CN113302310B - 单步生物催化酰胺化 - Google Patents

单步生物催化酰胺化 Download PDF

Info

Publication number
CN113302310B
CN113302310B CN201980089131.2A CN201980089131A CN113302310B CN 113302310 B CN113302310 B CN 113302310B CN 201980089131 A CN201980089131 A CN 201980089131A CN 113302310 B CN113302310 B CN 113302310B
Authority
CN
China
Prior art keywords
calb
proline
reaction
amidation
ammonia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980089131.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113302310A (zh
Inventor
彼得·珀依克劳尔
菲利普·赛利格
克里斯托弗·津甘奈尔
朱莉娅·比泽
安盾·金尔德
沃尔夫冈·克鲁蒂尔
克斯廷·斯坦纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ACIB GmbH
Original Assignee
ACIB GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ACIB GmbH filed Critical ACIB GmbH
Publication of CN113302310A publication Critical patent/CN113302310A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113302310B publication Critical patent/CN113302310B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于无保护氨基酸的生物催化酰胺化的方法，其包含以下步骤：在有机溶剂和酶的存在下，使无保护氨基酸与氨源接触。

Description

单步生物催化酰胺化
技术领域
本发明涉及生物催化酰胺化的领域。具体地说，本发明涉及一种用于无保护氨基酸的生物催化酰胺化的方法，其包含以下步骤：在有机溶剂和酶的存在下，使无保护氨基酸与氨源接触。
背景技术
酰胺官能团构成了许多天然和合成结构的基本骨架。它尤其存在于蛋白质、药物和聚合物中，使其成为开发化学和生物催化过程的有吸引力的目标。两个领域都存在许多酰胺合成策略(Lundberg H.等人,《化学学会综述(Chem.Soc.Rev.)》43,2714(2014)、Pitzer J.等人,《生物技术杂志(J.of Biotechnol.)》235,32-46(2016))。在ACS GCI制药圆桌会议的投票中强调了改进酰胺形成方法的重要性和要求。避免差的原子经济性试剂的酰胺形成被选为制药公司最感兴趣的反应，以获得更好和更环保的试剂。
以前的努力主要集中在由例如酯的活化物质或如长链脂肪酸和胺的亲脂性底物形成酰胺上。辛酸的酰胺化例如经由酯中间体执行，因为直接氨解导致形成盐而不是所需的辛酰胺。无溶剂体系用于脂肪酸与外消旋2-乙基己胺的对映选择性酰胺化。除了酰胺化反应之外，酰胺形成也可以通过使用例如γ-谷氨酰转移反应(Tachiki等人,《生物科学生物技术生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)》62(7),1279-1283(1998))生物催化地执行。
此外，报告了各种伯胺的选择性酶动力学拆分用于用CalB在己烷中使羧酸酯和酸酰胺化。最简单明了的方法，羧酸与氨的反应，很少实现。Cbz保护的氨基酸和肽，以及带有游离N端胺的肽已成功地通过蛋白酶Alcalase CLEA转化为酰胺，该蛋白酶对α-羧酸具有特异性(Nuijens,T.等人,《四面体通讯(Tetrahedron Lett.)》53,3777-3779(2012))。此外，Cbz保护的氨基酸和肽已借助脂肪酶CalB使用铵盐或氨转化为酰胺(Nuijens,T.等人,《四面体通讯》53,3777-3779(2012))。
由于未受保护的氨基酸在有机溶剂中的溶解度低，因此用CalB使它们直接酰胺化预计是不可行的(Litjens M.J.J.等人,《四面体(Tetrahedron)》55,12411-12418(1999))。
考虑到绿色化学的原则，包括原子效率和废物预防，避免衍生化步骤是高度期望的。然而，尚未完成未衍生化氨基酸的生物催化酰胺化。因此，仍然需要一种改进的用于未受保护的氨基酸的直接生物催化酰胺化的方法。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种改进的用于未受保护的氨基酸的直接生物催化酰胺化的方法。
根据本发明，该目的通过提供用于未受保护的氨基酸的生物催化酰胺化的一步法来解决。
因此，本发明涉及一种用于无保护氨基酸的生物催化酰胺化的方法，其包含以下步骤：在有机溶剂和酶的存在下，使无保护氨基酸与氨源接触。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中酶是脂肪酶。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中脂肪酶是南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CalB)或其变体。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中CalB变体包含参考SEQ ID NO:1编号的氨基酸取代T57A/A89T/G226R/R168K。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中酶被固定。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中氨源是氨(NH3)、氨基甲酸铵、碳酸铵、苄胺、乙醇胺、己胺、2-苯乙胺或3-苯丙胺，或其任何混合物。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中有机溶剂选自由二噁烷、2-甲基-2-丁醇和叔丁醇组成的组，或选自离子液体。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中未受保护的氨基酸是L-脯氨酸。
