RU1788466C - Способ определени холестерина - Google Patents
Способ определени холестеринаInfo
- Publication number
- RU1788466C RU1788466C SU904850152A SU4850152A RU1788466C RU 1788466 C RU1788466 C RU 1788466C SU 904850152 A SU904850152 A SU 904850152A SU 4850152 A SU4850152 A SU 4850152A RU 1788466 C RU1788466 C RU 1788466C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cholesterol
- concentration
- sodium chlorate
- buffer
- peroxidase
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: медицина, ферментативный анализ. Цель изобретени - повышение точности способа. Сущность изобретени : процесс осуществл ют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20-55°С в течение 2-20 минут реагентом, содержащим холе- стеринэстеразу, буферную смесь и детергент , при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина. На второй стадии осуществл ют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образовани перок- сида водорода. Регистрацию ведут фотометрическим методом.
Description
Изобретение относитс к области ферментативного анализа и может быть использовано в клинических исследовани х при диагностике атеросклероза, диабета, мочекаменной болезни, функциональных расстройств печени и некоторых инфекционных заболеваний.
Известен способ определени холестерина , основанный на измерении скорости выделени пероксида водорода. Определение холестерина данным способом, которой по своей сути наиболее близок к за вл емому изобретению, выполн етс следующим образом, Аликвота исследуемого образца, например, сыворотки крови, вноситс в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую реакционную смесь следующего состава:
Буферна смесь 0,1 М, рН 5-9 Субстраты пероксидазы Соли желчных кислот 1-20 мМ, Неиснные детергенты - 0,1 - 10 г/л Холестеринэстераза 100 - 30000 ед/л Холестериноксидаза 100 - 30000 ед/л
Пероксидаза 2500 ед/л. Далее провод т регистрацию изменени оптической плотности при температуре 20- 40°С в течение 2-15 мин,
Недостатки рассматриваемого способа определени холестерина заключаютс в следующем.
Оптимальные услови проведени реакций гидролиза и окислени не идентичны (не совпадают оптимум рН, температурный оптимум, концентрации детергентов), что приводит к использованию больших количеств ферментов.
Проведение определени холестерина рассматриваемым способом основано на одновременном проведении 3-х последовательных реакций. Исходно в исследуемых образцах содержитс как этерифицирован- ный. так и неэтерифицированный холестерин , причем соотношение этих форм холестерина может мен тьс в зависимости от сыворотки. Кроме того, скорость гидролиза этерифицированного холестерина холе- стеринэстеразой зависит от длины и
00
С
Ivl
iOO
ioo
i.N О О
степени насыщенности остатка жирной кислоты . Поэтому начальна скорость образовани пероксида водорода зависит не Только от общей концентрации холестерина , но и от соотношени разных форм холе- стерина в образце, что приводит к снижению достоверности определени .
Целью изобретени вл етс повышение точности определени .
Поставленна цель достигаетс предложенным способом, заключающимс в том, что исследуемую пробу добавл ют в водную среду инкубации состава: не менее 0,01 М буфера с рН 6,5-8, не менее 5 г/л холевокис- лого натри и не менее 10 ед/л холестери- нэстеразы, инкубируют при температуре 22-55°С не менее 2 мин, после чего аликво- ту инкубационной смеси внос т в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую не менее 0,01 м/л буфера с рН 6,5-8, не менее 2 г/л холевокислого натри , не менее 0,3 ед/л пероксидазы, не менее 0,5 ед/л холестериноксидазы, не менее 0,08 г/л 4-аминоантипирина и не менее 0,03 г/л 8- оксихинолина, с последующей спектрофо- тометрической регистрацией скорости реакции образовани пероксида водорода.
Предложенный способ отличаетс от известного пор дком проведени операций , а именно, разделением стадии гидролиза и экстракции со стадией окислени , что дает возможность осуществл ть гидролиз в оптимальных услови х при температуре 25- 55°С не менее 2 мин, а также соотношением реагентов в гидролизующей и окисл ющей смес х.
Эти отличи позвол ют повысить точность определени и существенно сократить расход реагентов.
Пример 1. Образец сыворотки (0,02 мл) внос т в пробирку с реакционной смесью (0,2 мл), содержащей 0,01 М К-фос- фатного буфера рН 7.0, холевокислого натри 10 г/л, 30 ед/л холестеринэстеразы из поджелудочной железы. Параллельно в раствор того же состава внос т 0,02 мл стандартного раствора холестерина (5 мМ). Пробы инкубируют 10 мин при 45° С. Затем из каждой пробирки отбирают по 0,1 мл реакционнойсмеси , внос т - в спектрофотометрическую кювету, содержащую 0,7 мл раствора следующего состава: 0,03 М К-фосфатный буфер, рН 7.0, 5 г/л холевокислого натри , холестериноксидазу (5 ед/л), пероксидазу (20 ед/л), 4-аминоан- типирин (0,16 г/л), 8-оксихинолин (0,20 г/л). Дл каждого из образцов измер ют начальную скорость изменени оптической плотности в течение 2 мин при длине волны 500
нм. Результаты измерений приведены в табл.1,
Концентрацию холестерина рассчиты- 5 вают по уравнению:
холестерин
Ухол
х 5.0 мМ,
где холестерин -концентраци холестерина в исследуемой пробе;
Ухол - скорость изменени оптической плотности дл исследуемой пробы;
. Уст - скорость увеличени оптической плотности в случае стандартного раствора холестерина.
