CN103732569B - 使用水解酶来增加废物流中的单体含量 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于富集环烷氧化工艺混合的有机废物流中的单体含量的方法。具体地，所述方法涉及将生物催化剂与来自环烷氧化工艺的混合的有机废物流组合，并将所述废物流的二聚体和/或寡聚体组分酶促转化成单体组分。所述方法可富集混合的有机废物流中二酸、己二酸和/或其他α,ω-双官能C6烷的含量。另外，经处理的混合的有机废物流可具有改进的燃烧效率。

Description

使用水解酶来增加废物流中的单体含量
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月17日提交的临时申请No.61/498404和2011年11月11日提交的临时申请No.61/558718的优先权，其公开内容通过提述完整并入本文。
发明领域
本发明涉及用于从工业环烷氧化的废物流富集单体组分、二酸和己二酸浓度、和/或产生α,ω-双官能烷的方法。
发明背景
尼龙是一般通过二胺与二羧酸、ω-氨基酸或内酰胺的缩合聚合作用合成的聚酰胺。尼龙的一种常见变体是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺和己烷-1,6-双酸(己二酸)的反应形成。或者，尼龙6可通过己内酰胺的开环聚合作用合成。因此，己烷-1,6-双酸(己二酸)、氨基己酸、六甲基二胺和己内酰胺均是尼龙生产中的重要中间物(Anton,A.和Baird,B.R.2005.Polyamides,Fibers.Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology)。
在工业上，这些中间物已使用基于石油化学品的原料合成。在目前使用的商业性工艺中，用于生产己二酸和己内酰胺的起始材料是环己烷，其然后在一系列步骤中经空气氧化以形成环己酮(K)和环己醇(A)的混合物，其中该混合物称为KA油。对于己二酸，KA油在后续步骤中经由硝酸氧化而氧化成己二酸。对于己内酰胺，环己酮经由几个公知的步骤转化成己内酰胺(Oppenheim,J.P.和Dickerson,G.L.2003.AdipicAcid.Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology)。该工艺和各种改进已披露于美国专利No.2,439,513；2,557,282；2,791,566；2,840,607；2,971,010和3,338,959。
在环己烷到KA油的空气氧化中，产生大量体积的废物流，其包含二羧酸、一元酸、羟基酸、环己酮、环己醇和它们的酯/寡聚体的混合物。这些废物流被称为不挥发性残余物(NVR)、水洗物或COP酸流。已有大量关于从这些混合物回收材料的化学方法和工艺的公开出版物，如美国专利No.4,058,555。然而，从这些流回收碳受制于低产量，且大部分碳未被利用。
经济和环境考虑保证了对石油化学品原料环己烷的更有效的碳利用。在数十年前，对来自苛性(caustic)环己基氢过氧化物(CHHP)分解过程的NVR中组分作为发酵底物的利用进行了简单研究(Ramsay等,Applied&EnvironmentalMicrobiology,1986,52(1):152-156)，但迄今为止由于这些流对微生物的高毒性性质，尚未开发出用于这些废物流处理或用于利用这些废物流中碳的生物学工艺。如此，这些废物流需要通过燃烧进行处置，而且根据流的性质这可能需要在专门设计的焚化炉中燃烧。
因此，需要用于更有效地利用在这些废物流中损失的碳和/或将碳转化成有用产品的其他方法，而非出于燃料值燃烧它或弃去它。
发明概述
本发明经由酶、天然和非天然存在的微生物的使用以改进混合的有机废物流的特性和组成，从而解决此需要和其他需要。具体地，发明人令人惊讶地发现，可以使用酶和微生物将来自商业性环烷氧化(例如环己烷氧化)的这些混合的有机废物流(例如，NVR、COP酸和水洗废物流)中存在的化学物的复杂毒性混合物的组分进行转化，以产生富集有单体的流，所述单体随后可转化成有用的化合物如多元醇、二酸、尼龙中间物或可转化成尼龙中间物的前体，或聚氨酯(polyurethane)中间物，尽管这些混合物中的组分有生物毒性。这使得能够从商业性环烷氧化工艺回收和/或重复利用副产物，如此提供更经济和更可持续的工艺。
具体地，发明人已鉴定出其中可使用特定酶来将不可用的C6组分(在NVR和COP酸中以寡聚体酯存在)的相当大的量转化成单体的方法。一旦可作为单体获得，水解的混合物中的组分即可以高得多的产率化学转化成有用的产物如多元醇。
或者，可利用代谢工程化的微生物将这些单体转化成有用的产物，如二酸、1,6-己二酸(己二酸)、或可用于生产聚合物的其他C6化合物的混合物，所述其他C6化合物例如1,6-己二醇、己内酯、6-氨基己酸、六亚甲基二胺和己内酰胺。
发明人亦已鉴定出戊内酯是NVR中的抑制性组分。通过处理混合的有机废物流以除去或减少混合物中存在的戊内酯量，不能在NVR中自然生长的宿主细胞能在存在经处理混合物的情况下生长，并催化其他混合的有机废物流组分转化成期望的化合物。
因此，本发明提供用于富集环烷氧化工艺混合的有机废物流，例如NVR、COP酸或水洗废物流中的单体含量的方法，其通过将生物催化剂与来自环烷氧化工艺的混合的有机废物流组合，并将所述废物流的二聚体和/或寡聚体组分酶促转化成单体组分。
在一些实施方案中，水解混合的有机废物流中的寡聚体酯组分以增加流中单体组分的量。在一个方面，所述方法包括用生物催化剂处理所述混合的有机废物流，所述生物催化剂包含至少一种水解酶、天然存在的宿主细胞或非天然存在的宿主细胞，其将所述废物流中的寡聚体酯水解成单体并增加混合的有机废物流中的单体组分量。
在另一个方面，所述方法包括用天然或非天然存在的宿主细胞处理混合的有机废物流，所述宿主细胞单独或组合地将所述废物流中的至少一部分寡聚体酯水解成单体，将混合的有机废物流中的至少一部分内酯水解成羟基酸，或将所述混合的有机废物流中存在的至少一部分直链C4-C6一元酸、羟基酸和含氧酸(oxo-acid)氧化成相应的二酸，增加混合的有机废物流中的单体组分量。
在一个方面，所述生物催化剂是分离的酶或由天然存在或非天然存在的宿主细胞分泌的酶。在另一个方面，所述生物催化剂是非天然存在的宿主细胞，其分泌作用于寡聚体酯或内酯的内源性或异源性水解酶和/或具有ω-羟基化途径以将一元酸转化成二酸和/或环己醇降解途径以将环己醇和环己酮转化成己二酸。所述生物催化剂还可具有削弱的经由β-氧化降解己二酸、6-羟基己酸和/或己酸的能力。全细胞生物催化剂还可表达将羟基己酸、6-氧己酸和己二酸转化成α,ω-双官能烷的酶，其中官能团选自-OH、-COOH和-NH2。
在一个方面，寡聚体酯到单体的水解由分离的或固定化的水解酶，或由天然或非天然存在的宿主细胞分泌的内源性或异源性水解酶在发酵和生物转化期间催化。
在另一个方面，所述水解酶(EC3.1.1.-)是脂肪酶(EC3.1.1.3)、酯酶(EC3.1.1.1)、角质酶(EC3.1.1.74)、聚羟基链烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76)、内酯水解酶如1,4-内酯酶(EC3.1.1.25)或葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)、或其组合。
在一个方面，寡聚体酯到单体的水解由在酸性pH、生理学pH或碱性pH有活性的水解酶催化。在另一个方面，将混合的有机废物流用非天然存在的宿主细胞处理，所述宿主细胞能在pH5.0-8.0利用并转化废物流中的碳源。
在一个方面，用水解酶处理降低混合的有机废物流的粘度以改进流的燃烧效率和/或准备该流用于进一步化学或生物学处理。具体地，经处理的混合的有机废物流可燃烧用于燃料值或产生合成气，或者经处理的混合的有机废物流的一种或多种组分用于酯化以产生混合的酯或多元醇、氢化为二醇、氧化为二酸、还原性氨基化、磺化、或用NH4OH或多胺处理。
在一个方面，寡聚体酯到单体的水解与另外的分离、化学转化或通过生物催化剂的酶促转化同时进行。或者，寡聚体酯到单体的水解在另外的分离、化学转化或通过生物催化剂的酶促转化之前进行。
在一些实施方案中，不挥发性残余物、COP酸或水洗物中的C4-C6一元酸和羟基酸被转化成二酸，其通过用天然存在或非天然存在的宿主细胞处理混合的有机废物流，所述宿主细胞能够将至少一部分的寡聚体酯水解成单体；将至少一部分的内酯水解成羟基酸；和/或将所述混合有机酸流中至少一部分的直链C4-C6一元酸、羟基酸和含氧酸氧化成相应的二酸。在一个方面，二酸混合物在分离成C4、C5、或C6二酸之前进行酯化。
在另一个方面，将混合的有机废物流用非天然存在的宿主细胞处理，所述宿主细胞单独或组合地将至少一部分寡聚体酯水解成单体；将至少一部分戊内酯水解成5-羟基-戊酸；将至少一部分己酸、6-羟基己酸和6-氧己酸氧化成己二酸；将废物流的至少一部分环C6组分转化成己二酸；将所述混合的有机废物流中存在的至少一部分C3、C4和C5组分分解代谢；和/或以低于C3、C4和C5组分的速率分解代谢所述混合的有机废物流中的C6组分。这类处理增加己二酸在流中的相对浓度并降低一元酸和羟基酸在流中的量。在一个方面，二酸混合物在分离成C4、C5、或C6二酸之前进行酯化。或者，己二酸从混合物结晶。
在再一个方面，将混合的有机废物流用非天然存在的宿主细胞处理，所述宿主细胞单独或组合地将至少一部分寡聚体酯水解成单体；将至少一部分己酸氧化成6-羟基己酸；将至少一部分环C6组分转化成6-羟基己酸或6-氧己酸；将所述混合的有机废物流中存在的至少一部分C3、C4和C5组分分解代谢；和/或以低于C3、C4和C5组分的速率分解代谢所述混合的有机废物流中的C6组分；表达至少一种生物合成途径酶以将己二酸、6-羟基己酸或6-氧己酸转化成1,6-己二醇、6-氨基己酸、ε-己内酰胺或六亚甲基二胺。这类处理将所述流中存在的C6组分和前体转化成α,ω-双官能C6烷。
在一个方面，将寡聚体酯、己酸和环C6化合物转化成6-羟基己酸、6-氧己酸和己二酸的非天然存在的宿主细胞还生成1,6-己二醇。在一个具体的方面，产生1,6-己二醇的宿主细胞表达催化6-氧己酸到6-羟基己酸的转化的醛脱氢酶和催化6-羟基己酸到1,6-己二醇的转化的醇脱氢酶。
在另一个方面，将寡聚体酯、己酸和环C6化合物转化成6-羟基己酸、6-氧己酸和己二酸的非天然存在的宿主细胞还生成6-氨基己酸。在一个具体的方面，生成6-氨基己酸的非天然存在的宿主细胞表达将6-氧己酸转化成6-氨基己酸的氨基转移酶。在一个方面，生成6-氨基己酸的非天然存在的宿主细胞还表达将6-氨基己酸转化成ε-己内酰胺的氨基(amidohydrolase)水解酶。或者，生成6-氨基己酸的非天然宿主细胞还经由将6-氨基己酸转化成6-氨基己醛的醛脱氢酶和将6-氨基己醛转化成六亚甲基二胺的1-氨基转移酶产生六亚甲基二胺。
在一个方面，将C4-C6或C6一元酸、羟基酸和含氧酸经由含氧酸转化成二酸的天然或非天然存在的宿主细胞具有内源性或异源性ω-氧化途径，其催化丁酸、戊酸和/或己酸到琥珀酸、戊二酸和/或己二酸的转化；丁酸、戊酸和/或己酸到4-羟基丁酸、5-羟基戊酸和/或6-羟基己酸的转化；4-羟基丁酸、5-羟基戊酸和/或6-羟基己酸到4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸的转化；和/或4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸到琥珀酸、戊二酸和/或己二酸的转化。具体地，具有内源性或异源性ω-氧化途径的天然或非天然存在的宿主细胞能将脂肪族脂肪酸经由羟基酸和含氧酸转化成二酸，且所述宿主细胞是利用n-烷的酵母或细菌。在一个具体的方面，利用n-烷的酵母是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、C.parapsilosis、C.zeylenoides或其组合，或红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和油脂酵母属(Lipomyces)的酵母或其组合，且其中利用n-烷的细菌是假单胞菌属，如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)、铜绿假单胞菌(P.aeroginosa)、食油假单胞菌(P.oleoverans)、除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)、不动杆菌属(Acinetobacter)菌种如Acinetobactervenetianus、Oleiphilusmessinensis、粘节杆菌(Arthrobacterviscosus)、Cupriavidusmetallidurans、红球菌属菌种如紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)和红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、Sphingomonaspaucimobilis、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、Delftiaacidovorans、Alcanivoraxdiesolei或其组合。
在一个方面，将废物流的至少一部分环C6组分转化成6-羟基己酸、6-氧己酸或己二酸的天然或非天然存在的宿主细胞具有内源性或异源性途径，其催化环己醇到6-氧己酸的转化；1,2-环己二醇到6-氧己酸的转化；和/或6-氧己酸到己二酸的转化。
在一个方面，消弱经由β-氧化对己二酸和/或6-羟基己酸和/或己酸的降解，其通过阻止C6酸活化成CoA酯，或通过缺失一个或多个编码酰基-CoA氧化酶的POX基因进行。
在一个具体的方面，1,2-环己二醇到6-氧己酸的转化包括环己烷-1,2-二醇到环己烷-1,2-二酮的转化和/或环己烷-1,2-二酮到6-氧己酸的转化。
在另一个具体的方面，环己醇到环己酮的转化包括环己酮到ε-己内酯的转化；ε-己内酯到6-羟基己酸的转化；和/或6-羟基己酸到6-氧己酸的转化。
在多个实施方案中，将不挥发性残余物或水洗物中的一些6碳组分(包括6-羟基己酸和/或己酸)转化成己二酸。
在多个实施方案中，将不挥发性残余物或水洗物中的一些残余环己酮和/或环己醇转化成6-羟基己酸或6-氧己酸。
在一个方面，所述天然或非天然存在的宿主细胞对NVR耐受。在一个具体的方面，所述宿主细胞对按体积计至少1%的混合的有机废物流耐受。在另一个方面，宿主细胞对混合的有机废物流的耐受性通过降低所述流中抑制性化合物的量得到改进。在一个具体的方面，所述抑制性化合物是内酯，且在用天然存在或非天然存在的宿主细胞处理混合的有机废物流之前或期间，通过用一种或多种生物催化剂处理所述流将混合的有机废物流中内酯的量降低，所述生物催化剂能将内酯水解成相应的羟基酸。在另一个方面，所述生物催化剂是在发酵期间由宿主细胞表达并分泌的酶。
在一个方面，降低宿主细胞对C6化合物分解代谢的速率以提供来自废物流更高的C6组分产率。在一个具体的方面，降低己酸、羟基己酸和己二酸经由宿主细胞的β-氧化降解成乙酰基-CoA。在一个更具体的方面，己酸、羟基己酸和己二酸经由β-氧化的降解通过缺失或抑制使用己酸、羟基己酸和己二酸来形成CoA酯的酶得到降低。在一个方面，降低己酸、羟基己酸和己二酸经由β-氧化的降解，其通过缺失或抑制氧化CoA酯的酶。形成CoA酯的例示性酶是CoA连接酶和CoA转移酶。氧化CoA酯的例示性酶是酰基-CoA氧化酶和酰基-CoA脱氢酶。
有利的是，本文中描述的方法减少基于石油化学品的原材料的使用且提供可持续工艺，其利用来自商业性工业工艺的废产物。尽管，在期望时这些工艺可在新设备中进行，但这些工艺可在现有商业工厂(plant)中进行且如此不需要建造新的昂贵的工厂。此外，由于所述原料是原位生成的，运输费用得到最小化，因为产生的己二酸可直接补料到现有纯化和/或结晶设备中。
在多个实施方案中，NVR或水洗流的一些4碳和5碳组分被分解代谢或转化成相应的二酸。
本发明还提供组合物，其包含环烷氧化工艺的混合的有机废物流和生物催化剂。在一个方面，所述混合的有机废物流包含NVR、水洗物/COP酸、或苛性水流。在另一个方面，所述生物催化剂是分离的酶或由天然存在或非天然存在的宿主细胞分泌的酶或全细胞。
在另一个方面，所述宿主细胞对NVR耐受。在一个具体的方面，所述宿主细胞对按体积计至少1%的混合的有机废物流耐受。
在一个方面，所述天然或非天然存在的宿主细胞包含能将脂肪族脂肪酸经由羟基酸和含氧酸转化成二酸的内源性或异源性ω-氧化途径，且所述宿主细胞是利用n-烷的酵母或细菌。在一个具体的方面，利用n-烷的酵母是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、麦芽糖假丝酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides或其组合，或红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和油脂酵母属(Lipomyces)的酵母或其组合；且其中利用n-烷的细菌是假单胞菌属，如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)、铜绿假单胞菌(P.aeroginosa)、食油假单胞菌(P.oleoverans)、除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)、不动杆菌属菌种如A.venetianus、Oleiphilusmessinensis、粘节杆菌(Arthrobacterviscosus)、Cupriavidusmetallidurans、红球菌属菌种如紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)和红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、Sphingomonaspaucimobilis、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、Delftiaacidovorans、或Alcanivoraxdiesolei或其组合。
对本发明各实施方案的详细描述
