DE2633728B2 - NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine neue NADH-Peroxidase aus Mikroorganismen, welche sich in verschiedenen Eigenschaften von der bekannten NADH-Peroxidase unterscheidet, das Verfahren zu ihrer Gewinnung sowie die Verwendung dieses neuen Enzyms zur Bestimmung von H2O2, insbesondere in gekoppelter Reaktion in Gegenwart einer spezifischen Oxidase.

Zahlreiche wichtige Substanzen, wie Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Aminosäuren, Alkohole u.dgl., werden enzymatisch unter Verwendung von Oxidasen bestimmt, welche bei dieser Reaktion H2O2 bilden. Letzteres wird anschließend nach verschiedenen Methoden, wie Oxidation eines Chromogens, Oxidation von Alkoholen mit Katalase (Hantzsche Reaktion), mit Aldehyd-Dehydrogenase u. a., gemessen. Alle diese bekannten Indikatorreaktionen weisen Nachteile auf.

So wird die Peroxidation von Chromogenen durch Pharmaka gestört, der Nachweis unter Verwendung der

r> Hantzschen Reaktion benötigt eine sehr lange Reaktionszeit, die Reaktionsführung über die Aldehyd-Dehydrogenase ist umständlich, und das Enzym ist sehr unstabil u. dgl. Es besteht daher ein Bedarf nach einer einfachen Nachweismethode für H2O2, welche diese

ίο Nachteile nicht aufweist und sich insbesondere auch in Kombination mit spezifischen Oxidasen einsetzen läßt.

Ideal wäre es, die zur Bildung von H₂O₂ führende spezifische Oxidasereaktion mit der für enzymatische Bestimmungen bevorzugt eingesetzten NADH-Reak-

)^r, tion (NADH = Nicotin-amid-adenin-dinucleotid in reduzierter Form) kuppeln zu können. Eine NADH-Peroxidase, welche die Reaktion

NADH — POD

NADH + H ⁺ + H₂O₂ — NAD⁺ + 2H₂O

katalysiert, ist bereits bekannt: ABB, 55,415 (1955); JBC, 225, 557 (1957). Dieses Enzym mit der EC-Nr. 1.11.1.1 wurde in Streptococcus faecalis 10 C I und in Lactobacillus casei gefunden und zeichnet sich durch ein pH-Optimum bei 5,4 sowie durch Michaelis-Konstanten Ä"_Mfür H₂O₂ von 2 ■ ΙΟ-" und für NADH von 1,4 · ΙΟ-⁵ aus. Da für viele Oxidasen nur pH-Werte im alkalischen Bereich geeignet sind, die bekannte NADH-Peroxidase aber bei pH 7,0 bereits praktisch inaktiv ist (Arch. Biochem. Biophys. 111, 535 [1965]) sowie aufgrund der ungünstigen Michaelis-Konstanten eignet sich das Enzym in der Praxis nicht für die H₂O₂-Bestimmung in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase.

Nunmehr wurde eine weitere NADH-Peroxidase gefunden, welche die Nachteile der bekannten NADH-Peroxidase von der sie sich klar unterscheidet, nicht aufweist und die sich vorzüglich zur Verwendung bei der enzymatischen H₂O₂-Bestimmung, insbesondere in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase, eignet. Ein Erfindungsgegenstand ist daher eine NADH-Peroxidase, welche NADH mit H₂O₂ zu NAD und H₂O oxidiert und gekennzeichnet ist durch eine Michaelis-Konstante Km gegenüber H₂O₂ von 2,8 · 10-⁵M und gegenüber NADH von 1,7 · IQ-⁵M, 4^r) gemessen bei 25°C in 0,2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer pH 6,0, enthaltend 0,1 M Kaliumacetat.

