее 10 ед/л холестери- нэстеразы, инкубируют при температуре 22-55°С не менее 2 мин, после чего аликво- ту инкубационной смеси внос т в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую не менее 0,01 м/л буфера с рН 6,5-8, не менее 2 г/л холевокислого натри , не менее 0,3 ед/л пероксидазы, не менее 0,5 ед/л холестериноксидазы, не менее 0,08 г/л 4-аминоантипирина и не менее 0,03 г/л 8- оксихинолина, с последующей спектрофо- тометрической регистрацией скорости реакции образовани  пероксида водорода.
Предложенный способ отличаетс  от известного пор дком проведени  операций , а именно, разделением стадии гидролиза и экстракции со стадией окислени , что дает возможность осуществл ть гидролиз в оптимальных услови х при температуре 25- 55°С не менее 2 мин, а также соотношением реагентов в гидролизующей и окисл ющей смес х.
Эти отличи  позвол ют повысить точность определени  и существенно сократить расход реагентов.
Пример 1. Образец сыворотки (0,02 мл) внос т в пробирку с реакционной смесью (0,2 мл), содержащей 0,01 М К-фос- фатного буфера рН 7.0, холевокислого натри  10 г/л, 30 ед/л холестеринэстеразы из поджелудочной железы. Параллельно в раствор того же состава внос т 0,02 мл стандартного раствора холестерина (5 мМ). Пробы инкубируют 10 мин при 45° С. Затем из каждой пробирки отбирают по 0,1 мл реакционнойсмеси , внос т - в спектрофотометрическую кювету, содержащую 0,7 мл раствора следующего состава: 0,03 М К-фосфатный буфер, рН 7.0, 5 г/л холевокислого натри , холестериноксидазу (5 ед/л), пероксидазу (20 ед/л), 4-аминоан- типирин (0,16 г/л), 8-оксихинолин (0,20 г/л). Дл  каждого из образцов измер ют начальную скорость изменени  оптической плотности в течение 2 мин при длине волны 500
нм. Результаты измерений приведены в табл.1,
Концентрацию холестерина рассчиты- 5 вают по уравнению:
холестерин
Ухол
х 5.0 мМ,
где холестерин -концентраци холестерина в исследуемой пробе;
Ухол - скорость изменени  оптической плотности дл  исследуемой пробы;
. Уст - скорость увеличени  оптической плотности в случае стандартного раствора холестерина.
Пример 2. Услови  проведени  эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что при анализе стандартной сыворотки (5 мМ) используют различные значени  рН при проведении
первой стадии реакции гидролиза. Результаты измерений приведены в табл. 2.
Из полученных данных следует, что оптимальные значени  рН дл  проведени  реакции гидролиза составл ют 6,5-8,0,
Примерз. Услови  эксперимента аналогичны услови м в примере 1, за исключением того, что используют различные кон- центрации холевокислого натри  в гидролизующей смеси. Результаты измерений приведены в . 3.
На основании данных, приведенных в табл. 3, оптимальна  концентраци  холевокислого натри  в гидролизующей смеси составл ет не менее 5 г/л.
П р и м е р 4. Услови  проведени  эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что измен ют температуру при которой проводитс  гидролиз (табл. 4).
Из данных приведенных в табл. 4 следует , что полный гидролиз этерифицированно- го холестерина достигаетс  при температуре 20-55°С при концентрации холестеринэстеразы из поджелудочной железы в гидролизующе й смеси 2 мг/мл (активность холестеринэстеразы 0,03 ед/мл).