本发明的方法使用至少一种生物催化剂，从而能够具有更高的产率和改进的从有机废物流的组分回收。如本文中使用的，术语“生物催化剂”指分离或纯化的酶，或由实施有机分子的单一化学转化的宿主细胞原位生成的酶，或催化一种或多种有机分子的一系列连续转变的全细胞。所述分离或纯化的酶可购自商业来源，或从天然或非天然表达该酶的宿主细胞纯化。宿主细胞可以是天然存在或非天然存在的，例如经遗传工程化的。宿主细胞可以是原核生物的，如细菌或古细菌，或者是真核生物的，如酵母或动物细胞。宿主细胞可表达或分泌能够催化特定反应例如水解的酶。另外，宿主细胞可含有催化不同反应的其他酶途径。举例而言，宿主细胞可含有ω-羟基化途径，其催化混合的有机废物流中单羟基酸或含氧酸组分的氧化，或含有转化从废物流组分形成的化合物如6-氧己酸以生成更具商业价值的产物如6-氨基己酸的酶。
具体地，所述生物催化剂将寡聚体酯水解成单体。这改进了废物流的燃烧价值和/或改进了废物流的组成，其通过产生可用于后续化学或酶促加工的单体，如富集的二酸、己二酸和双官能烷。开发本文中所述方法中的一个重要步骤是鉴定出天然表达和/或已经过遗传修饰来表达各种酶和途径的宿主细胞，所述各种酶和途径是将工业环己烷氧化的NVR、COP酸和水洗物中存在的化合物转化成更期望的化合物所需要的。在一些情况下，天然和非天然存在的宿主细胞可将NVR和水洗废物中存在的那些化合物(其不能容易地转化成6-氧己酸)用作生长的营养源。
发明人令人惊讶地发现，在存在混合的有机废物流的情况下，宿主细胞保持存活且酶保持活性，而且能够将废物流的不太想要的组分转化成工业和商业上有用的化合物或中间物。此外，发明人的发现，即尽管NVR和水洗废物中存在作为氧化过程副产物的抑制性化学物组，但宿主细胞仍能耐受工业环己烷氧化的NVR和水洗废物流(且在一些情况下，分解代谢其组分)也是未预料到的。
附图简述
图1是酶转化的示意图，其涉及将工业环己烷氧化的NVR和水洗废物的脂肪族和环C6组分转化成己二酸。该图还例示了将水洗废物和NVR的C3-C5组分转化成能补料到细胞的中心代谢中的化合物，从而使得该细胞能将那些化合物用于生长所需要的转化。此外，该图例示了可在本发明的工程化细胞中抑制以增加期望产物的总产率的那些酶转化。这些抑制的途径由交叉形的存在指示，箭头显示转化的方向。
图2是显示6-羟基己酸到1,6-己二醇和6-氧己酸到6-氨基己酸转化的例示性酶转化的示意图，6-氨基己酸随后被转化成己内酰胺或经由6-氨基己醛转化成己烷-1,6-二胺(六亚甲基二胺)。1：1-氨基转移酶EC2.6.1.191，也是来自BacillusweihenstephanensisKBAB4、铜绿假单胞菌gi99510722的氨基转移酶；2：羧酸还原酶EC1.2.99.6或醛脱氢酶EC1.2.1.3/EC1.2.1.31；3：6-羟基己酸脱氢酶EC1.1.1.258；4：醇/醛脱氢酶EC1.2.1.10；5：氨基水解酶(EC3.5.2.-)，如EC3.5.2.11。
图3是表达载体构建体的示意图，其用于表达在宿主菌株解脂西洋蓍霉中靶向胞外分泌的酶。
图4显示测试商业性酯酶和脂肪酶水解NVR和COP酸寡聚体的能力的代表性清空板测定法的图。图4，A部分显示酯酶对COP酸(4%v/v)的水解：孔1为对照(无酶，仅磷酸盐缓冲液)；孔2是米黑毛霉(Mucormiehei)酯酶；孔3是荧光假单胞菌酯酶；孔4是假单胞菌属菌种胆固醇酯酶；孔5是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilu)酯酶；孔6是马肝酯酶；孔7是解脂假丝酵母(Candidalipolytica)酯酶；孔8是米根霉酯酶；而孔9是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)酯酶。图4，B和C部分显示脂肪酶对COP酸(4%v/v)的水解：c-无酶对照(磷酸盐缓冲液)，孔1.疏棉状嗜热霉(Thermomyceslanuginosus)，孔2.洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶，孔3.米黑毛霉脂肪酶，孔4.曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶，孔5.荧光假单胞菌脂肪酶，孔6.沙门柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)脂肪酶，孔7.黑曲霉(Aspergillusniger)脂肪酶，孔8.黑曲霉amano脂肪酶A，孔9.南极假丝酵母(Candidaantartica)脂肪酶A，孔10.皱落假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶III型，和孔11.雪白根霉(Rhizopusniveus)脂肪酶。
图5显示选定的酯酶在不同pH对聚己内酯二醇聚合物(2%,w/v,MW=530g/mol)的水解。来自米黑毛霉(E1)和米根霉(Rhizopusoryzae)(E12)的酯酶在pH3.5有活性。来自淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiostotochromogenes)(E8)的酯酶是碱性酯酶且仅在pH>8显示活性。
图6显示在生物转化测定法期间磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中的NVR反应混合物(2%v/v)用选定酯酶处理16小时后己酸、6-羟基己酸、己二酸和总酸浓度中的增加。
图7显示在生物转化测定法期间磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中的NVR反应混合物(2%v/v)用选定脂肪酶处理16小时后6-羟基己酸浓度中的增加。
图8显示在生物转化测定法期间磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中的COP酸(4%v/v)用选定酯酶处理16小时后己酸、6-羟基己酸、己二酸和总酸浓度中的增加。
图9显示在生物转化测定法期间磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中的COP酸(4%v/v)用选定脂肪酶处理16小时后己酸、羟基己酸、己二酸和总酸浓度中的增加。
图10显示在生物转化测定法期间磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中的NVR(4%v/v)用固定化脂肪酶处理16小时后6-羟基己酸浓度中的增加。
图11显示测试重组解脂西洋蓍霉菌株水解寡聚体酯能力的典型清除板测定法的图，所述酵母菌株表达由定向进化创建的内源性Lip2脂肪酶的变体。将解脂西洋蓍霉未转化宿主和米黑毛霉酯酶用作对照来评价分泌的脂肪酶变体的相对活性。变体15和36展现出高活性，如由菌落周围的晕(halo)的大小判断的。
图12是用于选择能分解代谢NVR中存在的丁酸和戊酸的恒化器(chemo-stat)发酵设置的示意图。
图13是显示在约0.1[h-1]的稀释速率达到恒化器稳定态的图示。
图14是显示在约0.1[h-1]的稀释速率接近稳定态期间的pH扰动。
图15是显示在约0.1[h-1]的稀释速率在近稳定态来自pH偏移移动(excursiondrift)实验的结果的图示。
图16显示恒化器，其具有用于研究在作为碳源和能量源的NVR中生长的解脂西洋蓍霉的细胞截留的细胞截留实验设置。
图17显示具有细胞截留的稳定态恒化器培养，其以～215[mL/h]的流速和～0.025[h-1]的有效生物质稀释速率使用2[%](v/v)NVR。
图18显示选定的酵母在0.1-1g/L内酯存在下的生长。Iss#125是酿酒酵母(对照)。Iss#134是在3%(v/v)NVR+YPD培养基上缓慢生长后自板分离的。Iss#137是使用合成的NVR组分给料自恒化器分离的。
图19显示在使用1-2%NVR作为唯一碳源的细胞截留恒化器中戊内酯的积累。
图20显示涉及将环己酮氧化成己二酸的基因，包括催化己内酯到6-羟基己酸转化的ChnC。数种归类为ChnC的酶还催化戊内酯到5-羟基戊酸的转化。
图21例示在与NVR(4%)温育时，具有受损β-氧化的解脂西洋蓍霉菌株(各种POX突变体)的反应上清液中6-羟基己酸和己二酸累积而在亲本和野生型菌株中没有观察到累积。如此，编码酰基-CoA氧化酶的POX基因的缺失阻止NVR中经由β-氧化对己二酸和6-羟基己酸两者的降解。
图22例示NVR中的6-羟基己酸和己二酸被亲本和野生型菌株降解，而POX突变体累积两种酸。POX3对C6组分的降解具有最大影响。
发明详述
混合的废物流：不挥发性残余物、水洗废物和COP酸
商业性环烷氧化成二酸工艺一般涉及两个步骤。在第一步骤中，利用空气来氧化环烷以产生环烷醇和环烷酮的混合物。然后，使用硝酸将该混合物氧化成二酸。在KA混合物的产生期间生成数种副产物流。更具体地，当用氧或含氧气体来氧化环己烷时，产生在环己烷中含有环己醇(A)、环己酮(K)和环己基氢过氧化物(CHHP)的中间物流。该中间物流还包含共产物，其干扰意图将CHHP转化成KA的后续加工步骤。因此，商业性工艺可包括一个步骤，其中使含有K、A和CHHP的中间物流与水或苛性碱(如记载于美国专利No.3,365,490的)接触以除去不想要的共产物。该萃取步骤产生(i)纯化的环己烷流，其含有K、A和CHHP；和(ii)水废物流。
如本文中使用的，术语“水洗物”、“水洗废物流”或“水废物流”指由环己烷氧化物的水萃取产生的水流(Oppenheim,J.P.和Dickerson,G.L.2003.AdipicAcid.Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology)。水洗物含有在环己烷的初始氧化期间形成的各种一元酸和二元酸、羟基酸和其他氧化副产物。
一旦完成CHHP到K和A的转化，就对所得混合物进行精化以回收(i)用于再循环的未反应的环己烷，和(ii)获得纯化的K和A用于其后氧化成己二酸或转化为己内酰胺。如本文中使用的，术语“不挥发性残余物流”或“NVR”指来自环己烷氧化产物环己醇和环己酮的蒸馏性回收的高温沸腾蒸馏底部，其具有低铬含量，更适于燃烧(Oppenheim,J.P.和Dickerson,G.L.2003.AdipicAcid.Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology)。NVR包含几种组分，包括但不限于，丁酸、戊酸、己酸、5-羟基戊酸、6-羟基己酸、戊内酯、琥珀酸、戊二酸和己二酸，以及环己醇、环己二醇和环己酮。
总之，共产物流，在本文中有时称为“副产物”流(可从环己烷氧化工艺获得)包含“水洗物”(由环己烷氧化物的水萃取产生的水流)和“NVR”(来自KA精化的高温沸腾蒸馏底部，CAS注册号68411-76-7)。通过除去至少一些水而对水洗物的浓缩产生浓缩的水萃取流，称为“COP酸”。如本文中使用的，术语“COP酸”指已经过热处理以除去过氧化物并浓缩以除去至少一些水的水洗物流(CAS注册号68915-38-8)。参见描述NVR产生的美国公开文本No.US2004/0054235(通过提述并入本文)，和美国公开文本NoUS2012/0064252和US2012/0101009(通过提述并入本文)，其描述通过将游离酸官能团转化成单体酯和寡聚体酯，并将寡聚体酯转化成单体酯来处理NVR、水洗物或COP酸。
在一个实施方案中，“COP酸”可通过使环己烷空气氧化产物与水在萃取步骤中接触并分离水相来提供，萃取物在后文中称为“水洗物”。在一个实施方案中，所述“水洗物”经过热处理以破坏掉可能在储存和装运期间增加困难的过氧化物。水洗物可通过部分除去水来浓缩以降低储存体积和运输成本。
在一个实施方案中，COP酸一般含有按重量计约10%至70%的水。在一个实施方案中，COP酸可含有按重量计约10%至50%的水。在一个实施方案中，NVR可含有按重量计约10%至50%的水。在一个实施方案中，水洗物可含有按重量计约70%至90%的水。在一个实施方案中，水洗物可含有按重量计约85%的水。
作为方法的起始材料，可以使用来自环己烷氧化工艺(或系统)的水性萃取的部分产物(后文称为“水洗物”)、来自环己烷氧化工艺的浓缩水洗萃取物(后文称为“COP酸”)、来自KA精化的蒸馏底部(本文中称为不挥发性残余物或“NVR”)或其组合。关于“其组合”，任意一种或两种的组合(例如，水洗物和COP酸；水洗物和NVR；或COP和NVR)或所有3种的组合(即水洗物、COP酸和NVR)均可视为其组合。
混合的有机废物流的组分
环己烷氧化的不挥发性残余物和水洗废物流包含化合物的混合物，所述化合物中一些是直链C6分子，一些是环C6分子，而一些是包含直链C6分子的聚合酯。其他具有更短链长度的化合物亦存在于NVR和水洗废物流中。
具体地，所述不挥发性残余物和水洗废物流含有单功能(functional)和多功能性产物。可存在于这些产物上的官能团包括酸、过氧化物、酮、醇、酯和寡聚体。亦可存在其他官能团如醛、内酯和烯。单分子可包含一种或更多种官能团(Ramsay等,Applied&EnvironmentalMicrobiology,1986,52(1):152-156)。
包含羟基酸基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于，羟基己酸、羟基戊酸、羟基丁酸、羟基丙酸和羟基乙酸。在一个实施方案中，所述酸基团可位于直链烃链的一端，而羟基基团可存在于链上的各个位置。
在一个实施方案中，所述羟基己酸是2-羟基己酸、3-羟基己酸、4-羟基己酸、5-羟基己酸或6-羟基己酸。
在一个实施方案中，所述羟基戊酸是2-羟基戊酸、3-羟基戊酸、4-羟基戊酸或5-羟基戊酸。
在一个实施方案中，所述羟基丁酸是2-羟基丁酸、3-羟基丁酸或4-羟基丁酸。
在一个实施方案中，所述羟基丙酸是2-羟基丙酸或3-羟基丙酸。
包含一元酸基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸。
包含二元酸基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、延胡索酸、马来酸、草酸和己-2-烯双酸。
包含酮酸基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：α-酮酸例如2-氧酸如丙酮酸，β-酮酸例如3-氧酸如乙酰乙酸，γ-酮酸例如4-氧酸如4-氧戊酸(亦称为乙酰丙酸)和5-氧己酸。
包含醇基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：环己醇、丙醇(例如1-丙醇、2-丙醇)、丁醇(例如1-丁醇、2-丁醇等)、戊醇(例如1-戊醇、2-戊醇等)、己醇(例如1-己醇、2-己醇等)和二醇如1,2-、1,3-和1,4-环己二醇，各种丁二醇异构体和各种戊二醇异构体。
包含过氧化物基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：环己基氢过氧化物和羟基己酸氢过氧化物。
包含酯基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：环己基甲酸酯和环己基戊酸酯。
包含酮基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：环己酮和环戊酮。
包含醛酸基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：5-甲酰基戊酸和4-甲酰基丁酸。
包含内酯基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：γ-丁内酯、δ-戊内酯、γ-戊内酯和ε-己内酯。
包含烯基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗废物流中的产物的例子包括但不限于：环己烯-1-酮、戊烯酸和环己烯-醇。
包含酯基团且可存在于不挥发性残余物和/或水洗流中的产物的例子包括但不限于：6-羟基己酸的酯或寡聚体以及含有6-羟基己酸和二羧酸如1,6-己二酸的交叉酯或寡聚体。
生物催化剂对寡聚体混合的有机废物流组分的水解
NVR中高达60%的可获C6碳分子以羟基己酸、己二酸和己酸的酯寡聚体，以及掺有C4-C5羟基酸、一元酸和环醇的混合聚合酯存在。类似的寡聚体酯存在于COP酸中，尽管具有更低的异质性，其主要由羟基-己酸组成。羟基-己酸是这些寡聚体的主要组分，而一元酸和二酸充当链终止体，产生具有不同链长度的寡聚体。对NVR和COP酸的商业可行利用需要从寡聚体酯释放出单体以改进产物如多元醇、C4-C6二元酸或二元酯混合物或α,ω-双官能C6烷的产率，所述产物可用于源自这些废物流的聚合物应用。NVR中寡聚体的高水平还导致高粘度和燃烧的低效率(当NVR作为锅炉燃料处置时)。
羧基酯水解酶(EC3.1.1.-)是将酯水解成醇和酸的水解作用酶。脂肪酶(EC3.1.1.3)是这些水解酶的亚类，其水解脂质并且能在水相和有机相的界面处作用。酯酶(EC3.1.1.1)、角质酶(EC3.1.1.74)、聚羟基链烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76)、内酯水解酶如1,4-内酯酶(EC3.1.1.25)或葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)亦水解酯键。
可基于脂肪酶的结合位点表面状况、基因序列、功能或其他特性对其进行分类。脂肪酶工程数据库(LipaseEngineeringDatabase)(LED)整合脂肪酶、酯酶和具有α/β水解酶折叠的相关蛋白质的序列、结构和功能信息以生成针对所有脂肪酶的分类系统(Widmann等,BMCGenomics2010,11:123)。根据涉及形成氧阴离子孔的氨基酸(其加上催化性三联体(Ser-Asp(Glu)-His)形成活性位点)，来自任意生物体的脂肪酶可分成3组：GGGX-、GX-和Y-类。一旦已鉴定出对给定底物具有期望活性的脂肪酶，该数据库即为可用于外推出鉴定具有期望特异性和特性的其他酶的结果的资源。
在一个实施方案中，本发明提供一种或多种酶如脂肪酶和酯酶的组合的使用。例如，在一个方面，脂肪酶将寡聚体酯水解成更小的寡聚体且酯酶将更小的寡聚体水解成单体。
