DE3725851A1 - Nad(p)h-oxidase, verfahren zu ihrer isolierung und anwendung - Google Patents

Nad(p)h-oxidase, verfahren zu ihrer isolierung und anwendung

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Description

Die Erfindung betrifft eine NAD(P)H-Oxidase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung. Sie betrifft insbesondere eine NAD(P)H-Oxidase mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Substratmenge oder der Enzymaktivität einer Probenlösung unter ihrer Verwendung.
Es wurde berichtet, daß eine NAD(P)H-Oxidase, die auf Nicotinamid-adenindinucleotid der reduzierten Form (nachfolgend als NADH bezeichnet) und Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat der reduzierten Form (nachfolgend als NADPH bezeichnet) unter Bildung von Wasserstoffperoxid einwirkt, in Acholeplasma laidlawii [European Journal of Biochemistry, 120, 329 (1981)] und in Bacillus megaterium [Journal of Biochemistry, 98, 13 (1985)] gefunden wurde. Das aus diesen Mikroorganismen erhaltene Enzym hat ein pH-Optimum nahe dem neutralen Bereich.
NAD und NADP sind Coenzyme für verschiedene Dehydrogenasen. Die Menge eines Substrates und die Enzymaktivität einer Probelösung kann durch quantitative Bestimmung von NADH oder NADPH, welches bei der Dehydrogenasereaktion gebildet wird, bestimmt werden. Von dieser Technik wird in der klinischen Analyse und der Lebensmittelanalyse weitverbreitet Gebrauch gemacht.
NADH und NADPH werden im allgemeinen durch Messung der Absorption bei 340 nm bestimmt, die für diese Verbindungen charakteristisch ist, oder durch eine colorimetrische Bestimmung mittels Formazan, welches bei der Reaktion mit einem Tetrazoliumsalz gebildet wird. Die ältere Methode leidet an der geringen Empfindlichkeit, weil die molaren Extinktionskoeffizienten von NADH und NADPH nicht sehr hoch sind, und das letztere Verfahren weist das Problem auf, daß der gebildete Formazanfarbstoff, welcher in Wasser schwach löslich ist, dazu neigt, zu präzipitieren oder an der Zelle oder dem verwendeten Teströhrchen anzuhaften.
Diese Nachteile können durch Verwendung der NAD(P)H-Oxidase vermieden werden, die NADH oder NADPH unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert, wobei die Menge des verbrauchten Sauerstoffs oder die Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids bestimmt werden kann. Die Reaktionen von Dehydrogenasen sind im allgemeinen jedoch reversibel, wobei das Gleichgewicht im neutralen Bereich stark auf die Seite NAD(P)H → NAD(P) verschoben ist, und somit ist es schwierig, die Menge des Substrates oder die Enzymaktivität durch Verknüpfung mit der NAD(P)H-Oxidasereaktion zu messen. Im alkalischen Bereich hingegen verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten von NAD(P) → NAD(P)H. Unter dieser Bedingung wird die Kupplungsreaktion einfach durchgeführt und ermöglicht eine hochempfindliche Analyse durch Bestimmung der Menge verbrauchten Sauerstoffs oder der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge. Somit bestand eine große Nachfrage zur Entwicklung einer NAD(P)H-Oxidase mit einem im alkalischen Bereich liegenden pH-Optimum und einem Verfahren zur Substrat- und Enzymaktivitätsbestimmung unter Verwendung dieser NAD(P)H-Oxidase.
Aufgabe der Erfindung ist somit die Bereitstellung einer NAD(P)H-Oxidase mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich und einer einfachen, hochempfindlichen und preiswerten Methode zur Bestimmung der Substratmenge oder der Enzymaktivität in einer Probelösung unter Verwendung derselben.
Diese Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen gelöst.
Die Erfindung betrifft eine NAD(P)H-Oxidase, insbesondere eine NAD(P)H-Oxidase mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser NAD(P)H-Oxidase.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Menge eines Substrats und der Enzymaktivität in einer Probelösung unter Verwendung der NAD(P)H-Oxidase. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Substratmenge und der Enzymaktivität in einer Probelösung unter Verwendung eines NADH oder NADPH bildenden Reaktionssystems, indem die NAD(P)H-Oxidase zur Bestimmung der Menge verbrauchten Sauerstoffs oder der Menge gebildeten Wasserstoffperoxids verwendet wird.