本发明的一个实施例涉及如本文所述的方法，其在60至80℃范围内的温度下进行。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中氨包含于有机溶剂中。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中反应介质中的水含量低于1.0v/v％，或低于0.5v/v％。
本发明的另一实施例涉及如本文所述的方法，其中方法以分批或连续模式执行。
本发明的一个实施例涉及如本文所述的方法，其中未受保护的氨基酸以0.01-1.0％w的量提供并且酶以0.01-1.0％w的量提供。
附图说明
图1描绘了在有机溶剂中的L-脯氨酸与氨的生物催化酰胺化形成L-脯氨酰胺和水的反应流程。
图2描述了在具有约0.5M NH3的不同溶剂(500μL)中用CalB435执行的L-脯氨酸(33mM)的转化。
图3示出了向用CalB435执行的L-脯氨酸(33mM)在具有约0.5M NH3的2-甲基-2-丁醇(MeBuOH)(500μL)中的反应中添加H2O的影响。
图4示出了在氨基甲酸铵和CalB 435的情况下L-脯氨酸在不同溶剂中的转化。示出了以[mM]为单位的底物和产物的转化率和浓度。
图5示出了L-脯氨酸在NH3、1,4-二噁烷(500μL)或2-甲基-2-丁醇(MeBuOH)或叔丁醇(t-BuOH)中的生物催化转化结果。
图6示出了在添加氨基甲酸铵(30mg，7.5当量)的情况下L-脯氨酸的生物催化转化结果。
图7示出了L-脯氨酸在2-甲基-2-丁醇、NH3、CalB 435或2倍、3倍、6倍量的酶(E，即CalB435)和底物(S，即L-脯氨酸)中的生物催化转化结果。
图8示出了L-脯氨酸或三倍量的L-脯氨酸在2-甲基-2-丁醇和NH3中的生物催化转化结果。
图9示出了相对于相同量的酶制剂标准化的不同的CalB制剂的影响。
图10示出了相对于酶负载量标准化的不同CalB制剂的影响(以酰胺浓度/mg CalB为单位)。
图11示出了各种羧酸与NH3的生物催化酰胺化。
图12示出了胺供体范围。
图13描绘了CalBopt的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明的目标是开发一种具有高转化率的用于无保护氨基酸的生物催化酰胺化的一锅法，该方法也可大规模应用。主要挑战之一是高极性带电底物在亲脂性溶剂中的低溶解度。由于反向水解反应和酶抑制的问题，必须避免其中底物高度可溶的反应介质，例如水或甲醇。常推荐用于无水极性环境的选项是离子液体和低共熔溶剂。
如本文所述的改进方法适合于带有氨基部分的羧酸，特别适用于氨基酸，其中氨基未被保护基团，如氨基甲酸苄酯(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)或芴基甲氧羰基(Fmoc)覆盖。优选地，它是无保护氨基酸，更优选地是无保护L-脯氨酸。任选地，如本文所述的方法还可适合于无保护羧酸，例如非脂肪羧酸，例如苯丙酸、环戊酸。
如本文所用，术语“无保护氨基酸”是指其中α-氨基或任何侧链官能团均不受保护基团，如氨基甲酸苄酯(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)或芴基甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸。优选地，无保护氨基酸是L-脯氨酸。
考虑到无保护氨基酸，用L-脯氨酸和D-脯氨酸获得良好的酰胺形成。对于L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸，检测到低酰胺形成。然而，对于其他测试的氨基酸(L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酰胺、D-天冬氨酸和D,L-丝氨酸)，通过HPLC-MS未观察到酰胺形成。令人惊讶的是，甚至在L-脯氨酸作为底物时观察到L-脯氨酰胺的无外消旋化合成。
在本文中，描述了在一个步骤中的未受保护的氨基酸例如L-脯氨酸与氨的生物催化酰胺化(图1)。
为了研究反应体系的底物范围，以2-甲基-2-丁醇(2M2B或MeBuOH)作为溶剂测试了不同的羧酸、芳香族酸和氨基酸。在标准条件下，用NH3和CalB435吲哚-3-乙酸和3-(4-羟基苯基)丙酸示出比肉桂酸明显更高的酰胺形成(图11)。在苯甲酸或扁桃酸与CalB 435和NH3的情况下几乎没有观察到转化。
评估了不同有机溶剂，在二异丙醚和叔丁基甲基醚中酰胺产率最高。酶、氨源和溶剂的正确选择似乎决定了底物的酰胺化是否发生。庞大的底物(如吲哚-3-乙酸)的转化得非常好-然而，添加了L-色氨酸的氨基，将转化率降低至痕量。另一方面，如在3-(4-羟基苯基)丙酸中那样将羟基添加到芳环会导致高于80％的高转化率。
当测试受保护的氨基酸时，对于N-Cbz-L-丙氨酸，测量到了低的酰胺转化率，而通过HPLC-MS未检测到N-Cbz-L-苯丙氨酸的酰胺化。结果表明，就此而言溶剂的选择也是基本参数。以前，在1,4-二噁烷中用CalB对N-Cbz-L-脯氨酸获得的转化率非常高。有趣的是，当使用2M2B时，转化率显著降低。用固定在树脂8285(ECR8285，)上的CalB435以及CalBopt(CalB变体T57A/A89T/G226R/R168K)也可以看到这种效果。
在1,4-二噁烷中用NH3进行进一步测试。受保护的氨基酸(N-Fmoc-L-脯氨酸、N-Cbz-L-丙氨酸)、脂肪酸(己酸、辛酸、癸酸)、各种带有芳香族部分的羧酸(3-苯基丙酸、3-(4-羟基苯基)丙酸、吲哚-3-乙酸、2-(4-异丁基苯基)丙酸(布洛芬)、2-苯基丙酸、3-羟基-4-甲氧基-苯乙酸)和环酸(环戊烷羧酸、己烷羧酸)转化为酰胺。结果指示，在1,4-二噁烷与NH3中的最高转化率是用长链或环状脂肪酸和庞大的芳香族酸获得的。
用于催化生物分子酰胺化的酶涵盖几个结构和功能蛋白质家族。例如，酰胺化可以经由转酰基作用来实现。几种酶通过酰基供体的共价系栓来催化酰基受体的取代。丝氨酸蛋白酶家族和α/β水解酶折叠超家族的许多酶已被证明可催化转酰基作用。
两类感兴趣的酶属于α/β水解酶折叠超家族：脂肪酶(三酰甘油水解酶；E.C.3.1.1.3)和酯酶(羧酸酯酶；E.C.3.1.1.1)。然而，脂肪酶更喜欢长链而不是短链酰基甘油酯底物，而酯酶倾向于使用相对极性的底物(Goswami A.等人,《分子生物系统(MolBiosyst.)》2015年2月20日；11(2):338-353)。此外，还可以使用蛋白酶或酰胺酶。合适的酶可以衍生自例如南极假丝酵母、红假丝酵母(Candida rugosa)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)和米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)以及枯草杆菌蛋白酶A(Subtilisin A)。