本发明的方法提供改进来自环己烷氧化工艺的混合的有机废物流的特性和组成的手段，其通过对废物流应用至少一种生物催化剂。有机废物流通过有限数目的来源生成，而废物流最经常燃烧以用于燃料值或产生合成气。燃烧废物流或将其经由例如蒸汽重形成转化成合成气的结果是失去商业上有价值的流C6组分。另外，废物流中多达40-60%的C6组分被“捕获”为寡聚体，其导致可用化合物从使用废物流作为输入材料的进一步化学或酶促加工的较差回收并降低废物流用于燃料的燃烧效率，因为寡聚体不像单体那样有效燃烧。不受理论束缚，认为NVR中的寡聚体增加流的粘度，其阻碍在喷燃器尖端(burnertip)的有效雾化(atomisation)。此外，认为由于寡聚体在组成和量中不同，因此优化燃烧过程非常困难。如此，从NVR和COP酸消除寡聚体可导致流的更低粘度，其导致更均一的易于通过焚烧处置的流。
这些与混合的有机废物流例如NVR和COP酸有关的限制减少废物流及其C6组分在商业有价值的操作例如生产二酸或尼龙中间物中的使用。
本发明提供用于释放C6组分为单体的方法，其通过对所述废物流应用至少一种生物催化剂，其中所述生物催化剂将寡聚体水解以形成单体。所述单体能更有效地燃烧用于燃料和/或用于其后化学和酶促加工以提供改进的产率。
在一个方面，所述生物催化剂是分离的酶、固定化的酶、天然表达酶的宿主细胞、或已经过修饰以分泌来自α,β-水解酶折叠家族(EC3.1.1.-)的羧酸酯酶的宿主细胞。
能够将寡聚体酯水解成单体的水解酶可以是分离的或固定化的酶。或者，所述水解酶可以是由天然存在的或非天然存在的宿主细胞在发酵和生物转化期间分泌的内源性或异源性水解酶。
在一个方面，能够将寡聚体酯水解成单体的水解酶是羧酸酯水解酶(EC3.1.1.-)。在另一个方面，所述水解酶选自脂肪酶(EC3.1.1.3)、酯酶(EC3.1.1.1)、角质酶(EC3.1.1.74)、聚羟基链烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76)、内酯水解酶或其组合。在一个具体的方面，所述内酯水解酶是1,4-内酯酶(EC3.1.1.25)或葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)。
根据从中生成NVR、COP酸、水洗物或苛性废物流的特定环己烷氧化工艺以及意图的应用，寡聚体酯的水解可在不同pH条件进行。例如，来自cyane氧化的NVR、COP酸和水洗物是酸性的，而苛性CHHP工艺导致碱性NVR流和苛性水洗物&COP废物流。如此，能够用可在酸性、中性或碱性条件下使用的不同酶将存在于不同NVR和浓缩水洗物流中的寡聚体水解是有利的。
所述混合的有机废物流可用水解酶处理，调节或不调节混合物的pH和水含量。依照水解酶在适宜pH保留其酶活性的能力对其进行选择，从而使其能在近中性pH、酸性pH或碱性pH将废物流中存在的寡聚体酯水解成单体。在一个方面，将混合的有机废物流用在酸性pH，即低于6的pH有活性的水解酶处理。在另一个方面，将混合的有机废物流用在碱性pH，即大于8的pH有活性的水解酶处理。在又一个方面，将混合的有机废物流用在生理学pH，即pH6-8有活性的水解酶处理。
将混合的有机废物流用水解酶处理能降低流的粘度并改进流燃烧的效率。另外，对混合的有机废物流的水解酶处理还能将该流准备为用于进一步化学和/或生物学加工。
在一个方面，将用水解酶处理的混合的有机废物流如NVR燃烧用于燃料值或产生合成气。不受理论束缚，认为如果通过水解从寡聚体酯释放出单体，那么所得混合物在作为锅炉燃料处置时燃烧得更有效率。在另一个方面，将来自用水解酶处理的混合的有机废物流如NVR的至少一种组分用于进一步化学加工。对单体的例示性的进一步化学加工包括酯化以产生混合的酯或多元醇、氢化为二醇、氧化为二酸、还原性氨基化、磺基化、或用NH4OH或多胺处理。
当用水解酶处理的废物流意图用作锅炉燃料，或当将废物流用水解酶处理以将其准备为用于进一步化学加工时，在用水解酶处理之前或期间使得废物流用水稀释最小化和对混合物的pH调节最小化是有利的。在低pH保留活性的水解酶对于来自Cyane氧化工艺的废物流的处理最有利，而在碱性pH保留活性的水解酶在来自CHHP工艺的废物流的情况中最有利。当废物流意图通过宿主细胞进行生物学处理以分解代谢废物流的组分和/或将废物流中的组分转化成二酸或α,ω-双官能烷时，采用在近生理学pH(pH5-8)有活性的水解酶是最有利的。
例如，发明人证明，尽管解脂西洋蓍霉具有广泛的生长pH范围(pH3.0-9.0)，但宿主细胞在混合的有机废物流中存在的碳源上的生长速率在酸性pH和/或碱性pH受到显著抑制(NVR中在pH>8.0和pH<5.0的生长抑制)。见实施例2。在一个方面，将混合的有机废物流用能在pH5.0-8.0利用废物流中碳源的宿主细胞生物催化剂处理。
对混合的有机废物流的寡聚体酯组分的水解可与另外的分离、化学转化或通过宿主细胞在发酵期间分泌的酶的酶促转化同时进行。混合的有机废物流可通过用游离或固定化的水解酶处理该流在发酵之前用水解酶进行处理，或通过向发酵液分批、逐步或与营养给料(nutrientfeed)一起添加生物催化剂在发酵期间处理。或者，宿主细胞可在发酵期间将水解NVR中存在的寡聚体酯的酶分泌到发酵液中。
在近生理学pH(pH5-8)有活性的羧酸酯酶是已知的。本领域技术人员会知晓这类水解酶的pH最适度、底物特异性和活性可通过采用合理设计或定向进化技术的酶工程改变(Dalby,P.A.(2003).Optimizingenzymefunctionbydirectedevolution.CurrentOpinioninStructuralBiology,13,500-505)。在实施例1中，提供了几种能在pH5-8水解NVR和COP酸中的寡聚体酯的脂肪酶和酯酶。此外，在实施例1中提供了在pH3.5展现出对NVR和COP酸中的寡聚体酯的水解活性的酯酶例子，如来自米黑毛霉(E1)和米根霉(E12)的酯酶，和仅在pH>8展现活性的来自淀粉酶产色链霉菌(E8)的碱性酯酶。
在非常低pH(pH<3.5)有活性的羧酸酯酶未有很好记载。然而，发明人鉴定出几种能用于处理NVR和COP酸流以在pH<5水解寡聚体酯的水解酶，如来自黑曲霉NCIM1207(GenBankAn16g01880;SEQIDNO:6)、克氏担孢酵母属(Kurtzmanomyces)菌种I-11(GenBankBAB91331.1;SEQIDNO:5)、极度嗜热古核生物PyrobaculumcalidifontisVa1(GenBankBAC06606;SEQIDNO:8)的脂肪酶，以及Picrophilustorridus酯酶(GenBankAAT43726;SEQIDNO:7)。已显示黑曲霉NCIM1207产生高水平的胞外脂肪酶，其在pH2.5有活性(Mahadik等,2002.ProcessBiochemistry,38:715-721)。将来自黑曲霉的这种独特脂肪酶纯化并在浸没发酵下表征(Mhetras等,2009.BioresourceTechnology,100:1486-1490)。它是一种32.2kDa蛋白，具有8.5的pI，50℃的最适温度和在2.5的最适pH。在更低的pH(如pH1.5)，活性降低。
克氏担孢酵母属菌种I-11菌株是甘露糖赤藓糖醇脂质的高水平生产者，当细胞在含有大豆油作为唯一碳源的培养基中生长时产生该脂质。在培养的起始阶段，培养液的pH降至3.2且大豆油在该pH快速水解成脂肪酸和甘油，表明在培养液中产生该嗜酸性脂肪酶。克氏担孢酵母属菌种I-11菌株脂肪酶与南极假丝酵母A脂肪酶显示高序列同一性，后者已由发明人显示为以高活性水解NVR和COP酸中的寡聚体酯(实施例1中的L5)。纯化并表征由酵母克氏担孢酵母属菌种I-11产生的胞外脂肪酶(Kakugawa等,2002.BioscienceBiotechnologyBiochemistry,66(5):978-985)。它是一种49kda蛋白，具有在75℃的最适温度，但活性在低于70℃的温度稳定。该酸性脂肪酶具有在酸性区(pH1.9-7.2)的活性pH范围，且活性在存在浓度为40%的各种有机溶剂的情况下稳定。
已报告极端嗜热古核生物PyrobaculumcalidifontisVa1产生高度活性的热稳定性羧酸酯酶。发现该酯酶为已报告的最热稳定和最嗜热性的脂肪分解酶之一。它是一种34.3kDa蛋白，显示90℃的最适温度，最适pH在7。该酯酶在与浓度为80%的各种水混杂性有机溶剂温育后是稳定的且在存在有机溶剂的情况下展现活性(Hotta等,2002.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,68(8):3925-3931)。Picrophilustorridus代表了研究负责在极端严苛条件下(在pH0.7和60℃最适生长)繁盛能力的遗传和分子机制的一种独特的模式生物，和极度稳定的酯酶和脂肪酶的有前景的来源。鉴定并表征P.torridus的编码酯酶的两种基因。其中一种酯酶(EstB)显示在存在各种有机溶剂的情况下水解脂肪酸酯的高能力。EstB是≈27kDa酯酶，其具有在70℃测量到的最佳活性(Hess等,(2008).Extremophiles,12:351-364)。
角质酶与脂肪酶的区别在于它们不需要界面活化，因为它们的催化位点没有盖覆盖且因此仍然是溶液中底物可达的(Martinez等,1992)。如此，角质酶不管是否存在界面均为活性的，且由此能水解可溶性和不可溶性底物。米曲霉(Aspergillusoryzye)分泌能水解含C6羧酸的寡聚体的角质酶(AoC)，且其在pH>11稳定并具有活性(Maeda,H.等,(2005).Purificationandcharacterisationofabiodegradableplastic-degradingenzymefromAspergillusoryzae.AppliedandEnvironmentalBiotechnology,67:778-788)。
其他由于其广泛底物特异性以及在广泛pH范围内的活性和稳定性可用于水解NVR和COP酸中的寡聚体酯的角质酶包括来自甘蓝链格孢菌(Alternariabrassicicola)(AbC)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(AfC)、特异腐质霉(Humicolainsolens)(HiC)和茄镰孢(Fusariumsolani)(FsC)的角质酶。已发现来自植物病原体茄镰孢豌豆专化型(F.solanisp.pisi)的角质酶(Egmond等2000)降解广泛范围内的底物，包括角质、羧基酯、三酰甘油(TAG)和磷脂(15)(具有短链和长链脂肪酸)。该酶在可溶性底物如短链p-硝基苯基酯上也具有活性。茄镰孢角质酶在广泛pH范围(2-12)内操作，在pH8.5具有最适活性且显示为在40-60℃为中度嗜热的(Peterson等,2001)。此外，显示野生型茄镰孢豌豆专化型能降解聚己内酯并将其用作碳源和能量源。角质酶活性受到培养基中存在的葡萄糖(0.5%w/w)的抑制，而且由聚己内酯降解的酶促产物诱导(Murphy等,1996)。对类似于茄镰孢角质酶1的蛋白质的BLAST搜索指示有两种主要的分泌角质酶的生物组。它们是真菌植物病原体或分枝杆菌(Mycobacteria)。在真菌角质酶中，HiC由于其高热稳定性展现出在升高温度和在所有pH值下对聚己内酯降解的最高活性。AoC、AfC和HiC在更极端的温度和pH条件下保留大量的水解活性。相比之下，AbC和FsC是最不热稳定的且在高温和低pH值保留极小活性。
本部分中描述的酶可在本文中所述的任一方法中使用或可包含在本文中所述的任一种组合物中。
增加混合的有机废物流中二酸的相对量的方法
本发明提供用于改进混合的有机废物流的特性和组成的其他手段，其通过将一元酸和羟基酸组分转化成二酸。这些废物流的主要组分由C4-C6一元酸、羟基酸和二酸的混合物组成。然而，具有许多应用的二酸不能与废物流中的一元酸和羟基酸组分容易地分开，由此限制了废物流对于进一步的化学或生物学加工(除了其他潜在应用以外)的有用性和产率。
所述方法采用生物催化剂以将NVR中的直链C4、C5和C6一元酸和羟基酸组分以及环C6组分酶促转化成C4、C5和C6二元酸的混合物。所得二酸混合物本身即可使用(即无另外修饰或加工地)。或者，可将二酸混合物分成C4、C5和C6二酸，或酯化然后分开为C4、C5和C6二酸，或者可从二酸混合物结晶出己二酸。生物催化剂可用于增加含有大量寡聚体酯的NVR和COP酸的单体组分，所述寡聚体酯有效捕获单体使之不能用于其它应用，例如燃烧价值和/或转化成己二酸或双官能烷。
一元酸和羟基酸到二酸的酶促转化增加废物流中二酸的相对量，其增加从其他废物流组分分开的二酸的回收。具体地，这些方法能增加混合的有机废物流中二酸的相对量，其通过将至少一部分寡聚体酯水解成单体，将至少一部分内酯水解成羟基酸，将混合的有机废物流中存在的至少一部分直链C4、C5和C6一元酸、羟基酸和含氧酸氧化成相应的二酸。优选地，将水解酶用于将NVR和COP酸废物流中存在的寡聚体酯水解成单体。多种其他生物催化剂可用在NVR和COP酸以及水洗废物流中以将内酯水解成羟基酸和/或将直链C4、C5和C6一元酸、羟基酸和含氧酸氧化成二酸。
能够将寡聚体酯水解成单体的水解酶可以是分离或固定化的酶。或者，所述水解酶可以是由天然存在的或非天然存在的宿主细胞在发酵和生物转化期间分泌的内源性或异源性水解酶。
优选地，将一元酸和羟基酸酶促转化成二酸的生物催化剂是天然存在或非天然的宿主细胞。例如，解脂西洋蓍霉是天然存在的宿主细胞，其能够将NVR中的碳源用于生长。另外，天然存在或非天然存在的宿主细胞生物催化剂可用于废物流组分到二酸的酶促转化，因为转化牵涉细胞色素p450酶，该酶是跨膜整合蛋白，如此需要包含p450酶途径的宿主细胞。
1.增加来自6-氧己酸的己二酸的相对浓度
6-氧己酸可进一步转化成在尼龙合成中有用的各种化合物。例如，6-氧己酸可转化成己烷-1,6-双酸(己二酸)。另外，己二酸或6-氧己酸可转化成6-氨基己酸、己内酰胺、6-氨基己醛或己烷-1,6-二胺(六亚甲基二胺)。本发明还提供用于生成这些化合物的方法。
i)水解寡聚体酯和内酯以释放直链C6组分
在一个方面，从混合的有机废物流产生6-氧己酸牵涉水解废物流如NVR和/或水洗物中存在的聚合性和寡聚体酯。这些二聚体、三聚体、四聚体或寡聚体酯由在从聚合体和寡聚体释放后可转化成6-羟基己酸、己酸和可能的1,6-己二酸的直链C6分子构成。如此，本发明提供从环己烷氧化的混合的有机废物流产生6-羟基己酸的方法，包括使用来自α,β-水解酶折叠家族的生物催化剂如羧酸酯酶，包括酯酶/脂肪酶和聚羟基链烷酸酯(PHA)解聚酶。
在从包含直链C6分子的聚合酯产生6-氧己酸中的一个步骤是将6-羟基己酸转化成6-氧己酸。在本发明的一个方面，生物催化剂如脂肪醇氧化酶或醇脱氢酶用于将6-羟基己酸酶促转化成6-氧己酸。
在从包含直链C6分子的聚合酯产生6-氧己酸中的另一个步骤是己酸到6-羟基己酸的转化。在本发明的一个方面，生物催化剂如ω-羟化酶用于将己酸酶促转化成6-羟基己酸。
可将这些酶促转化组合成单个方法，而非两个分开的步骤。在这一方面，使用酶如羧酸酯酶、ω-羟化酶和脂肪醇氧化酶或醇脱氢酶的组合从混合的有机废物流产生6-氧己酸。
ii)将直链C6组分转化成6-氧己酸
在从己酸产生6-氧己酸中的一个步骤是将己酸(己酸)转化成6-羟基己酸(羟基己酸)。如此，在一个方面，本发明提供从混合的有机废物流中存在的组分产生6-羟基己酸的方法，其使用酶如细胞色素P450或来自EC1.14.15.3类的ω-羟化酶或ω-加氧酶。尽管特定酶对于具体转化的用途是已知的(例如Coon,Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2005,338:378-385)，但发明人令人惊讶地发现这些酶可用于酶促转化混合的有机废物流的组分。
另外，6-氧己酸可从己酸间接产生或经由6-羟基己酸到6-氧己酸的转化从6-羟基己酸直接产生。在一个方面，本发明提供从混合的有机废物流中存在的组分即己酸或6-羟基己酸产生6-氧己酸的方法，其使用酶如来自EC1.1.1.-类的脂肪醇氧化酶或醇脱氢酶(Eurich等,Applied&EnvironmentalMicrobiology,2004,70(8):4872–4879)。
可将这些酶步骤组合成单个方法。如此，在一个方面，本发明提供从环己烷氧化的混合的有机废物流如NVR和/或水洗物产生6-氧己酸的方法，包括使用酶的组合，如(i)细胞色素P450或ω-羟化酶，和(ii)脂肪醇氧化酶或醇脱氢酶。
ii)将环C6组分转化成6-氧己酸
在从环己醇产生6-氧己酸中的一个步骤是环己醇到环己酮的转化。如此，在一个方面，本发明提供从环己烷氧化的混合的有机废物流的组分产生环己酮的方法，其包括使用酶如来自EC1.1.1.-类的醇脱氢酶或环己醇脱氢酶/ChnA，例如EC1.1.1.90，1.1.1.245等(Donoghue&Trudgill,EurJBochem.,1975,60:1-7)。
在将环己醇转化成环己酮后，6-氧己酸产生中的后续步骤是将环己酮转化成ε-己内酯。如此，在一个方面，本发明提供从混合的有机废物流的组分产生ε-己内酯的方法，其包括使用酶如Baeyer-Villiger单加氧酶、环己酮单加氧酶/ChnB，例如1.14.13.22等(Kim等,Biotechnol.BioprocessEng.,2008,13:40-47)。
在从环己醇产生6-氧己酸中的又一个步骤是ε-己内酯到6-羟基己酸的后续转化。如此，在一个方面，本发明提供从混合的有机废物流的组分产生6-羟基己酸的方法，其包括使用酶如己内酯内酯水解酶、来自EC3.1.1.17类的葡糖酸内酯酶/ChnC等(Cheng等,JournalofBacteriology,2000,182(17):4744–4751)。
在ε-己内酯转化成6-羟基己酸后，从环己醇产生6-氧己酸中的另一个步骤是6-羟基己酸到6-氧己酸的转化。如此，在一个方面，本发明提供从混合的有机废物流的组分产生6-氧己酸的方法，其包括使用酶如脂肪醇氧化酶或醇脱氢酶或ChnD。例如，醇脱氢酶可选自EC1.1.1.2类，如1.1.1.258等(Cheng等,JournalofBacteriology,2000,182(17):4744–4751)。
可将这些酶步骤组合成单个方法。如此，在一个方面，本发明提供从混合的有机废物流中存在的环己醇和环己酮分子产生ε-己内酯的方法，包括使用醇脱氢酶和Baeyer-Villiger单加氧酶。在另一个方面，本发明提供从混合的有机废物流产生6-羟基己酸的方法，包括使用酶如醇脱氢酶、Baeyer-Villiger单加氧酶和己内酯内酯水解酶的组合。在又一个方面，本发明提供从混合的有机废物流产生6-氧己酸的方法，包括使用醇脱氢酶、Baeyer-Villiger单加氧酶、己内酯内酯水解酶和脂肪醇氧化酶或醇脱氢酶。在一个别的方面，本发明提供从存在于环己烷氧化的不挥发性残余物和/或水洗物中的1,2-环己二醇和环己烷-1,2-二酮产生6-羟基己酸的方法，包括使用环己烷-1,2-二醇脱氢酶和环己烷-1,2-二酮酰基水解酶。