Пример 5. Услови  измерени  те же. что в примере 1, за исключением того, что
измен ют концентрацию холестеринэстеразы в гидролизующей смеси. Данные пред- ставлены в табл. 5.
На основании данных, приведенных в табл. 5, оптимальна  концентраци  холестеринэстеразы составл ет не менее 10 ед/л при температуры 45°С и времени гидролиза 10 мин.
Пример 6. Услови  проведени  реакции аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что измен ют состав реакционной смеси дл  проведени  реакции окислени  холестерина: (табл. 6), варьиру  концентрацию холевокислого натри .
Таким образом, оптимальна  концентраци  холевокислого натри  в реакционной смеси при окислении холестерина составл ет не менее 2,0 г/л.
Пример 7. Услови  проведени  эксперимента такие же как в примере 1, но измен етс  концентраци  8-оксихинолина. Результаты измерений представлены в табл. 7 получены дл  стандартной сыворотки с концентрацией 5 мМ.
Таким образом, оптимальной концентрацией 8-оксихинолина  вл етс  не менее 0,3 г/л.
Пример 8. Услови  измерени  те же, что в примере 1, за исключением того, что измен ют концентрацию 4-аминоантипири- на. Данные, измеренные дл  стандартной сыворотки 5 мМ, приведены в табл 8.
Из данных, приведенных в табл. 8, следует , что оптимальной концентрацией 4- аминоантипирина  вл етс  концентраци  не менее 0,08 г/л.
Пример 9. Услови  эксперимента те же, что в примере 1, за исключением того, что измен ют концентрацию пероксидазы в реакционной смеси. Данные приведены в табл. 9.
Полученные данные показывают, что оптимальной концентрацией пероксидазы в реакционной смеси  вл етс  не менее 0,3 ед/л.
Пример 10. Услови  эксперимента те же, что в п. 1, за исключением того, что все сыворотки параллельно измер ют и по способу прототипа, а при измерении по за вл емому способу используют концентрации холестеринэстеразы и холестериноксидазы те же, что в прототипе -- 1 ед/мл. При измерении по способу прототипа к 20 мкл образцов сывороток добавл ли 2 мл смеси следующего состава:
0,1 М фосфатный буфер рН 6,7
8,6 мМ трибромгидроксибензойна  кислота
1,6 мМ 4-аминоантипирин
3 мМ холевокислый натрий
0,1 % полиэтиленгликоль 6000
0,1 % трезит
1000 ед/л холестеринэстераза 1000 ед/л холестериноксидаза 2500 ед/л пероксидаза
Инкубировали при 30°С и через 2 минуты регистрировали фотометрически скорость образовани  пероксида водорода. В эксперименте использовались следующие контрольные сыворотки: фирмы Boehringer
mannheim PrecHip EL (концентраци  холестерина 8,5 мМ), фирмы Labsystem norm (концентраци  холестерина 3,7 мМ), sepocont P (концентраци  холестерина 4,7 мМ, фирмы Hyland паталогическа  (концентраци  холестерина 5,0 мМ). Результаты измерений приведены в таблице. 10.
Из приведенных в табл. 10 данных следует , что при измерении по способу-прототипу полученные результаты завис т от
состава липопротеидных комплексов в сыворотках крови, а при измерении по за вл емому способу точность результатов во всех сыворотках одинакова, что свидетельствует о большей точности предложенного способа .

Claims (1)

  1. Формула изобретени  Способ определени  холестерина, включающий инкубацию исследуемой пробы в среде, содержащей буфер, субстрат
    пероксидазы, соль желчных кислот, холе- стеринэстеразу, холестериноксидазу и пероксидазу и последующую спектрофо- тометрическую регистрацию скорости образовани  перекиси водорода, о т л ичающийс  тем, что, с целью повышени  точности способа, исследуемую пробу добавл ют в водную среду инкубации, содержащую буфер с рН 6,5-8,0 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 5 г/л, холестериноксидазу не менее 10 ед/л, инкубируют не менее 2 мин при 25-55°С, затем аликвоту инкубационной смеси внос т в измерительную кювету, содержащую буфер с
    рН 8,0-8,6 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 2 г/л, пероксидазу не менее 0,3 ед/л, холестериноксидазу не менее 0,5 ед/л, 4- аминоантипирин в концентрации не менее
    0,08 г/л и 8-оксихинолин в концентрации не менее 0,03 г/л.
    Таблица 1
    Таблица2
    Таб лицаЗ
    Таблиц   4
    Активность холестеринэстеразы, ед/л
    3,0
    7,5
    10,2
    15,0
    22,0
    30,0
    45,0
    Концентраци  холевокислого натри , г/л в реакции окислени 
    1,0
    1.5
    2,0
    5,5
    6,5
    8,5
    15,0
    20,0
    Таблицаб
    Измеренна  величина концентрации холестерина в станд. сыворотке , мМ ( при )
    1,5+ 1,20 4,4 + 0,28 4,75 + 0,26 4,95 + 0,20
    4.9 + 0,21
    5.0 + 0,22 4,9 + 0,25
    Таблицаб
    Измеренна   величина концентрации холестерина в станд. сыворотке , мМ ( при )
    0,6 + 1,90
    2,5 + 0,72
    4,8 + 0,34
    4,85 + 0,24
    5,0 + 0,21
    4,9 +0,26
    4,85 + 0,17
    4,9 + 0,22
    Таблица
    ТаблицаЗ
    ТаблицаЭ
    Таблица 10
SU904850152A 1990-05-22 1990-05-22 Способ определени холестерина RU1788466C (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU904850152D RU1788467C (ru) 1990-05-22 1990-05-22 Способ определени холестерина
SU904850152A RU1788466C (ru) 1990-05-22 1990-05-22 Способ определени холестерина

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU904850152A RU1788466C (ru) 1990-05-22 1990-05-22 Способ определени холестерина

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU1788466C true RU1788466C (ru) 1993-01-15

Family

ID=21526977

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU904850152D RU1788467C (ru) 1990-05-22 1990-05-22 Способ определени холестерина
SU904850152A RU1788466C (ru) 1990-05-22 1990-05-22 Способ определени холестерина

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU904850152D RU1788467C (ru) 1990-05-22 1990-05-22 Способ определени холестерина

Country Status (1)

Country Link
RU (2) RU1788467C (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЕР № 265933, кл. С 12 Q 1/60, 1988. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU1788467C (ru) 1993-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US3964974A (en) Enzymatic determination of glucose
SU1338787A3 (ru) Способ определени перекиси водорода при ферментативной реакции
Huang et al. Fluorometric enzymatic determination of total cholesterol in serum
US6008006A (en) Determination of glycated proteins
US4399218A (en) Method and reagent for the determination of glycerin
Shephard et al. Falsely low estimation of triglycerides in lipemic plasma by the enzymatic triglyceride method with modified Trinder's chromogen
US4211844A (en) Bilirubin-specific fungal enzyme preparation
US4366244A (en) Method for measuring serum cholesterol
EP0116307B1 (en) Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase
EP0010296A1 (en) Test composition for the determination of triglycerides and its use
JP4889396B2 (ja) ロイコ色素の安定化方法
US4001089A (en) Method for determination of triglycerides and glycerol
Kohlbecker et al. Direct spectrophotometric determination of serum and urinary oxalate with oxalate oxidase
EP1288306B1 (en) Method of analyzing components in biological samples
NL7905141A (nl) Bepaling van triglyceriden alsmede enzymreagentia.
EP0121254B1 (en) Process for determining substrate or enzymatic activity
US5149633A (en) Process and reagent for the specific determination of fructosamine content in blood and samples obtained from blood
EP0657545B1 (en) Assay method for biological components
RU1788466C (ru) Способ определени холестерина
US4695539A (en) Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase
US4142938A (en) Determination of triglycerides and glycerol
JPH0452119B2 (ru)
EP0387697A2 (en) Determination of aminotranferases
KR100276749B1 (ko) 저밀도리포단백증의콜레스테롤의정량법
JPH09248200A (ja) グルコース測定用試薬