Das neue Enzym eignet sich wegen seiner niedrigen

Km wesentlich besser als das bekannte Enzym für eine H₂O₂-Bestimmung. Je höher nämlich die Km ist, desto

^r)<> höher muß bei einer Bestimmung auch die H₂0₂-Konzentration im steady state sein. Je höher aber die H₂0₂-Konzentration ist, desto größer ist auch der Einfluß der Katalase, die im Probenmaterial in der Regel vorhanden ist. Durch die Konkurrenz der Katalase um

5¹) das H₂O₂ werden aber die Resultate verfälscht.

Das neue Enzym der Erfindung ist wie das bekannte Enzym ein Flavoprotein und daher gelblich gefärbt. In Glycerin/Wasser 1:1 ist das Enzym bei +4° C monatelang stabil. NADPH kann NADH nicht ersetzen

to im Gegensatz zum bekannten Enzym, welches mit NADPH etwa 8% der Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber NADH aufweist.

Das Enzym weist in Trispuffer in Gegenwart von Acetat- oder Propionat-Ionen ein pH-Optimum bei 6,0 auf, die Aktivität in Natriumacetatpuffer bei pH 5,4, also unter den optimalen Bedingungen des bekannten Enzyms, liegt etwa 20% niedriger. Bei pH 9,0 beträgt die Aktivität noch etwa 20% des Optimums.

Erfindungsgemäß wird das neue Enzym aus Streptococcus faecalis ATCC 8043 gewonnen. Die Gewinnung erfolgt durch Aufschluß oder durch Behandlung des Mikroorganismus mit einem oberflächenaktiven Mittel unter Freisetzung des Enzyms, welches dann aus der -, Lösung isoliert werden kann. Geeignete Aufschlußmethoden sind beispielsweise Ultraschalleinwirkung, Zerreiben mit Glasperlen, Einwirkung hoher Scherkräfte u. dgl. Alle diese Aufschlußmethoden sind bekannt und für Mikroorganismen üblich. Die Behandlung mit einem ι» oberflächenaktiven Mittel erfolgt vorzugsweise bei erhöhter Temperatur zwischen 25 und 60⁰C. Bevorzugt wird eine Behandlung bei 45 bis 55° C bei schwach sauren pH-Werten zwischen etwa 4,5 und 6,0. In dei Regel reichen 15 bis 30 Minuten aus, diese Einwirkungs- r, dauer kann jedoch ohne Nachteil erheblich überschritten werden. So werden selbst bei dreistündiger Einwirkung bei 55°C noch sehr gute Ausbeuten erzielt. Die Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln wird bevorzugt, da hierbei weniger Verunreinigungen in .'ti Lösung gehen als bei mechanischen Aufschlußmethoden und daher von vornherein ein reineres Enzym gewonnen wird. Unter den oberflächenaktiven Mitteln werden die nichtionogenen bevorzugt. Besonders bevorzugt werden Polyäthylenglycolester, z. B. Alkylarylpolyäthylenglycolester wie p-Isooctylphenyläthylenglycoläther mit durchschnittlich 8 bis 9 Äthylenglycoleinheiten. Ein besonderer Vorzug dieser Aufschlußmethode besteht auch darin, daß der Gehalt an störender NADH-Oxidase hierbei besonders gering ist. 1»

Zur Gewinnung des Enzyms werden die Lösungen von den ungelösten Stoffen befreit, z. B. dutch Zentrifugieren, und aus dem gewonnenen klaren Überstand kann die das Enzym enthaltende Eiweißfraktion gefällt werden. Zur Fällung eignen sich die hierfür >', in der Biochemie üblichen Mittel wie Aussalzen, z. B. mit Ammoniumsulfat, Fällung durch organische Lösungsmittel wie Aceton oder Methanol, Fällung mit Polyionen wie Polyäthyleni?iiin u. dgl. Eine weitere Aufreinigung des rohen Enzympräparats kann beispielsweise durch Chromatographie an Adsorbentien wie Carboxymethylcellulose, vernetztem Dextran, Ionenaustauschern u. dgl. erfolgen. Außerdem zeigt es sich, daß das Enzym auch durch Säurebehandlung von Begleitsubstanzen befreit werden kann. Zweckmäßig erfolgt die Säurebehandlung <r> bei pH-Werten zwischen 4,2 und 4,8 während 10 bis 25 Minuten.