iv)6-氧己酸到尼龙中间物的转化
如本文中论述的，6-氧己酸可通过醛脱氢酶的作用酶促转化成己烷-1,6-双酸(己二酸)。如此，在一个方面，本发明提供产生己烷-1,6-双酸(己二酸)的方法，包括使用如上文所列生物催化剂产生6-氧己酸，且还包括6-氧己酸到己烷-1,6-双酸的酶促转化，其使用生物催化剂如醛脱氢酶，例如来自EC1.2.1.4和EC1.2.1.63等的。生物催化剂可以是分离的酶或者表达并分泌该酶的天然存在或非天然存在的宿主细胞。
如本文中论述的，6-氧己酸可通过氨基转移酶的作用转化成6-氨基己酸。如此，在一个方面，本发明提供产生6-氨基己酸的方法，包括使用如上文所列生物催化剂产生6-氧己酸，且还包括6-氧己酸到6-氨基己酸的酶促转化，其使用生物催化剂如转氨酶(EC2.6.1.-)或脱氢酶，如EC1.4.1.-等。生物催化剂可以是分离的酶或者表达并分泌该酶的天然存在或非天然存在的宿主细胞。
如本文中论述的，6-氨基己酸可通过氨基水解酶的作用转化成己内酰胺。如此，在一个方面，本发明提供产生己内酰胺的方法，包括使用如上文所列生物催化剂产生6-氨基己酸，且还包括6-氨基己酸到己内酰胺的酶促转化，其使用生物催化剂如氨基水解酶，例如EC3.5.2.-等。生物催化剂可以是分离的酶或者表达并分泌该酶的天然存在或非天然存在的宿主细胞。
如本文中论述的，6-氨基己酸可通过醛脱氢酶的作用转化成6-氨基己醛。如此，在一个方面，本发明提供产生6-氨基己醛的方法，包括使用如上文所列生物催化剂产生6-氨基己酸，且还包括6-氨基己酸到6-氨基己醛的酶促转化，其使用生物催化剂如醛脱氢酶。在另一个方面，6-氨基己酸经过多个酶步骤转化成6-氨基己醛，例如通过形成6-乙酰氨基己酸酯(相应的乙酰-CoA或磷酸酯)作为中间物。生物催化剂可以是分离的酶或者表达并分泌该酶的天然存在或非天然存在的宿主细胞。
如本文中论述的，6-氨基己醛可通过氨基转移酶或胺氧化酶的作用转化成六亚甲基二胺。如此，在一个方面，本发明提供产生六亚甲基二胺的方法，包括对混合的有机废物流应用如上文所列生物催化剂以产生6-氨基己醛，且还包括6-氨基己醛到六亚甲基二胺的酶促转化，其使用生物催化剂如氨基转移酶或胺氧化酶。生物催化剂可以是分离的酶或者表达并分泌该酶的天然存在或非天然存在的宿主细胞。
增加混合的有机废物流中己二酸的相对量的方法
本发明提供用于改进混合的有机废物流的特性和组成的其他手段，其通过使用生物催化剂来降低混合的有机废物流如NVR的复杂性，和增加所述流中己二酸的相对浓度，这有助于从废物流回收己二酸。具体地，所述方法增加混合的有机废物流中己二酸的相对浓度，并降低所述流中一元酸和羟基酸的量。作为低聚反应和/或与二酸一元酸和羟基酸不可分地混合的结果，约10%的己二酸在混合的有机废物流中失去。然而，发明人已发现对有机废物流应用至少一种生物催化剂能改进己二酸的回收。
具体地，生物催化剂能将至少一部分寡聚体酯水解成单体，将至少一部分e-己内酯水解成ε-羟基-己酸，将至少一部分己酸、6-羟基己酸和6-氧己酸氧化成己二酸，和/或将废物流至少一部分的环C6组分转化成己二酸。
能够将寡聚体酯水解成单体的水解酶可以是分离或固定化的酶。或者，所述水解酶可以是由天然存在的或非天然存在的宿主细胞在发酵和生物转化期间分泌的内源性或异源性水解酶。
这些方法能降低NVR的复杂性，并增加NVR废物流中己二酸的相对浓度(其有助于从NVR回收己二酸)，其通过将己酸、羟基-己酸和环C6化合物(例如K和A)转化成己二酸。将NVR的不那么想要的组分例如C3-C5用于生长的生物催化剂可进一步降低废物流的复杂性。例如，优选的方法包括将废物流中存在的寡聚体酯水解成单体；将一元酸和羟基酸转化成二酸；从混合物除去C4和C5组分；分解代谢混合的有机废物流中存在的至少一部分C3、C4和C5组分；和/或以低于C3、C4和C5组分的速率分解代谢混合的有机废物流中的C6组分。除了NVR外，生物催化剂还可应用于COP酸和水洗废物流以实施多种酶转化，例如将内酯水解成羟基酸和/或将直链C4-C6一元酸和羟基酸氧化成二酸。
在一个方面，这些方法可用于富集发酵期间混合的有机废物流中己二酸的相对浓度。然后，可从发酵罐移出经处理的混合物并返回结晶过程，其中作为发酵期间充分富集的结果，己二酸将从混合物结晶出来。使用这类方法，可将现有的用于环烷氧化的设备修改为允许用生物催化剂对废物流进行富集己二酸的处理。不需要为这类富集建立完全新的设备，这节省了大量时间和金钱。
优选地，用于增加己二酸的相对浓度并降低一元酸和羟基酸的量的方法使用非天然存在的宿主细胞作为生物催化剂进行，因为这些方法需要认为不天然共存于宿主细胞的两个酶促途径。在一个方面，生物催化剂中存在的β-氧化途径可能受损因而己二酸未降解。例如，宿主细胞可以是POX基因敲除即失活的解脂西洋蓍霉，从而使得宿主细胞β-氧化途径受损，这导致己二酸的累积。
将混合的有机废物流的C6组分和前体转化成α,ω-双官能C6烷的方法
本发明提供用于改进混合的有机废物流的特性和组成的其他手段，其通过使用生物催化剂来将废物流中存在的C6组分和前体转化成α,ω-双官能C6烷。
6-羟基己酸到1,6-己二醇、己二酸到6-氧己酸和6-氧己酸到6-氨基己酸的酶促转化由一系列不同酶介导(见图2)。具体地，6-氧己酸由氨基转移酶EC2.6.1.19转化成6-氨基己酸(关于β-丙氨酸的酶研究披露于(Hayaishi等1961J.Biol.Chem.236,p.781-790)，以及氨基转移酶披露于WO2009/113855&WO2011/031147，通过提述完整并入本文中)，其显示使用这类酶分别从5-甲酰基制备6-氨基己酸和从α-酮酸制备包含胺基团的化合物。类似地，可使用这些氨基转移酶将6-氨基己醛转化成六亚甲基二胺。6-氧己酸可通过羧酸还原酶EC1.2.99.6或醛脱氢酶EC1.2.1.3或EC1.2.1.31转化成己二酸。6-氨基己酸相应地可转化成六亚甲基二胺或己内酰胺。在一个方面，可使用这些羧酸还原酶或醛脱氢将6-氨基己酸转化成6-氨基己醛。在另一个方面，6-氧己酸可转化成1,6-己二醇，其经由通过6-羟基己酸脱氢酶EC1.1.1.258到6-羟基己酸的转化，6-羟基己酸可随后通过醇/醛脱氢酶EC1.2.1.10转化成1,6-己二醇。另外，6-氨基己酸可通过氨基水解酶(EC3.5.2.-)如EC3.5.2.11转化成己内酰胺。
在一个方面，将混合的有机废物流用有以下能力的非天然存在的宿主细胞处理：能够将至少一部分寡聚体酯水解成单体；将至少一部分己酸氧化成6-羟基己酸；将至少一部分环C6组分转化成6-羟基己酸或6-氧己酸；分解代谢混合的有机废物流中存在的至少一部分C3、C4和C5组分；和/或以低于C3、C4和C5组分的速率分解代谢混合的有机废物流中的C6组分。
能够将寡聚体酯水解成单体的水解酶可以是分离或固定化的酶。或者，所述水解酶可以是由天然存在的或非天然存在的宿主细胞在发酵和生物转化期间分泌的内源性或异源性水解酶。
另外，所述宿主细胞能够表达至少一种生物合成途径酶以将己二酸、6-羟基己酸或6-氧己酸转化成1,6-己二醇、6-氨基己酸、ε-己内酰胺、或六亚甲基二胺。
在另一个方面，本发明提供用于使用微生物作为宿主细胞生物催化剂来生物合成NVR组分到双官能烷的酶促转化的方法。先前已显示微生物对于从混合的有机废物流以外的来源生物产生己二酸和双官能烷的用途。参见WO2009/151728和WO2010/068944，通过提述完整并入本文。本发明提供应用非天然存在的宿主细胞，例如经过修饰以含有将NVR的环C6组分转化成6-羟基己酸或6-氧己酸所需的异源酶。
在另一个方面，所述非天然存在的宿主细胞还经过修饰以产生1,6-己二醇。任选地，这类产生1,6-己二醇的宿主细胞还可表达牵涉1,6-己二醇产生的特定酶。优选地，所述宿主细胞表达醛脱氢酶，其催化6-氧己酸到6-羟基己酸的转化，和醇脱氢酶，其催化6-羟基己酸到1,6-己二醇的转化。
在再一个方面，所述非天然存在的宿主细胞还经过遗传修饰以产生6-氨基己酸。任选地，这类产生6-氨基己酸的宿主细胞还可表达牵涉6-氨基己酸产生的特定酶。优选地，所述宿主细胞表达能将6-氧己酸转化成6-氨基己酸的氨基转移酶。在一个方面，所述表达氨基转移酶的宿主细胞还经过遗传修饰以表达能将6-氨基己酸转化成ε-己内酰胺的氨基水解酶。在另一个方面，所述表达氨基转移酶的宿主细胞还经过遗传修饰以产生六亚甲基二胺，其经由能将6-氨基己酸转化成6-氨基己醛的醛脱氢酶和能将6-氨基己醛转化成六亚甲基二胺的1-氨基转移酶。
C3、C-4和C-5种类的转化和/或降解
任选地，存在于来自环己烷氧化的NVR或水洗物中的C-4和C-5一元酸(丁酸和戊酸)和/或羟基酸(4-羟基丁酸和5-羟基戊酸)经由同一途径转化，所述途径由针对己酸和羟基己酸描述的ω-羟化酶、醇脱氢酶和醛脱氢酶组成。丁酸和戊酸转化成相应的二酸，即琥珀酸和戊二酸。此转化将来自环己烷氧化的NVR或水洗物中化学物种类混合物的复杂性降低为主要由C6、C5和C4二酸组成的混合物。通过减少混合物中化学物种类的数目，所得二酸混合物更容易地从发酵液回收以用于二酸的商业性应用，或任选地通过已知方法酯化成相应的二元酯(其作为二元酯混合物具有商业用途)，或任选地通过已知方法分开为C6、C5和C4二元酯。来自环己烷氧化的NVR或水洗物中存在的一些或所有C4和C5种类如丁酸、戊酸、琥珀酸、戊二酸、4-羟基丁酸和5-羟基戊酸经由β-氧化分解代谢成乙酰-CoA经由TCA循环，由此降低化学物种类的复杂性并促进己二酸、氨基己酸、己内酰胺或六亚甲基二胺的更容易的回收，并充当用于生物质生产的碳源且如此降低生物质产生所需的可发酵碳源的量。如此，本发明提供一种降低C-4和C-5种类浓度的方法，其通过分解代谢来自环己烷氧化的NVR或水洗物中的至少一部分C-4和C-5碳种类。可实施对宿主的遗传工程化以使得经由β-氧化或经由TCA循环分解代谢的己酸和/或己二酸的损失最小化。
为了减少己酸或己二酸经由宿主生物的β-氧化途径的降解并如此改进可从发酵液回收的可用产物的量，可敲除或突变编码作用于这些底物或其CoA酯的酶的基因以降低其活性或改变由这些基因编码的酶的底物特异性。为了阻止或降低己酸或己二酸到其相应CoA酯的活化，破坏或突变编码作用于己二酸或己酸(如果存在于宿主菌株)的CoA连接酶或CoA转移酶的宿主菌株基因是可用的，所述CoA连接酶或CoA转移酶属于EC6.2.1.-类，如作用于具有5至16个碳的链长度的二羧酸的EC6.2.1.23等。或者，阻止活化的CoA酯进入β-氧化途径也是有利的，其通过破坏或突变宿主生物中存在的、编码作用于己酰-CoA或己二酰-CoA的酰基-CoA氧化酶或酰基-CoA脱氢酶(如EC1.3.3.6或EC1.3.99.-等)的基因。
非天然存在的酶
在一些实施方案中，用于实施本文所述方法中的转化的酶是非天然存在的，即编码该酶的DNA已从野生型序列突变以改进该酶的一种或多种特性。用于诱变基因和蛋白质工程的方法是本领域中公知的。或者/另外地，随机和/或组合诱变办法包括办法如DNA改组、STEP和易错PCR、分子进化和致突变菌株(mutatorstrain)可用于创建突变库。诱变变化的非限制性列表包括缺失、插入、取代、重排、点突变和抑制突变。
然后，应对诱变方法的产物筛选期望的活性。如此，在一些实施方案中，用于水解混合的有机废物流的寡聚体酯组分或其他酶促转化例如氧化的酶源自上文例如1(i)-(iv)部分中所描述的酶。如本文中使用的，术语“源自”意指该酶相比于野生型酶的氨基酸序列含有一个或多个氨基酸变化，其中一个或多个变化包括缺失、插入、取代、重排、点突变。技术人员会理解关于上文所述酶论述的EC分类系统是高度特异性的，且依赖于由酶催化的特定底物。因此，源自如所述酶之一的酶可归类在与野生型酶不同的EC分类中。
在一个方面，所述非天然存在的酶源自以下一种或多种：P450细胞色素氧化酶、来自EC1.14.15.3类的ω-羟化酶、ω-加氧酶或烷-1-单加氧酶；脂肪醇氧化酶；来自EC1.1.1类的醇脱氢酶；Baeyer-Villiger单加氧酶；己内酯内酯水解酶；脂肪醇氧化酶；醇脱氢酶；环己烷-1,2-二醇脱氢酶；环己烷-1,2-二酮酰基水解酶；来自α,β-水解酶折叠家族(EC3.1.1.-)的羧酸酯酶；或其组合。
在另一个方面，所述非天然存在的酶源自以下一种或多种：来自EC1.1.1.245类的环己醇脱氢酶/ChnA；来自EC1.14.13.22类的环己酮单加氧酶/ChnB；来自EC3.1.1.17类的葡糖酸内酯酶/ChnC；来自EC1.1.1.2类的ChnD；来自EC1.1.1.174类的环己烷-1,2-二醇脱氢酶；环己烷-1,2-二酮酰基水解酶EC3.7.1.10或EC3.7.1.11；脂肪酶(EC3.1.1.3)；酯酶(EC3.1.1.1)；角质酶(EC3.1.1.74)；聚羟基链烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76)；1,4-内酯酶(EC3.1.1.25)；葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)；漆酶(EC1.10.3.2)；或其组合。
用于本发明方法的酶可针对许多参数进行改进。(Dalby,P.A(2003).Optimisingenzymefunctionbydirectedevolution.CurrentOpinioninStructuralBiology,13,500-505)。所述酶可针对反应速率相对于野生型酶改进，从而使得该酶能够在限定时段内将更多底物转化为产物。这是有利的，因为它降低了实施本发明方法所花的时间。在一个备选方案中，所述酶可针对有机溶剂存在下酶的溶剂稳定性相对于野生型酶改进。这是有利的，因为在一些实施方案中，本发明方法可全部或部分地在二相系统或混合的溶剂系统(例如混合的水/环己醇和环己酮系统)中实施。在一个别的备选方案中，所述酶可针对在升高温度处的活性相对于野生型酶改进。这是有利的，因为它意味着所述方法可全部或部分地在提高反应速率的温度实施(但其会使野生型酶失活)。
在一个别的备选方案中，将酶工程化为降低产物抑制和/或底物抑制。这有利地允许反应中存在更高浓度的产物和/或底物。在一个别的备选方案中，可改变酶的底物反应性。这意指工程化的酶能与野生型酶所不能与之反应的底物反应。这类酶通常在能够进行期望反应的野生型酶未知或不合适的情况下采用。底物特异性还可通过工程化该酶从而使其能接受并与野生型酶所不能与之反应的底物反应来改变。在又一个别的备选方案中，将酶工程化为将其pH最适性偏移到更酸性或更碱性的pH。这意指该酶能在适合工艺需要的pH采用。
在一个别的备选方案中，将编码用于所要求保护的方法中的酶的基因进行密码子优化。如此，改变编码该酶的DNA序列从而使得每个氨基酸的密码子使用其要表达的宿主细胞中该氨基酸最普遍的tRNA。
在另一个备选方案中，可将多肽工程化为包含用于简单纯化的标签(例如His-标签、GST标签、Flag标签)。在另一个备选方案中，可将多肽工程化为包含定位序列以靶向多肽至特定的细胞位置，例如细胞器、胞外、细胞膜或周质。
可在单一的工程化的酶中组合多种这些备选方案，例如密码子优化、修饰为包含定位序列和/或纯化标签、和修饰为改变在温度处的活性、底物抑制等。
酶的组合
在本文中所述的任一种方法或组合物中，可存在多种类型的酶。例如，可使用本文中论述的酶类型的任意组合，例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12的组合。合适的酶包括但不限于：细胞色素P450或ω-羟化酶(ω-羟化酶)、脂肪酸氧化酶或伯醇脱氢酶、醛脱氢酶或ChnE、醇脱氢酶或ChnA、葡糖酸内酯酶或BaeyerVilliger单加氧酶、环己烷-1,2-二酮酰基水解酶、环己烷-1,2-二醇脱氢酶、羧酸酯酶或酯酶或脂肪酶或聚羟基链烷酸酯解聚酶、转氨酶或6-氨基己酸脱氢酶、氨基水解酶、醛脱氢酶、和二胺氧化酶或二胺转氨酶。
宿主细胞生物催化剂
本发明涉及使用生物催化剂以将在环烷氧化如环己烷氧化的混合的有机废物流例如不挥发性残余物或水洗废物流中发现的化合物酶促转化成可用于尼龙合成的化合物。
用于本发明方法的生物催化剂可以多种形式引入反应。在一个方面，每种酶以相同的形式。在另一个方面，以不同的形式提供酶。
表达可用于所要求保护方法中的一种或多种酶的宿主细胞生物催化剂可用作生物催化剂。使用的宿主细胞通常具有许多特性：它们可容易地进行遗传修饰，对本发明方法中使用的条件耐受，且生长至工业可用的细胞密度。任选地，全细胞可以是单细胞微生物，或可以是细胞系的细胞。全细胞可具有野生基因型。在此情况中，用于催化所要求保护方法中一个或多个步骤的酶是天然存在于全细胞的且在本发明方法中以具有工业用途的水平表达。在一个备选方案中，宿主生物已经过遗传修饰以在本发明方法中以具有工业用途的水平表达该酶。所述酶可源自其中表达该酶的细胞。在一个备选方案中，所述酶源自不同菌株或物种的细胞。
在一个方面，所述全细胞是原核生物的。在另一个备选中，其为真核生物的。通常使用单细胞微生物。
术语原核细胞包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。可与本发明方法一起使用的革兰氏阴性细菌的例子是大肠杆菌(Escherichiacoli)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、鞘脂单胞菌(sphingomonads)、假单胞菌(pseudomonads)、和属于以下属的其他细菌：沙门氏菌属(Salmonella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、莫拉氏菌属(Moraxella)、产碱杆菌属(Acaligenes)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)、不动杆菌属、红细菌属(Rhodobacter)、固氮弓菌属(Azoarcus)和红螺菌属(Rhodospirillum)。可与本发明方法一起使用的革兰氏阳性细菌的例子包括：链球菌(streptococci)、乳杆菌(lactobacilli)，和属于以下属的其他细菌：诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)和节杆菌属(Arthobacter)。
真核宿主细胞包括那些来自酵母和其他真菌的。可与本发明方法一起使用的真核宿主细胞的例子包括：解脂西洋蓍霉、假丝酵母属如热带假丝酵母(Candidatropicalis)、C.albicans、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、麦芽糖假丝酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides、属于红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、丝孢酵母菌(Trichosporon)和油脂酵母菌(Lipomyces)的酵母，和属于以下属的其他真菌：曲霉属(Aspergillus)、外瓶霉属(Exophiala)、毛霉属(Mucor)、木霉属(Trichoderma)、枝孢属(Cladosporium)、平革菌属(Phanerochaete)、Cladophialophora、拟青霉属(Paecilomyces)、Scedosporium和Ophiostoma。
宿主细胞生物催化剂天然地或经由遗传修饰含有另外的酶途径，其实施连同其他改进混合的有机废物流的特性和组成的所要求保护的酶促转化特别有用的酶促转化。例如，天然存在的宿主细胞生物催化剂可含有增加混合的有机废物流中己二酸的相对量所需的两个酶途径，所述增加通过将所述流中存在的至少一部分直链C4-C6一元酸、羟基酸和含氧酸氧化成其相应的二酸。这类过程需要宿主细胞细胞色素p450途径以及另外的任选酶。宿主细胞中另外的内源性或异源性酶途径的存在对于增加混合的有机废物流中二酸的相对量、增加己二酸的相对浓度和降低废物流中一元酸和羟基酸的量、和/或将废物流中存在的C6组分和前体转化成α,ω双官能烷特别有用。
在一个方面，所述进行C4-C6或环C6一元酸、羟基酸、或含氧酸到二酸的酶促转化(经由酮酸)的天然或非天然存在的宿主细胞具有内源性或异源性ω氧化途径，其能够进行以下一种或多种转化：
将丁酸、戊酸和/或己二酸转化成其相应的二酸(即分别为琥珀酸、戊二酸和/或己二酸)；
将丁酸、戊酸和/或己二酸转化成其相应的羟基酸(即分别为4-羟基丁酸、5-羟基戊酸和/或6-羟基己酸)；
将4-羟基丁酸、5-羟基戊酸和/或6-羟基己酸转化成其相应的含氧酸(即分别为4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸)；或
将4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸转化成相应的二酸(即分别为琥珀酸、戊二酸和/或己二酸)。
具有能够将脂肪族脂肪酸经由羟基酸和含氧酸转化成二酸的内源性或异源性ω-氧化途径的宿主细胞可以是利用n-烷的酵母或细菌。例示性的利用n-烷的酵母包括解脂西洋蓍霉、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、C.albicans、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、麦芽糖假丝酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides或其组合，或红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、丝孢酵母菌(Trichosporon)和油脂酵母菌(Lipomyces)的酵母或其组合。利用n-烷的例示性细菌包括荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)、铜绿假单胞菌(P.aeroginosa)、食油假单胞菌(P.oleoverans)、除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)、不动杆菌属菌种如A.venetianus、Oleiphilusmessinensis、粘节杆菌(Arthrobacterviscosus)、Cupriavidusmetallidurans、红球菌属菌种如紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)和红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、Sphingomonaspaucimobilis、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、Delftiaacidovorans、或Alcanivoraxdiesolei或其组合。
在另一个方面，所述将混合的有机废物流中存在的至少一部分环C6组分酶促转化成6-羟基己酸、6-氧己酸、或己二酸的天然或非天然存在的宿主细胞具有能够(i)将环己醇转化成6-氧己酸，(ii)将1,2-环己二醇转化成6-氧己酸，和/或(iii)将6-氧己酸转化成己二酸的内源性或异源性途径。
在将环己醇转化成6-氧己酸中，宿主细胞催化环己醇到环己酮的转化；环己酮到ε-己内酯的转化；ε-己内酯到6-羟基己酸的转化；和/或6-羟基己酸到6-氧己酸的转化。
在将1,2-环己二醇转化成6-氧己酸中，宿主细胞催化环己烷-1,2-二醇到环己烷-1,2-二酮的转化，或环己烷-1,2-二酮到6-氧己酸的转化。
宿主细胞生物催化剂的修饰
本发明方法中使用的生物催化剂可以是其中天然存在该酶的物种的未经修饰的宿主细胞。然而，可能需要遗传修饰宿主细胞以产生工程化细胞。如本文中使用的，工程化细胞意指已经过操作从而其基因组从野生型细胞的基因组变化的细胞。基因组的变化包括质粒的导入和缺失。在一个方面，所述遗传修饰是将核酸导入细胞基因组中。见图3。导入细胞的核酸可以包含来自另一物种或生物的核酸序列，例如不存在于全细胞野生型基因组中的DNA序列。在其他情况中，导入的DNA序列可以是全细胞基因组中的DNA序列的额外拷贝。在一些备选方案中，所述遗传修饰是从全细胞的基因组缺失DNA序列。在另一个方面，遗传修饰是细胞基因组的修饰。
在一个备选方案中，工程化的细胞是原核生物的。在另一个备选中，其为真核生物的。通常使用单细胞微生物。
术语原核细胞包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。适合用作本发明工程化细胞的革兰氏阴性细菌的例子是大肠杆菌(Escherichiacoli)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、鞘脂单胞菌(sphingomonads)、假单胞菌(pseudomonads)、和属于以下属的其他细菌：沙门氏菌属(Salmonella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、莫拉氏菌属(Moraxella)、产碱杆菌属(Acaligenes)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)、不动杆菌属、红细菌属(Rhodobacter)、固氮弓菌属(Azoarcus)和红螺菌属(Rhodospirillum)。适合用作本发明工程化细胞的革兰氏阳性细菌的例子包括：链球菌(streptococci)、乳杆菌(lactobacilli)，和属于以下属的其他细菌：诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)和节杆菌属(Arthobacter)。
真核工程化细胞通常为酵母和其他真菌。真核工程化细胞的非限制性例子包括：解脂西洋蓍霉、假丝酵母属如热带假丝酵母(Candidatropicalis)、C.albicans、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、麦芽糖假丝酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides、属于红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、丝孢酵母菌(Trichosporon)和油脂酵母菌(Lipomyces)的酵母，和属于以下属的其他真菌：曲霉属(Aspergillus)、外瓶霉属(Exophiala)、毛霉属(Mucor)、木霉属(Trichoderma)、枝孢属(Cladosporium)、平革菌属(Phanerochaete)、Cladophialophora、拟青霉属(Paecilomyces)、Scedosporium和Ophiostoma。在一个备选方案中，所述宿主细胞是解脂西洋蓍霉。
i)导入的核酸序列
导入细胞的核酸可包含许多元件的一种或多种。通常地，元件之一将是编码用在本发明方法中的酶的基因，所述酶例如细胞色素P450、ω-羟化酶(omega-羟化酶)、脂肪酸氧化酶、伯醇脱氢酶、酮还原酶、Baeyer-Villiger单加氧酶、己内酯羟化酶、二酮水解酶、酯酶/脂肪酶、醛脱氢酶、氨基转移酶、氨基水解酶或这些酶类型中任一种的工程化型。在一些备选方案中，所述核酸编码不是在本发明方法中起作用的酶的蛋白质，如伴侣蛋白或作为基因激活剂或阻遏物的蛋白质。
通常地，核酸将设计为使得多肽可操作地连接于启动子。如本文中使用的，术语“可操作连接”意指元件位于某位置从而使得其能够指导多核苷酸或多肽的表达。这可通过将启动子元件可操作连接至一种或多种在导入的核酸序列上表达的多肽，从而在将核酸导入细胞之前建立可操作连接来安排。为了确保启动子对一种或多种酶的可操作连接，启动子应置于酶的5’且启动子和酶之间的序列中不应存在符合阅读框的终止密码子。或者，核酸可设计为使得当其被导入时，核酸中的基因序列以某种方式置于宿主细胞的基因组中从而使其可操作连接于已存在于宿主细胞的基因组中的启动子，因此可从该启动子表达该酶。
ii)全细胞中多种酶的表达
在一些实施方案中，将全细胞的单一菌株用于表达超过一种用在本发明方法中的酶。在此情况中，多种酶可由相同的导入的核酸编码。在一个备选方案中，所述酶可编码在分开的导入的核酸片段上。所述酶可均从单个启动子表达(例如通过将酶以操纵子的形式安排)。在一个备选方案中，所述酶可从多个分开的启动子表达。在一些情况中，所述多个分开的启动子可由相同的化学物诱导(例如，多种酶中的每一种可从酵母GAL启动子表达，如此意味着每个基因可用半乳糖诱导)。其他合适的启动子是本领域中已知的。在一个备选方案中，编码用在本发明方法中的酶的每个基因在不同启动子的控制之下。如此，可经由使用不同的诱导化合物来分别引入不同的酶。在另一个备选方案中，使用一种折中的办法，其中许多酶在相同启动子的控制之下，而许多酶在不同启动子的控制之下。这一备选在全细胞中已生成大量酶途径，且期望协同其他途径成员来控制一种途径的每个成员但分开控制每个途径时特别有利。
iii)伴侣蛋白系统
当细胞已工程化为在非自然条件下(例如，当某物种天然的蛋白质以高于自然水平的水平表达或者在一个备选方案中，当来自不同物种的蛋白质在宿主细胞中表达时)表达蛋白质时，在一些情况下该蛋白将不会以活性形式表达。相反它会不正确地折叠并累积为非功能性“包含体”聚集物。在此情况下，用于表达该蛋白质的细胞可进行遗传修饰以进一步表达伴侣蛋白，其能够阻止该蛋白质的错误折叠，或者能够将其从聚集状态重折叠。
纳入这类伴侣蛋白是有利的，因为它增加每细胞的活性蛋白质的量，且因此增加本发明方法的总体效率。所表达的伴侣蛋白可以是宿主细胞的伴侣蛋白。在一个备选方案中，伴侣蛋白可来自与该蛋白质相同的物种/菌株。典型的用于表达的伴侣蛋白包括GroEL/GroES家族的成员和DnaJ/DnaK/GrpE家族的成员。原型大肠杆菌GroEL/GroES和DnaJ/DnaK/GrpE蛋白的同系物已在其他原核物种中鉴定出来，且真核同系物也是已知的(GroEL和GroES分别对应于真核蛋白Hsp60和Hsp10，而DnaJ、DnaK和Grp分别E对应于真核蛋白Hsp70、Hsp40和Hsp24)。这些蛋白质已在许多酵母物种(例如酿酒酵母)中鉴定出来。用于与用在本发明方法中的酶共表达的适宜伴侣蛋白的选择对于遵循本文中教导的技术人员来说将是明显的。
全细胞的代谢工程化
代谢工程化是优化全细胞中参数以增加细胞产生一种化合物能力的过程。任选地，本发明方法中使用的全细胞已经过工程化以优化二酸，或己二酸或6-氧己酸、1,6-hexanedoil、6-氨基己酸、己内酰胺和六亚甲基二胺的输出。
增加细胞产生一种化合物能力的代谢工程化主要经由两种途径进行。第一种是优化途径中从起始材料产生期望产物的酶。可以使用技术人员已知的技术(例如，二维电泳、使用同位素标记的前体、和核磁共振(NMR)光谱学)来测定途径中每种中间物的浓度，并因此确定哪个酶转化是限速步骤，即反应方案中的哪个步骤最慢。这可以通过观察中间物的积累来确定，中间物的积累指示作用于此中间物的酶在限制转化的总体速率。在此情况中，因而应增加该中间物反应的速率。
作为一个例子，在本发明的方法中，转化可以是从己酸产生己烷-1,6-双酸。该转化(如图2中显示的)需要使用3种酶：将己酸转化成6-羟基己酸的细胞色素P450，将6-羟基己酸转化成6-氧己酸的醇脱氢酶和将6-氧己酸转化成己烷-1,6-双酸的醛脱氢酶。
如果通过细胞色素P450从己酸产生6-羟基己酸的速率低于途径中后续转化进行(即通过醇脱氢酶和醛脱氢酶)的速率，那么应提高产生6-羟基己酸的速率。这可通过许多手段来进行。首先，可以增加细胞色素P450的表达水平。任选地，这可以通过将编码该酶的基因置于强启动子例如T7启动子(如果该酶在大肠杆菌中表达)或TEF启动子(如果该酶在酵母中表达)的控制之下来实现。
第二个选项是增加细胞中存在的编码该酶的基因的拷贝数，例如通过将该基因置于多拷贝质粒上，或通过将该基因的多个拷贝掺入宿主细胞的染色体中(这些拷贝可以掺入到染色体中的同一位置或染色体中的不同位置)。
第三，可对细胞色素P450酶进行诱变以将该酶进化为以更快的速率反应或将该酶进行密码子优化以提高其表达。此描述是完全例示性的，而且可实施相同的过程来优化用在本发明方法中的其他酶的表达，所述酶即ω-羟化酶(ω-羟化酶)、脂肪酸氧化酶、伯醇脱氢酶、酮还原酶、Baeyer-Villiger单加氧酶、己内酯羟化酶、二酮水解酶、酯酶/脂肪酶、醛脱氢酶、氨基转移酶、氨基水解酶或这些酶类型中任一种的工程化型。
己烷-1,6-双酸的产生还可通过失活或降低能使底物、任意中间物或产物转向到并非本发明目标的代谢途径中的任意酶的活性来增加。在上文论述的例示性途径中，己酸和己烷-1,6-双酸均可受酰基-CoA连接酶和/或CoA转移酶作用。一旦连接于CoA，该化合物即可补料到细胞的β-氧化(beta-氧化)途径中，从而导致该化合物的分解。如此，在一些实施方案中，用在本发明方法中的全细胞已经过工程化以缺失一种或多种能够将CoA连接至己酸、6-羟基己酸、6-氧己酸或己烷-1,6-双酸的酰基-CoA连接酶和/或CoA转移酶。
在一个备选方案中，酰基-CoA连接酶和/或CoA转移酶未缺失，而是经过工程化从而使其不再作用于底物、中间物或产物(即它不再接受直链C6分子作为底物)，但保留将CoA连接至其他分子(通常为C3-C5链)的任何能力。
在一个方面，通过降低宿主细胞中C6组分分解代谢的速率来实现C6组分的高产率。这类办法对于涉及以下的方法尤其有用：(i)增加混合的有机废物流中己二酸的相对浓度以及降低一元酸和羟基酸的量，和/或(ii)将混合的有机废物流中存在的C6组分和前体转化成α,ω-双官能烷。具体地，混合物中存在的宿主细胞生物催化剂对己酸、羟基己酸和己二酸的分解代谢可通过降低经由β-氧化到乙酰-CoA的降解来降低。
对混合的有机废物流中存在的C6化合物的宿主细胞分解代谢的速率的降低可通过缺失或抑制宿主细胞生物催化剂中将己酸、羟基己酸和己二酸活化成其相应CoA酯的酶来实现。例如，宿主细胞酶如CoA连接酶和转移酶的缺失或抑制可降低分解代谢这些化合物的速率。再举一个例子，宿主细胞酶如酰基-CoA氧化酶和酰基-CoA脱氢酶的缺失或抑制可降低己酸、羟基己酸和己二酸经由宿主细胞的β-氧化途径到其相应CoA酯的速率。
在一个方面，通过代谢工程化来优化NVR或COP酸中的种类进出细胞的运输以改进底物的摄取和产物的分泌。这通过表达另外的一元酸运输物，或通过将运输物工程化以改进一元酸的摄取速率来实现。或者，作用于一元酸上的第一酶如CytP450可展现在细胞表面上以将一元酸转化成以比一元酸更高的速率摄入细胞中的羟基酸。
通过生长全细胞生物催化剂将C3-C5分子用作碳源
在本发明方法中用作起始材料的环己烷氧化的混合的有机废物流包含氧化的烃分子的混合物。所要求保护的方法改进混合的有机废物流的特性和组成，其通过对所述流应用至少一种生物催化剂，其将废物流中存在的不想要组分酶促转化成更期望的产物，从而经处理的废物流可用在后续化学和/或酶促加工中以提供期望产物的高产率，以尽可能高的纯度。如上文描述的，环己烷氧化的所得产物包括原始C6分子的分解产物，包括戊酸、5-羟基戊酸、丁酸、4-羟基丁酸和丙酸，其见于NVR和/或水洗物中。为了改进NVR和/或水洗物的特性，将全细胞生物催化剂应用于废物流以利用起始材料中存在的不想要的化合物。
在一个方面，可通过减少废物流中C3-C6组分的存在来降低混合的有机废物流例如NVR的复杂性。一种实现降低的复杂性的方法是选择能利用混合的有机废物流的C3-C5组分作为用于生长的碳源的宿主细胞生物催化剂。这类混合的有机废物流的复杂性中的降低对于直接提高己二酸的相对浓度以及间接提高己二酸的相对浓度可能有用，其通过促进己二酸从己酸、羟基-己酸和环C6化合物例如K和A的回收。
戊酸、丁酸和丙酸可被细胞用作碳源，其通过将CoA(辅酶A)连接至该分子以及CoA-连接的分子到细胞beta氧化途径中的代谢。如此，在一些实施方案中，用在本发明方法中的全细胞生物催化剂包含酰基-CoA连接酶和/或CoA转移酶，其能将CoA连接至戊酸、丁酸和/或丙酸。另外，亦经常存在于环己烷氧化的不挥发性残余物和/或水洗物中的、用作本发明方法中的起始材料的5-羟基戊酸和4-羟基丁酸也可由全细胞代谢以进一步改进本发明方法的产物的纯度。5-羟基戊酸可通过醇脱氢酶氧化成5-氧戊酸，而4-氧戊酸可通过醛脱氢酶相应地氧化成戊烷-1,5-双酸(戊二酸)。通过合适的酰基-CoA连接酶和/或CoA转移酶将CoA连接至戊烷-1,5-双酸导致化合物经由细胞的beta氧化途径代谢。4-羟基丁酸可通过醇脱氢酶氧化成4-氧丁酸，其相应地可通过醛脱氢酶氧化成丁烷-1,4-双酸(琥珀酸)。琥珀酸是三羧酸循环(也称为柠檬酸循环或Krebs循环)中的中心组分。丙酸亦可分解代谢成丙酮酸和β-丙氨酸。
预处理混合的有机废物流以除去抑制性化合物
发明人已鉴定出作为主要抑制性化合物存在于混合的有机废物流中的戊内酯，并确认戊内酯负责阻止NVR耐受性宿主细胞的生长。基于鉴定出戊内酯为NVR的关键抑制性组分，废物流可进行适宜处理以从废物流除去戊内酯或减少废物流中存在的戊内酯量，从而允许在NVR存在下的适宜宿主细胞生长。
在一个方面，将混合的有机废物流用游离或固定化的水解抑制性化合物，或者有效从所述流除去抑制性化合物的酶预处理。这类抑制性化合物的除去减轻混合的有机废物流中对宿主细胞生长的抑制。
所述不挥发性残余物、COP酸或水洗流在水解聚合酯之前和/或在其用作底物之前可经历预处理以除去抑制性化合物。例如，存在于水洗物中的烃基氢过氧化物可通过用合适的生物催化剂处理来除去，所述生物催化剂如过氧化物酶/过氧化氢酶，例如KatA、KatG和EC1.11.1-类中的其他酶，包括烃基氢过氧化物还原酶(例如酵母中的Ahp1或细菌中的AhpC)、EC1.11.1.15和其他烃基氢过氧化物还原酶(例如EC1.8.1.-和EC1.6.99.3)，有或者无电子供体地，如AhpD或AhpF。羧酸酯酶(水解混合物中的聚合酯)和作用于烃基氢过氧化物的酶的组合可用作酶制备物，其在添加到生物反应器之前添加到所述流中，或通过将未经处理的流给料到含微生物培养物(能通过分泌脂肪酶/酯酶水解聚合酯并同时将有机氢过氧化物还原)的‘预发酵罐’中，接着将上清液给料到第二生物反应器中以用于产生有价值的化合物。
另外，可将混合的有机废物流用内酯水解酶或能从所述流除去抑制性内酯组分的其他酶(宿主细胞生物催化剂或从宿主细胞分离的酶)处理，由此改进使用所述流作为碳源的宿主细胞的生长。微生物在混合的有机废物流中的生长可能受到这类抑制性化合物存在的损害。具体地，在含NVR的培养物中生长的各种解脂西洋蓍霉的菌株不能达到稳定态，这是戊内酯累积的结果。见实施例4。然而，表达并分泌内酯水解酶(将戊内酯转化成羟基戊酸)的宿主细胞可在NVR中成功生长，因为已从培养基中除去了抑制性化合物。见实施例5。
选择对混合的有机废物流耐受的宿主细胞
或者，为了改进生物催化剂在含有混合的有机废物流的培养物中的生长，可选择对混合的有机废物流耐受，例如能在含NVR、COP酸或水洗废物流的培养物中生长的宿主细胞。
此外，可在包含按体积计特定百分比的经处理混合的有机废物流的培养物中生长耐受性宿主细胞。耐受性宿主细胞连同经预处理的混合的有机废物流(例如应用水解酶以除去内酯化合物如戊内酯)的使用可显著改进宿主细胞在含有废物流材料的培养基中的生长。
在一个方面，所述生物催化剂是天然存在或非天然存在的宿主细胞，其对混合的有机废物流如NVR耐受。优选地，宿主细胞对按体积计至少1%的混合的有机废物流耐受。例如，所述宿主细胞生物催化剂能在含至少1%NVR的培养物中实现稳定态生长。
在另一个方面，通过降低混合的有机废物流中存在的抑制性化合物的量来改进宿主细胞对混合的有机废物流的耐受性。如上文论述的，将废物流用酶的1,4-内酯酶类(EC3.1.1.25)预处理以将培养基中的戊内酯转化成羟基戊酸(calericacid)可促进在剩余废物流组分存在下的细胞生长。另外，酶的葡糖酸内酯酶类(EC3.1.1.17)也可用于将内酯转化成其相应的酸形式，羟基羧酸。见实施例5。
在一个方面，混合的有机废物流中存在的抑制性化合物是内酯，且混合的有机废物流中的内酯量通过在用天然存在或非天然宿主细胞处理混合的有机废物流之前或期间用一种或多种能将内酯水解成相应羟基酸的酶来处理所述流得到降低，所述宿主细胞能介导增加二酸的相对量、增加己二酸的相对浓度和降低一元酸和羟基酸的量、和/或将C6组分和前体转化成α,ω双官能烷所需要的转化。
产物的分离和回收
本发明还提供本文中所述单体组分(例如二酸、己二酸)的分离和/或回收。例如，本发明提供在将混合的有机废物流的6碳组分例如6-氧己酸转化成己二酸之后从反应混合物分离己二酸或己二酸衍生物的方法。这些分离的产物可通过除去能在初始步骤中除去的C4和C5二酸和/或衍生物来进一步纯化。
在一个方面，从其他组分分离己二酸，其通过将己二酸从浓缩的反应混合物结晶或通过酯化和蒸馏来自反应混合物的己二酸二酯。
如上文论述的，可使用生物催化剂来将直链C4-C6一元酸和羟基酸组分以及环C6组分转化成C4-C6二酸的混合物，所述混合物能随后分开为C4、C5和C6二酸。在一个方面，所述二酸混合物在分离成C4、C5和C6二酸之前酯化。
混合的有机废物流和生物催化剂的组合物
本发明还提供包含环己烷氧化工艺的混合的有机废物流和生物催化剂的组合物。在一个方面，所述混合的有机废物流是NVR、水洗物/COP酸、或苛性水流。
在一个方面，所述生物催化剂是分离的酶或由天然存在或非天然存在的宿主细胞分泌的酶。所述组合物可包含一种或多种选自前文部分中详述的酶的酶或其非天然存在的变体。
在一个方面，所述组合物包含对混合的有机废物流耐受的宿主细胞生物催化剂。换言之，生物催化剂能在含有混合的有机废物流的培养物中生长至工业可用的密度。优选地，所述宿主细胞对NVR耐受。在另一个方面，所述宿主细胞对按体积计至少1%的混合的有机废物流耐受。因此，所述宿主细胞能在含有按体积计1%的混合的有机废物流的培养物中生长至工业可用的密度。
Omega氧化(ω-氧化)是脂肪酸代谢的相对于beta氧化(β氧化)的备选途径。ω-氧化途径牵涉ω碳，即离脂肪酸羧基基团最远的碳的氧化，其不同于牵涉β碳的β氧化途径。ω-氧化过程正常为中等链脂肪酸即C10-12的次要分解代谢途径，但该途径在β-氧化有缺陷时变得更为重要。ω-氧化过程牵涉ω碳的羟基化和继续氧化，其得到己二酸和其他产物例如琥珀酸。
在一个方面，所述天然或非天然存在的宿主细胞生物催化剂包含内源性或异源性ω-氧化途径，其能将脂肪族脂肪酸经由羟基酸和含氧酸转化成二酸。优选地，所述具有ω-氧化途径的宿主细胞生物催化剂是利用n-烷的酵母或细菌。
熟练技术人员知晓适合用在所要求保护方法中的大量利用n-烷的酵母或细菌。在一个方面，例示性利用n-烷的酵母包括解脂西洋蓍霉、热带假丝酵母、白色假丝酵母、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、麦芽糖假丝酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides或其组合，红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和油脂酵母属(Lipomyces)的酵母或其组合。在另一个方面，例示性的利用n-烷的细菌包括荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌(P.putida)、铜绿假单胞菌(P.aeroginosa)、食油假单胞菌(P.oleoverans)、除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)、不动杆菌属菌种如A.venetianus、Oleiphilusmessinensis、粘节杆菌(Arthrobacterviscosus)、Cupriavidusmetallidurans、红球菌属菌种如紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)和红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、Sphingomonaspaucimobilis、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、Delftiaacidovorans、Alcanivoraxdiesolei或其组合。
发酵工艺
本发明的发酵工艺可以分批、补料分批或连续模式进行。在补料分批模式中，该工艺可用部分滴液(partialdrops)进行。或者，可以采用恒化器发酵，有或无细胞截留地。见实施例3。此外，可将废物流中的组分作为唯一碳源和能量源补料，或者可将甘油或糖或其他合适的可发酵碳源或能量源共补料用作另外的能量源和碳源以获得更高的生物质。可采用碳源限制性培养来降低NVR和COP酸中种类的毒性。在一个优选的实施方案中，培养在5-8的pH范围内，更优选在pH6至pH7.5进行以克服未解离的有机酸的生长抑制。
以下实施例不意图以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1–NVR、COP酸和水洗物中寡聚体酯的水解
筛选来自基于其结合位点表面状况的不同类别的商业性脂肪酶(游离和固定化的)和酯酶对NVR和COP酸中寡聚体酯的水解(表1和表2)。基于此筛选的结果，使用脂肪酶工程化数据库(LipaseEngineeringdatabase)(LED)(Widmann等,BMCGenomics2010,11:123)和其他生物信息学资源来鉴定另外的候选酶以筛选对寡聚体酯的水解，且尤其是在低pH热稳定或有活性的酶。本领域技术人员将理解还可以改变具有期望活性的酶的pH最适度和稳定性，或者改变具有期望pH和稳定性特性或两者的酶的底物特异性，其通过使用合理设计或定向进化技术的酶工程。
验证用商品化脂肪酶和酯酶水解NVR和COP酸中寡聚体酯的筛选方法，其使用具有一定分子量范围的商品化己内酯二醇(CPL)聚合物。使用琼脂板测定法和生物转化反应来鉴定候选的酶，其中在琼脂板测定法中如果琼脂中的寡聚体水解则径向酶扩散产生清空区(clearancezone)，而生物转化反应通过HPLC与UV检测或LC-MS测定以量化单体的浓度。两种筛选方法提供互补的信息：用板测定法观察到的清空区的大小指示将寡聚体水解成更小可溶酯的总体水解活性(内切和外切)，而液相层析提供关于单体浓度增加的数据，如此鉴定出水解寡聚体的末端单体的酶。
对于板测定法，用50mM柠檬酸盐、Tris/HCl或磷酸盐缓冲液制备含1-4%聚己内酯(PCL)、NVR或COP酸(v/v)的琼脂板(1.5%琼脂糖)以测定酶在pH3,5(3.5),5,7&8的水解活性。PCL的分子量是530g/mol。在板中制有约3mm直径的孔，并添加酶(1U/孔)。在24小时后测量清空区。见表1和2，其显示分别比较商业性脂肪酶和酯酶水解NVR、COP酸中寡聚体和己内酯聚合物的活性的结果。
使用与板测定法相同的缓冲液和底物浓度实施与未结合的商业性酯酶和脂肪酶的生物转化反应。反应通过添加商业性酶制备物(1U/ml)开始。在固定化脂肪酶的情况中，使用ChiralVisionImmozymeTM脂肪酶试剂盒(酶共价结合于聚丙烯酸珠)来水解NVR中的寡聚体酯。将固定化的酶(100mg)与1ml磷酸盐缓冲液pH7.0中2%NVR(v/v)温育。在16小时后，通过在100℃将酶失活10min停止生物转化反应，离心、过滤并通过HPLC或LC-LC-MS分析。见图4，其显示琼脂板上的典型清空区，和图5，其比较通过在不同pH的酯酶清空区直径测量的相对活性。
HPLC分析在ShimadzuHPLC2100系统上进行，DAD检测器在210nm处监测。分离在SynergiFusionRP柱(250mmx4.6mm)上以0.9ml/min的流速进行，并使用磷酸和乙腈洗脱样品。
LC-MS分析在与Agilent6530Accurate–MassQ-TOFLC/MS偶联的Agilent1290InfinityUHPLC系统上进行。
酸和内酯的LC条件：
柱：100x2mmSynergiFusionRP柱(Phenomenex)
柱烤箱温度：40℃
注射体积：2μL
洗脱液：A：含0.1%乙酸的5mM醋酸铵
B：含5%水的乙腈
梯度：
MSQ-TOF条件：离子源：ESI(ElectroSprayIonization)。极性模式：阴性(酸)和阳性(内酯)。
图6、7、8和9显示由于通过商业性脂肪酶和酯酶的作用NVR和COP酸中寡聚体酯的水解所导致的单体(己酸、羟基己酸、己二酸和总酸)浓度的增加，如通过LC和LC/MS测定的。如通过LC/MS测量的从NVR中寡聚体酯释放单体显示于图10。
表1.针对NVR和COP酸中寡聚体水解评估的商业性酯酶和脂肪酶
表2.针对NVR和COP酸中寡聚体水解评估的固定化的脂肪酶.
表3.通过测量含聚己内酯(PCL)聚合物(MW530g/mol)、NVR或COP酸的琼脂板上的清空区直径而测定的商业性酯酶的水解活性的比较
表4.通过测量含聚己内酯(PCL)聚合物(MW530g/mol)、NVR或COP酸的琼脂板上的清空区直径而测定的商业性脂肪酶的水解活性的比较.
板测定法的结果显示通过几种选定的酯酶和脂肪酶在pH5-8的pH范围内对存在于NVR和COP酸两者中的寡聚体酯的水解。来自米黑毛霉的酯酶展现出对NVR和COP酸寡聚体两者在较宽pH范围内在板上的高水解活性。来自荧光假单胞菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、解脂假丝酵母和米根霉的酯酶对于合成的聚己内酯二醇底物，以及NVR和COP中的寡聚体在pH5-8展现出极好的水解活性。另外，来自马肝的酯酶展现出对COP酸寡聚体的极好的水解。类似地，来自疏棉状嗜热霉和粘稠色杆菌的脂肪酶对于合成的、NVR和COP酸寡聚体在较宽pH范围内展现出高水解活性。另外，来自曼赫根毛霉、米黑毛霉、荧光假单胞菌、洋葱伯克霍尔德氏菌和黑曲霉的脂肪酶水解NVR和COP酸两者中的寡聚体，产生大清空区。见表3、4和图4。
生物转化测定法显示当用不同脂肪酶和酯酶处理NVR和COP酸中的寡聚体酯时，单体浓度中的显著增加。然而，由LC/MS测量的单体的最高释放表明选择水解酶组合以从COP酸和NVR寡聚体最大释放单体的重要性。见图6、7、8和9。来自马肝的酯酶(E9)展现出从NVR和COP酸两者的极好的单体释放，但在板测定上，清空区的相对大小指示仅中等水解活性。如此，这将是极好的酶选择，其与来自米黑毛霉(E1)或米根霉(E12)的酯酶组合以处理NVR或COP酸。来自洋葱伯克霍尔德氏菌(L2)和南极假丝酵母A(L5)的脂肪酶展现出来自COP酸中寡聚体酸的极好的单体酸释放。
总之，数种选定的游离脂肪酶和酯酶以较好的活性水解NVR和COP酸寡聚体，且大多数酶在较宽pH范围内(pH5-8)保持极好的活性。见图4A-C和图5。
来自南极假丝酵母A(IL4)、荧光假单胞菌(Il13)和米根霉(IL17)的固定化脂肪酶(表2，图10)展现出与游离脂肪酶(L5，L10)类似的对NVR中寡聚体酯的高外切水解活性。
通过定向进化获得并在解脂西洋蓍霉的脂肪酶缺陷性菌株中表达的脂肪酶变体对NVR和COP酸中寡聚体的水解显示，具有更高活性的改进的脂肪酶变体可通过定向进化获得，且将脂肪酶分泌到培养基中的细胞能有效水解寡聚体酯。
使用如上文描述的滴液板(dropplate)来评估对寡聚体酯的水解并在YNB培养基中过夜培养表达Lip2变体的酵母菌株(Bordes等,2011.IsolationofathermostablevariantofLip2lipasefromYarrowialipolyticabydirectedevolutionanddeeperinsightintothedenaturationmechanisms.JournalofBiotechnology,156:117-124)，稀释至OD6001.0并将5μl滴到琼脂糖板上。YNB琼脂糖板含有油酸(2%)、聚己内酯三元醇(2%)(Sigma200387)、50mM磷酸盐pH7.0，有或无葡萄糖(0.5%)。将板在28℃温育72h，并分析细胞周围的清空区。将具有主要胞外脂肪酶的宿主菌株和0.1U米黑毛霉酯酶用作对照。表达LIP2突变脂肪酶库的几种变体的菌株展现对寡聚体酯的显著水解，如由细胞周围的清空区测定的。见图11。
实施例2–选择能分解代谢NVR中主要C4和C5组分的宿主细胞
从NVR除去C4和C5一元酸(丁酸和戊酸)和羟基酸(通过将其转化成相应的二酸或通过经由β-氧化将其用于生长)对于从NVR产生C4-C6二酸混合物或己二酸是重要的。为了从NVR产生二酸混合物，期望从一元酸经由ω-氧化的二酸的积累和二酸相比于一元酸的低消耗速率。本实施例显示了对能分解代谢混合的有机废物流的主要C4和C5组分的宿主细胞微生物的选择。
将解脂西洋蓍霉菌株的混合培养物(总共72种菌株)用作恒化器培养的起始培养物以针对菌株有效利用丁酸和戊酸的能力进行选择。这通过在恒化器培养期间将一元酸作为唯一碳源给料完成。测定一元酸相比于相应二酸(琥珀酸和戊二酸)的消耗速率。
设置恒化器发酵，如图12中显示的，其具有1L带夹套的玻璃发酵罐。该实验设置提供含有NVR中普遍的C4和C5碳源的NutrientFeed和BaseFeed(12%(v/v)NH3(aq))，两者均经由蠕动泵(peristalticpump)无菌过滤到发酵罐中。此外，蠕动泵允许从发酵罐的生物质收获。
恒化器的控制体系需要经由泵的可变速度驱动对营养给料进行手动给料控制，经由BaseFeed进行pH控制，经由对发酵罐的夹套的降温水供应进行温度控制，经由相应反馈环的固定通气和搅拌速率，以及使用收获泵经由收获管深度进行水平控制。
制备初始最小电荷培养基(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基、16.5g/L葡萄糖H2O、1mL/L消泡剂)，并制备含C4和C5酸的NutrientFeed(A1：6.7g/L无氨基酸的酵母基；10g/L戊酸；0.4g/L琥珀酸；2.3g/L丁酸；0.8g/L戊二酸；和1mL/L消泡剂；A2：6.7g/L无氨基酸的酵母基；30g/L戊酸；1.2g/L琥珀酸；6.9g/L丁酸；2.3g/L戊二酸；和1mL/L消泡剂)。设置发酵罐的控制参数(A1和A2：1vvm通气，pH7.0，DO校正于pH7.0和1vvm至100%饱和，28℃、750rpm初始搅拌直至葡萄糖耗尽，葡萄糖耗尽后最大rpm终搅拌，手动消泡)。
将发酵罐用来自72种野生型解脂西洋蓍霉菌株混合物的10[%](v/v)接种物接种，其使用来自每个摇瓶的从冷冻贮存原料过夜生长的750μL。培养物以分批阶段在葡萄糖上生长直至达到稳定态。开始Nutrientfeed且稳定态在～0.1[h-1]的稀释速率在～20[%]饱和的溶解氧(DO)浓度达到(图13)。在达到在0.1[h-1]的该稳定态之前，引起pH扰动，如图14中显示的，并进行如图15中显示的pH偏移移动实验。在稀释速率的每次增加之前取样品以选出能有效利用有机酸的菌株。
结果：
从原始72种菌株已分离出～13种能有效利用作为唯一碳源的丁酸和戊酸的解脂西洋蓍霉菌株(基于菌落形态学的视觉评估)的混合培养物。
由于无竞争力的生长速率，不能有效分解代谢丁酸和戊酸的菌株被从恒化器发酵罐清洗掉。表5显示丁酸、戊酸、琥珀酸和戊二酸的即时消耗速率。
表5.
组分 消耗速率[μmol/((g DCW)·h)]
丁酸 162
戊酸 440
琥珀酸 7.3
戊二酸 -5.1
如图14中显示的，溶解氧(DO)浓度作为在固定氧转移速率处氧摄取的指示物，在pH从7.0增加至8.0时急剧从～35%饱和增加至～70%饱和。鉴于氧消耗是生长速率和由此在专性需氧菌如解脂西洋蓍霉中碳源消耗的指示物，使用NVR碳种类作为唯一碳源和能量源在pH>8.0培养不可行。
如图15中显示的，溶解氧(DO)浓度作为在固定氧转移速率处氧摄取的指示物，在pH从7.0降低至5.0时急剧从～20%饱和增加至90%饱和。鉴于氧消耗是生长速率和由此在专性需氧菌如解脂西洋蓍霉中碳源消耗的指示物，使用NVR碳种类作为唯一碳源和能量源在pH<5.0培养不可行。
尽管解脂西洋蓍霉具有2.0<pH<9.0的广泛生长pH范围(Gonzalez-Lopez,C.I.(2002),GeneticcontrolofextracellularproteasesynthesisintheyeastYarrowialipolytica.Genetics,160:417-427)，但在NVR中主要碳源上的生长速率在pH>8.0和pH<5.0受到显著抑制。
对C4和C5一元酸的消耗是极好的，而二酸利用的有效性则低得多且在培养液中积累。对培养液组分的HPLC量化清楚地指示，丁酸和戊酸的一部分被用于生长，而剩余的经由内源性ω-氧化途径氧化成二酸、琥珀酸和丁酸。见表5。因此，宿主细胞微生物如解脂西洋蓍霉可用于消耗混合的有机废物流的不那么想要的组分例如C4和C5一元酸。
实施例3–使用作为碳源和能量源对解脂西洋蓍霉的具有细胞截留的恒化器发酵
设置具有细胞截留的恒化器发酵，如图16中显示的，具有1L加套玻璃发酵罐和225[cm2]聚醚砜0.2[μm]中空纤维膜。实验设置提供经由蠕动泵过滤灭菌到发酵罐中的NVRFeed、NutrientFeed和BaseFeed(12[%](v/v)NH3(aq))。此外，一个蠕动泵为中空纤维膜提供必要的交叉流动滞留物流速，一个蠕动泵允许渗透物的退出，而一个蠕动泵允许生物质从发酵罐排出(bleed)。
恒化器的控制体系需要针对NVRFeed速率对NVRFeed进行手动给料率控制，经由BaseFeed进行pH控制，经由对发酵罐的夹套的降温水供应进行温度控制，经由相应的反馈环的固定的通气和搅拌速率，经由滞留泵的可变速度驱动的固定的交叉流速，经由渗透泵的手动水平控制，和经由排出泵的手动稀释速率控制。
制备初始最小电荷培养基(6.7g/L无氨基酸的酵母基+(NH4)2SO4，15g/L葡萄糖，75mg/L柠檬酸(Mr=210g/mol)，5.8g/L柠檬酸钠(Mr=294.1g/mol)，10.7g/LK2HPO4(Mr=174g/mol)，5.2g/LKH2PO4(M=136.1g/mol)和2mL/L消泡剂)，并制备NutrientFeed(6.7g/L无氨基酸的酵母基+(NH4)2SO4，75mg/L柠檬酸(Mr=210g/mol)，5.8g/L柠檬酸钠(Mr=294.1g/mol)，10.7g/LK2HPO4(Mr=174g/mol)，5.2g/LKH2PO4(M=136.1g/mol)和2mL/L消泡剂)。设置发酵罐的控制参数(A1和A2：1vvm通气，pH7.0，DO校正于pH7.0和1vvm至100%饱和，28℃、750rpm初始搅拌直至葡萄糖耗尽，葡萄糖耗尽后1250rpm终搅拌，手动消泡)。
将发酵罐用来自野生型解脂西洋蓍霉摇瓶的、从冷冻贮存原料过夜生长的10%(v/v)接种物接种。分批指数生长开始约8小时直至葡萄糖耗尽。
在葡萄糖耗尽后，在有效的2%(v/v)NVR给料以～215[mL/h]的NutrientFeed流速和～0.025[h-1]的有效生物质稀释速率达到稳定态，如图17中显示的。
在NVRFeed和渗透物样品中经由HPLC截留时间鉴定出的NVR碳种类是γ-丁内酯、丁酸、琥珀酸、δ-戊内酯、戊酸、5-羟基戊酸、戊二酸、己酸、6-羟基己酸和己二酸。
表6汇总了通过野生型解脂西洋蓍霉具有净分解代谢或生物合成的NVR种类。具体地，通过解脂西洋蓍霉对C4、C5和C6一元酸的分解代谢在具有细胞截留的稳定态恒化器培养期间观察到，其以～215[mL/h]的流速和～0.025[h-1]的有效生物质稀释速率使用2%(v/v)NVR。
表6.
NVR种类 合成(S)、分解代谢(C)&未代谢(NM) 通量[%戊酸摄取]
γ-丁内酯 NM 0
丁酸 C 7
琥珀酸 S 17
δ-戊内酯 NM 0
戊酸 C 100
5-羟基戊酸 S 32
戊二酸 S 12
己酸 C 42
6-羟基己酸 S 18
己二酸 C 18
从表6可看到，在稳定态实现琥珀酸和戊二酸的净合成，这显示一部分直链C4-C6种类被野生型解脂西洋蓍霉培养物氧化成相应的二羧酸。
还可从表6看到，5-羟基戊酸和6-羟基己酸的净合成显示到ω-氧化中的碳溢出，这指示饱和的β-氧化途径。因此，C4-C6NVR种类的分解代谢在野生型解脂西洋蓍霉培养物中减弱。
此外，表6显示一部分直链C4-C6一元羧酸被分解代谢；特别是丁酸、戊酸和己酸。因此，一部分C4-C6NVR种类被野生型解脂西洋蓍霉培养物分解代谢。
还可在表6中看到C6组分己酸和己二酸的分解代谢分别具有C5组分戊酸分解代谢的42%和18%的稳定态通量。丁酸在7%戊酸分解代谢的较低稳定态通量是给定NVRFeed中的低浓度对丁酸的碳源限制性条件的结果。因此，己酸和己二酸以低于戊酸的速率被野生型解脂西洋蓍霉培养物分解代谢。
最后，表6显示有己酸的净分解代谢和6-羟基己酸的净合成，其指示ω-氧化活性。因此，一部分己酸被野生型解脂西洋蓍霉培养物氧化成6-羟基己酸。
表7显示在具有细胞截留的稳定态恒化器培养期间己二酸和二羧酸在大量基础上的富集，该培养以～215[mL/h]的流速和～0.025[h-1]的有效生物质稀释速率使用2%(v/v)NVR。
表7.
从表7可看到在鉴定的NVR种类基础上二羧酸的稳定态培养液纯度相对于NVR中的二羧酸纯度增加。
在2%(v/v)的有效NVR给料浓度稳定态溶解氧(DO)浓度<100[%]饱和显示对于>1%(v/v)的有效NVR给料浓度培养物存活性的维持。见图17。在～0.025[h-1]的有效生物质稀释速率稳定态溶解氧(DO)浓度<100[%]显示在>1%(v/v)的有效NVR给料浓度中的可测量的生长速率。
本实施例显示在NVR中培养的野生型解脂西洋蓍霉能将直链C4-C6种类氧化成相应的二羧酸，并减弱C4-C6NVR种类的分解代谢。此外，野生型解脂西洋蓍霉培养物能选择性地分解代谢NVR组分，因为己酸和己二酸以低于戊酸的速率被分解代谢。另外，己酸的分解代谢导致可用的中间物例如6-羟基己酸的产生。
实施例4–鉴定戊内酯为NVR中的抑制性化合物
针对其消耗丁酸和戊酸的能力，选定13种解脂西洋蓍霉菌株。将菌株在恒化器中在作为唯一能量源和碳源的2.5%(v/v)NVR上在不同条件下(包括C源限制性和pH恒化)培养。在每一情况中，培养物均不能到达稳定态且被清洗掉。评估所有已知存在于NVR中的组分(包括重金属)，并测试毒性，但没有一种解释在作为唯一碳源的NVR给料期间观察到的严重抑制性效应。对培养液中组分的HPLC分析显示一种未知的化合物在培养液中积累且完全未被消耗。
当将先前适应于含3%NVR琼脂板上的NVR的解脂西洋蓍霉菌株暴露于浓度为0.1至1g/L的丁内酯、戊内酯和己内酯时，发现戊内酯是抑制性的，尤其对于通过在C4和C5酸上生长进行恒化器培养所选定的菌株(图18)。需要细胞截留恒化器以避免细胞清洗掉。在一个这类细胞截留恒化器中，在2%(v/v)的有效NVR给料，戊内酯累积至发酵液中约1.7g/L(图19)，根据抑制性研究其将完全抑制生长。HPLC分析确认NVR含有高浓度(约92g/L)的戊内酯。
本实施例鉴定出戊内酯作为重要的抑制性化合物存在于NVR中。确认了戊内酯的存在抑制NVR耐受性宿主细胞的生长。
实施例5-内酯水解酶通过将戊内酯转化成5-羟基戊酸来将其从NVR消除，以及NVR中环己醇/环己酮到己二酸的转化
内酯的水解由酶的1,4-内酯酶类(EC3.1.1.25)和葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)催化，其介导羟基羧酸的内酯和酸形式之间的互变。能够在作为唯一碳源的环己醇或环己酮上生长的微生物细胞将环己酮经由ε-己内酯转化成己二酸。ε-己内酯到6-羟基己酸的水解由ChnC催化(图20)。
已知来自具有环己醇降解途径的生物的内酯酶(ChnC)能够将δ-戊内酯转化成5-羟基戊酸，并且可在具有ω-氧化途径的宿主中克隆和表达为分泌的酶。这可以允许宿主如解脂西洋蓍霉通过将δ-戊内酯转化成5-羟基戊酸，然后将形成的5-羟基戊酸转化成戊二酸将NVR解毒。见实施例7中的在解脂西洋蓍霉中表达靶向胞外分泌的异源水解酶的一般方法。
类似地，包含ChnB、ChnC、ChnD和ChnE的基因簇可在解脂西洋蓍霉或其他合适的宿主细胞中表达以将NVR中存在的环己醇/环己酮转化成己二酸。用于将环己酮转化成己二酸的基因簇，或将δ-戊内酯转化成5-羟基戊酸的ChnC的合适来源包括以下：
不动杆菌属(Acinetobacter)乙酰水解酶(ChnC)(GenBank登录号AAG10029.1,SEQIDNO:1).不动杆菌属SE19中的一种基因簇(其利用作为唯一碳源的环己醇)含有13个开放阅读框，包括负责水解步骤的ChnC(图1,ChengQ,ThomasSM,KostichkaK,ValentineJR,NagarajanV(2000).GeneticanalysisofageneclusterforcyclohexanoloxidationinAcinetobactersp.StrainSE19byinvitrotransposition.JournalofBacteriology.182:4744-4751)。当不动杆菌属中突变时，己内酯的累积证明chnC编码己内酯水解酶。Onakunle等(1997)报告该内酯酶具有ε-己内酯的强特异性，对δ-内酯具有一些活性。(OnakunleOA,KnowlesCJ,BunchAW.(1997).Theformationandsubstratespecificityofbacteriallactonasescapableofenantioselectiveresolutionofracemiclactones.EnzymeandMicrobialTechnology.21:245-251)。
表皮短杆菌(Brevibacteriumepidermidis)HCU内酯水解酶(ChnC2)(GenBankAccessionAAK73167.2,SEQIDNO:2).表皮短杆菌HCU能在环己醇上生长且被提出为含有两种不同的ε-己内酯水解酶(BrzostowiczPC,BlaskoMS,RouvièrePE(2002).IdentificationoftwogeneclustersinvolvedincyclohexanoneoxidationinBrevibacteriumepidermidisstrainHCU.AppliedandMicrobiologicalBiotechnology.58:781-789)。这些彼此仅共享21%的同一性，Cluster1基因与红球菌己内酯酶(下文)更紧密相关。来自Cluster2的基因与δ-戊内酯酶，包括来自Comomonas菌种NCIMB9872的那种具有最紧密的同源性，而且该内酯水解酶是从能在作为其唯一碳源的0.1%环戊醇上生长的细菌分离的(IshikawaT,NishikawaH,GaoY,SawaY,ShibataH,YabutaY,MarutaT,ShigeokaS(2008).ThepathwayviaD-galacturonate/L-galactonateissignificantforascorbatebiosynthesisinEuglenagracilis:identificationandfunctionalcharacterizationofaldonolactonase.JournalofBiologiocalChemistry.283:31133-31141)且具有对δ-戊内酯的强偏好性(比ε-己内酯大10倍)，如Onakunle等报告的。(OnakunleOA,KnowlesCJ,BunchAW(1997)Theformationandsubstratespecificityofbacteriallactonasescapableofenantioselectiveresolutionofracemiclactones.EnzymeandMicrobialTechnology.21:245-251)。来自Cluster1的基因与己内酯水解酶更紧密。
红球菌属菌种Phi2己内酯水解酶(ChnC)(GenBankAccessionAAN37290.1,SEQIDNO:3).Brzostowicz等(2003)从在废水生物反应器中环己酮上富集生长的微生物群体鉴定出红球菌属菌种Phi2中的一种部分基因簇。(BrzostowiczPC,WaltersDM,ThomasSM,NagarajanV,Rouvie`rePE(2003)mRNAdifferentialdisplayinamicrobialenrichmentculture:simultaneousidentificationofthreecyclohexanonemonooxygenasesfromthreespecies.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.69:334-342)。该簇含有环己酮氧化成己二酸所需的4种基因，且己内酯水解酶与节杆菌属菌种BO2中的对应蛋白质(也在同一研究中鉴定出)紧密相关。Bennett等从小球诺卡氏菌(Nocardiagloberula)CL1纯化出己内酯水解酶，其在环己醇存在的情况下诱导(BennettAP,StrangEJ,TrudgillPW,WongVK(1988).Purificationandpropertiesofε-caprolactonehydrolasesfromAcinetobacterNCIB9871andNocardiaglobevulaCLl.JournalofGeneralMicrobiology.134:161-168)。该蛋白展现出对ε-己内酯和δ-戊内酯的最大活性(相对于与ε-己内酯的40%活性)。小球诺卡氏菌和红球菌均在诺卡氏菌科(Nocardiaceae)家族中。
Euglenagracilis内酯酶(GNL)(GenBankAccessionBAF94304.1,SEQIDNO:4).Ishikawa等(2008)报告来自光合性藻类Euglenagracilis的纯化的醛内酯酶的活性，其水解葡糖酸-δ-内酯、半乳糖酸-γ-内酯和葡糖酸-γ-内酯。
LIP2基因编码解脂西洋蓍霉的主要胞外脂肪酶活性(PignedeG,WangH,FudalejF,GaillardinC,SemanM,NicaudJM(2000).CharacterizationofanextracellularlipaseencodedbyLIP2inYarrowialipolytica.JournalofBacteriology.182:2802-2810)且其cDNA序列编码前原酶，所述前原酶含有13氨基酸信号序列、为二氨基肽酶底物的四个二肽(X-Ala或X-Pro)的延伸和含有KR(Lys-Arg)位点(Xprendoprotease的底物)的12氨基酸原区(pro-region)(FickersP,MartyA,NicaudJM(2011).ThelipasesfromYarrowialipolytica:Genetics,production,regulation,biochemicalcharacterizationandbiotechnologicalapplications.BiotechnologyAdvances29:632-644)。在生长的早期阶段，胞外脂肪酶主要与细胞壁关联，然后在生长阶段结束时释放到培养液中(FickersP,NicaudJM,GaillardinC,DestainJ,ThonartP(2004).CarbonandnitrogensourcesmodulatelipaseproductionintheyeastYarrowialipolytica.JournalofAppliedMicrobiology96:742–9)。因此，LIP2的信号序列适于与其他蛋白质融合以能够进行分泌。
基于本领域中报告的内酯酶将δ-戊内酯转化成5-羟基戊酸，可克隆内酯酶并在宿主细胞中表达为分泌的酶，所述宿主细胞还含有ω-氧化途径以介导经由到5-羟基戊酸的转化从NVR除去戊内酯。另外，基于文献中报告的微生物基因例如ChnB、ChnC、ChnD和ChnE负责作为唯一碳源的环己醇或环己酮的利用，可克隆这些基因并在另一宿主细胞例如解脂西洋蓍霉中表达以将环己酮经由ε-己内酯转化成己二酸。
因此，可在宿主细胞如解脂西洋蓍霉中表达内酯酶例如ChnC以通过将δ-戊内酯转化成5-羟基戊酸(其然后可经由ω-氧化途径转化成戊二酸)从NVR除去生长抑制性组分。以这类方式，宿主细胞可改良混合的有机废物流的特性从而使得废物流适于微生物的生长。
实施例6–通过解脂西洋蓍霉将己酸和羟基己酸转化成己二酸和己二酸在具有受破坏的编码酰基-CoA氧化酶的POX基因的菌株中的累积
在YPD(3ml)中预培养解脂西洋蓍霉野生型(W29或Po1d(Mataura3-302-270,xpr2-322,Ura-,Leu-))和具有各种POX基因缺失(下表)的突变菌株达16小时并用于接种含10%生产培养基(Y1T2D1O2，pH6.8-见一般方法)的摇瓶至最终0.05的OD600。
表8.本研究中使用的酵母菌株
将菌株培养48小时，通过离心收获并在磷酸盐缓冲液(50mM.pH7.0含葡萄糖(10mM)、葡萄糖-6-磷酸盐(6.7mM)、0.4UGlc6P脱氢酶和NADPH(5mM))中重悬为200mg/ml。反应由添加NVR(4%)开始并通过添加100ul6MH2SO4在24小时后终止，并通过LC-MS分析上清液。
结果清楚地显示6-羟基己酸和己二酸在具有受损β-氧化的菌株(POX突变体)的反应上清液中累积，而在亲本和野生型菌株中没有观察到累积。如此，POX基因的缺失防止NVR中的己二酸和6-羟基己酸经由β-氧化降解，如图1中绘出且在图21和22中例示的。如此，可阻止亲本和野生型菌株对6-羟基己酸和己二酸的分解代谢，其通过鉴定涉及NVR中C6组分经由β-氧化分解代谢的POX基因并在宿主菌株中删除那些POX基因。在解脂西洋蓍霉中，POX3对C6组分具有最大的影响。
实施例7–用于克隆基因并在解脂西洋蓍霉中表达靶向胞外分泌的酶的一般方法
LIP2基因编码解脂西洋蓍霉的主要胞外脂肪酶活性(PignedeG,WangH,FudalejF,GaillardinC,SemanM,NicaudJM(2000).CharacterizationofanextracellularlipaseencodedbyLIP2inYarrowialipolytica.JournalofBacteriology.182:2802-2810)，且其cDNA序列编码含有13氨基酸信号序列、作为二氨基肽酶底物的4个二肽(X-Ala或X-Pro)的延伸和含有KR(Lys-Arg)位点的12氨基酸原区(Xprendoprotease的底物)(FickersP,MartyA,NicaudJM(2011).ThelipasesfromYarrowialipolytica:Genetics,production,regulation,biochemicalcharacterizationandbiotechnologicalapplications.BiotechnologyAdvances29:632-644)。在生长的早期阶段，胞外脂肪酶主要与细胞壁关联，然后在生长阶段结束时释放到培养液中(FickersP,NicaudJM,GaillardinC,DestainJ,ThonartP(2004).CarbonandnitrogensourcesmodulatelipaseproductionintheyeastYarrowialipolytica.JournalofAppliedMicrobiology96:742–9)。因此，LIP2的信号序列适于与其他蛋白质融合以能够进行分泌。
应用依照Sambrook等(MolecularCloning–aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)的标准分子技术。首先将编码相应水解酶(酯酶、脂肪酶、角质酶、内酯酶)的靶DNA序列进行密码子优化，其依照表达宿主解脂西洋蓍霉中的密码子使用频率。然后，将经密码子优化的水解酶基因序列设计为用解脂西洋蓍霉脂肪酶2(Lip2)前原DNA序列在5’臂侧融合/替换其原始信号肽序列以进行有效的蛋白质表达、分泌和加工。在5’臂和3’臂侧两者还分别工程化BamHI位点连同在翻译起始位点处的通用序列(CACA)，和AvrII位点加上两个终止密码子，以协助将靶基因克隆到酵母表达载体中(Gasmi等,(2011)ApplMicrobiolBiotechnol89:109-119)。合成所有水解酶基因，并通过EurofinsMWG操纵子(Germany)最终克隆到pEX-A载体中(pEX-A_Hydrolases)。
从pEX-A_Hydrolases质粒用BamHI/AvrII限制酶取出携带前原Lip2_Hydrolases(酯酶、脂肪酶、角质酶或内酯酶)的片段，纯化并亚克隆到解脂西洋蓍霉表达载体JMP62URAex(JME803)中，其含有可诱导的强Pox启动子、Lip2基因终止子、Ura3可选择标志、以及用于随机染色体整合的Zeta-对接(docking)序列(见图3的JMP62-水解酶表达载体和水解酶表达盒的示意性质粒图谱)。
将具有靶水解酶的表达载体用限制酶NotI消化并进行电泳。从凝胶提取表达盒并用于对解脂西洋蓍霉的转化。
使用如LeDall等,1994(Multiple-copyintegrationintheyeastYarrowialipolytica.CurrentGenetics26:38-44)描述的醋酸锂方法转化解脂西洋蓍霉的脂肪酶缺陷性菌株JMY1212(MATAura3-302leu2-270-LEU2-zetaxpr2-322Δlip2Δlip7Δlip8,Leu+,Ura-)。在选择YNB培养板上的Ura+时获得解脂西洋蓍霉转化体。从具有相应水解酶的每个经转化菌株选择独立的菌落。
在丰富培养基YPD(10g/l酵母提取物、10g/l细菌用蛋白胨、10g/l葡萄糖)或在Y1T2D1O2培养基(1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、1%葡萄糖、2%油酸和50mM磷酸钠缓冲液，pH6.8)中生长酵母菌株用于可诱导表达。蛋白质表达和对寡聚体酯的酶促水解活性用改良后的方法测定，如由(Pignede等,2000Appl.Environ.Microbiol66:3283-3289)描述的。
因此，使用这些标准克隆技术，解脂西洋蓍霉可被修饰为表达并分泌将混合的有机废物流的寡聚体酯组分分解代谢成单体，并进一步将单体组分酶促加工成期望化合物的酶。
实施例8–将NVR中的组分转化成α,ω-双官能C6烷
图2显示6-羟基己酸到1,6-己二醇、己二酸到6-氧己酸和6-氧己酸到6-氨基己酸的酶促转化。6-氨基己酸又可转化成六亚甲基二胺或己内酰胺。
已记载了由β-丙氨酸-氨基转移酶(EC2.6.1.19)催化的6-氧己酸到6-氨基己酸的转化(图2中的反应1)。关于β-丙氨酸的代谢的酶研究(Hayaishi等,.1961J.Biol.Chem.236,p.781-790)，和1-氨基转移酶的其他例子披露于WO2009/113855(从5-甲酰戊酸制备6-氨基己酸)和WO2011-031147(从α-酮酸制备包含胺基团的化合物)。适于催化己二酸到6-氧己酸的转化(图2中的反应2)的酶包括羧酸还原酶(EC1.2.99.6)或醛脱氢酶(EC1.2.1.3和EC1.2.1.31)。适于催化6-氧己酸到6-羟基己酸的转化的酶包括6-羟基己酸脱氢酶(EC1.1.1.258)。适于催化6-羟基己酸到1,6-己二醇的转化(图2中的反应4)的酶包括双官能醇/醛脱氢酶(EC1.2.1.10)，而适于催化6-氨基己酸到己内酰胺的转化(图2中的反应5)的酶包括氨基水解酶(EC3.5.2.-)如EC3.5.2.11。已披露了预测的适于催化图2中2、3、4和5转化的酶(WO2009/151728:Microorganismsfortheproductionofadipicacidandothercompounds,WO2010/068944:Biologicalsynthesisofdifunctionalalkanesfromcarbohydratefeedstocks)。
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Claims (48)

1.一种用于富集环烷氧化工艺混合的有机废物流中的单体含量的方法，包括：
将来自环烷氧化工艺的混合的有机废物流用分离的生物催化剂或由天然存在或非天然存在的宿主细胞分泌的生物催化剂处理；
其中所述生物催化剂将所述废物流的二聚体和/或寡聚体组分酶促转化成单体组分，
其中所述生物催化剂包含至少一种水解酶，其将所述废物流中的寡聚体酯水解成单体或将所述混合的有机废物流中的至少一部分内酯水解成羟基酸，从而增加所述混合的有机废物流中的单体组分量，
其中所述混合的有机废物流包含NVR、水洗物、COP酸、苛性洗流或其组合。
2.依照权利要求1的方法，其还包括：用天然或非天然存在的宿主细胞处理所述混合的有机废物流，所述宿主细胞单独或组合地，将所述混合的有机酸废物流中的至少一部分直链C4-C6一元酸、羟基酸和含氧酸酶促氧化成相应的二酸，由此增加所述流中二酸的相对量。
3.依照权利要求1的方法，其中所述非天然存在的宿主细胞分泌所述生物催化剂，且其中用所述非天然存在的宿主细胞处理所述混合的有机废物流，所述宿主细胞单独或组合地导致：
a.所述混合的有机废物流中的至少一部分寡聚体酯酶促水解成单体；
b.所述混合的有机废物流中的至少一部分ε-己内酯酶促水解成6-羟基-己酸；
c.所述混合的有机废物流中的至少一部分己酸、6-羟基己酸和6-氧己酸酶促氧化成己二酸；
d.所述混合的有机废物流中的至少一部分环C6组分酶促转化成己二酸；
e.所述混合的有机废物流中存在的至少一部分C3、C4和C5组分进行酶促的分解代谢；或
f.以低于C3、C4和C5组分的速率对所述混合的有机废物流中的C6组分进行酶促的分解代谢，
由此增加所述废物流中己二酸的相对浓度和降低所述流中一元酸和羟基酸的量。
4.依照权利要求1的方法，其中所述非天然存在的宿主细胞分泌所述生物催化剂，且其中用所述非天然存在的宿主细胞处理所述混合的有机废物流，所述宿主细胞单独或组合地导致：
i.所述混合的有机物中的至少一部分寡聚体酯酶促水解成单体；
ii.所述混合的有机物中的至少一部分己酸酶促氧化成6-羟基己酸；
iii.所述混合的有机物中的至少一部分环C6组分酶促转化成6-羟基己酸或6-氧己酸；
iv.所述混合的有机废物流中的至少一部分C3、C4和C5组分进行酶促的分解代谢；或
v.以低于C3、C4和C5组分的速率对所述混合的有机废物流中的C6组分进程酶促的分解代谢；且所述非天然宿主细胞表达至少一种生物合成途径酶以将己二酸、6-羟基己酸或6-氧己酸转化成1,6-己二醇、6-氨基己酸、ε-己内酰胺或六亚甲基二胺，并
将所述流中存在的C6组分和前体转化成α,ω-双官能C6烷。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述水解酶是分离的或固定化的水解酶，或由天然或非天然存在的宿主细胞在发酵和生物转化期间分泌的内源性或异源性水解酶。
6.权利要求5的方法，其中所述水解酶是脂肪酶、酯酶、角质酶、聚羟基链烷酸酯解聚酶、内酯水解酶、葡糖酸内酯酶、漆酶、或其组合。
7.权利要求6的方法，其中所述内酯水解酶是1,4-内酯酶。
8.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述水解酶在酸性pH、生理学pH或碱性pH有活性。
9.权利要求1的方法，其中用所述水解酶处理降低所述混合的有机废物流的粘度以改进燃烧所述流的效率和/或准备所述流用于进一步化学或生物处理。
10.权利要求9的方法，其还包括燃烧所述经处理的混合的有机废物流用于燃料值或产生合成气。
11.权利要求9的方法，其还包括(i)酯化所述经处理的混合的有机废物流的一种或多种组分以产生混合的酯或多元醇，(ii)氢化所述经处理的混合的有机废物流的一种或多种组分以产生二醇，(iii)氧化所述经处理的混合的有机废物流的一种或多种组分以产生二酸，(iv)还原性氨基化所述经处理的混合的有机废物流的一种或多种组分以产生胺，(v)磺化所述经处理的混合的有机废物流的一种或多种组分，或(vi)用NH4OH或多胺处理所述经处理的混合的有机废物流的一种或多种组分。
12.权利要求1的方法，包括同时实施另外的分离、化学转化或通过生物催化剂的酶促转化。
13.权利要求2-4中任一项的方法，其中可将C4-C6或C6一元酸、羟基酸和含氧酸经由含氧酸转化成二酸的所述天然或非天然存在的宿主细胞具有内源性或异源性ω-氧化途径，其催化一种或多种以下转化：
a.将丁酸、戊酸和/或己二酸转化成琥珀酸、戊二酸和/或己二酸；
b.将丁酸、戊酸和/或己二酸转化成4-羟基丁酸、5-羟基戊酸和/或6-羟基己酸；
c.将4-羟基丁酸、5-羟基戊酸和/或6-羟基己酸转化成4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸；或
d.将4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸转化成琥珀酸、戊二酸和/或己二酸。
14.权利要求13的方法，其中具有内源性或异源性ω-氧化途径的所述天然或非天然存在的宿主细胞将脂肪族脂肪酸经由羟基酸和含氧酸转化成二酸，且所述天然或非天然存在的宿主细胞是利用n-烷的酵母或细菌。
15.权利要求14的方法，其中所述利用n-烷的酵母是解脂西洋蓍霉、热带假丝酵母、白色假丝酵母、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、麦芽糖假丝酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides或其组合，或红酵母属、根霉属、丝孢酵母属、德巴利氏酵母属和油脂酵母属的酵母或其组合；且其中所述利用n-烷的细菌是假单胞菌属的荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、食油假单胞菌、除烃海杆菌、Acinetobactervenetianus、Oleiphilusmessinensis、粘节杆菌、Cupriavidusmetallidurans，是红球菌属的紫红红球菌或红串红球菌、Sphingomonaspaucimobilis、洋葱伯克霍尔德氏菌、Delftiaacidovorans、Alcanivoraxdiesolei或其组合。
16.权利要求3或4的方法，其中将所述废物流的至少一部分环C6组分转化成6-羟基己酸、6-氧己酸或己二酸的所述天然或非天然存在的宿主细胞具有内源性或异源性途径，其催化一种或多种以下转化：
I.环己醇到6-氧己酸，其中催化一种或多种以下转化：
a.环己醇到环己酮的转化；
b.环己酮到ε-己内酯的转化；
c.ε-己内酯到6-羟基己酸的转化；或
d.6-羟基己酸到6-氧己酸的转化；
II.1,2-环己二醇到6-氧己酸，其中催化一种或多种以下转化：
a.环己烷-1,2-二醇到环己烷-1,2-二酮的转化；或
b.环己烷-1,2-二酮到6-氧己酸的转化；和
III.6-氧己酸到己二酸的转化。
17.权利要求1-的方法，其中所述天然或非天然存在的宿主细胞对NVR耐受。
18.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞对按体积计至少1％的所述混合的有机废物流耐受。
19.权利要求3或4的方法，其包括降低所述宿主细胞对C6化合物的分解代谢速率以提供来自所述废物流的更高C6组分产率。
20.权利要求19的方法，其包括降低己酸、羟基己酸和己二酸经由宿主细胞的β-氧化到乙酰-CoA的降解。
21.权利要求20的方法，其中通过缺失或抑制使用己酸、羟基己酸和己二酸来生成CoA酯的酶而降低经由β-氧化对己酸、羟基己酸和己二酸的降解。
22.权利要求21的方法，其包括通过缺失或抑制氧化CoA酯的酶而降低经由β-氧化对己酸、羟基己酸和己二酸的降解。
23.权利要求21或22的方法，其中所述CoA酯包含CoA连接酶、转移酶、酰基-CoA氧化酶或酰基-CoA脱氢酶。
24.权利要求2的方法，其包括在分离成C4、C5或C6二酸之前将所述二酸混合物酯化。
25.权利要求2-4中任一项的方法，其包括从所述混合物结晶出己二酸。
26.权利要求4的方法，其中将寡聚体酯、己酸和环C6化合物转化成6-羟基己酸、6-氧己酸和己二酸的所述非天然存在的宿主细胞还产生1,6-己二醇或6-氨基己酸。
27.权利要求26的方法，其中所述产生1,6-己二醇的宿主细胞表达催化6-氧己酸到6-羟基己酸转化的醛脱氢酶，和催化6-羟基己酸到1,6-己二醇转化的醇脱氢酶。
28.权利要求26的方法，其中所述产生6-氨基己酸的非天然存在的宿主细胞表达将6-氧己酸转化成6-氨基己酸的氨基转移酶。
29.权利要求28的方法，其中所述产生6-氨基己酸的非天然存在的宿主细胞还表达将6-氨基己酸转化成ε-己内酰胺的氨基水解酶。
30.权利要求28的方法，其中所述产生6-氨基己酸的非天然宿主细胞产生六亚甲基二胺，其经由将6-氨基己酸转化成6-氨基己醛的醛脱氢酶和将6-氨基己醛转化成六亚甲基二胺的1-氨基转移酶。
31.权利要求1-的方法，其中所述生物催化剂包含分离的酶或由天然存在或非天然存在的宿主细胞分泌的酶，且所述酶是P450细胞色素氧化酶、来自EC1.14.15.3类的ω-羟化酶、ω-加氧酶或烷-1-单加氧酶；脂肪醇氧化酶；来自EC1.1.1类的醇脱氢酶；Baeyer-Villiger单加氧酶；己内酯内酯水解酶；脂肪醇氧化酶；醇脱氢酶；环己烷-1,2-二醇脱氢酶；环己烷-1,2-二酮酰基水解酶；或来自α,β-水解酶折叠家族的羧酸酯酶。
32.权利要求1的方法，其中所述生物催化剂是分离的酶或由天然存在或非天然存在的宿主细胞分泌的酶，且所述酶是来自EC1.1.1.245类的环己醇脱氢酶/ChnA；来自EC1.14.13.22类的环己酮单加氧酶/ChnB；来自EC3.1.1.17类的葡糖酸内酯酶/ChnC；来自EC1.1.1.2类的ChnD；来自EC1.1.1.174的环己烷-1,2-二醇脱氢酶；来自EC3.7.1.10或EC3.7.1.11的环己烷-1,2-二酮酰基水解酶；脂肪酶；酯酶；角质酶；聚羟基链烷酸酯解聚酶；1,4-内酯酶；葡糖酸内酯酶；漆酶；或其组合。
33.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述宿主细胞在pH5.0-8.0利用所述废物流中的碳源。
34.一种组合物，其包含环烷氧化工艺的混合的有机废物流和生物催化剂，其中所述生物催化剂是分离的酶或由天然存在或非天然存在的宿主细胞分泌的酶，
其中所述混合的有机废物流是NVR、水洗物、COP酸、苛性洗流或其组合，其中所述酶是水解酶。
35.权利要求34的组合物，其中所述宿主细胞对NVR耐受。
36.权利要求35的组合物，其中所述宿主细胞对按体积计至少1％的所述混合的有机废物流耐受。
37.权利要求34-36中任一项的组合物，其中所述天然或非天然存在的宿主细胞包含内源性或异源性ω-氧化途径，其将脂肪族脂肪酸经由羟基酸和含氧酸转化成二酸，且其中所述天然或非天然存在的宿主细胞是利用n-烷的酵母或细菌。
38.权利要求37的组合物，其中所述利用n-烷的酵母是解脂西洋蓍霉、热带假丝酵母、白色假丝酵母、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、麦芽糖假丝酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides或其组合，或红酵母属、根霉属、丝孢酵母属、德巴利氏酵母属和油脂酵母属的酵母或其组合；且其中所述利用n-烷的细菌来自假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、食油假单胞菌、除烃海杆菌、Acinetobactervenetianus、Oleiphilusmessinensis、粘节杆菌、Cupriavidusmetallidurans，来自红球菌属如紫红红球菌或红串红球菌、Sphingomonaspaucimobilis、洋葱伯克霍尔德氏菌、Delftiaacidovorans、Alcanivoraxdiesolei或其组合。
39.权利要求34的组合物，其中所述水解酶是脂肪酶、酯酶、角质酶、聚羟基链烷酸酯解聚酶、内酯水解酶；葡糖酸内酯酶、漆酶、或其组合。
40.权利要求39的组合物，其中所述内酯水解酶是1,4-内酯酶。
41.权利要求34的组合物，其中所述酶是P450细胞色素氧化酶、来自EC1.14.15.3类的ω羟化酶、ω-加氧酶或烷-1-单加氧酶；脂肪醇氧化酶；来自EC1.1.1类的醇脱氢酶；BaeyerVilliger单加氧酶；己内酯内酯水解酶；脂肪醇氧化酶；醇脱氢酶；环己烷-1,2-二醇脱氢酶；环己烷-1,2-二酮酰基水解酶；来自α,β-水解酶折叠家族的羧酸酯酶；或其组合。
42.权利要求41的组合物，其中所述酶是来自EC1.1.1.245类的环己醇脱氢酶/ChnA；来自EC1.14.13.22类的环己酮单加氧酶/ChnB；来自EC3.1.1.17类的葡糖酸内酯酶/ChnC；来自EC1.1.1.2类的ChnD；来自EC1.1.1.174的环己烷-1,2-二醇脱氢酶；来自EC3.7.1.10或EC3.7.1.11的环己烷-1,2-二酮酰基水解酶；或其组合。
43.权利要求1的方法，其进一步包括从所述废物流回收或分离所述单体组分、二酸、己二酸或其他α,ω-双官能C6烷。
44.一种用于补料分批或连续培养微生物的方法，其包括：
a)在存在NVR、COP酸或水洗物的情况下培养微生物，且其中所述NVR、COP酸或水洗物供应所述微生物生长所需的至少一些碳，和
b)使用由所述微生物分泌的水解酶来富集所述NVR、COP酸或水洗物中的单体含量，其中所述水解酶将所述NVR、COP酸或水洗物中的二聚体和/或寡聚体组分酶促转化成单体组分，
其中所述微生物是解脂西洋蓍霉。
45.权利要求44的方法，其中所述培养物的pH控制为6.0至7.5。
46.权利要求44或45的方法，其进一步包括供应另外的可发酵碳源甘油或葡萄糖。
47.权利要求44的方法，其进一步包括在补料分批发酵情况中或在恒化器培养期间使用部分滴液的细胞截留。
48.权利要求44的方法，其中所述单体组分包含二酸、己二酸、α,ω-双官能烷或其组合。
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