Nachfolgend wird die Erfindung unter teilweiser Berücksichtigung der Zeichnungen erläutert:
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Aktivität der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase zeigt;
Fig. 3 zeigt den pH-Wertbereich, in welchem das erfindungsgemäße Enzym stabil bleibt;
Fig. 4 zeigt die Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms in Abhängigkeit von der Temperatur;
Fig. 5 ist eine Kalibrierungskurve und wird in Beispiel 2 für das erfindungsgemäße analytische Verfahren verwendet, wobei die Absorption bei 550 nm gegen die NADH-Menge aufgetragen ist, und
Fig. 6 ist eine Kalibrierungskurve, die in Beispiel 3 für das erfindungsgemäße analytische Verfahren verwendet wird, bei dem die Absorption bei 550 nm gegen die Natriumcholatmenge aufgetragen ist.
Als Ergebnis der Auswahlverfahren nach von Mikroorganismen produzierten NAD(P)H-Oxidasen wurde festgestellt, daß Brevibacterium ammoniagenes und andere Spezies eine stabile NAD(P)H-Oxidase mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich produzieren. Deshalb wurden ihre enzymatischen Eigenschaften untersucht (JP-A 1 88 824). Die Ergebnisse weichen von denen bereits bekannter NAD(P)H-Oxidasen hinsichtlich des pH-Optimismus im alkalischen Bereich ab. Deshalb handelt es sich um eine neue NAD(P)H-Oxidase.
Alle zur Herstellung der NAD(P)H-Oxidase fähigen Stämme können zur Isolierung dieser NAD(P)H-Oxidase gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden. Zu den bevorzugten Beispielen gehören Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 (FERM BP-1392), Corynebacterium flaccumfaciens AHU 1622, Arthrobactor atrocyaneus IAM 12339, Micrococcus flavus IFO 3242, Pseudomonas aeruginosa IAM 1156, Achromobactor parvulus IFO 13182, Agrobacterium radiobactor IFO 12664, Flavobacterium esteroaromaticum IFO 3751 und Streptomyces aureus IAM 0092.
Diese Stämme können in allen Kulturmedien gezüchtet werden, die eine Produktion der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase ermöglichen. Geeignete Stickstoffquellen umfassen Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Melasse, Glycerin, Saccharose und Sorbit. Zusätzlich können anorganische Salze oder Metallsalze (beispielsweise Phosphate, Kalziumsalze und Magnesiumsalze), Vitamine und geeignete Wachstumsfaktoren im Kulturmedium enthalten sein.
Die Stämme werden im allgemeinen bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40°C, vorzugsweise nahe 30°C, kultiviert. Der Anfangs-pH-Wert liegt im allgemeinen im Bereich von 6 bis 8, vorzugsweise nahe 7. Der höchste Ausstoß an der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase wird im allgemeinen nach 10 bis 30 Stunden kontinuierlicher Kultivierung unter Rühren und Belüftung erreicht. Es ist überflüssig zu erwähnen, daß die gewählten Kulturbedingungen in Abhängigkeit des jeweiligen Stammes und des verwendeten Kulturmediums gewählt werden müssen, um den höchsten Ausstoß der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase zu gewährleisten.
Der größte Anteil der erfindungsgemäßen, gebildeten NAD(P)H-Oxidase liegt innerhalb der Bakterienzelle vor.
Die oben beschriebene Kulturbrühe wird zuerst einer Fest-/Flüssigtrennung unterzogen, die so abgetrennten Zellen werden durch eine herkömmliche Technik aufgebrochen (beispielsweise Ultraschallbehandlung, Behandlung mit einem Enzym und Homogenisieren), und es wird ein zellfreier Extrakt erhalten. Eine gereinigte Probe der NAD(P)H-Oxidase, die in der Polyacrylamidgelelektrophorese lediglich eine einzige Bande zeigt, kann aus diesem zellfreien Extrakt durch bekannte Techniken wie Aussalzen, Präzipitation mit einem organischen Lösungsmittel, Ionenaustausch-Chromatographie, Adsorptionschromatographie, Gelfiltration und Gefriertrocknung erhalten werden.
Die enzymatischen Eigenschaften der NAD(P)H-Oxidase, die aus der Kulturbrühe von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 (FERM BP-1392) aus Beispiel 1 isoliert wurde, werden nachfolgend gezeigt.