南极假丝酵母脂肪酶(CAL)是研究最彻底的酶之一，并且将胺和酯转化为酰胺(Yang B.等人,《印度化学杂志(Indian J.Chem.)》44B,2005年6月,1312-1316)。Xiang-Quian Peng(《应用生物化学与生物技术(Appl Biochem Biotechnol)》(2013)169:351-358)报道了改进的CALB变体。所描述的变体具有改进的热稳定性，例如变体T57A/A89T/G226R/R168K(CalBopt，SEQ ID NO:1)。
酶工程化和热稳定化的CalB变体的使用进一步提高了转化率。
如本文所用，术语“变体”是指通过改变前体氨基酸序列和/或其结构获得的酶。变体可以是酶的氨基酸序列的取代、缺失或添加变体。然而，变体序列的修饰不应改变酶的功能特性。例如，Xiang-Qian Peng(2013)描述了CalB的热稳定变体。
在本发明的一个实施例中，稳健且廉价的脂肪酶南极假丝酵母B(CalB)以固定形式在纯有机溶剂中使用，水是形成的唯一副产物。与涉及亚硫酰氯和外消旋化问题的繁琐的化学酰胺化方法相反，L-脯氨酰胺是在一个步骤中以对映异构纯形式形成的。改进的方法可大规模应用，并且代表了L-脯氨酰胺的工业生产的有前景的替代方案，L-脯氨酰胺是一种用于例如抗糖尿病药物的有价值的药物结构单元。
为了在纯有机溶剂中的高效酰胺形成，酶必须稳定，例如通过固定。通过固定，酶不仅稳定而且可以重复使用。使用后，酶很容易从反应混合物中去除。以这种方式，它们可以在多种加工条件下使用。理想地，底物和反应特异性以及酶反应性不应因固定而丧失。
酶被固定到合适的颗粒负载物或基质。如本文所述的固定酶是指通过吸附物理连接到固体负载物或通过离子键或共价键化学连接到固体负载物的酶。
关于本文所述的固定酶，固体负载物是树脂。树脂可由任何合适的组合物制成，包括但不限于聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、二氧化硅和苯乙烯/DVB共聚物。这类树脂可包括官能团并促进酶与树脂的吸附、共价键合或离子键合。适合的官能团包括但不限于环氧化物、酯、烷基芳香族基团、羟基、羧酸基团和季铵基团。另外，其他结构特征如十八烷基和包括多孔结构的树脂促进酶的吸附。
CalB不同制剂的比较表明，用来自诺维信(Novozymes)的CalB435和在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达并固定在树脂ECR8806(CalB 8806)上的CalB获得了改进的结果。在这两种情况下，固定都是经由吸附发生的。来自诺维信的CalB 435吸附在由聚(甲基丙烯酸)与用于交联的二乙烯基苯组成的大孔Lewatit VP OC 1600上。报道了这种制剂的许多应用，通常是由于其卓越的活性和稳定性。尽管如此，由于酶浸出和机械不稳定性，CalB435的再循环可能存在问题。ECR8806/>的十八烷基取代的甲基丙烯酸酯树脂具有可逆但同时非常强的吸附性。与共价结合相反，吸附几乎不会引起构象变化，这可以解释后者的转化率更高。当CalB固定在来自/>的树脂ECR8285(CalB 8285)上时，酶的胺基团与环氧化物/甲基丙烯酸丁酯载体的环氧基团之间发生共价结合。
此外，还测试了固定在受控孔隙率玻璃上的交联酶聚集体(CLEA)32、33、溶胶-凝胶包裹的CalB34和EziGTM。L-脯氨酸(33mM)在2M2B(0.5M，500μL)中用NH3的转化如本文所述用各种CalB制剂(8.3mg)在700rpm和70℃下进行16小时；添加甲醇和HPLC-MS分析。在图9中示出了与相同量的酶制剂的比较。CalB 8806导致最高的酰胺形成。对于ECR8806和ECR8285/>相同量的CalB(5mg)固定在树脂(100mg)上。在EziG的情况下，100mg制剂含有15.3mg的CalB。根据文献，CalB 435载体上的酶负载量在8.5和20w/w％之间变化。对于溶胶-凝胶制剂(300mg)，使用c-LEcta CalB粉末(50mg，含有10-15％酶)。对于来自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)的CalB CLEA，活性(2.6U/mg)是已知的，但蛋白质负载量未知。不同的酶负载量使比较变得困难。当酰胺形成相对于酶的实际量标准化时，制剂CalB 8806再次获得最高的产物浓度，并且对CalB435的改进更为明显(图10)。L-脯氨酸(33mM)在NH3和2M2B(0.5M，500μL)中的转化如本文所述用各种CalB制剂(8.3mg)在700rpm和70℃下进行16小时；添加甲醇和HPLC-MS分析。
溶剂的选择结果是关键参数，影响底物、产物和氨的溶解度、水活性和酶稳定性。L-脯氨酸在水中的溶解度最高(20℃下为1500g/L)，其次是甲醇(20℃下为17.5w％)和短链醇。然而，由于与氨相比作为亲核试剂的水大量过量，水会引起反向水解反应并阻碍酰胺化。在甲醇中的酰胺化活性很低，这可能是由于抑制作用。L-脯氨酸在伯醇如正丁醇(20℃下为3.1w％)中的底物溶解度显著高于异丁醇(20℃下为0.4w％)，一种仲醇，或2-甲基-2-丁醇(2M2B，20℃下为0.02w％)，一种叔醇。尽管这可能表明在伯醇中最高的酰胺形成，但令人惊讶的是，在叔醇中获得了最好的结果。
测试了许多有机溶剂的L-脯氨酸酰胺化(图2)。先前用N-Cbz-L-脯氨酸的实验表明使用甲苯或t-BuOH/DMF(Nuijens(2012))。尽管L-脯氨酸在2M2B中的溶解度低，但在这种溶剂中获得了最高的转化率。必须注意，添加NH3或产物L-脯氨酰胺后溶解度增加。与伯醇相反，用叔醇未观察到酯形成。所有其他溶剂，包括1,4-二噁烷、四氢呋喃(THF)、2-甲基-THF、甲苯、t-BuOH和添加作为助溶剂的DMF到2M2B中，示出转化率在10-30％左右。使用2M2B作为溶剂使转化率翻倍至60％左右。
在溶剂选择指南中，醇被列为‘最环保’的溶剂类别之一，明显优于烃、醚或卤化溶剂。因此，2M2B不仅基于获得的高转化率，而且还因为涉及其可持续性的环境方面是期望的。
用叔醇、2-甲基-2-丁醇和叔丁醇以及氨基甲酸铵作为铵源进行测试。由于价格高，另外的叔醇似乎不适合大规模使用。随着氨基甲酸铵量的增加(2当量和7.5当量)，酰胺形成增加。在2-甲基-2-丁醇中获得最好的结果，其次是t-BuOH和1,4-二噁烷(图4A、4B)。
替代地，液体盐也可用于本发明的方法中。液体盐也称为“离子液体”，通常是熔点低于100℃且通常低于室温的有机盐。液体盐可以包括衍生自卤化铵和路易斯酸的那些，如AlCl3、TiCl4、SnCl4和FeCl3。
本发明的另一重要方面是氨源。合适的源是例如氨(NH3)、氨基甲酸铵、碳酸铵、苄胺、乙醇胺、己胺、2-苯乙胺或3-苯丙胺，或其任何混合物。