Eine bevorzugte Reinigungsmethode besteht daher in einer Einstellung der wäßrigen Enzymlösung auf pH 4,2 bis 4,8, Abtrennung des Unlöslichen und Fraktionierung >o des im Überstand befindlichen Enzyms mit Polyäthylenimin.

Es versteht sich, daß alle Schritte des Gewinnungsverfahrens in gepufferter Lösung durchgeführt werden. Besonders geeignete Puffer sind dabei Phosphatpuffer, ^r» TRIS-Puffer und Acetatpuffer. Aber auch die anderen üblichen Puffer wie Glycinpuffer, Borat-Citratpuffer u. dgl. sind brauchbar.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der neuen NADH-Peroxidase zur Bestim- e>o mung von H2O2 in einfacher oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase. Die Bestimmung erfolgt zweckmäßig bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,0. Auf diese Weise gelingt es, die spezifische Oxidasereaktion mit der Messung der NADH-NAD- fe5 Reaktion zu koppeln. Letztere Reaktion läßt sich bekanntlich besonders einfach durch Bestimmung der Extinktionsänderung, die der Änderung der NADH-Konzentration proportional ist, verfolgen.

Unter »spezifischer Oxidase« werden im Rahmen der Erfindung Enzyme verstanden, welche mit bestimmten Substraten und O2 unter Bildung von H2O2 reagieren.

Als spezifische Oxidasen werden im Rahmen der Erfindung bevorzugt Glucoseoxidase, D-Aminosäureoxidase, L-Aminosäureoxidase, Cholesterinoxidase, Alkoholoxidase, Uricase und Xanthinoxidase verwendet. Dementsprechend lassen sich in der gekoppelten Reaktion Glucose, D-Aminosäuren wie D-Alanin, L-Aminosäuren wie L-Leucin, Cholesterin und Cholesterinester, niedere Alkohole^Harnsäure, Xanthin und Hypoxanthin bestimmen. In einfacher Reaktion kann H₂O₂ selbst bestimmt werden, also nicht nur als Zwischenprodukt wie in Gegenwart des Oxidasesystems.

Die Messung der NADH-Peroxidase der Erfindung läßt sich vorteilhaft nach folgendem Test durchführen:

2.68 ml TRIS-Kaliumacetatpuffer (0,2 M TRIS + 0,15 M Kaliumacetat): 2,42g TRiS + 1,42g Kaliumacetat in 70 ml H₂O lösen, mit 2 N Essigsäure auf pH 6,0 einstellen, mit H2O ad 100 ml auffüllen.

0,20 ml NADH (6 mM): 5 mg NADH mit 1 ml H₂O lösen.

0,02 ml Probe NADH-POD.

Mischen, bei 365 nm, d = 1 cm, 25°C Vorlauf registrieren ΔΕ/m'm. Dieser Vorlauf (Extinktionsabnahme) dient zur Berechnung der »NADH-Oxidase«. Start mit

0,10 ml H₂O₂ (40 mM (0,05 ml 30%iges H₂O₂ werden mit 10 ml H₂O verdünnt)).
Mischen, Extinktionsänderung/min messen (ΔΕ/m'm). Vor Berechnung der NADH-POD-Aktivität wird von ΔE/min der NADH-Oxidase-Vorlauf abgezogen.

Bevorzugt wird TRIS-Acetat-Puffer verwendet, doch ist die Anwendung der NADH-POD nicht auf dieses Puffersystem beschränkt. Die Bestimmung von H₂O₂ mit NADH-POD kann u. a. durchgeführt werden mit:
Natriumacetat, Piperazin, Kaliumphosphat, Kaliumdiphosphat, Borat/Citrat, Glycyl-Glycin, Triäthanolamin.HCl oder HEPES (N-2-HydroxyäthyIpiperazin-N-äthan-sulfonsäure) als Puffersystem.