  • (1) Reaktionsweise:
    Das Enzym der vorliegenden Efindung oxidiert NADH und NADPH in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von NAD, NADP und Wasserstoffperoxid gemäß der folgenden Reaktionsgleichung. NAD(P)H + H⁺ + O₂ → NAD(P)⁺ + H₂O₂
  • (2) Substratspezifität:
    Sie reagiert mit NADH und NADPH.
  • (3) pH-Optimum und pH-Stabilität:
    Die Messung unter Verwendung von Britton-Robinson-Pufferlösungen ergaben, daß das erfindungsgemäße Enzym sein pH-Optimum bei etwa 9 bis 10 (Fig. 1) hat. Getrennt davon wurde das erfindungsgemäße Enzym bei 37°C 60 Minuten lang in Britton-Robinson-Pufferlösungen verschiedener pH-Werte behandelt, und in jeder Probe wurde die Restaktivität gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß die Enzymaktivität in einem pH-Wertbereich von 6 bis 10,5 erhalten bleibt.
  • (4) Bevorzugte Temperatur und Temperaturstabilität:
    Die Messungen in einem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) ergab, daß die optimale Reaktionstemperatur der NAD(P)H-Oxidase im Bereich von etwa 40 bis 50°C (Fig. 2) liegt. Unabhängig davon wurde das erfindungsgemäße Enzym im gleichen Puffer bei verschiedenen Temperaturen 10 Minuten lang behandelt und in jedem Fall die Restaktivität gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß diese bis zu Temperaturen von 55°C (Fig. 4) stabil ist.
Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wurde gemäß dem nachfolgend beschriebenen Verfahren gemessen.
Eine Lösung, die durch Mischen von 1,0 ml 0,3 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,1 ml 6 mM NADH-Lösung und 1,9 ml destillierten Wassers hergestellt worden war, wurde bei 37°C gehalten, es wurden 0,1 ml der zu untersuchenden Enzymlösung hinzugegeben, die Reaktion wurde bei 37°C durchgeführt und der Abfall der Absorption bei 340 nm gemessen. Die Menge Enzym, die 1 µMol NADH in einer Minute oxidiert, entspricht einer Einheit.
Die vorliegende Erfindung verwendet eine NAD(P)H-Oxidase, die ihr pH-Optimum im alkalischen Bereich hat, und die sich leicht in eine Dehydrogenasereaktion einsetzen läßt und somit hochempfindliche Messungen erlaubt. Wird die neue NAD(P)H-Oxidase beispielsweise zur Bestimmung der Lactatdehydrogenase (nachfolgend abgekürzt als LDH) in einer Probelösung mittels Messung der Menge gebildeten Wasserstoffperoxids verwendet, kann folgendes Reaktionssystem aufgestellt werden:
Da das Gleichgewicht der LDH-Reaktion im neutralen Bereich entsprechend der Reaktion NADH → NAD⁺ verschoben ist, ist es schwierig, die LDH-Aktivität aus der Menge des durch die Reaktion der NAD(P)H-Oxidase gebildeten Wasserstoffperoxids zu bestimmen. Unter alkalischen Bedingungen ist das Gleichgewicht auf die andere Seite zum NADH hin verschoben, was der durch die neue NAD(P)H-Oxidase katalysierten Reaktion ermöglicht, vollständig abzulaufen, und somit kann die LDH-Aktivität aus der Menge gebildeten Wasserstoffperoxids bestimmt werden. In ähnlicher Weise kann die Milchsäuremenge einer Porbelösung aus der Wasserstoffperoxidmenge, welche gebildet wird, wenn LDH und die neue NAD(P)H-Oxidase unter alkalischen Bedingungen miteinander reagieren, bestimmt werden. Somit ist die Verwendung der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase, die stabil ist und eine hohe Aktivität aufweist, für Hochempfindlichkeitsanalysen hervorragend geeignet. Die Menge des in der oben beschriebenen enzymatischen Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxids kann durch bekannte Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzverfahren bestimmt werden.
Die erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich kann in Form einer Lösung oder immobilisiert (an einen geeigneten Träger wie beispielsweise Glaskügelchen oder einen Mehrschichtfilm gebunden) verwendet werden. Wird das Enzym an einer Sauerstoffelektrode fixiert, kann die Menge des Substrates oder die Enzymaktivität einer Probelösung durch Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß hochempfindliche Messungen durchgeführt werden können, daß die neue NAD(P)H-Oxidase durch Mirkoorganismen in großen Mengen bei geringen Kosten zur Verfügung gestellt werden kann und daß die durch die Brevibacteriumstämme hergestellte erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase eine hohe Produktionseffektivität und eine hohe Stabilität bereitstellt und somit ein neues Verfahren zur Bestimmung von Substraten und der Enzymaktivität bei klinischen Untersuchungen liefert.