Litjens等人(1999)比较了由羧酸与碳酸氢铵、氨基甲酸铵和氨气合成丁酰胺和油酰胺的酰胺合成。作者注意到反应速率随着氨浓度的增加而降低，并得出结论，需要适当的酸和氨浓度比以避免铵盐沉淀。这是通过逐渐添加缓慢溶解的氨基甲酸铵来实现的。
L-脯氨酸的酰胺化可以用NH3或铵盐(例如氨基甲酸铵或碳酸铵，在1,4-二噁烷中测试)执行。L-脯氨酸的N-取代酰胺可以通过使用不同的烷基胺作为胺供体来产生，例如苄胺、乙醇胺、己胺、2-苯乙胺、3-苯丙胺。L-脯氨酸(20mM)与不同烷基胺(5当量)在2M2B(500μL)中用CalB435(10mg)的酰胺化在70℃下以700rpm执行16小时，溶解在甲醇中并通过HPLC-MS分析(图12)。然而，用二甲胺没有观察到显著的酰胺形成。用芳香族胺和短脂肪族胺(乙醇胺、己胺)的转化率高于用2-辛胺或异丙胺。
NH3的实验证实2-甲基-2-丁醇是首选溶剂(图5)。反应如本文所述用CalB 435(8.3mg)在700rpm和70℃下执行88小时；添加甲醇和HPLC-MS分析。与CalB435(来自诺维信)相比，使用CalBopt(例如，根据Vogl等人(2016)通过发酵、固定和冻干生产)形成的产物量略高。当氨基甲酸铵(7.5当量)用作铵供体时，所有溶剂的产物形成都显著降低(图6)。反应如本文所述用L-脯氨酸(5.8mg，100mM)在1,4-二噁烷、2-甲基-2-丁醇(MeBuOH)或叔丁醇(500μL)中进行，并添加氨基甲酸铵(30mg，7.5当量)。反应用CalB 435(8.3mg)在700rpm和70℃下执行88小时；添加甲醇和HPLC-MS分析。
本发明的一个实施例涉及如本文所述的方法，其中氨源是氨(NH3)、氨基甲酸铵、碳酸铵、甲酸铵、苯甲酸铵、苄胺、乙醇胺、己胺、2-苯乙胺或3-苯丙胺或其任何混合物，优选氨。
在本发明的一个实施例中，氨包含于有机溶剂中。氨可以溶解、混合或分配在有机溶剂中或可以作为气泡存在。
当酶负载量增加时，酰胺形成也增加(图7)。反应如本文所述用L-脯氨酸作为底物(1.9mg，33mM或底物浓度的三倍(3×S)，5.7mg，100mM)在具有约0.5M NH3的2-甲基-2-丁醇(500μL)中进行。反应用CalB 435作为酶(8.3mg或酶(E)的2、3、6倍量)在700rpm和70℃下进行16小时；添加甲醇和对反应的HPLC-MS分析。没有酶就没有酰胺形成。将底物负载量从33mM增加三倍至100mM不会减损酰胺的形成。在图7中，在通过添加甲醇完全溶解底物和产物后分析总反应混合物。
与此相反，在图8中，反应的可溶相是在室温下分析的。反应如本文所述用L-脯氨酸(1.9mg，33mM或底物浓度的三倍(3×S)，5.7mg，100mM)在具有约0.5M NH3的2-甲基-2-丁醇(500μL)中进行。反应用CalB 435(8.3mg或酶(E)的2、3、6倍量)在700rpm和70℃下执行16小时；对反应的可溶相的HPLC-MS分析。正如预期的那样，两种情况下的酰胺浓度相似。然而，L-脯氨酸的溶解浓度约为23mM。溶解度极限可能主要取决于当前的NH3浓度和温度。在与六倍酶和三倍底物(100mM)的反应中，溶解的L-脯氨酸浓度明显较低(约10mM)，但预期相同的浓度。
以前的出版物描述了即使有机溶剂中的痕量水也可能导致酰基供体水解。研究了向2M2B中添加不同水浓度(0.5-2.5v/v％)的影响，以深入了解反应系统耐受的水量。反应前溶剂中的水含量<0.10％。对于高效酰胺化，在反应介质中低水浓度(优选<0.5v/v％)是优选的(图3)。当水浓度增加时，可以看到酰胺形成的减少，但仍然可以观察到反应，尽管有一些额外的水(例如，2v/v％水使转化率降低了一半)。这些结果对于更大规模的长期生产尤其重要，以获取有关在溶剂再循环的情况下需要从介质中去除多少水的数据。
根据本发明的另一实施例，该方法在反应介质中进行，其中反应介质包含小于2v/v％、1.5v/v％、1.0v/v％、0.75v/v％或小于0.5v/v％的水。
使用化学成分确定的介质的根据本发明的工业生物催化方法可以作为分批、重复分批、补料分批、重复补料分批或连续反应方法执行。
大多数用于转化化合物的生物催化方法是在液体介质中进行的。实际上，这类转化过程是在液体介质中进行的，并作为分批方法执行。分批方法是不连续方法，其中所有介质组分作为整体在转化过程开始之前直接添加到介质中。在重复分批方法中，发生转化化合物的部分收获，伴随着完整介质的部分补充，任选地重复若干次。
在补料分批方法中，在反应开始之前，没有或部分包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物被添加到介质中，并且无关地，在反应过程期间馈入全部或剩余部分的包含一种或多种结构和/或催化元素的组分。被选择用于馈入的组分可以一起或彼此分开地馈入到反应过程中。
在重复补料分批或连续反应方法中，在反应过程期间额外馈入完整的起始介质。起始介质可以与(一种或多种)结构元素一起或分开馈入。在连续方法中，部分反应介质和目标化合物的去除连续发生。反应过程由此连续补充与取出的反应介质的量对应的一部分新鲜介质。
根据本发明的方法可以是在500mL至10L范围内的生物反应器等、10至1000mL范围内的摇瓶等、1至100mL范围内的比色皿、玻璃小瓶、法尔康管等、5μL至1mL范围内的微量滴定板等中的“实验室规模”方法。
然而，根据本发明的方法可以是在10L至200m3或100L至100m3的反应容器中的“大规模”方法。
实例
阐述以下实例以帮助理解本发明，但不旨在并且不应当被理解为以任何方式限制本发明的范围。实例不包括常规方法的详细描述。这类方法是本领域普通技术人员熟知的。
实例1-L-脯氨酸的转化
与L-脯氨酸的小规模分批标准反应
对于标准条件下的生物转化，使用L-脯氨酸(1.9mg，33mM)和固定CalB(8.3mg)，来自诺维信的CalB435或固定CalB变体(除非另有说明)。反应在用盖子和隔膜密封的小玻璃瓶中在含约0.5M NH3的有机溶剂(2-甲基-2-丁醇、1,4-二噁烷或t-BuOH，500μL)中执行，并在700rpm和70℃下在舒适型埃彭道夫恒温振荡器(Eppendorf Thermoshaker Comfort)中振荡16小时。
在反应之后，添加甲醇(500μL)以完全溶解底物和产物。用甲醇将样品稀释至1mM底物浓度(1:33)。添加作为内标的D,L-正缬氨酸(0.5mM)，并且将样品涡旋、离心(13,000rpm，2分钟)，通过棉絮过滤并通过HPLC-MS进行分析。
在HEL压力反应器中与L-脯氨酸的反应
对于压力下的生物转化，使用HEL DigiCAT反应器系统，该系统耐受高达200巴和300℃的反应条件。将L-脯氨酸(167mg，145mM)和CalB(167mg，来自诺维信的CalB435或固定CalBopt)装入反应器中。在70℃下用2-甲基-2-丁醇或1,4-二噁烷作为溶剂(10mL)执行反应。使用10mL体积以确保氨气鼓泡通过反应混合物。用十字形搅拌棒的150rpm搅拌速度用于避免研磨酶珠。将反应器密闭并以0.6-1.4巴的压力施加NH3气体。反应在70℃下运行6小时。在生物转化之后，取出反应溶剂样品并过滤以分析底物和产物的可溶浓度。将样品用甲醇+0.1％甲酸稀释(1:80)。添加作为内标的D,L-正缬氨酸(0.5mM)并通过HPLC-MS分析样品。