In entsprechender Weise kann auch die H₂O₂-Bestimmung durchgeführt werden, wobei NADH-POD im Überschuß zugegeben und die H₂O₂-Menge bestimmt wird, die der Extinktionsänderung entspricht. Die Messung kann nach der Endpunktmethode oder kinetisch, d. h. durch Messung der Extinktionsdifferenz innerhalb eines bestimmten kurzen Zeitraumes, erfolgen. Präzision und zeitlicher Verlauf der H₂O₂-Bestimmung bei pH 8,0 im oben beschriebenen TRIS-Kaliumacetatpuffer und bei den oben angegebenen Meßbedingungen zeigt die Zeichnung. In dieser stellt dar:

F i g. 1 eine Eichkurve, in der die H₂O2-Menge (Abszisse) gegen die Extinktionsdifferenz (Ordinate) aufgetragen ist,

F i g. 2 die Extinktionsabnahme mit der Zeit bei 25°C. Am Start wurden 0,4 μΜοΙ H₂O₂ zugesetzt.

Die beiden Figuren der Zeichnung lassen die Brauchbarkeit des erfindungsgemäßen Enzyms für die quantitative H₂O₂-Bestimmung erkennen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1
Gewinnung und Reinigung des Enzyms

Streptococcus faecalis ATCC 8043 Biomasse wird mit einer l%igen Lösung von p-Isooctylphenyläthylengly- > coläther mit durchschnittlich 8 bis 9 Äthylenglycoleinheiten in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer pH 5,0 30 Minuten auf 55°C erhitzt. Dann wird auf 4°C abgekühlt und das Unlösliche abgetrennt. Man erhält eine wäßrige Lösung mit einer Aktivität von 1,77 U/ml und einer in spezifischen Aktivität von 0,77 U/mg.

Die erhaltene Lösung wird Ammonsulfat zugesetzt, bis sich die gesamte enzymatische Aktivität im Niederschlag befindet. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Phosphatpuffer pH 0,5 aufgenommen und ι ^Γ> durch Molekularsiebpassage entsalzt. Die so erhaltene Enzymlösung kann direkt oder nach vorheriger Konzentrierung durch Lyophilisieren und Aufnehmen in 3,0 M Ammoniumsulfat-Lösung, pH ca. 7, für den H₂O₂-TeSt verwendet werden.

Zweckmäßig erfolgt eine weitere Aufreinigung der Ausgangslösung ohne vorherige Abtrennung des Enzyms durch Ammonsulfatfällung wie folgt:

Die Lösung wird mit Essigsäure auf pH 4,4 eingestellt und 20 Minuten stehengelassen. Dann wird vom Unlöslichen abfiltriert. Dem Oberstand wird Polyäthyleniminlösung portionsweise zugesetzt und vom jeweils auftretenden Unlöslichen filtriert. Die das Enzym enthaltende Fraktion wird erneut in Puffer gelöst und über Diäthylaminoäthylcellulose chromatographiert. Anschließend erfolgt eine Entsalzung über vernetztes Dextran. Man erhält so ein Präparat mit ca. 45 U/mg.

Beispiel 2

i>

Abhängigkeit der Aktivität der NADH-POD
vom im Test verwendeten Puffer

Gemessen wird in 0,1 M Puffern (1 mM H₂O₂, 0,4 mM NADH).

Tabelle 1

Enzymaktivitäten bei pH 7,5 in % in verschiedenen Puffern, bezogen auf die Aktivität in Natriumacetat-Puffer (= 100%)

Puffer	%
Natriumacetat	100
TRlS · Acetat	101
TRA · Acetat	100
Piperazin · HCl	100
HEPES	89
Kaliumphosphat	63
Kaliumdiphosphat	61
Borat/Citrat	25
TRA = Triäthanolamin.
Beispiel 3

Einfluß des pH-Wertes im Testsystem auf die Aktivität der NADH-POD.