Das analytische Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auf alle Probelösungen, die NADH oder NADPH enthalten, eingeschlossen solche Lösungen, in denen NADH oder NADPH als Ergebnis einer enzymatischen Reaktion gebildet wird, angewendet werden. Nachfolgend werden einige typische Beispiele enzymatischer Reaktionen, die NADH oder NADPH bilden und auf die das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Substraten und der Enzymaktivität anwendbar ist, beispielhaft dargestellt.
  • 1. Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1)
    Alkohol + NAD⁺ Aldehyd + NADH + H⁺
  • 2. Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.2)
    Alkohol + NADP⁺ Aldehyd + NADPH + H⁺
  • 3. Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6)
    Glycerin + NAD⁺ Dihydroxyaceton + NADH + H⁺
  • 4. L-Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27)
    L-Milchsäure + NAD⁺ Brenztraubensäure + NADH + H⁺
  • 5. 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.30)
    D-3-Hydroxybuttersäure + NAD⁺ Acetylessigsäure + NADH + H⁺
  • 6. L-Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37)
    L-Äpfelsäure + NAD⁺ Oxalessigsäure + NADH + H⁺
  • 7. L-Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.40)
    L-Äpfelsäure + NADP⁺ Brenztraubensäure + CO₂ + NADPH + H⁺
  • 8. Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.41)
    Isocitronensäure + NAD⁺ 2-Oxoglutarsäure + CO₂ + NADH + H⁺
  • 9. Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.42)
    Isocitronensäure + NADP⁺ 2-Oxoglutarsäure + CO₂ + NADPH + H⁺
  • 10. Glucose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.47)
    β-D-Glucopyranose + NAD(P)⁺ D-Glucono-δ-lacton + NAD(P)H + H⁺
  • 11. Galactose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.48)
    D-Galactofuranose + NAD⁺ D-Galactono-δ-lacton + NADH + H⁺
  • 12. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49)
    D-Glucose-6-phosphat + NADP⁺ D-Glucono-γ-lacton-6-phosphat + NADPH + H⁺
  • 13. 3-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (EC 1.1.1.50)
    3-Hydroxysteroid + NAD(P)⁺ 3-Oxosteroid + NAD(P)H + H⁺
  • 14. Testosteron-17β-dehydrogenase (EC 1.1.1.63)
    Testosteron + NAD⁺ 4-Androsten-3,17-dion + NADH + H⁺
  • 15. Testosteron-17β-dehydrogenase (EC 1.1.1.64)
    Testosteron + NADP⁺ 4-Androsten-3,17-dion + NADPH + H⁺
  • 16. Galactose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.120)
    D-Galactofuranose + NADP⁺ D-Galactono-γ-lacton + NADPH + H⁺
  • 17. L-Fucose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.122)
    L-Fucopyranose + NAD⁺ L-Fucono-1,5-lacton + NADH + H⁺
  • 18. Formaldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.1)
    Formaldehyd + Glutathion (reduzierte Form) + NAD⁺ S-Formylglutathion + NADH + H⁺
  • 19. Formiat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.2)
    Ameisensäure + NAD⁺ CO₂ + NADH + H⁺
  • 20. L-Alanin-Dehydrogenase (EC 1.4.1.1)
    L-Alanin + H₂O + NAD⁺ Brenztraubensäure + NH₄⁺ + NADH + H⁺
  • 21. L-Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2)
    L-Glutaminsäure + H₂O + NAD⁺ 2-Oxoglutarsäure + NH₄⁺ + NADH + H⁺
  • 22. L-Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.3)
    L-Glutaminsäure + H₂O + NAD⁺ 2-Oxoglutarsäure + NH₄⁺ + NAD(PH)H + H⁺
Ist die Substratmenge einer Probelösung zu bestimmen, wird eine Dehydrogenase zur Oxidation des Substrats, NAD oder NADP, und die NAD(P)H-Oxidase zu der Probelösung hinzugegeben.