L-脯氨酸的分析
对于HPLC-MS分析，Agilent 1200Infinity系统配备了来自安捷伦(Agilent)的Zorbax 300-SCX 4.6×250mm 5微米柱。分析通过使用90％H2O+0.1％甲酸和10％甲醇+0.1％甲酸的等度洗脱进行约20分钟。流速设置为1mL/分钟，并且最大压力限制为400巴。在正SCAN(114.5-300m/z)和SIM模式(对于L-脯氨酰胺为115m/z，对于L-脯氨酸为116m/z，对于作为内标的D,L-正缬氨酸为118m/z)下执行分析。注射了2μL的样品体积。
L-脯氨酸和L-脯氨酰胺校准曲线是用含有作为内标的D,L-正缬氨酸(0.5mM)的0.03-4mM在甲醇中的参考溶液制成的。
样品制备的标准程序：将反应物溶解在含有0.5mM作为内标的D,L-正缬氨酸的甲醇(500μL)中。将样品在含有0.5mM D,L-正缬氨酸的甲醇中稀释至1mM，涡旋，离心(13,000rpm，2分钟)并通过棉絮过滤，然后通过HPLC-MS测量样品。
实例2-Cbz-L-脯氨酸的转化
Cbz-脯氨酸的生物催化酰胺形成
对于标准条件下的生物转化，Cbz-L-脯氨酸(4.1mg，33mM)和固定CalB(8.3mg，Novozyme 435或自身的固定CalB变体)与1,4-二噁烷(500μL)中的0.5M NH3一起使用。反应在舒适型埃彭道夫恒温振荡器中在70℃和700rpm下执行16小时(除非另有说明)。
然后将反应溶液在具有作为内标的L-苯丙氨酸(3mM)的甲醇中稀释至1mM，涡旋，离心(13,000rpm，2分钟)并通过棉絮过滤，然后通过HPLC-MS分析。
Cbz-L-脯氨酸的分析
于HPLC-MS分析，Agilent 1200 Infinity系统配备了来自安捷伦的Poroshell120 EC-C18 4.6×50mm 2.7微米柱。用水/乙腈+0.1％甲酸的梯度进行分析(0分钟：100％水+0.1％甲酸，5分钟：100％乙腈+0.1％甲酸，8分钟：100％水+0.1％甲酸)。流速设置为0.75mL/分钟，并且最大压力限制为600巴。在正SCAN(115-350m/z)和SIM模式(对于Cbz-脯氨酰胺为249m/z，对于Cbz-脯氨酸为250m/z，对于作为内标的L-苯丙氨酸为166m/z)下执行分析。注射了1μL的样品体积。
为了制备校准曲线，分别在甲醇中制备浓度为0.1mM-4mM的Cbz-脯氨酸和Cbz-脯氨酰胺的参考溶液。L-苯丙氨酸(3mM)用作内标并添加到每个样品中。
样品制备的标准程序：将反应溶剂在具有作为内标的L-苯丙氨酸(3mM)的甲醇中稀释至1mM，将样品涡旋、离心并通过棉绒过滤，然后通过HPLC-MS测量样品。
实例3-与新底物的反应
用CalB 435和NH3测试不同的酸
不同的酸(33mM)与CalB 435(8.3mg)在含0.5M NH3的1,4-二噁烷(500μL)中一起孵育。制备反应样品加上不含酶的参考样品，并针对每种底物进行孵育。在70℃下16小时反应时间之后，稀释并分析样品。在通过GC-MS或HPLC-UV分析反应之前，通过HPLC-MS(使用上文针对Cbz-脯氨酸描述的方法)确认产物形成。GC-MS：稀释样品并将未转化的底物衍生为对应的甲酯。通过向样品(150μL)中添加甲醇(60μL)并随后添加2M三甲基甲硅烷基重氮甲烷的己烷溶液(10μL)来执行衍生化程序。在室温下孵育10分钟之后，用GC-MS测量样品。比较底物和产物峰面积的比率。使用配备有Agilent 5975C质量选择检测器(EI 70eV)和HP-5MS柱(30m×0.25mm×0.25μm)的Agilent 7890A GC系统，使用氦气作为载气(流速＝0.5mL/分钟)。
210nm处的HPLC-UV测量结果用于分析以下底物：3-苯基丙酸、布洛芬、3-羟基-4-甲氧基-苯乙酸和3-苯基丙酸。
替代底物的分析
HPLC-UV实验在带有二极管阵列检测器和反相Phenomenex Luna C18柱(250×4.6mm，5μm，柱温24℃)的HPLC Agilent 1260Infinity系统上执行。所有化合物分别在210、220、254、263、280和310nm处进行分光光度法检测。设置流速为1mL/分钟，并且最大压力为250巴。使用5μL的注射体积。该方法运行22分钟，以H2O/三氟乙酸(TFA，0.1％)和ACN/TFA(0.1％)的梯度作为流动相(0-2分钟，5％ACN/TFA；2-15分钟，5-100％ACN/TFA；15-17分钟，100％ACN/TFA；17-22分钟，100-5％ACN/TFA)。
样品制备的标准程序：向反应中添加ACN/H2O 1/1+3％TFA(或甲醇，500μL)以溶解底物和产物，并用ACN/H2O 1/1+3％TFA稀释(总共1:8稀释)。将样品涡旋、离心(13,000rpm，2分钟)，通过棉絮过滤并通过HPLC-UV测量进行分析。
实例4-附加方法
NH3定量
在用磁力搅拌棒搅拌约2小时的同时将NH3鼓泡通过开放圆底烧瓶中的溶剂(60mL)之后，测定2-甲基-2-丁醇中的NH3浓度。根据供应商的手册使用来自西格玛-奥德里奇(MAK310)的氨检定试剂盒。首先，让冷冻试剂达到室温。在dH2O中制备浓度为0(空白)、0.25、0.5和1mM NH4Cl的NH4Cl标准物。样品用dH2O(1:600)稀释，以获得试剂盒线性范围内0.012-1mM的浓度。透明的96孔微量滴定板(MTP)用于在酶标仪中进行测量。制备工作试剂混合物，其含有氨检定缓冲液(90μL)、试剂A(4μL)和试剂B(4μL)。在添加90μL工作试剂混合物之前，将标准物(10μL)和样品(10μL)用移液管移取到MTP中，并立即在轻敲和振荡酶标仪中的板。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟并测量荧光强度(λex＝360nm，λem＝450nm)。
实例5-酶工程化
制备CalB的变体
CalB的合理变体是基于两步定点诱变方案(Wang和Malcolm,1999,2002)使用高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室有限公司(New England Biolabs GmbH))生成的。为了表达CalB，使用了PCAT1启动子(Vogl等人,《ACS合成生物技术(ACS SyntheticBiology)》,5(2),第172-186页(2016))。工作流程的第一步是通过PCR将(一个或多个)所需突变插入CalB野生型基因中。在转化到大肠杆菌(E.coli)Top10 F'细胞中并测序后，根据标准方案(图13，CalBopt(T57A/A89T/G226R/R168K)蛋白质序列)通过整合到基因组中将DNA转化到巴斯德毕赤酵母中。
在巴斯德毕赤酵母中的CalB表达
含有染色体整合CalB的巴斯德毕赤酵母(法夫驹形氏酵母(Komagataellaphaffii))菌株的菌落用于在2.5L超高产烧瓶(UYF)中接种BMG1％或BMD1％培养基(450mL)。将烧瓶在28℃和100rpm下孵育60小时。每天添加甲醇以诱导和维持CalB的表达。每12小时，首先添加BMM5％(50mL，BMM10)，随后添加纯甲醇(5mL)。在蛋白质表达72小时后，通过在500mL管中在5,000rpm和4℃下离心15分钟来收获培养物。将上清液转移到干净的瓶子中，并通过真空过滤通过最小孔径为0.45μm的膜过滤。
培养基制备：制备以下储备溶液：500×B：0.02％D-生物素，过滤灭菌；10×YNB：134g/L DifcoTM酵母氮源基础，无氨基酸，10×D(20％)：220g/Lα-D(+)-葡萄糖一水合物，10×G(20％)：200g 100％甘油+800mL dH2O；10×PPB(1M PPB，pH 6.0)：30.13g/L K2HPO4*3H2O，118.13g/L KH2PO4。为了制备BMD1％/BMG1％/BMM10(5％)，在高压处理之后将10×YNB(100mL/L)、10×PPB(200mL/L)、10×D/10×G/100％甲醇(50mL/L)和500×B(2mL/L)添加到dH2O中。按照甲醇依赖性蛋白表达方案在Sartorius biostat CT/Cplus生物反应器中执行巴斯德毕赤酵母mutS的发酵。
由于上清液中CalB的浓度相对低(约0.15g/L；由布拉德福(Bradford)蛋白质定量检定来测定)，因此必须对其进行浓缩以进一步固定。对于较大量样品，用10,000MWCO滤盒执行错流过滤，而当必须并行浓缩许多较小体积的样品(300mL上清液浓缩至2-5mL)时，使用Sartorius20管与10,000MWCO。
CalB的固定和冻干
PD10脱盐柱：根据供应商的建议，使用来自GE医疗生命科学(GE Healthcare LifeSciences)的PD10脱盐柱进行小规模缓冲液交换。在用ddH2O和目标缓冲液(根据表2)洗涤柱子后，将样品(2.5mL)装载到柱子上。然后施加目标缓冲液(3.5mL)以洗脱蛋白质并收集级分。根据总样品体积，在需要时重复最后两个步骤。最后，用ddH2O洗涤柱子并储存在20％EtOH中。通过离心使用来自赛多利斯(Sartorius)的Vivaspin 20、10,000MW CO离心管在全速和8℃下来浓缩获得的蛋白质溶液。
表2：来自普诺泰克生命科技(Purolite Lifetech)的不同固定树脂和对应的固定缓冲液的特征汇总。
蛋白质浓度
使用布拉德福检定(Bradford Assay)(Bio-Rad；Art:5000006)测定样品中的蛋白质浓度。布拉德福溶液用dH2O 1:5稀释。将样品(5μL)用移液管移取在透明96孔微量滴定板的孔中，并添加布拉德福溶液(200μL)。还测量了浓度为0.0625至2mg/mL BSA的BSA标准物和空白样品。所有测定均一式两份进行。在孵育至少5分钟后，用酶标仪测量595nm处的吸光度(测量前振荡5秒时段)。
固定
在缓冲液交换后，通过离心使用Vivaspin 20、10.000MW CO离心管来浓缩蛋白质溶液，直到达到至少10mg/mL的所需蛋白质浓度。
通过共价结合固定在ECR8285上：将珠粒(100mg)装入称重的1.5mL管中，并用洗涤缓冲液(100μL，10mM PPi,pH 7.5)洗涤四次。将蛋白质溶液(600μL固定缓冲液0.5M PPi，pH7.5中的5mg蛋白质)添加到洗涤过的珠粒中，并在旋转轮上以50rpm孵育18小时，并在室温下在工作台上孵育20小时。在用洗涤缓冲液(100μL，10mM PPB，pH 7.5)洗涤珠粒两次后，一次用含有0.5M NaCl(100μL)的洗涤缓冲液用于解吸非共价结合的蛋白质，后一次用洗涤缓冲液(100μL)，将酶珠在-80℃下冷冻1小时。打开试管并在-40℃和50微巴真空下置于冻干机中24小时。随后，将它们储存在冰箱中并测试与L-脯氨酸的目标酰胺化反应。
初始程序：开始时，在固定和洗涤珠粒后，通过真空过滤来过滤珠粒以去除过量的水。由于珠粒的过高水含量结果是大幅度减少酰胺形成，因此珠粒被冻干而不是真空过滤。
通过吸附固定在ECR8806上：将珠粒(100mg)装入称重的1.5mL管中，并用洗涤缓冲液(120μL，10mM PPi,pH 7.5)洗涤两次。将蛋白质溶液(600μL固定缓冲液20M PPi，pH 7.5中的5mg蛋白质)添加到洗涤过的珠粒中，并在旋转轮上以50rpm在室温下孵育24小时。在用洗涤缓冲液(150μL，10mM PPB，pH 7.5)洗涤珠粒一次后，将酶珠在-80℃下冷冻1小时。打开试管并在-40℃和50微巴真空下置于冻干机中24小时。随后，将它们储存在4℃的冰箱中并测试与L-脯氨酸的目标酰胺化反应。
将固定上清液和洗涤级分收集在预先称重的管中，并测量剩余的蛋白质浓度(如2.5.3.2中所述)，以确定固定效率。
序列表
<110> 帕西昂奥地利有限两合公司(Patheon Austria GmbH & Co KG)
<120> 单步生物催化酰胺化
<130> PN001EP
<160> 1
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T57A/A89T/G226R/R168K
<400> 1
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Lys Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His
210 215 220
Ala Arg Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315

Claims (6)

1. 一种用于无保护氨基酸的生物催化酰胺化的方法，其包含以下步骤：在有机溶剂和脂肪酶的存在下，使无保护氨基酸与氨源接触，其中所述无保护氨基酸是L-脯氨酸，其中所述氨源是氨（NH3）、氨基甲酸铵、碳酸铵、苄胺、乙醇胺、己胺、2-苯乙胺或3-苯丙胺，或其任何混合物，其中所述有机溶剂选自由二噁烷、2-甲基-2-丁醇和叔丁醇组成的组，其中所述方法在60至80℃范围内的温度下进行；并且其中所述脂肪酶是南极假丝酵母脂肪酶B（CalB）或其变体，其中所述CalB变体的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶被固定。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中氨包含于所述有机溶剂中。