Пример 2. Услови проведени эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что при анализе стандартной сыворотки (5 мМ) используют различные значени рН при проведении
первой стадии реакции гидролиза. Результаты измерений приведены в табл. 2.
Из полученных данных следует, что оптимальные значени рН дл проведени реакции гидролиза составл ют 6,5-8,0,
Примерз. Услови эксперимента аналогичны услови м в примере 1, за исключением того, что используют различные кон- центрации холевокислого натри в гидролизующей смеси. Результаты измерений приведены в . 3.
На основании данных, приведенных в табл. 3, оптимальна концентраци холевокислого натри в гидролизующей смеси составл ет не менее 5 г/л.
П р и м е р 4. Услови проведени эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что измен ют температуру при которой проводитс гидролиз (табл. 4).
Из данных приведенных в табл. 4 следует , что полный гидролиз этерифицированно- го холестерина достигаетс при температуре 20-55°С при концентрации холестеринэстеразы из поджелудочной железы в гидролизующе й смеси 2 мг/мл (активность холестеринэстеразы 0,03 ед/мл).
Пример 5. Услови измерени те же. что в примере 1, за исключением того, что
измен ют концентрацию холестеринэстеразы в гидролизующей смеси. Данные пред- ставлены в табл. 5.
На основании данных, приведенных в табл. 5, оптимальна концентраци холестеринэстеразы составл ет не менее 10 ед/л при температуры 45°С и времени гидролиза 10 мин.
Пример 6. Услови проведени реакции аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что измен ют состав реакционной смеси дл проведени реакции окислени холестерина: (табл. 6), варьиру концентрацию холевокислого натри .
Таким образом, оптимальна концентраци холевокислого натри в реакционной смеси при окислении холестерина составл ет не менее 2,0 г/л.
Пример 7. Услови проведени эксперимента такие же как в примере 1, но измен етс концентраци 8-оксихинолина. Результаты измерений представлены в табл. 7 получены дл стандартной сыворотки с концентрацией 5 мМ.
Таким образом, оптимальной концентрацией 8-оксихинолина вл етс не менее 0,3 г/л.
Пример 8. Услови измерени те же, что в примере 1, за исключением того, что измен ют концентрацию 4-аминоантипири- на. Данные, измеренные дл стандартной сыворотки 5 мМ, приведены в табл 8.
Из данных, приведенных в табл. 8, следует , что оптимальной концентрацией 4- аминоантипирина вл етс концентраци не менее 0,08 г/л.
Пример 9. Услови эксперимента те же, что в примере 1, за исключением того, что измен ют концентрацию пероксидазы в реакционной смеси. Данные приведены в табл. 9.
Полученные данные показывают, что оптимальной концентрацией пероксидазы в реакционной смеси вл етс не менее 0,3 ед/л.
Пример 10. Услови эксперимента те же, что в п. 1, за исключением того, что все сыворотки параллельно измер ют и по способу прототипа, а при измерении по за вл емому способу используют концентрации холестеринэстеразы и холестериноксидазы те же, что в прототипе -- 1 ед/мл. При измерении по способу прототипа к 20 мкл образцов сывороток добавл ли 2 мл смеси следующего состава:
0,1 М фосфатный буфер рН 6,7
8,6 мМ трибромгидроксибензойна кислота
1,6 мМ 4-аминоантипирин
3 мМ холевокислый натрий
0,1 % полиэтиленгликоль 6000
0,1 % трезит
1000 ед/л холестеринэстераза 1000 ед/л холестериноксидаза 2500 ед/л пероксидаза
Инкубировали при 30°С и через 2 минуты регистрировали фотометрически скорость образовани пероксида водорода. В эксперименте использовались следующие контрольные сыворотки: фирмы Boehringer
mannheim PrecHip EL (концентраци холестерина 8,5 мМ), фирмы Labsystem norm (концентраци холестерина 3,7 мМ), sepocont P (концентраци холестерина 4,7 мМ, фирмы Hyland паталогическа (концентраци холестерина 5,0 мМ). Результаты измерений приведены в таблице. 10.
Из приведенных в табл. 10 данных следует , что при измерении по способу-прототипу полученные результаты завис т от
состава липопротеидных комплексов в сыворотках крови, а при измерении по за вл емому способу точность результатов во всех сыворотках одинакова, что свидетельствует о большей точности предложенного способа .
Claims (1)
- Формула изобретени Способ определени холестерина, включающий инкубацию исследуемой пробы в среде, содержащей буфер, субстратпероксидазы, соль желчных кислот, холе- стеринэстеразу, холестериноксидазу и пероксидазу и последующую спектрофо- тометрическую регистрацию скорости образовани перекиси водорода, о т л ичающийс тем, что, с целью повышени точности способа, исследуемую пробу добавл ют в водную среду инкубации, содержащую буфер с рН 6,5-8,0 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 5 г/л, холестериноксидазу не менее 10 ед/л, инкубируют не менее 2 мин при 25-55°С, затем аликвоту инкубационной смеси внос т в измерительную кювету, содержащую буфер срН 8,0-8,6 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 2 г/л, пероксидазу не менее 0,3 ед/л, холестериноксидазу не менее 0,5 ед/л, 4- аминоантипирин в концентрации не менее0,08 г/л и 8-оксихинолин в концентрации не менее 0,03 г/л.Таблица 1Таблица2Таб лицаЗТаблиц 4Активность холестеринэстеразы, ед/л3,07,510,215,022,030,045,0Концентраци холевокислого натри , г/л в реакции окислени1,01.52,05,56,58,515,020,0ТаблицабИзмеренна величина концентрации холестерина в станд. сыворотке , мМ ( при )1,5+ 1,20 4,4 + 0,28 4,75 + 0,26 4,95 + 0,204.9 + 0,215.0 + 0,22 4,9 + 0,25ТаблицабИзмеренна величина концентрации холестерина в станд. сыворотке , мМ ( при )0,6 + 1,902,5 + 0,724,8 + 0,344,85 + 0,245,0 + 0,214,9 +0,264,85 + 0,174,9 + 0,22ТаблицаТаблицаЗТаблицаЭТаблица 10
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904850152D RU1788467C (ru) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | Способ определени холестерина |
SU904850152A RU1788466C (ru) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | Способ определени холестерина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904850152A RU1788466C (ru) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | Способ определени холестерина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1788466C true RU1788466C (ru) | 1993-01-15 |
Family
ID=21526977
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904850152D RU1788467C (ru) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | Способ определени холестерина |
SU904850152A RU1788466C (ru) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | Способ определени холестерина |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904850152D RU1788467C (ru) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | Способ определени холестерина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (2) | RU1788467C (ru) |
-
1990
- 1990-05-22 RU SU904850152D patent/RU1788467C/ru active
- 1990-05-22 RU SU904850152A patent/RU1788466C/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЕР № 265933, кл. С 12 Q 1/60, 1988. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU1788467C (ru) | 1993-01-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US3964974A (en) | Enzymatic determination of glucose | |
SU1338787A3 (ru) | Способ определени перекиси водорода при ферментативной реакции | |
Huang et al. | Fluorometric enzymatic determination of total cholesterol in serum | |
US6008006A (en) | Determination of glycated proteins | |
US4399218A (en) | Method and reagent for the determination of glycerin | |
Shephard et al. | Falsely low estimation of triglycerides in lipemic plasma by the enzymatic triglyceride method with modified Trinder's chromogen | |
US4211844A (en) | Bilirubin-specific fungal enzyme preparation | |
US4366244A (en) | Method for measuring serum cholesterol | |
EP0116307B1 (en) | Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase | |
EP0010296A1 (en) | Test composition for the determination of triglycerides and its use | |
JP4889396B2 (ja) | ロイコ色素の安定化方法 | |
US4001089A (en) | Method for determination of triglycerides and glycerol | |
Kohlbecker et al. | Direct spectrophotometric determination of serum and urinary oxalate with oxalate oxidase | |
EP1288306B1 (en) | Method of analyzing components in biological samples | |
NL7905141A (nl) | Bepaling van triglyceriden alsmede enzymreagentia. | |
EP0121254B1 (en) | Process for determining substrate or enzymatic activity | |
US5149633A (en) | Process and reagent for the specific determination of fructosamine content in blood and samples obtained from blood | |
EP0657545B1 (en) | Assay method for biological components | |
RU1788466C (ru) | Способ определени холестерина | |
US4695539A (en) | Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase | |
US4142938A (en) | Determination of triglycerides and glycerol | |
JPH0452119B2 (ru) | ||
EP0387697A2 (en) | Determination of aminotranferases | |
KR100276749B1 (ko) | 저밀도리포단백증의콜레스테롤의정량법 | |
JPH09248200A (ja) | グルコース測定用試薬 |