>-, Gemessen wird in 0,1 M TRIS.Acetat-Puffer (1 mM H₂O₂ und 0,4 mM NADH).

Tabelle _J() pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität in %

pH %

5,0 5,4 6,0 7,0 7,5 8,0 9,0

67 98 100 88 56 37 19

Beispiel 4 *\ Harnsäurebestimmung mit Uricase

Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:

2 H₂O + Harnsäure + O₂

Uricase, NADH-POD gemäß Erfindung und NADH wurden in 0,2 M TRISAcetat-Puffer unterschiedlichen pH-Wertes, welcher jeweils 0,15 M Kaliumacetat enthielt, gelöst. Dann wurde eine 0,2 μΜοΙ Harnsäure enthaltende wäßrige Lösung zum Start zugesetzt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Uricase

Tabelle 3	Enzymmenge	Uri	Endablauf	% Wieder
pH	im Test	case	zeit in min.	findung,
		U		bezogen auf
	NADH-POD	1		UV-lest = 100%
		I
	U
	0,1	16	95,5
6	0.1	IO	99
7

Allantoin + H,O, + CO

pH lin/ymmenge Kndahluuf-

im Tesi /eil in min.

NADIi-POD Uricase

0,1 0,1 0,1 0,2

2 0,2

5 16 10 10

% Wicderfindung, bezogen auf UV-test = 100¹K

100 96,5 96,5 98

b^r> Referenzmethode: P. Scheibe, E. Bcrnt und II. U Bergmeyer in H. U. Bergnieyer - Methoden der enzy matischon Analyse, Bd. II, 3. AuIl., S. 1999, (1974).

Tabelle 4

Wiederfindung Harnsäure in %, bei 0,2 μΜοΙ Harnsäure/Testansatz (Testbedingungen: 0,2 M TRIS 'Acetat, 0,15 M Kaliumacetat, 0,4μΜο1 NADH, 0,1 U NADH-POD, 1 U Uricase aus Aspergillus flavus, 3 ml Testvolumen, 25^CC, 365 nm), bezogen auf 5 min Reaktionsabiauf bei pH 8 = 100%

6,0
7,0
8,0
8,5
9,0
10,0

71 95 100 98 76 69

Beispiel 5 Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase (GOD)

Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung:

GOD

D-Glucosc + H₂O + O₂ Gluconat + H₂O₂

Die Bestimmung wurde bei pH 7,0 unter Einsatz von 210 U GOD, 0,2 U NADH-POD und 60 U Mutarotase durchgeführt. Die Bestimmung der Glucose im Harn ergab 100% des mit der Referenzmethode GOD-Perid R (DBPS 1648 840 und H. U. Bergmeyer, Bd. II, 3. Aufl., S. 1257 [1974]) erhaltenen Wertes.

Beispiel 6

Bestimmung von D-Alanin mit D-Aminosäureoxidase (D-AOD)

Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:

D —AOD

D-Alanin + O₂ + H₂O Pyruvat + NH, + H₂O₂

Beispiel 7

Bestimmung von L-Leucin mit L-Aminosäureoxidase (L-AOD) aus Crotalus terrificus

Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung: L-Leucin + O₂

L-AOD

— > Kctoisocapronsiiure + H₂O₂

Die Durchführung erfolgte bei pH-Werten zwischen 7,5 und 8,0 in TRIS.Acetat-Puffer 0,2 M, welcher 0,15 M Acetat enthält. Bei Zusatz von 0,2 U NADH-POD gemäß Erfindung und 0,7 U L-AOD im Test betrug die Wiederfindung etwa 100%. Bei einer Konzentration von 0,2 μΜοΙ L-Leucin betrug die Reaktionsdauer ca. 20 Minuten. Referenzmethode: nicht bekannt.

IO

Beispiel 8

Cholesterinester-Bestimmung
mit Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase

Die Bestimmung erfolgt gemäß nachstehenden Gleichungen:

25

1. Cholesterinester + H₂O
Chol. Esterase

Cholesterin + Fettsäure

2. Cholesterin + O₂
Chol. Oxid.

Cholestenon + H₂O₂

JO Es wurden handelsübliche Cholesterin-Standardlösungen und Serum verwendet. Die Wiederfindung bei einer handelsüblichen Standardlösung mit 0,2 μΜοΙ Cholesterin betrug 98 bis 102% bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,0 innerhalb von 9 bis 12 Minuten. Eingesetzt wurden 0,1 U NADH-POD, 2 U Cholesterinoxidase in 3 ml Testvolumen.

4(i Die Cholesterinbestimmung im Serum unter Verseifung des veresterten Cholesterinanteils mit äthanolischer KOH ergab Wiederfindungswerte zwischen 95 und 105%.

Referenzmethode: P. Roeschlau, E. Bernt und

4i W. Gruber, H. U. Bergmeyer, Bd. II, 3. Auf U S. 1938(1974).

Die Bestimmung wurde bei pH 8,5 unter Einsatz von 0,25 U NADH-POD, 20 U D-AOD, 5 U Lactatdehydrogenase bei 25°C durchgeführt. Bei 20minütiger Inkubation bei 25° C betrug die Wiederfindung 100%.

Referenzmethode: M. G r a ß 1 in H. U. B e r g m e y er, Bd. 11,3.Aufl.,S. 1731(1974).

Beispiel 9

Bestimmung von Alkoholen
mit Methanol-Oxidase(MOD)

Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:

Methanol -f O₂

MOD

Formaldehyd + H₂O₂

bO

Die Bestimmung wurde bei pH-Werten zwischen 9,0 und 9,5 in Glycin-Na-Pyrophosphatpuffer unter Zusatz von Semicarbazid durchgeführt. Die eingesetzten Enzymmengen waren 0,3 U NADH-POD und 8 U MOD. Die Wiederfindung bei 0,2 μΜοΙ Methanol und Äthanol lag um 100%. Auch mit Isopropanol konnte die Bestimmung durchgeführt werden.

9 10

Beispiel 10 XOD
Bestimmung von Xanthin und Hypoxanthin ^{Xanthin + H}>° ^{+ 0}^ " Harnsäure + H₂O₂

mitXanthinoxidase(XOD) „.. „ . , , . ,,

Die Bestimmung erfolgte bei pH 8,0 mit TRIS-Puffer

Die Bestimmung erfolgt gemäß folgenden Gleichun- -> wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die gen: Wiederfindung betrug 100% Xanthin bzw. Hypoxan

thin. Als Referenzmethode wurde die in B e r g m e y e r,

XOD »Methoden der enzymatischen Analyse«, 3. Aufl., Bd. II,

Hypoxanthin + H₂O + O, ■* Xanthin + H₂O₂ S. 1988 (1974)beschriebenen Methode verwendet.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. NADH-Peroxidase, welche NADH mit H₂O₂ zu NAD und H₂O oxidiert, gekennzeichnet durch eine Michaeliskonstante Km gegenüber H₂O₂ von 2,8 · 10"⁵ M und gegenüber NADH von 1,7 · ΙΟ-⁵ M, gemessen bei 25⁰C in 0,2 M Trispuffer pH 6,0, enthaltend 0,1 M Kaliumacetat.

2. Verfahren zur Gewinnung der NADH-Peroxidase von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus Streptococcus faecalis ATCC 8043 durch Aufschluß oder Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel freigesetzt und aus der Lösung gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung auf einen pH-Wert von 4,2 bis 4,8 eingestellt, Unlösliches abgefenr.t und im Filtrat eine Fraktionierung mit Polyäthylenimin durchgeführt wird.

4. Verwendung des Enzyms von Anspruch 1 zur Bestimmung von H₂O₂ in einfacher oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase.