JPS594995B2 - 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は発酵法によるＬ−メチオニンの製造法に関し
、詳しくは、メタノールを炭素源とする発酵法によるＬ
−メチオニンの製造法に関する。

メタノールを炭素源とする発酵法によるＬ−メチオニン
の製造法については、プロタミノバクタ−属、シュード
モナス属およびアクロモバクタ−属のエチオニンに耐性
を有する変異株がＬ−メチオニンを生産することが知ら
れている（特開昭５Ｏ−３１０９２）。

本発明者らは、シュードモナス（Ｐｓｅｎｄｏｍｏｎａ
ｓ）属に属し、エチオニンおよびα−アミノ−β−ヒド
ロキミ吉草酸に耐性を有する変異株が、メタノールを炭
素源としてより高い効率でＬ−メチオニンを生産するこ
とを見い出した。

即ちこの発明は、シュードモナス属に属シ、エチオニン
およびα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性を有し
、Ｌ−メチオニン生産能を有する変異株を、炭素源とし
てメタノールを使用して培養し、培地中に生成、蓄積さ
れたＬ−メチオニンを採取することを特徴とする発酵法
によるし一メチオニンの製造法である。

本発明において使用される変異株は、上に述べたように
、シュードモナス属に属し、エチオニンおよびα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性を有する変異株である
。

このような変異株は、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロングアニジンに接触せしめる等の通常の変異方法
により得られる。

変異処理後、エチオニンおよびα−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸に耐性を有する変異株を選別する方法は、そ
の親株が生育できないような量のエチオニン又はα−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸を含有する培地中又は培地
上に生育できるような変異株を分離すればよい。

本発明の変異株を具体的に例示すれば、以下のものがあ
る。

シュードモナスｓｐ、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ、
）ＦＥＡ４４（ＦＥＲ，Ｍ−Ｐ ５８４２ ）（−Ｔ
−チオニン耐性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐
性） 上記例示の変異株は、野性株ＦＭ５１８ （ＦＢＲＭ−Ｐ ５８４１）を親株として変異誘導さ
れたものである。

ＦＭ５１８の菌学的性質は以下のとおりである。

ＦＭ５１８の菌学的性質 （ａ） 形態 （１）細胞の形および大きさ：桿菌、 ０．８ Ｘ １．０〜０．８〜３．ＯｐｒｒＬ（２）細
胞の多形性の有無：なし ３）運動性の有無、鞭毛の着生状態：あり、極鞭毛 ４）胞子の有無、形状、大きさ、部位：なし５）ダラム
染色性：陰性 ６）抗酸性：陰性 （ｂ） 各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培養：中程度の生育、円形、凸円状〜
クッション状、金縁、円滑、半透明〜不透明、メタ様光
沢、均質、だいだい色〜ピック色。

２）肉汁寒天斜面培養：適度の生育、薄膜状、糸状、混
光、だいだい色〜レンガ色 ３）肉汁液体培養：生育中程度、均一に濁らない、薄片
状沈澱あり。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。

５）リドマス・ミルク：変化なし。

（ｃ） 生理学的性質 ■）硝酸塩の還元：あり。

２）脱窒反応：なし。

３）ＭＲテスト：なし。

４）ＶＰテスト：なし。

５）インドールの生成：なし。

６）硫化水素の生成：なし。

７）デンプンの加水分解：なし。

８）クエン酸の利用：Ｋｏｓｅｒ培地で利用しない００
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地で利用しない０９）無機窒素
源の利用：硝酸塩を利用する。

アンモニウム塩を利用する。

１０）色素の生成：生成しない。

１１）ウレアーゼ：あり。

１２）オキシダーゼ：あり。

１３）カタラーゼ：あり。

１４）生育の範囲：温度 ３５℃で生育し、４０℃で生
育しない。

ｐＨ６〜９１５）酸素に対する態度：好気性。

１６）０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ＆Ｌｅｉｆｓｏｎ法によ
る）二〇。

１７）糖類から酸およびガスの生成の有無酸の生成 ガ
スの生成 Ｌ−アラビノース −− Ｄ−キシロース ± − Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース −− Ｄ−フラクトース ＋ − 酸の生成 ガスの生成 り−ガラクトース −− 麦 芽 糖 −− シ ヨ 糖 −− 乳 糖 −− トレハロース −− Ｄ−ソルビット −− Ｄ−マンニット −− イノジット −− グリセリン ＋ − デンプン −− １８）デカルボキンラーゼ反応（Ｍψ１１ｅｒ の方
法） リジン ； なし オルニチン： なし アルギニン； なし １９）アルギニン、ジヒドロラーゼ反応（Ｓｔａｎｉｅ
ｒｅｔ ａｌ の方法による）：なし ２０）カゼインの分解性二分解しない。

２１）ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：蓄積する。

２２）栄養要求性：なし。

２３）下記の化合物の資化性（５ｔａｎｉｅｒの培地に
よる） Ｄ−グルコース ＋ トレハロース − ２−ケト−グルコン酸 − メン−イノジット − Ｌ−バリン − β−アラニン − ＤＬ−アルギニン − ベタイン ＋ Ｌ−アラビノース − サッカロース − プロピオン酸 − 酪 酸 − アトニット − エタノール ＋ Ｄ−キシロース − Ｄ−リボース − Ｌ−ラムノース − ギ 酸 十 レブリン酸 − シトラコン酸 − フマール酸 十 Ｄ（−）−酒石酸 − ソルビトール − メサコン酸 − エリスリトール − ２，３−ブチレングリコール − メタ−安息香酸 − パラ−安息香酸 − トリプタミン − α−アミルアミン − ＤＬ−乳酸 十 Ｄ−フラクトース ＋ マロン酸 十 テストステロン − セロビオース − ＤＬ−β−ハイドロオキシフ゛チレート＋Ｌ−ヒスチジ
ン − パントテン酸 − 酢 酸 十 コハク酸 十 クエン酸 − Ｌ−オルニチン − ５−ケト−グルコン酸 − Ｌ−リジン − Ｌ−アラニン − ズルシット − メタノール ＋ グリセリン ＋ １２−プロパンジオール ＋ ！ メチルアミン ＋ ジメチルアミン − エタノールアミン − ２４）ハイドロキシピルベートレダクターゼ活性：陽性 ２５） ３−へキニスロースフオスフエートシンターゼ
活性：陰性 １、ＦＭ５１８菌はｉ）ダラム陰性桿菌である。

ｉｉ）極鞭毛を有する。

１ｉｉ）好気的条件下だけで生育する。

１い オキシダーゼ陽性であることからシュードモナス
属に属する。

２、種について検索するとＦＭ５１８菌はＢｅｒｇｅｙ
ｓ Ｍａｍｅｌ ｏｆ ＤｅｔｅｖｍｉｎａｔｉｖｅＢ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版に従兄がポリ−β−ヒド
ロブチレートを蓄積し、栄養要求性がなく、４１℃で生
育出来ないのでシュードモナス属のセクション■に属す
る。

セクション■に属する既知菌種とＦＭ５１８菌を対比す
ると炭素源の資化性パターン及び集落の色調などで合致
する既知菌種はない。

従って、同第８版によればＦＭ５１８菌は性菌と言える
が第８版が出版された以降の文献内には集落の色調など
がＦＭ５１８菌と類似した菌が知られている。

（Ｐ、 ｒ ｈｏｄｎｍｅｔ ｈｙ ｌ。ｆａｃｉｅｎ
ｓ 、 Ｐ、ｍｅｇａｒｕｂｅｃｅｎｓ 、Ｐ、ｒｕｂ
ｅｒ ）一方メタノール資化細菌の分類学的取扱につい
ては論争のあるところである。

以上の事を考えると現段階では単に新種とすることを差
控えて種の命名を保留しておくのが妥当と考えてＦＭ５
１８菌をシュードモナスｓｐ、と同定した。

このような変異株を培養する培地としては、メタノール
炭素源として含有するほかは、通常の培地が使用できる
。

即ち、炭素源としてメタノール、窒素源、無機イオンお
よび必要によりアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有するものである。

窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩、硝酸、硝酸塩等が好ましい。

有機微量栄養素としてビタミンＢ１２を使用すれば、よ
りよい結果が得られる。

又、金儲無機、又は有機化合物を培地に添加すれば、よ
り望ましい結果が得られる場合が多い。

メタノールは、培地中の濃度があまり高くならないよう
、遂次補給添加するのが好ましい。

培養は好気的条件下で行うのが好ましく、培養の間ｐＨ
を５ないし８に調節し、温度を２５ないし３５℃とすれ
ば、より好ましい結果が得られる。

かくして２ないし５日間も培養すれば、培地中に著量の
Ｌ−メチオニンが蓄積される。

培養液よりＬ−メチオニンを採取する方法としては、イ
オン交換樹脂を用いる方法等の通常の方法が適用できる
。

実施例 １゜ １、変異株の誘導 シュードモナスｓｐ、ＦＭ ５１８の菌体を、２５０
μｍ／ｒｒＬｌのＮ−メチル−Ｎ−＝ドローＮ−ニトロ
ソグアニジンを含有する０、１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，
０）にけん濁し、３０℃に１５分間保った。

エチオニン耐性を獲得した変異株を分別し、これより最
もＬ−メチオニンの生産法の高い変異株ＦＢ２４４ （
ＦＥＲ，−Ｐ５８４０：を得た。

ＦＢ２４４を、Ｎ−メチル−Ｎ′ −二トローＭ−ニト
ロソグアニジンを用いて上記と同様に変異処理し、更に
α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性も獲得した変異
株を得た。

これより、最もＬ−メチオニンの生産性の高い変異株Ｆ
ＥＡ４４を得た。

２、ＦＥＡ４４の薬剤耐性度 １１当り、メタノール１０ｇ、（ＮＨ４）２ ：８０４
３．０．！ｉ’、Ｋ２ＨＰＯ４２，Ｏｇ、Ｎａ０１１．
Ｏｇ、Ｍ、！ｉ’ｓ０４・７Ｈ２００，２ｇ、ビタミン
混合液１０ｍ、ｌを含み、更にＬ−エチオニン又はＤＬ
−α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸を第１表に示す量
添加した培地を調製し、とのｐＨを７．０に調節した培
地の４ｒｒＬｌを試験管に入れ加熱殺菌した。

これに第１表に示す試験菌株を接種し、２８℃にて２４
時間、振とうしつつ培養した。

培養後、培養液の６１０ｎｍにおける吸光度を測定して
生育度とした。

結果を第１表に示す。３、 Ｌ−メチオニン生産試験 ５００ ｒｒＬｌ容振とうフラスコに純水１１当り（Ｎ
Ｈ４）２８０４５．（１、Ｋ２ＨＰＯ４４，０＆。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ、ＮａｐＨ，Ｏｇ１Ｆｅ
Ｃ１３・６Ｈ６Ｈ２Ｏ１０、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０２、
Ｏｍｇおよび酵母エキス２．０．＠をそれぞれ含有し、
ｐＨをＨ２ＳＯ４にて７．０に調節した生産培地５０
ｒｒＬｌを仕込んだ。

これを１２１℃にて１０分間殺菌後、別途殺菌したメタ
ノールを最終濃度として１０ｇ／ｌとなるように添加し
た。

これに上記と同組成の培地４ｒｒＬｌを含む試験管を用
いて２８℃にて２４時間培養した第２表に示す菌株を接
種し、２８℃で振とう培養を行った。

培養２４時間後、別途殺菌したメタノールおよびＣａＣ
Ｏ３を最終濃度としていずれも２０ｇ／ｌとなるように
添加した。

さらに培養４８時間後メタノールを２ Ｏｆ！／ｌとな
るように添加して培養を続けた。

培養９０時間後に培養液中に生成蓄積されたＬ−メチオ
ニンを測定した。

結果は第２表に示す通りである。

（Ｌ−メチオ ン蓄積量は培地中に既に含有しているＬ
−メチオニン量を差引いた値を示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属
   に属し、エチオニンおよびα−アミノ−β−ヒドロキシ
   吉草酸に耐性を有し、Ｌ−メチオニン生産能を有する変
   異株を、炭素源としてメタノールを使用して培養し、培
   地中に生成、蓄積されたＬ−メチオニンを採取すること
   を特徴とする発酵法によるＬ−メチオニンの製造法。