CN102037131A - 通过赖氨酸环化制备α-氨基-ε-己内酰胺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备α-氨基-ε-己内酰胺的方法，所述方法包括将赖氨酸转化成α-氨基-ε-己内酰胺，其中所述转化由生物催化剂催化。另外，本发明涉及包含至少一种重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含编码具有赖氨酸环化酶活性的生物催化剂的核酸序列。本发明还提供了一种方法，其中用α-氨基-ε-己内酰胺来制备ε-己内酰胺。
Description
本发明涉及制备α-氨基-ε-己内酰胺(下文也称作ACL)的方法。本发明还涉及其中ACL被用于制备ε-己内酰胺(下文称作“己内酰胺”)的方法。本发明还涉及可用于制备ACL或己内酰胺的宿主细胞。
己内酰胺是一种内酰胺，其可以被用于生产聚酰胺，例如尼龙-6或尼龙-6，12(己内酰胺和十二内酰胺的共聚物)。由大量化学品制备己内酰胺的多种方式是本领域已知的，它们包括由环己酮、甲苯、苯酚、环己醇、苯或环己烷制备己内酰胺。这些中间产物化合物通常得自矿物油。考虑到使用更加可持续的技术来制备材料的日益增长的需要，人们期望提供一种方法，其中由能够从生物来源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被转化成己二酸或己内酰胺的中间产物来制备己内酰胺。另外，想要提供一种方法，所述方法比利用来自石油化学来源的大量化学品的传统化学工艺需要更少能源。
由6-氨基己酸(6-ACA)制备己内酰胺是已知的，例如如US-A 6,194,572中所述。如WO 2005/068643中所公开的，可以在存在具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶时，通过转化6-氨基己-2-稀酸(6-AHEA)以生物化学方式制备6-ACA。可以例如以生物化学方式或通过纯化学合成，由赖氨酸制备6-AHEA。尽管可以通过WO 2005/068643中公开的方法通过6-AHEA的还原来制备6-ACA，但是本发明人发现：在还原反应条件下，6-AHEA可自发并且基本不可逆地环化形成不想要的副产物，特别是β-高脯氨酸。所述环化可以是6-ACA生产中的瓶颈，其导致相当大的产率损失。
本发明的一个目的是提供用于制备己内酰胺的新颖方法，所述方法可以作为已知方法的替代方式。本发明尤其有一个目的是提供用于制备下述中间产物化合物的新颖方法，所述中间产物化合物可以被用于制备己内酰胺。
本发明的又一个目的是提供克服一种或多种上文提到的缺点的新颖方法。
本发明的又一个目的是提供用于制备己内酰胺或用于制备己内酰胺的中间产物化合物的新颖发酵方法。
根据本发明可解决的一个或多个其他目的可根据下文的说明书获知。
目前已发现，可从特定的起始化合物以生物催化方式制备己内酰胺或用于制备己内酰胺的中间产物化合物。
因此，本发明涉及用于制备α-氨基-ε-己内酰胺(ACL)的方法，所述方法包括将赖氨酸转化成α-氨基-ε-己内酰胺，其中所述转化由生物催化剂催化。
本发明还涉及由α-氨基-ε-己内酰胺制备己内酰胺的方法。
本发明基于下述认识：可从赖氨酸或从可通过赖氨酸的环化获得的产物以生物催化方式制备己内酰胺。
本发明人认为尤其出乎意料的是，根据本发明的方法也可以在水性环境中，例如在细胞内环境中进行。可以预期，大量水的存在(如典型地存在于(活)生物内的那样)，会将从赖氨酸到ACL的反应平衡驱动至赖氨酸侧。毕竟，本质上赖氨酸的闭环是其中形成肽键的反应。通常在水性环境中，酶促水解是在动力学上比酶促肽键形成更受欢迎的反应。
通过下述事实进一步阐述本发明的预料不到的特性：针对天然微生物在科学文献和数据库中进行的彻底搜索未能找到任何关于能将赖氨酸转化成ACL的已知生物的报道。
根据本发明，未注意到关于在形成ACL以及任选地形成己内酰胺时中间产物的不想要的环化的问题，这导致产率的损失。
在本发明的一个有利的实施方案中，ACL或己内酰胺是发酵制备的。
除非另有说明，在本文中使用的术语“或者”表示“和/或”。
在本文中使用的术语“一个”(“a”或“an”)表示“至少一个”。
提到单数名词(例如一种化合物、一种添加剂等)时，复数旨在被包括在内。因此，除非另有说明，当涉及特定的名词例如“化合物”时，表示“至少一种”所述名词，例如“至少一种化合物”。
提到存在立体异构体的化合物时，所述化合物可以是任何这类立体异构体或其组合。因此，提到例如存在对映异构体的ACL或氨基酸时，所述ACL或氨基酸可以是L-对映异构体、D-对映异构体或其组合。存在天然立体异构体时，化合物优选地是天然立体异构体。
在本文中提到羧酸或羧酸酯例如6-ACA、另外的氨基酸或脂肪酸时，这些术语旨在包括质子化的羧酸、它们相应的羧酸酯(其共轭碱)及其盐。在本文中提到氨基酸例如6-ACA时，所述术语旨在包括其两性离子(zwitterionic)形式的氨基酸(其中氨基是质子化的形式且羧酸酯基是去质子化的形式)，其中氨基是质子化的且羧基为其中性形式的氨基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸酯基是去质子化形式的氨基酸，以及它们的盐。类似地，提到胺(例如赖氨酸或另外的氨基酸或ACL)时，这旨在包括质子化的胺(典型地为阳离子的，例如R-NH3 +)和非质子化的胺(典型地不带电荷，例如R-NH2)。
当使用括号中的酶种类(EC)提到酶时，所述酶种类是以Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)提供的Enzyme Nomenclature为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。(尚)未归类但是可以同样被归类于特定种类中的其他合适的酶也旨在包括在内。
术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少30％、优选地至少40％、更优选地至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、尤其是至少85％、更尤其是至少90％、至少91％、92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸或多肽。术语同源物也旨在包括由于遗传密码子的简并性而与另外的核酸序列(多核苷酸序列)不同但编码相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。
序列同一性或相似性在本文中被定义为两条或更多条多肽序列或两条或更多条核酸序列(多核苷酸序列)之间的相互关系，这是通过比较所述序列来测定的。通常，序列同一性或相似性是在序列全长上比较的，但是也可以仅在彼此对齐的序列的一部分上比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列(多核苷酸序列)之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列串之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.1990，215，403-410)，公众可以从NCBI和其他来源(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894)获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，Blosum 62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。
在本发明的方法中，使用生物催化剂，即所述方法中至少一个反应步骤由生物材料或来自生物来源的部分(例如来自生物来源的生物或生物分子)催化。生物催化剂可尤其包含一种或多种酶。生物催化剂可以以任何形式使用。在一个实施方案中，使用从天然环境中分离(从生产它们的生物中分离)的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻干细胞(悬浮液)、作为裂解物或固定在支持物上。在一个实施方案中，一种或多种酶形成活生物的一部分(如活的完整细胞)。酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所述细胞存在的培养基中。
活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠细胞(例如孢子)或稳定期细胞。还可能使用酶形成通透化(即，使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透)的细胞的部分。
本发明方法中使用的生物催化剂原则上可以是任何生物，或得自或源于任何生物。生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可选自动物(除人之外，至少在生物本身的使用被涉及的生物中)、植物、细菌、古细菌、酵母和真菌。合适的生物催化剂或其部分原则上也可以来自人。具体地，酶可得自或源于用于本发明方法中的人细胞材料。
在一个实施方案中，生物催化剂例如酶可源自动物，尤其源自其部分，例如肝、胰、脑、肾或其他器官。动物可尤其选自无脊椎海洋动物，更尤其选自海绵(Porifera)，尤其选自Demospongiae、Pachastrellidae或Jaspidae，例如Jaspis sp.、Pachastrella sp.、Poecillastra sollasi、Choristidae和哺乳动物，更尤其是选自Leporidae、Muridae、Suidae和Bovidae的组的哺乳动物。
合适的细菌可尤其选自下组：Pseudomonas、Bacillus、Escherichia、Ochrobactrum、Citrobacter、Klebsiella、Mycobacterium、Providencia、Achromobacter、Rhodococcus、Myxococcus、Enterobacter、Methylophilus、Streptomyces、Nocardia、Thermus和Alcaligenes。
合适的真菌可尤其选自Aspergillus、Tremella和Periconia的组。
合适的酵母可尤其选自Candida、Saccharomyces、Kluyveromyces、Cryptococcus和Trichosporon的组。
本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的天然存在的生物催化剂(野生型)或天然存在的生物催化剂的突变体。
可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计(rational design)改进天然存在的生物催化剂的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因重组等)修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化剂的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分(如酶)。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的(宿主)细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO 2008/000632中所述的方法。WO 2003/010183公开了一种尤其合适的制备变体多核苷酸的方法，其中使用对多核苷酸起始种群的诱变以及对经突变的多核苷酸加以重组的组合。
突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面：针对底物的选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、pH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。
提到来自具体来源的生物催化剂(尤其是酶)、来自第一生物但是实际上在(经遗传修饰的)第二生物中生产的重组生物催化剂(尤其是酶)时，特定地旨在包括来自所述第一生物的生物催化剂(尤其是酶)。
根据本发明的方法，ACL通过环化赖氨酸制备，其中所述环化由生物催化剂催化。原则上，可以使用D-赖氨酸、L-赖氨酸或其混合物。通过环化这些赖氨酸形成了D-ACL、L-ACL或其混合物。在实践中L-赖氨酸是优选的。
环化反应中使用的生物催化剂优选地包含具有赖氨酸环化酶活性的酶。例如，可以使用来自上文提到的生物的具有赖氨酸环化酶活性的酶。
具体地，能够催化赖氨酸环化成为ACL的酶可选自水解酶(EC 3)的组。水解酶优选地选自作用于酯键的水解酶(酯酶)(EC 3.1)和作用于除肽键之外的碳-氮键(EC 3.5)的水解酶的组。酯酶可尤其选自羧酸酯水解酶(EC 3.1.1)的组，更尤其选自羧基酯酶(EC 3.1.1.1)，优选地选自猪肝酯酶。EC 3.5类的酶可尤其选自主要作用于线性酰胺(EC 3.5.1)的水解酶组。
主要作用于线性酰胺的水解酶(如酰胺酶)可尤其是来自Ochrobactrum、Rhodococcus、Enterobacter、Thermus、Klebsiella、Aspergillus、Methylophilus或Mycobacterium的此类水解酶。更尤其可使用来自下述生物的主要作用于线性酰胺的水解酶(如酰胺酶)，所述生物选自下组：Ochrobactrum anthropi、Rhodococcus erythropolis、Enterobacter cloacae、Thermus sp.、Klebsiella terrigena、Klebsiella oxytoca、Aspergillus nidulans、Methylophilus methylotrophus和Mycobacterium smegmatis。来自Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321的酰胺酶或来自Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540的酰胺酶在其中ACL还被用于制备己内酰胺的方法中是尤其有利的。这类酰胺酶可尤其包含根据Sequence ID 4、Sequence ID 6的氨基酸序列或其同源物。
另外，可使用US 2005/0079595或EP-A 1 409 667中所述酰胺酶进行环化反应，所述参考文献中与具有赖氨酸环化酶活性的酶和编码这类酶的基因相关的内容通过引用并入本文。
另外，EC 3.5类的酶也尤其选自主要作用于环状酰胺中C-N键的水解酶(EC 3.5.2)(也可称作内酰胺酶)的组，尤其选自赖氨酸内酰胺酶(EC 3.5.2.11)的组。
具体地，内酰胺酶(即在环状酰胺中发挥作用的水解酶)可选自L-赖氨酸-1，6-内酰胺水解酶(EC 3.5.2.11)和6-氨基己酸酯-环状二聚体水解酶(EC 3.5.2.12)等等。
在一个实施方案中，内酰胺酶，尤其是L-赖氨酸内酰胺酶选自来自Aspergillus、Cryptococcus、Candida、Citrobacter、Trichosporon、Tremella 和Providencia的内酰胺酶的组。更具体地，所述内酰胺酶可选自来自Aspergillus ustus、Aspergillus niger、Cryptococcus laurentii、Candida humicola、Citrobacter freundii、Trichosporon cutaneum、Tremella fuciformis、Tremella aurentia、Tremella foliacea、Tremella subanomalia和Providencia alcalifaciens的内酰胺酶的组。
在一个实施方案中，内酰胺酶，尤其是6-氨基己酸酯-环状二聚体水解酶(EC 3.5.2.12)是下述来自Alcaligenes的内酰胺酶，例如来自Alcaligenes lactamlytics或来自Achromobacter，例如来自Achromobacter xerosis或Achromobacter guttatus。
脂肪酶可尤其选自来自哺乳动物的脂肪酶，如猪脂肪酶、牛脂肪酶等等。具体地，本发明方法中使用的脂肪酶可以是胰脂肪酶。脂肪酶可商业获得，例如猪胰脂肪酶可得自
(产品目录号7023C)或得自Sigma(产品目录号L-3126)。本领域技术人员已知，商业猪肝酯酶(PLE)制剂，例如可作为悬浮液(产品目录号E2884)或粉末形式(产品目录号E3019)得自Sigma的商业猪肝酯酶(PLE)制剂通常是酶(尤其是猪肝酯酶)的混合物。认为PLE制剂中这些同工酶中的一种或多种负责将赖氨酸生物转化成ACL。本领域技术人员知道如何在需要时在合适的宿主中分离、克隆猪肝酯酶同工酶和/或将猪肝酯酶同工酶表达进合适的宿主中。
在一个实施方案中，可以使用非核糖体肽合酶(NRPS)来环化赖氨酸。已知次级代谢产物生产者通过非核糖体肽合酶(NRPS)来合成肽。NRPS被详细描述于例如“Assembly-Line Enzymology for Polyketide and Nonribosomal Peptide Antibiotics：Logic，Machinery，and Mechanisms”Michael A.Fischbach and Christopher T.Walsh，Chem.Rev.2006，106，3468-3496和WO/00/58478中。在一些情况下，与NRPS的一些部分类似的生物催化剂也被用于生产经修饰的氨基酸(例如，作为尼柯霉素X中咪唑啉酮基元前体的新生霉素和β-羟基组氨酸中的氨基香豆素)，作为次级代谢产物的构建块。在细菌和低级真菌中，生产次级代谢产物所需的生物合成基因典型地在基因组上一个基因座中成簇。具体地，在使用NRPS的一个实施方案中，NRPS可以是模块非核糖体肽合酶，所述合酶包含赖氨酸特异性腺苷酸化结构域、肽基运载体结构域和硫代酯酶/环化结构域。
在一个特定的实施方案中，用于将赖氨酸环化成ACL的生物催化剂可被发现于下述基因簇中，所述基因簇编码bengamides、nocardiamycins、capuramycins、circinatins或含有次级代谢产物的任何其它ACL或ACL-衍生物的生物合成。此类基因簇可存在于生产这类化合物的任何微生物或其微生物内共生体中。可使用来自已知生物合成通路的信息通过本领域普遍已知的方法容易地鉴定此类基因簇，所述方法例如为基因组扫描、全基因组测序、使用简并引物的PCR或Southern杂交。特定的生物催化剂可由截短的NRPS模块构成，所述NRPS模块由赖氨酸活化特异性腺苷酸化结构域、肽基运载体结构域和特异性环化结构域构成。预期该环化结构域与催化环状非核糖体肽(如短杆菌酪肽(tyrocidin))大环化(macrocyclisation)的已知硫代酯酶同源。预期赖氨酸环化特异性的环化结构域含有允许其与其它环化硫代酯酶或硫代酯酶结构域差异化的特异性签名基序。赖氨酸环化所需的结构域可由一个开放读码框编码，得到模块生物催化剂，或者在单独的开放读码框中编码，得到单独的蛋白质，所述单独的蛋白质一起形成生物催化剂。在本发明中使用这类生物催化剂可以是有利的，因为所述反应与ATP的水解偶联，并因此(至少基本上)是不可逆的。
在本发明方法中制备的ACL可用于制备己内酰胺。这可以以化学方式完成，例如使用羟胺-o-磺酸和氢氧化钾或氢氧化钠在水、醇或其混合物中进行脱氨基来完成。合适的制备方法和随后的纯化步骤例如描述于WO 07/99029中。
在一个实施方案中，在本发明方法中制备的ACL被转化成(Z)-6，7-二氢-1H-氮杂卓-2(5H)-酮(6，7-DAO)。这可以化学方式完成，或由生物催化剂催化。6，7-DAO可被用作为用于制备己内酰胺的中间产物化合物。
6，7-DAO可尤其在下述方法中由ACL制备，所述方法包括：通过生物催化去除ACL的氨(由具有氨解酶活性的生物催化剂催化)，从α-氨基-ε-己内酰胺中生物催化性去除α-氨基，从而形成6，7-DAO，或者通过能够催化这类消除的另外的生物催化剂或能够催化这类氨基去除的另外的生物催化剂，从ACL去除α-氨基。
另外，6，7-DAO的化学制备可基于例如Reimschuessel，H.K.et al.J.Org.Chem.(1969)，34，969，其公开内容通过引用并入本文，尤其是涉及反应条件的公开内容。基于该方法，技术人员应当能够如下由ACL制备6，7-DAO：在存在HCl或HBr(或类似物)时用NaNO2使ACL叠氮化，藉此将形成的重氮ACL衍生物分别原位转化为α-氯或α-溴己内酰胺。可以如所述参考文献中所述，使用2，6-二甲基吡啶，在消除反应中将后者化合物(或使用不同的酸时的类似化合物)转化成6，7-DAO。
另外，去除ACL的α-氨基得到6，7-DAO可以例如通过氨消除或通过随后的转氨基反应、酮基还原和脱水来完成。去除反应可由一种或多种生物催化剂催化。
具体地，α-氨基的去除可以由包含裂合酶(EC 4)的生物催化剂催化。优选地使用C-N裂合酶(EC 4.3)，更优选地使用氨解酶(EC 4.3.1)。
催化ACL转化成6，7-DAO的生物催化剂可例如来自如上文所述的生物。
还可使用如下文所述的选择方法，选择合适的生物催化剂，用于将ACL转化成6，7-DAO。
例如，可使用下述文库来选择生物催化剂，所述文库包含用于从ACL去除α-氨基的可能的生物催化剂的集合。在用于发现合适的生物催化剂的选择方法中，将候选的生物催化剂与下述培养基接触，所述培养基中存在作为唯一氮源的ACL和/或至少一种ACL的功能性类似物。只有能够使用ACL-类似物作为氮源的这些微生物能够生长。
之后，选择在这类培养基上显示生长的一种或多种样品(所谓的“生长培养物”)。之后测试一种或多种这些生长培养物是否具有将ACL转化成6，7-DAO的活性。任选地，尤其是在仅一种或多种ACL-类似物被用作唯一氮源的情况下，首先针对显示转化一种或多种ACL-类似物的活性来对生长培养物加以检查，之后测试显示这类活性的一种或多种培养物将ACL转化成6，7-DAO的活性。
因此，在本发明的一个特定方面中，本发明涉及寻找能够催化从ACL去除α-氨基的生物催化剂的方法，所述方法包括：
-提供在一种或多种细胞培养物中包含多种候选生物催化剂的文库，所述培养物包含含有α-氨基-ε-己内酰胺和/或一种或多种其类似物作为唯一氮源的培养基；
-选择在所述培养基上生长的一种或多种候选者生物催化剂；和
-筛选出在所述培养物中生长的、具有从ACL中去除α-氨基的催化活性的生物催化剂。
在本文中使用时，术语“选择”被定义为一种方法，其中使用某些特定的条件针对生长来测试一种或多种生物催化剂，所述生长是存在期望的生物催化活性的指征。
在本文中使用时，术语“筛选”被定义为一种方法，其中针对一种(或多种)想要的生物催化转化测试一种或多种生物催化剂。
文库可尤其是宏基因组(metagenomic)文库，其包含微生物的基因组片段，所述片段可已被鉴定或者可以是未被鉴定的，并且所述片段已被克隆进用于表达的合适微生物如Escherichia、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces或Saccharomyces中。所述片段可原则上来自任何生物和一种或多种生物。所述生物可以是在现存条件下可培养或不可培养的，可具有特定的生境、需要特定的环境因素(例如温度、pH、光、氧、养分)或共生伴侣。具体地，所述生物可以是多细胞生物如海绵、昆虫、哺乳动物或植物的内共生体。
在一个实施方案中，文库包含含有候选生物催化剂的多种环境样品，尤其是多种水样品(例如废水样品)、堆肥(compost)样品和/或土壤样品。这类样品包含多种野生型微生物。
术语“ACL的功能性类似物”在本文中被用于表示所述类似物包含可被生物催化剂识别的功能性基团。具体地，功能性类似物可具有L-构型或D-构型或其任何比例的混合物，由α-位和任选地内酰胺氮上具有额外碳取代基的七元α-氨基内酰胺或α-氨基(硫代)内酯组成。
优选地，选择ACL类似物，所述类似物i)引起想要的ACL氨解酶活性或导致从ACL去除α-氨基的类似活性，和ii)具有消除副反应的低倾向。具体地，唯一的氮源可由式I或II表示的一种或多种化合物组成：
本文中R和R’独立地表示氢原子或有机基元，所述有机基元任选地包含一个或多个杂原子。有机基元R和R’中的杂原子可尤其选自N、S、O、F、Cl、Br和I原子。有机基元R和R’可尤其独立地选自经取代或未经取代的C1-C6烷基。X表示O原子或S原子。
使用一种或多种功能性类似物作为唯一的氮源是优选的，因为发明人考虑到使用ACL时找到假阳性的概率会更高。
寻找能够催化ACL转化成6，7-DAO的生物催化剂的另一合适的选择方法基于赖氨酸营养缺陷型补足。在本文中使用下述宿主细胞来表达筛选基因组或宏基因组文库，所述宿主细胞是赖氨酸营养缺陷型(auxotroph)，并且含有ACL-水解酶活性。这类宿主细胞可天然存在，或者可以例如通过在E.coli中使lysA基因失活并表达合适的ACL-水解酶来工程化。然后使用这样的宿主细胞构建如上文所述的文库，得到含有不同DNA片段的多种宿主细胞。多种细胞包含不同的经克隆的基因。
将宿主细胞与包含6，7-DAO作为唯一赖氨酸前体的培养基接触。然后选择在所述培养基上生长的一种或多种宿主细胞。之后通常针对将6，7-DAO转化成ACL的催化活性，测试一种或多种生长的宿主细胞。之后针对将ACL转化成6，7-DAO的催化活性，测试一种或多种生长的宿主细胞(通常选自具有将6，7-DAO转化成ACL的催化活性的宿主细胞)。具有这类活性的宿主细胞可以被用作生物催化剂，或者被用于由其获得生物催化剂。
因此，本发明还涉及检测能够催化从α-氨基-ε-己内酰胺去除α-氨基的生物催化剂的方法，所述方法包括：
-提供赖氨酸营养缺陷型宿主细胞，所述宿主细胞包含编码能够催化α-氨基-ε-己内酰胺转化成L-赖氨酸的酶的基因，所述宿主细胞包含编码具有赖氨酸环化酶活性的酶的候选基因；
-将所述宿主细胞与包含多种下述载体的文库接触，所述载体含有编码能够催化6，7-DAO转化成ACL的酶的候选基因，其中至少部分所述宿主细胞被提供有所述载体；
-将被提供有所述载体的宿主细胞与(Z)-6，7-二氢-1H-氮杂卓-2(5H)-酮和氨源接触；
-对在所述培养基中生长的一种或多种培养物加以选择；和
-针对从α-氨基-ε-己内酰胺生物催化去除α-氨基的催化活性筛选一种或多种生长的所述培养物，因为所述培养物提供了能够催化α-氨基-ε-己内酰胺的α-氨基消除的生物催化剂。
本发明人提出的另一合适的筛选方法基于在合适的宿主生物中使用分子报告子和报告子系统。若干这类系统已在本领域描述(Beggah，S.；Vogne，C.；Zenaro，E.；van der Meer，J.R.Microbial Biotechnology 2008，1(1)，68-78；Sint Fiet，S.；van Beilen，J.B.；Witholt，B.Proceedings of the National Academy of Sciences 2006，103(6)，1693-1698.)。在这样的系统中，合适的转录调节子(在本文中也称作受体)能够结合感兴趣的化合物如6，7-DAO或类似物。这样的受体可以是在例如对感兴趣的化合物的特异性和亲合力方面具有想要的特性的天然存在的受体。在大部分情况下，必须针对感兴趣的特定化合物和受体相互作用，通过本领域普遍已知的蛋白质改造方法，优化这些特性。结合后受体从与合适的报告子基因(在本文中也称作报告子)连接的合适启动子引发转录。合适的报告子原则上可以是对宿主菌株引起可检测的、优选地可定量的表型(如生产色素、荧光蛋白、补充营养缺陷型的酶或抗生素抗性标记物)的基因。
可以在宿主中建立这样的受体/报告子系统，并随后被用于筛选(例如使用荧光蛋白如绿色荧光蛋白作为报告子)或选择(例如使用抗生素抗性基因作为报告子)将ACL转化成6，7-DAO的合适的生物催化剂。将宿主细胞与包含ACL或其类似物的培养基接触。然后选择或筛选引起与报告子表达相对应的表型的一种或多种宿主细胞培养物。之后，通常针对将ACL转化成6，7-DAO的催化活性筛选一种或多种这类宿主细胞培养物。具有这类活性的宿主细胞可以被用作生物催化剂，或者被用于由其获得生物催化剂。
因此，本发明还涉及寻找能够催化从α-氨基-ε-己内酰胺去除α-氨基的生物催化剂的方法，所述方法包括：
-鉴定或改造特异性结合6，7-DAO的受体；
-将所述受体与合适的受体如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或抗生素抗性基因连接；
-通过一轮或多轮蛋白质改造，任选地优化6，7-DAO与受体的结合，获得针对6，7-DAO或其类似物的想要的特异性(即没有或有少量来自天然配体和/或ACL或类似物的信号)和想要的亲和力；
-在适用于宏基因组筛选的宿主中表达这类受体/报告子；
-将所述宿主细胞与包含多种下述载体的文库接触，所述载体含有编码能够催化6，7-DAO转化成ACL的生物催化剂(例如酶)的候选基因，其中至少部分所述宿主细胞包含所述载体；
-将包含所述载体的宿主细胞与ACL或其类似物接触；
-选择或筛选基于被选择的报告子的表达显示想要的表型的一种或多种培养物；和
-针对从α-氨基-ε-己内酰胺生物催化去除α-氨基的催化活性筛选一种或多种所述培养物，因为所述培养物提供了能够催化α-氨基-ε-己内酰胺的α-氨基消除的生物催化剂。
可以使用载体，通过常规手段将编码能够催化α-氨基-ε-己内酰胺转化成赖氨酸的生物催化剂(例如酶)的基因适当地引入宿主细胞中。
可以使用下述载体将编码具有赖氨酸环化酶活性的生物催化剂的候选基因适当地引入宿主细胞中，所述载体可以与编码能够催化α-氨基-ε-己内酰胺转化成赖氨酸的生物催化剂的载体相同或不同。
或者，可以由本发明方法中获得的ACL化学制备6，7-DAO。
在根据本发明的方法中，可以通过还原在本发明方法中制备的(Z)-6，7-二氢-1H-氮杂卓-2(5H)-酮的不饱和碳-碳双键得到己内酰胺，来产生ε-己内酰胺。
这类还原可以在存在能够催化所述还原的生物催化剂时进行。优选地，这类生物催化剂具有还原酶活性，尤其是6，7-DAO烯酮还原酶活性，即所述催化剂能够催化6，7-DAO中碳-碳双键的还原，从而形成己内酰胺。
具体地，生物催化剂可包含下述酶，所述酶选自氧化还原酶(EC1)的组，更具体地，氧化还原酶可以是作用于供体的CH-CH基团(EC1.3)的氧化还原酶或作用于NADH或NADPH(EC 1.6)的氧化还原酶。
更特别地，可以使用来自EC 1.3.1的氧化还原酶，如2-烯酮还原酶(EC 1.3.1.33)。
EC 1.6类酶的一个特定的例子是旧黄酶(old yellow enzyme)1(OYE1，EC 1.6.99.1)。用于还原6，7-DAO的生物催化剂可与辅因子组合使用，合适的辅因子是本领域已知的，这取决于使用的生物催化剂(酶)。
能够催化所述还原的生物催化剂可来自例如上文所述的生物。具体地，所述生物催化剂可来自酵母、植物、细菌、真菌、古细菌或哺乳动物。更具体地，能够催化所述还原的合适的生物催化剂可来自选自以下的微生物：Candida macedoniensis、Kluyveromyces lactis、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas syringae pv.glycinea、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae和Bacillus subtilis。
本发明上下文中任何生物催化步骤的反应条件可根据生物催化剂(尤其是酶)的已知条件，本文公开的信息和任选地一些常规实验来选择。
原则上，使用的反应介质的pH可以在宽泛的界限内选择，只要生物催化剂在所述pH条件下有活性即可。可以使用碱性、中性或酸性条件，这取决于生物催化剂和其他因素。当所述方法包括使用微生物(例如用于表达催化本发明方法的酶)时，选择pH使得所述微生物能够发挥其预期的一种或多种功能。在25℃下基本水性体系的情况下，尤其可在低于中性pH四个pH单位和高于中性pH两个pH单位的范围内选择pH，即在pH 3和pH 9之间选择。如果水是唯一的溶剂或主要的溶剂(以总液体为基础＞50wt.％，尤其是＞90wt.％)，则系统被认为是水性的，其中例如小量(以总液体为基础＜50wt.％，尤其是＜10wt.％)的醇或另一种溶剂可以下述浓度溶解(例如作为碳源)，所述浓度使得可以存在的微生物保持活性。尤其是在使用酵母和/或真菌的情况下，可优选酸性条件，尤其是25℃下基于基本水性体系的pH可以在pH 3到pH 8的范围内。需要时可以使用酸和/或碱调节或者用合适的酸和碱的组合缓冲pH。
原则上，孵育条件可以在在广阔的界限内选择，只要生物催化剂显示足够的活性和/或生长即可。条件可选自需氧、限氧和厌氧的条件。
厌氧条件在本文中被定义为下述条件：无任何氧，或其中生物催化剂(尤其是微生物)基本不消耗氧并且通常对应于少于5mmol/l.h的氧消耗，尤其是小于2.5mmol/l.h的氧消耗，或小于1mmol/l.h的氧消耗。
需氧条件是下述条件，其中对不受限制的生长而言足够水平的氧溶于培养基中，能够支持至少10mmol/l.h、更优选地多于20mmol/l.h、进一步更优选地多于50mmol/l.h、最优选地多于100mmol/l.h的氧消耗速率。
限氧条件被定义为下述条件：其中氧消耗由从气体转移至液体的氧限制。限氧条件的下限由厌氧条件的上限决定，即至少1mmol/l.h，尤其是至少2.5mmol/l.h，或更特定地至少5mmol/l.h。限氧条件的上限由需氧条件的下限决定，即少于100mmol/l.h、少于50mmol/l.h、少于20mmol/l.h或少于10mmol/l.h。
条件是需氧、厌氧还是限氧取决于所述方法进行的条件，尤其是进入气流的量和组成、使用的设备的实际混合/质量转移特性、使用的微生物的类型和微生物密度。
原则上，使用的温度不是关键性的，只要生物催化剂(尤其是酶)显示大量活性即可。通常，温度可以是至少0℃，尤其是至少15℃，更尤其是至少20℃。想要的最大温度取决于生物催化剂。通常这类最大温度是本领域已知的，例如在可商业获得的生物催化剂的情况下在产品数据表中指出，或者可以基于公知常识和本文公开的信息常规地测定。温度通常是90℃或更低，优选地是70℃或更低，尤其是50℃或更低，更尤其是40℃或更低。
具体地，如果生物催化反应在宿主生物外进行，则可以高浓度(例如基于总液体大于50wt.％，或大于90wt.％)使用包含有机溶剂的反应介质，使得使用的酶在这样的介质中保持足够的活性。
在一个有利的方法中，利用己内酰胺或形成己内酰胺的中间产物(ACL，6，7-DAO)的底物进行全细胞生物转化，所述转化包含利用下述微生物和所述微生物的碳源，所述微生物中生产赖氨酸环化酶和解氨酶和/或具有从ACL中去除α-氨基的活性的生物催化剂，和6，7-DAO烯酮还原酶和/或能够将6，7-DAO还原成己内酰胺的其它生物催化剂。
碳源可尤其含有至少一种选自下组的化合物：一元醇、多元醇、羧酸、一氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括任何所述化合物的混合物。合适的一元醇包括甲醇和乙醇。合适的多元醇包括甘油和碳水化合物。合适的脂肪酸或甘油三酯可尤其以食用油的形式提供，优选地为植物来源的。
尤其可以使用碳水化合物，因为通常碳水化合物可从生物可更新来源如农产品(优选地农业废料)中大量获得。优选地，使用选自下组的碳水化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蔗二糖、淀粉、纤维素和半纤维素。尤其优选的是葡萄糖、包含葡萄糖的寡糖和包含葡萄糖的多糖。
认为赖氨酸浓度可以在纳米摩尔范围(1-1000nmol/l)、微摩尔范围(1-1000μmol/l)或mmol/l范围(1-1000mmol)内，或者是超出1mol/l的浓度。
具体地，在赖氨酸的制备和转化细胞内地发生于相同的细胞中或细胞外地发生于锅式进程(pot-type process)的情况下，1nmol/l或更多、100nmol/l或更多、1μmol/l或更多、10μmol/l或更多、或100μmol/l或更多的浓度可以已经提供了对可接受或有利的转化率而言足够浓度的赖氨酸。当赖氨酸制备以细胞内方式发生于与其转化相同的细胞中时，所述浓度尤其可以是赖氨酸的细胞内浓度。在这种实施方案中赖氨酸的细胞外浓度可可观地更低；甚至为0(即低于检出界限)。
当赖氨酸在生物内被转化而赖氨酸的制备发生在所述生物外时，或者当赖氨酸的制备发生于不同的反应体系中并且为了将赖氨酸转化成ACL使用从生物中分离的酶时，6，7-DAO的浓度通常至少为1μmol/l，尤其是至少100μmol/l，更尤其至少1mmol/l或至少10mmol/l(使用生物时存在所述生物的培养基中的细胞外浓度；或使用从生物中分离的酶时，其中赖氨酸被转化的反应介质中的浓度)。
赖氨酸浓度上限不是尤其关键的。赖氨酸浓度可超出1mol/l、1mol/l或更少、尤其是0.5mol/l或更少、或0.1mol/l或更少。
可以使用本领域本身已知的分子生物学技术，构建包含用于在本发明方法中催化反应步骤的一种或多种酶的细胞，尤其是重组细胞。例如，如果要在重组细胞(其可以是异源体系)中生产一种或多种生物催化剂，则这类技术可以被用于提供下述载体，所述载体包含一个或多个编码一种或多种所述生物催化剂的基因。可以使用各自包含一个或多个基因的一个或多个载体。可以使用一个或多个载体，每个载体包含一个或多个这类基因。这类载体可包含一个或多个调节元件，例如一个或多个启动子，所述启动子可与编码生物催化剂的基因可操作地连接。
在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指功能性相互关系中多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的一种连接。当核酸序列被置于与另一核酸序列的功能性相互关系之中时，所述核酸序列是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述编码序列可操作地连接。
在本文中使用时，术语“启动子”是指一种核酸片段，其功能是控制一个或多个基因的转录，根据转录的方向位于基因的转录起点上游，并且结构上由DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和任何其它DNA序列的存在识别，所述任何其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻抑因子和激活因子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的直接或间接地作用以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。当用于指出给定的(重组的)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的相互关系时，术语“同源的”应当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种(优选地相同变种或菌株)的宿主细胞或生物生产。