4. 根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中反应介质中的水含量低于1.0 v/v%，或低于0.5 v/v%。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述方法以分批或连续模式执行。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中在所述分批模式中所述无保护氨基酸以0.01-1.0%w的量提供并且所述脂肪酶以0.01-1.0 %w的量提供。
CN201980089131.2A 2018-12-18 2019-12-03 单步生物催化酰胺化 Active CN113302310B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18213434.6 2018-12-18
EP18213434 2018-12-18
PCT/EP2019/083541 WO2020126484A1 (en) 2018-12-18 2019-12-03 Single step biocatalytic amidation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113302310A CN113302310A (zh) 2021-08-24
CN113302310B true CN113302310B (zh) 2024-05-03

Family

ID=64744640

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980089131.2A Active CN113302310B (zh) 2018-12-18 2019-12-03 单步生物催化酰胺化

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220073958A1 (zh)
EP (1) EP3899003A1 (zh)
CN (1) CN113302310B (zh)
WO (1) WO2020126484A1 (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1558947A (zh) * 2001-07-26 2004-12-29 ֮����ʽ���� 肽生成酶的基因、肽生成酶以及二肽的生产方法
CN102037131A (zh) * 2008-05-20 2011-04-27 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 通过赖氨酸环化制备α-氨基-ε-己内酰胺
CN102666570A (zh) * 2009-12-01 2012-09-12 诺沃—诺迪斯克有限公司 新的肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶
WO2013129927A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Enzypep B.V. Enzymatic synthesis of amino acid and peptide c-terminal amides
CN106574281A (zh) * 2014-07-03 2017-04-19 巴斯夫欧洲公司 醇类的氧化还原自足性生物催化胺化
CN108251401A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 脂肪酶及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3187201B2 (ja) * 1992-05-14 2001-07-11 三共株式会社 Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法
US9090601B2 (en) * 2009-01-30 2015-07-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Thiazole derivatives
EP3258954A1 (en) * 2015-02-19 2017-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Orexin-b polypeptides and uses thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1558947A (zh) * 2001-07-26 2004-12-29 ֮����ʽ���� 肽生成酶的基因、肽生成酶以及二肽的生产方法
CN102037131A (zh) * 2008-05-20 2011-04-27 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 通过赖氨酸环化制备α-氨基-ε-己内酰胺
CN102666570A (zh) * 2009-12-01 2012-09-12 诺沃—诺迪斯克有限公司 新的肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶
WO2013129927A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Enzypep B.V. Enzymatic synthesis of amino acid and peptide c-terminal amides
CN106574281A (zh) * 2014-07-03 2017-04-19 巴斯夫欧洲公司 醇类的氧化还原自足性生物催化胺化
CN108251401A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 脂肪酶及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enzymatic C-terminal amidation of amino acids and peptides;Timo Nuijens et al.;Tetrahedron Letters;第53卷;第3777页右栏倒数第1段，3778页左栏第1-2段，第3778页右栏倒数第1段，3779页左栏第1-2段，表4及表注 *