Ein oxidiertes Substrat und NADH (oder NADPH) werden in der ersten Reaktionsstufe gebildet, und anschließend wird das so gebildete NADH (oder NADPH) in NAD (oder NADP) und Wasserstoffperoxid durch die Reaktion der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt. Dies trifft auch für die Bestimmung der Enzymaktivität zu, wenn NAD (oder NADP) und Wasserstoffperoxid als Endprodukte erhalten werden. Die Menge gebildeten Wasserstoffperoxids kann durch jede bekannte Methode wie beispielsweise colorimetrische, fluoreszenzanalytische, chemilumineszenzanalytische und elektroanalytische Verfahren bestimmt werden, und eine Sauerstoffelektrode kann zur Bestimmung der verbrauchten Menge Sauerstoffs verwendet werden.
Ein typisches colorimetrisches Verfahren zur Bestimmung des Wasserstoffperoxids ist die Verwendung eines Peroxidasesystems. Die bekanntesten Reagenzien, die in diesem System angewendet werden, sind die 4-Aminoantipyrine in Kombination mit Phenol. Phenolderivate wie 2,4-Dichlorphenol, 2,4-Dibromphenol und 2,6-Dichlorphenol und Anilinderivate wie Dimethylanilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin und N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin, nachfolgend abgekürzt als TOOS) können zur weiteren Vergrößerung der Empfindlichkeit anstelle von Phenol verwendet werden. 4-Aminophenazon und 3-Methylbenzothiazolinonhydrazon (MBTH) können ebenfalls anstelle von 4-Aminoantipyrin verwendet werden.
Zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid durch fluorimetrische Analyse sind Verfahren bekannt, in denen Homovanillinsäure oder p-Hydroxyphenylessigsäure in das korrespondierende fluoreszierende Produkt durch die Wirkung von Wasserstoffperoxid und einer Peroxidase umgesetzt werden.
Zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid durch ein Chemilumineszenzverfahren ist eine Technik bekannt, in der Wasserstoffperoxid mit Luminol und Kaliumferricyanid umgesetzt wird, um eine Chemilumineszenz zu verursachen.
Hinsichtlich der Auswahl der in der erfindungsgemäßen Reaktion zu verwendenden Pufferlösung bestehen keine Begrenzungen, jedoch wird die Verwendung eines alkalischen Puffers bevorzugt, um die Oxidation von NAD oder NADP zu erleichtern und weil die erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase ein pH-Optimum im alkalischen Bereich aufweist.
Die NAD(P)H-Oxidase der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen in einer Menge von 0,05 bis 10 Units, bevorzugt in einer Menge von 0,1 bis 1 Unit verwendet. Zur Bestimmung der Menge eines Substrats in einer Probenlösung, ist es erforderlich, eine ausreichende Menge Dehydrogenase hinzuzufügen, damit NAD oder NADP nicht in einer geringeren Molmenge als das Substrat umgesetzt wird, so daß die Oxidation des Substrates (Dehydrogenasereaktion) nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Gesamtreaktion ist. Ebenso ist es bei der Bestimmung der Enzymaktivität erforderlich, daß das Substrat und NAD (oder NADP) in ausreichenden Mengen verwendet werden, so daß die korrespondierende Enzymreaktion nicht die geschwindigkeitsbestimmende Reaktion in der Gesamtreaktion darstellt. Die Reaktion wird im allgemeinen bei 20 bis 40°C 1 bis 30 Minuten lang durchgeführt.
Nachfolgend wird das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase detalliert durch die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Ein Kulturmedium (100 ml), enthaltend 1,0% Glucose, 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 0,1% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄×7 H₂O (pH 7,0), wurde in einem 500-ml- Erlenmeyerkolben gegeben und bei 120°C 15 Minuten lang sterilisiert. Das Medium wurde mit Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 (FERM BP-1392) beimpft und bei 30°C 24 Stunden lang geschüttelt, um eine Stamm(Keim-)kultur zu erhalten.
500 ml Kulturmedium der gleichen Zuammensetzung, wie oben beschrieben, wurden in einen 2-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben und 15 Minuten lang bei 120°C sterilisiert, mit 20 ml der wie oben beschriebenen erhaltenen Stammkultur beimpft, und die Kultur kontinuierlich 15 Stunden lang bei 30°C geschüttelt. 68 g Zellen (Feuchtgewicht), von 5 l Kulturbrühe durch Zentrifugieren getrennt, wurden in 150 ml 30 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, die Suspension wurde einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, um die Zellwände aufzubrechen, der Überstand (rohe Enzymlösung) wurde gegen 10 mM Glycin-NaOH-Pufferlösung (pH 9,0) dialysiert und das Dialysat über eine vorher im gleichen Puffer, wie oben beschrieben, equilibrierte DEAE-Sepharose (CL-6B)-Säule (Pharmacia) gegeben. Das Eluat, welches Enzymaktivität aufwies, wurde auf pH 10,0 durch Hinzufügen einer Natriumcarbonatlösung eingestellt und zur Adsorption der NAD(P)H-Oxidase über eine Q-Sepharose (FF)-Säule (Pharmacia), die vorher mit einem 10 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0) equilibriert worden war, gegeben. Das adsorbierte Material wurde mit einer einen linear steigenden NaCl- Gradienten von 10 mM bis 1,0 M aufweisenden Lösung eluiert. Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden mittels eines Kollodiumbeutels konzentriert und mit dem Konzentrat eine Gelfiltration über eine Sephacryl-S-300-Säule (Pharmacia), die vorher mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) equilibriert worden war, durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und wiesen 50 ml NAD(P)H-Oxidase auf. Ihre relative Aktivität betrug 2,1 Units/mg, und ihre Ausbeute aus der rohen Enzymlösung war 42%.
Beispiel 2
Ein Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurde in 500-ml-Erlenmeyerkolben (100 ml in jeden) gegeben, die Kolben wurden durch 15minütiges Erhitzen bei 120°C sterilisiert und mit den in Tabelle 1 aufgeführten Stämmen beimpft. Anschließend wurden die Kulturen kontinuierlich bei 30°C 24 Stunden lang geschüttelt. Jede so erhaltene Kultur wurde einer Fest-/Flüssigtrennung unterworfen und die gesammelten Zellen in 20 ml eines 30 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wurde der Ultraschallbehandlung und einer anschließenden Trennung durch Zentrifugieren unterworfen und aus dem Überstand die NAD(P)H-Oxidaseaktivität gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 dargestellt.
StämmeAktivität
(Unit/ml)
Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 (FERM BP-1392)0,250 Corynebacterium flaccumfaciens AHU 16220,122 Arthrobactor atrocyaneus IAM 123390,092 Micrococcus flavus IFO 32420,119 Pseudomonas aeruginosa IAM 11560,107 Achromobactor parvulus IFO 131820,107 Agrobacterium radiobactor IFO 126640,100 Flavobacterium esteroaromaticum IFO 37510,124 Streptomyces aureus IAM 00920,068
Beispiel 3 (Bestimmung von NADH)
Zusammensetzung der Reagenzien:
Lösung R-1
Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)50 mM Erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase0,25 U/ml
Lösung R-2
Phosphat-Puffer (pH 6,0)500 mM 4-Aminoantipyrin2,4 mM TOOS2,4 mM Peroxidase (aus Meerrettich, Sigma)24 U/ml
2 ml einer Mischung von Lösung R-1 mit 10 µl NADH-Lösung (jeweils 5, 10, 15 und 20 mM) wurden 5 Minuten bei 37°C zur Durchführung der Oxidation gehalten. 1 ml der Lösung R-2 wurde zu jeder Reaktionsmischung hinzugegeben und die Absorption bei 550 nm gemessen. Eine gute lineare Beziehung zwischen der verwendeten NADH-Menge und dem Ansteigen der Absorption bei 550 nm konnte, wie in Fig. 5 dargestellt, beobachtet werden.
Beispiel 4 (Bestimmung von Natriumcholat)
Zusammensetzung der Reagenzien:
Lösung R-1
Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)50 mM NAD1 mM 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase
(von Pseudomonas testosteroni, Takara Shuzo)0,4 U/ml Erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase0,8 U/ml
Lösung R-2
Phosphat-Puffer (pH 6,0)500 mM 4-Aminoantipyrin2,4 mM TOOS2,4 mM Peroxidase (aus Meerrettich, Sigma)24 U/ml
2 ml einer Mischung aus Lösung R-1 mit 10 µl Natriumcholatlösung (jeweils 2, 4, 6, 8 und 10 mM) wurden zur Durchführung der Oxidation 5 Minuten lang bei 37°C gehalten. 1 ml der Lösung R-2 wurde zu jeder Reaktionsmischung hinzugegeben und die Absorption bei 550 nm bestimmt. Eine gute lineare Beziehung konnte zwischen der verwendeten Natriumcholatmenge und dem Ansteigen der Absorption bei 550 nm, wie in Fig. 6 dargestellt, beobachtet werden.
Beispiel 5 (Bestimmung von Natriumcholat)
Zusammensetzung des Reagenz:
Lösung R-1
Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)50 mM NAD1 mM 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase
(von Pseudomonas testosteroni, Takara Shuzo)0,4 U/ml Erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase0,8 U/ml
Die Lösung R-1 (1,4 ml) wurde in eine geschlossene, mit einer Clark-Sauerstoffelektrode ausgerüsteten Zelle gegeben; 10 µl Natriumcholatlösung (jeweils 2, 4, 6, 8 und 10 mM) wurden hinzugefügt und die Elektrode zur Stabilisierung 5 Minuten lang bei 37°C behalten. 10 µl einer 10 mM Natriumcholatlösung wurden anschließend hinzugefügt und die Menge des verbrauchten Sauerstoffs gemessen. Eine gute lineare Beziehung wurde zwischen der verwendeten Natriumcholatmenge und der Menge verbrauchten Sauerstoffs beobachtet.
Unabhängig davon wurde die erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase auf einen Acetylcellulosefilm fixiert, und das fixierte Enzym in die gleiche Art Sauerstoffelektrode eingesetzt. Es wurde ein ähnliches Experiment, wie oben beschrieben, unter Verwendung dieser Sauerstoffelektrode durchgeführt, wobei in diesem Falle ähnlich befriedigende Ergebnisse erhalten wurden.
Beispiel 6 (Bestimmung der Lactatdehydrogenaseaktivität)
Zusammensetzung der Reagenzien:
Lösung R-1
Glycerin-NaOH-Puffer (pH 9,5)50 mM L-Natriumlactat30 mM NAD1 mM Erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase0,8 U/ml
Lösung R-2
Phosphat-Puffer (pH 6,0)500 mM 4-Aminoatipyrin2,4 mM TOOS2,4 mM Peroxidase (aus Meerrettich, Sigma)24 U/ml
Eine Mischung aus 2 ml Lösung R-1 mit 10 µl Lactatdehydrogenaselösung (jeweils 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 und 2,5 mM) wurde 5 Minuten lang bei 37°C zur Durchführung der Oxidation gehalten. Die Reaktion wurde beendet und 1 ml der Lösung R-2 wurde zu jeder Reaktionsmischung hinzugefügt und anschließend die Absorption bei 550 nm gemessen. Es wurde eine gute lineare Beziehung zwischen der verwendeten Menge Lactatdehydrogenase und dem Anstieg der Absorption bei 550 nm beobachtet.
Wie aus dem bereits gesagten ersichtlich, ermöglicht das analytische Verfahren der vorliegenden Erfindung die spezifische und quantitative Bestimmung einer Substratmenge und der Enzymaktivität einer Probenlösung mit hoher Empfindlichkeit. Die neue NAD(P)H-Oxidase der vorliegenden Erfindung kann mit geringen Kosten durch Mikroorganismen hergestellt werden und dient als nützliches Reagens für klinische Untersuchungen.

Claims (3)

1. NAD(P)H-Oxidase, gekennzeichnet durch folgende enzymologische Eigenschaften:
  • (1) Reaktionsweise:
    Sie oxidiert NADH oder NADPH in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von NAD oder NADP und Wasserstoffperoxid. NAD(P)H + H⁺ + O₂ → NAD(P)⁺ + H₂O₂
  • (2) Substratspezifität:
    Sie reagiert mit NADH und NADPH.
  • (3) pH-Optimum:
    Ihr pH-Optimum liegt im Bereich von etwa 9 bis 10.
2. Verfahren zur Herstellung von NAD(P)H-Oxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Stämme der Genera Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobactor, Mircrococcus, Pseudomonas, Achromobactor, Agrobacterium, Flavobacterium oder Streptomyces züchtet und die NAD(P)H- Oxidase aus der Kulturbrühe gewinnt.
3. Verwendung der NAD(P)H-Oxidase nach Anspruch 1 zur Bestimmung der Menge des verbrauchten Sauerstoffs oder der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids und dadurch Bestimmung der Menge des Substrats oder der Enzymaktivität bei einem Verfahren zur Bestimmung der Substratmenge oder der Enzymaktivität in einer Probenlösung unter Verwendung eines NADH oder NADPH bildenden Reaktionssystems.
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