可用于实现编码本发明方法中使用的生物催化剂(尤其是赖氨酸环化酶)和任选地至少一种选自解氨酶(ammonia lyase)和6，7-DAO烯酮还原酶组(如上文所述)的生物催化剂的核酸序列表达的启动子对编码要表达的生物催化剂的核苷酸序列而言可以是天然的，或者可以对与之可操作地连接的核酸序列(编码序列)而言是异源的。优选地，启动子对宿主细胞而言是同源的，即内源的。
如果使用(对编码感兴趣的生物催化剂的核酸序列而言)异源启动子，则所述异源启动子优选地能够生产比编码序列的天然启动子更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子)。本发明上下文中合适的启动子包括本领域技术人员已知的组成型和诱导型启动子以及经改造的启动子。
“强组成型启动子”是与天然宿主细胞相比引起mRNA以高频率起始的启动子。革兰氏阳性微生物中这类强组成型启动子的例子包括SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。
革兰氏阳性微生物中诱导型启动子的例子包括IPTG诱导型Pspac启动子，木糖诱导型PxylA启动子。
革兰氏阴性微生物中组成型和诱导型启动子的例子包括，但不限于tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、tra(PBAD)、SP6、λ-PR和λ-PL。
用于(丝状)真菌细胞的启动子是本领域已知的，并且可以是例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子，蛋白酶启动子如pepA、pepB、pepC，葡糖淀粉酶glaA启动子，淀粉酶amyA、amyB启动子，过氧化氢酶catR或catA启动子，葡萄糖氧化酶goxC启动子，β-半乳糖苷酶lacA启动子，α-葡萄糖苷酶aglA启动子，翻译延伸因子tefA启动子，木聚糖酶启动子如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD，纤维素酶启动子如eglA、eglB、cbhA，转录调节子的启动子如areA、creA、xlnR、pacC、prtT或任何其它，并且可以在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)上找到其他。
在关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质的方面，使用术语“异源的”表示下述核酸或蛋白质，其不作为其存在的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的部分天然存在，或其存在于与其天然存在的细胞或位置基因组或DNA或RNA序列中的位点不同的地方。异源核酸或蛋白质对其被引入的细胞而言不是内源的，但是得自另一细胞或被合成或重组地生产。一般地(尽管并非必须)，这类核酸编码下述细胞通常不生产的蛋白质，所述DNA在所述细胞中被转录或表达。类似地，外源RNA编码下述蛋白质，所述蛋白质在存在所述外源RNA的细胞中通常不表达。异源核酸和蛋白质也可以被称作外来核酸或蛋白质。在本文中术语异源核酸或蛋白质包括本领域技术人员会识别为对于下述细胞是异源或外源的任何核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质在所述细胞中被表达。
根据本发明的方法可以在宿主生物中进行，所述宿主生物可以是新颖的。因此，本发明还涉及包含一种或多种能够催化赖氨酸转化成ACL的生物催化剂的新颖宿主细胞。本发明还涉及包含一种或多种编码能够催化赖氨酸转化成ACL的生物催化剂(尤其是酶)的一个或多个基因的新颖载体，本发明还涉及包含一种或多种下述载体的新颖宿主细胞，所述载体包含一种或多种编码能够催化赖氨酸转化成ACL的生物催化剂(尤其是酶)的一个或多个基因。
对根据本发明的宿主细胞或载体而言一个或多个合适的基因可尤其选自编码上文所述生物催化剂(如酶)的基因。这类基因可尤其包含编码Sequence ID 4、Sequence ID 6所示的生物催化剂的核酸序列或任何这些序列得同源物。合适的核酸序列的例子在Sequence ID 3和Sequence ID 5中给出。核酸序列可来自野生型生物。还可使用非野生型序列，其中为了在感兴趣的宿主生物中提高表达，对一个或多个密码子进行了优化。
根据本发明的方法可部分或全部在宿主生物中进行。因此，本发明还涉及下述新颖的载体，所述载体包含编码能够催化一个或多个反应步骤的一个或多个生物催化剂(尤其是酶)的一个或多个基因，还涉及包含一个或多个下述载体的新颖的宿主细胞，所述载体包含编码能够催化一个或多个反应步骤的一种或多种生物催化剂(尤其是酶)的一个或多个基因。
在一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞包含至少一个重组载体，所述载体包含编码具有赖氨酸环化酶活性的生物催化剂(尤其是酶)的核酸序列。任选地，所述细胞包含编码具有解氨酶活性的生物催化剂(尤其是酶)的核酸序列。在一个特定的实施方案中，提供了包含编码具有解氨酶活性的生物催化剂(尤其是酶)的核酸序列的重组载体，所述序列可处于与编码具有赖氨酸环化酶活性的生物催化剂的序列相同或不同的载体中。任选地，所述细胞包含编码具有6，7-DAO烯酮还原酶活性的生物催化剂(尤其是酶)。在一个特定的实施方案中，提供了包含编码具有6，7-DAO烯酮还原酶活性的生物催化剂(尤其是酶)的核酸序列的重组载体，所述序列可处于与编码具有赖氨酸环化酶活性的生物催化剂的序列相同或不同的载体中。
在一个有利的实施方案中，本发明的细胞包含编码具有赖氨酸环化酶活性的生物催化剂的核酸序列，编码具有解氨酶活性的生物催化剂的核酸序列，和编码具有6，7-DAO烯酮还原酶活性的生物催化剂的核酸序列。这类细胞尤其适用于由赖氨酸制备己内酰胺的方法，其中要避免的完全化学的(即非生物催化的)反应步骤至少被可观地减少。因此，细胞可被用作由赖氨酸制备己内酰胺的所有反应步骤的生物催化剂，所述步骤可在至少一些实施方案中细胞内地发生。例如，细胞可以是天然微生物或重组生物。在重组生物中存在至少一种、至少两种或至少三种重组核酸序列，用于编码任何所述生物催化剂(通常为酶)。
宿主细胞可例如选自细菌、酵母和真菌的组。具体地来自选自Aspergillus、Penicillium、Saccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Candida、Hansenula、Bacillus、Corynebacterium、Pseudomonas、Gluconobacter和Escherichia的组的属，其中如上文所述的一种或多种编码核酸序列已被克隆和表达。
具体地，宿主细胞可选自Escherichia coli、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Saccharomyces cervisiae、Hansenula polymorpha、Candida albicans、Kluyveromyces lactis、Pichia stipitis和Pichia pastoris宿主细胞的组。在一个优选的实施方案中，宿主细胞能够生产赖氨酸(作为前体)。
宿主细胞原则上可以是天然存在的生物，或者可以是经改造的生物。这样的生物可以使用本领域已知的突变筛选或代谢改造策略来改造。例如，这样的宿主细胞可选自Corynebacterium属，尤其是C.glutamicum，肠细菌，尤其是Escherichia coli，Bacillus，尤其是B.subtilis和B.methanolicus，和Saccharomyces，尤其是S.cerevisiae。特别优选的是已针对赖氨酸的工业生产开发的C.glutamicum或B.methanolicus菌株。
在一个特定的实施方案中，宿主细胞天然地包含(或者能够生产)一种或多种适用于催化本发明方法中反应步骤的酶。
接着，本发明将通过以下实施例阐述。
实施例
一般的：
分子和遗传技术
标准遗传和分子生物学技术是本领域普遍已知的，并且先前已被描述(Maniatis et al.1982“Molecular cloning：a laboratory manual”.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Miller 1972“Experiments in molecular genetics”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor；Sambrook and Russell 2001″Molecular cloning：a laboratory manual”(3rd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；F.Ausubel et al，eds.，″Current protocols in molecular biology″，Green Publishing and Wiley Interscience，New York 1987)。
质粒和插入物的鉴定
通过本领域普遍已知的遗传、生物化学和/或表型手段鉴定带有不同基因的质粒，所述手段例如转化体对抗生素的抗性，对转化体的PCR诊断性分析或质粒DNA的纯化，对经纯化的质粒DNA的限制性分析或DNA序列分析。
实施例1
由赖氨酸生物催化合成ACL
1.1用于测定赖氨酸和ACL的HPLC-MS分析
通过赖氨酸和ACL二者的外部校准曲线进行校准。Lys在2.4分钟(ESI(-)-MS，m/z 145)的滞留时间(Rt)处洗脱，ACL在4.4分钟(ESI(+)-MS，m/z 129)处洗脱。
LC-UV-MS实验在Agilent 1100上进行，所述Agilent 1100装有四元泵、除气器、自动取样机、柱温箱和具有10-mm单元的二极管-排列检测器(DAD)和飞行时间MS(Agilent，Waldbronn，德国)。
LC-UV-MS条件为：
柱：与250x4.6mm id.Prevail C18，5μm(Alltech)偶联的50x4.6mm Nucleosil C18，5μm(Mancherey & Nagel)前柱
洗脱液：超纯水中0.1(％v/v)的甲酸
流速：1ml/分钟，进入MS之前1∶3分流
梯度：无梯度
注射体积：5μl
UV检测：不使用UV进行检测
MS检测：ESI-MS，在Rt 0-4分钟使用负模式，在4-10分钟使用正模式。电喷射电离(ESI)使用以下条件：m/z 50-3600，175V碎裂电压，350℃干燥气体温度，10L N2/分钟干燥气体，50psig雾化器压强和2.5kV毛细管电压。
1.2生物催化剂的构建
从R.erythropolis NCIMB 11540中分离染色体DNA
按照用于从革兰氏阳性细菌中分离染色体DNA的QIAGEN Genomic DNA Handbook(QIAGEN，Hilden，德国)的一般流程，分离来自Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540的染色体DNA。通过使用QIAGEN Genomic-tip 500/G柱(QIAGEN，Hilden，德国)和制造商的流程，纯化粗制制剂。
R.erythropolis赖氨酸环化酶基因的PCR扩增：
用于扩增R.erythropolis NCIMB 11540赖氨酸环化酶PCR-反应的引物序列含有NdeI(正向引物)和SphI(反向引物)的限制性位点(加有下划线)，以允许将序列克隆进质粒pMS470Δ8中(Balzer et al.，Nucleic Acids Research，1992，20(8)：1851-1858)。
R.erythropolis-正向[SEQ ID No.1]：
5’-CTCATATGGC GACAATCCGA CCTGACG-3’
R.erythropolis-反向[SEQ ID No.2]：
5’-CTGCATGCTT GTTGTCTGAC AGTGCGTC-3’
根据供应商手册使用Synergy
-聚合酶(GeneCraft，Cologne，德国)，以允许对PCR产物进行TA-克隆。PCR温度谱如下：1)95℃ 15分钟；2)94℃ 1分钟，60℃ 0.5分钟，72℃ 4分钟(30x)；3)72℃ 10分钟。PCR反应的产物在分析性琼脂糖凝胶上形成具有预期大小的清楚条带。
使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)，通过制备性琼脂糖凝胶电泳，纯化15μl PCR产物。使用2μl DNA-溶液作为进入pCR
II质粒的Invitrogen TA-Topo克隆步骤的插入物，随后转化E.coli Top10F’。通过LB/氨苄西林/IPTG/X-Gal平板上的白/蓝筛选选择阳性克隆。挑取白色菌落并制备用于质粒分离。使用EcoRI的限制性分析显示克隆pCR-33/3/1带有具有期望尺寸的插入物。使用M13f(-20)和M13rev-引物的DNA测序证实编码来自Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540的赖氨酸环化酶[SEQ ID No.4]的目的赖氨酸环化酶基因[SEQ ID.No.3]的正确片段已被克隆。
将pCR-33/3/1-插入物克隆进pMS470Δ8
通过标准流程从E.coli分离质粒pMS470Δ8(Balzer et al.，Nucleic Acids Research，1992，20(8)：1851-1858)。使用NdeI和SphI的双限制性消化得到两个片段，从中由琼脂糖凝胶洗脱4kb的部分。用NdeI和SphI消化pCR-33/3/1。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)分离并纯化1.6kb片段。用T4-DNA-连接酶(Invitrogen)，在16℃下过夜进行线性化的pMS470片段和SphI/NdeI基因片段的连接。E.coli DH10B的转化和用EcoRI对氨苄西林克隆质粒进行的限制性分析得到带有pMS470-33/3/1/11质粒的克隆。
培养E.coli DH10B pMS470-33/3/1/11-1
在ISF-200实验室发酵罐(Infors，Bottmingen，瑞士)中以十升规模进行用于生产R.erythropolis NCIMB 11540赖氨酸环化酶的发酵。为了接种发酵罐，使用0.5l Terrific Broth(TB；12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物、4g/l甘油、2.31g/l KH2PO4、12.54g/l K2HPO4、pH 7.0，含有100μg/ml羧苄西林)中的过夜(24小时)起始培养物，所述起始培养物自身用0.1ml相应的E.coli DH10B pMS470-33/3/1/11-1甘油菌种培养物接种。
通过在OD620＝0.8的细胞浓度下添加0.5mM IPTG(终浓度)，诱导R.erythropolis NCIMB 11540赖氨酸环化酶的表达。培养20.5小时(OD620＝6.4)后，通过离心收获细胞(4℃下12,227xg 12分钟)。
制备E.coli DH10B pMS470-33/3/1/11-1的无细胞提取物
用20mM HEPES缓冲液(pH 7.0)洗涤E.coli DH10B pMS470-33/3/1/11-1(117g)的湿细胞(wet cell)并重悬于350ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。在1300bar下在nanojet匀化器(Haskel，Wesel，德国)中破碎细胞并随后离心(4℃下32,000xg 60分钟)，以获得无细胞提取物(上清液)。将无细胞提取物以10ml的小份冷冻并储存于-20℃下直至再次使用。
表达[SEQ ID No.5]所示核酸序列的E.coli的发酵
如US 7,241,602中所述发酵表达编码[SEQ ID No.6]中所示赖氨酸环化酶的如[SEQ ID.5]所示的核酸序列的Escherichia coli细胞，其中如US 7,241,602的表1中所述使用进料谱(feed profile)引入进料1。
由E.coli的细胞制备酶溶液LAM0011
如US 7,241,602中所述制备酶溶液LAM0011，所述酶溶液含有来自下述E.coli细胞的如[SEQ ID No.6]中所述的赖氨酸环化酶，所述细胞表达如[SEQ ID No.5]中所述的核酸序列。
ACL的生物催化合成
制备100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0，含1mM ZnSO4)中70mM L-赖氨酸.HCl和1mM ZnSO4的底物溶液。为了起始反应，向9ml底物溶液中添加1ml E.coli DH10B pMS470-33/3/1/11-1的无细胞提取物或1ml酶溶液LAM0011。将反应混合物在摇床上于37℃下孵育96小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物(不含无细胞提取物)和生物空白(由添加至不含L-赖氨酸.HCl的9ml 50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0中的1ml E.coli DH10B pMS470-33/3/1/11-1无细胞提取物或1ml酶溶液LAM0011组成)。孵育96小时后取样并通过HPLC-MS分析。结果概括于下表中。
表1：在存在酶溶液LAM0011和E.coli DH10B pMS470-33/3/1/11-1无细胞提取物时由L-赖氨酸形成ACL
生物催化剂 ACL浓度[mg/kg]
酶溶液LAM0011 4.2
E.coli DH10B pMS470-33/3/1/11-1的无细胞提取物 0.2
显示：L-赖氨酸到ACL的转化由表1中所述每种生物催化剂催化。在化学和生物学空白样品中未检测到ACL。
Claims (17)
1.用于制备α-氨基-ε-己内酰胺的方法，所述方法包括将赖氨酸转化成α-氨基-ε-己内酰胺，其中所述转化由生物催化剂催化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述生物催化剂具有赖氨酸环化酶活性。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述生物催化剂包含选自水解酶(EC 3)组的酶，尤其是选自作用于酯键的水解酶(EC 3.1)和作用于并且肽键的碳-氮键的水解酶(EC 3.5)组的酶。
4.根据权利要求3的方法，其中所述水解酶选自羧酸酯水解酶(EC3.1.1)、作用于线性酰胺的水解酶(EC 3.5.1)和作用于环状酰胺的水解酶(EC 3.5.2)的组。
5.根据权利要求4的方法，其中所述水解酶选自猪肝酯酶(EC3.1.1.1)、作用于线性酰胺的水解酶(EC 3.5.1)、L-赖氨酸-1，6-内酰胺水解酶(EC 3.5.2.11)和6-氨基己酸-环状二聚体水解酶(3.5.2.12)的组。
6.根据权利要求3、4或5的方法，其中所述酶选自来自下述生物或生物的部分的、能够催化赖氨酸环化成α-氨基-ε-己内酰胺的酶的组，所述生物选自哺乳动物、Jaspis、Poechillastra、Periconia、Pachastrella、Myxococcus、Nocardia、Streptomyces、Ochrobactrum、Rhodococcus、Enterobacter、Thermus、Aspergillus、Methylophilus、Mycobacterium、Citrobacter、Alcaligenes、Achromobacter、深海分离株PC 12/1000-B4、Providencia、Tremella、Cryptococcus、Candida和Trichosporon的组。
7.根据权利要求6的方法，其中所述生物选自选自Ochrobactrum、Rhodococcus、Aspergillus、Citrobacter、Providencia、Tremella、Cryptococcus、Candida和Trichosporon的组的生物的组。
8.根据前述权利要求任一的方法，其中所述生物催化剂包含SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6所示氨基酸序列或任何这些序列的同源物。
9.根据权利要求8的方法，其中所述氨基酸序列与任何所述SequenceID具有至少80％、尤其是至少90％、更尤其是至少95％的序列同一性。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述方法在水性环境中进行。
11.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，所述方法包括使用肽合酶将赖氨酸转化成α-氨基-ε-己内酰胺。
12.制备(Z)-6，7-二氢-1H-氮杂卓-2(5H)-酮的方法，所述方法包括：在根据前述权利要求中任意一项所述的方法中制备α-氨基-ε-己内酰胺之后，从α-氨基-ε-己内酰胺去除α-氨基。
13.用于制备ε-己内酰胺的方法，所述方法包括：在根据权利要求12的方法中制备(Z)-6，7-二氢-1H-氮杂卓-2(5H)-酮之后，还原(Z)-6，7-二氢-1H-氮杂卓-2(5H)-酮的碳-碳双键。
14.包含至少一种下述重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含编码具有赖氨酸环化酶活性的生物催化剂的核酸序列。
15.根据权利要求14的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码具有氨解酶活性的生物催化剂的核酸序列。
16.根据权利要求14或15的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由Aspergillus、Penicillium、Saccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Candida、Hansenula、Bacillus、Corynebacterium和Escherichia构成的属组。
17.根据权利要求14-16中任意一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码下述生物催化剂的核酸序列，所述生物催化剂包含SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。
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