gamma-Glutamyl Transfer Reactions by Glutaminase from Pseudomonas nitroreducens IFO 12694 and Their Application for the Syntheses of Theanine and gamma-Glutamylmethylamide;Takashi TACHIKI et al.;《Biosci.Biotechnol.Biochem.》;62(7);摘要，第1280页右栏表1和表注 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020126484A1 (en) 2020-06-25
US20220073958A1 (en) 2022-03-10
EP3899003A1 (en) 2021-10-27
CN113302310A (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10196667B2 (en) Processes using amino acid dehydrogenases and ketoreductase-based cofactor regenerating system
Barbosa et al. Effect of the immobilization protocol on the properties of lipase B from Candida antarctica in organic media: Enantiospecifc production of atenolol acetate
Grulich et al. Perspectives and industrial potential of PGA selectivity and promiscuity
Böhmer et al. Highly efficient production of chiral amines in batch and continuous flow by immobilized ω-transaminases on controlled porosity glass metal-ion affinity carrier
US6987010B2 (en) Process for the enzymatic preparation of enantiomer-enriched β-amino acids
Lin et al. Continuous production of aprepitant chiral intermediate by immobilized amidase in a packed bed bioreactor
Houng et al. Kinetic resolution of amino acid esters catalyzed by lipases
Wang et al. Covalently immobilize crude d-amino acid transaminase onto UiO-66-NH2 surface for d-Ala biosynthesis
CN113302310B (zh) 单步生物催化酰胺化
CN110129307B (zh) 固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用
CN114606221B (zh) 固定化酶、其制备方法及应用
CA2428163C (en) Process for the enzymatic preparation of enantiomer-enriched .beta.-amino acids
Fernandez-Lafuente et al. Modulation of the properties of penicillin G acylase by acyl donor substrates during N-protection of amino compounds
Gong et al. Accessing d‐Valine Synthesis by Improved Variants of Bacterial Cyclohexylamine Oxidase
WO1991019002A1 (en) A process for chiral enrichment of asymmetric primary amines
Paradisi et al. Engineered dehydrogenase biocatalysts for non-natural amino acids: efficient isolation of the D-enantiomer from racemic mixtures
Miyazawa et al. Resolution of non-protein amino acids via the microbial protease-catalyzed enantioselective hydrolysis of their N-unprotected esters
Miyazawa et al. Enhancement of enantioselectivity in the Bacillus subtilis protease-catalyzed hydrolysis of N-free amino acid esters using the ester grouping-modification approach
Molinaro et al. Asymmetric Synthesis of N-Alkyl Amino Acids through a Biocatalytic Dynamic Kinetic Resolution of PEGylated N-Alkyl Amino Esters
Stalder et al. Biocatalytic Synthesis of l‐Pipecolic Acid by a Lysine Cyclodeaminase: Batch and Flow Reactors
WO2016114479A1 (ko) 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소
Chao et al. Hydantoinases
CN116515782A (zh) 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺醇化合物合成中的应用
WO2009007759A1 (en) Resolution process
SHICHAO DEVELOPMENT OF NEW ENZYMES FOR GREEN TRANSFORMATION OF ESTER TO AMIDE VIA AMINOLYSIS

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant