TW202014209A - 用於消融造血幹細胞之抗體藥物軛合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了抗體藥物軛合物，其中特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段視情況藉由接頭與藥物部分連接。本發明進一步提供了包含抗體藥物軛合物之藥物組成物；以及製備和使用此類藥物組成物用於在有需要的患者中消融造血幹細胞之方法。

Description

用於消融造血幹細胞之抗體藥物軛合物
本揭露涉及抗cKIT抗體藥物軛合物(conjugate)，和它們用於在有需要的患者(例如造血幹細胞移植受者)中消融造血幹細胞之用途。序列表
本申請含有已經以ASCII格式電子遞交的序列表，並且將該序列表藉由引用以其整體特此併入。所述ASCII副本創建於2019年5月2日，名稱為PAT058157-WO-PCT_SL.txt並且大小為186,540位元組。
cKIT(CD117)係一種結合配位基幹細胞因子(SCF)的單次跨膜受體酪胺酸激酶。SCF誘導cKIT的同型二聚化，該同型二聚化激活其酪胺酸激酶活性並藉由PI3-AKT途徑和MAPK途徑發送訊號(Kindblom等人，Am J. Path. [病理學雜誌] 1998 152(5):1259)。最初發現cKIT為由貓科逆轉錄病毒表現的呈截短形式的致癌基因(Besmer等人，Nature [自然] 1986 320:415-421)。選殖相應的人基因證實cKIT係III類類型受體酪胺酸激酶的成員，其中認為FLT3、CSF-1受體和PDGF受體屬於本家族成員。cKIT係造血細胞、生殖細胞、肥大細胞和黑素細胞發育所必需的。骨髓中的造血先驅細胞，例如造血幹細胞(HSC)在細胞表面上表現高水平的cKIT。此外，肥大細胞、皮膚中的黑素細胞和消化道中Cajal間質細胞表現cKIT。
造血幹細胞(HSC)能夠再生移植受者中的所有血液和免疫細胞，並且因此具有很大的治療潛力。造血幹細胞移植廣泛用作白血病、淋巴瘤和其他威脅生命的疾病的療法。然而，許多風險與這種移植相關，包括移植不良、免疫排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、或感染。同種異體造血幹細胞移植通常需要藉由細胞減滅治療來調理受者，以防止移植物的免疫排斥。目前的調理方案通常對宿主係有毒的，以致於它們對於大量移植患者係禁忌的和/或不能以足夠預防移植物抗宿主病的量提供。因此，需要改進調理和移植方法並且降低與造血幹細胞移植相關的風險並增加其對各種障礙的有效性。
本揭露提供了抗體藥物軛合物，其中特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')視情況藉由接頭與藥物部分(例如細胞毒性劑)連接。那些抗體藥物軛合物可以選擇性地將細胞毒性劑遞送至表現cKIT的細胞，例如造血幹細胞，從而選擇性地消融患者，例如造血幹細胞移植受者中的那些細胞。較佳的是，該等cKIT抗體藥物軛合物具有藥物動力學 特性，使得它在患者的循環中不會長時間存在和/或有活性，因此它們可用於在造血幹細胞移植之前調理造血幹細胞移植受者。在一些實施方式中，本文提供了軛合物，該等軛合物包含特異性結合cKIT、視情況藉由接頭與藥物部分(例如細胞毒性劑)連接的抗體片段(例如Fab或Fab')。令人驚訝的是，本發明人發現全長抗cKIT抗體(例如，全長IgG)、F(ab')2 片段及其毒素軛合物引起肥大細胞去顆粒，但抗cKIT Fab'或Fab-毒素軛合物甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物(如在患者形成或具有預先存在的識別Fab片段的抗藥物抗體的情況下可以觀察到的)時也不引起肥大細胞去顆粒。本揭露進一步提供了包含抗體藥物軛合物的藥物組成物，以及製備和使用此類藥物組成物用於在有需要的患者(例如造血幹細胞移植受者)中消融造血幹細胞的方法。
在一個方面，本揭露涉及一種具有式 (I) 之軛合物： A-(LB -(D)n )y 式 (I)； 其中： A係特異性結合人cKIT的抗體片段； LB 係接頭； D係細胞毒性劑； n係從1至10的整數，並且y係從1至10的整數。
在一個方面，本揭露涉及一種具有式 (E) 之結構的軛合物：
Figure 02_image001
式 (E)， 其中R2 、A、L1 、y和R114 如本文所定義的。
在一個方面，本揭露涉及一種具有式 (G) 之結構的軛合物：
Figure 02_image003
式 (G)， 其中R2 、A、L1 、y和R114 如本文所定義的。
在另一個方面，本文提供了特異性結合人cKIT的抗體和抗體片段(例如Fab或Fab')。此類抗cKIT抗體和抗體片段(例如Fab或Fab')可用於本文所述的任一種軛合物中。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')係特異性結合人cKIT的細胞外結構域(SEQ ID NO: 112)的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')係特異性結合人cKIT的結構域1-3(SEQ ID NO: 113)中的表位的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')係表1中所述的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 1的HCDR1；SEQ ID NO: 2的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 16的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 4的HCDR1；SEQ ID NO: 5的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 19的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 21的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 6的HCDR1；SEQ ID NO: 2的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 16的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 7的HCDR1；SEQ ID NO: 8的HCDR2；SEQ ID NO: 9的HCDR3；SEQ ID NO: 22的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 27的HCDR1；SEQ ID NO: 28的HCDR2；SEQ ID NO: 29的HCDR3；SEQ ID NO: 42的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 43的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 30的HCDR1；SEQ ID NO: 31的HCDR2；SEQ ID NO: 29的HCDR3；SEQ ID NO: 44的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 45的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 32的HCDR1；SEQ ID NO: 28的HCDR2；SEQ ID NO: 29的HCDR3；SEQ ID NO: 42的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 43的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 33的HCDR1；SEQ ID NO: 34的HCDR2；SEQ ID NO: 35的HCDR3；SEQ ID NO: 46的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 43的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 1的HCDR1；SEQ ID NO: 51的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 16的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 4的HCDR1；SEQ ID NO: 52的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 19的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 21的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 6的HCDR1；SEQ ID NO: 51的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 16的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 7的HCDR1；SEQ ID NO: 53的HCDR2；SEQ ID NO: 9的HCDR3；SEQ ID NO: 22的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 60的HCDR1；SEQ ID NO: 61的HCDR2；SEQ ID NO: 62的HCDR3；SEQ ID NO: 75的LCDR1；SEQ ID NO: 76的LCDR2；和SEQ ID NO: 77的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 63的HCDR1；SEQ ID NO: 64的HCDR2；SEQ ID NO: 62的HCDR3；SEQ ID NO: 78的LCDR1；SEQ ID NO: 79的LCDR2；和SEQ ID NO: 80的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 65的HCDR1；SEQ ID NO: 61的HCDR2；SEQ ID NO: 62的HCDR3；SEQ ID NO: 75的LCDR1；SEQ ID NO: 76的LCDR2；和SEQ ID NO: 77的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 66的HCDR1；SEQ ID NO: 67的HCDR2；SEQ ID NO: 68的HCDR3；SEQ ID NO: 81的LCDR1；SEQ ID NO: 79的LCDR2；和SEQ ID NO: 77的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 86的HCDR1；SEQ ID NO: 87的HCDR2；SEQ ID NO: 88的HCDR3；SEQ ID NO: 101的LCDR1；SEQ ID NO: 102的LCDR2；和SEQ ID NO: 103的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 89的HCDR1；SEQ ID NO: 90的HCDR2；SEQ ID NO: 88的HCDR3；SEQ ID NO: 104的LCDR1；SEQ ID NO: 105的LCDR2；和SEQ ID NO: 106的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 91的HCDR1；SEQ ID NO: 87的HCDR2；SEQ ID NO: 88的HCDR3；SEQ ID NO: 101的LCDR1；SEQ ID NO: 102的LCDR2；和SEQ ID NO: 103的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 92的HCDR1；SEQ ID NO: 93的HCDR2；SEQ ID NO: 94的HCDR3；SEQ ID NO: 107的LCDR1；SEQ ID NO: 105的LCDR2；和SEQ ID NO: 103的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)，和含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO: 47的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 54的胺基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO: 108的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 99的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 118的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 122的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 118的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 123的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 124的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 128的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 124的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 129的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 130的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 134的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 130的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 135的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 136的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 140的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 141的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 145的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 119、120或121的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 125、126或127的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 131、132或133的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 137、138或139的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 142、143或144的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 97的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，本文提供了軛合物，該等軛合物包含特異性結合cKIT、視情況藉由接頭與藥物部分(例如細胞毒性劑)連接的抗體片段(例如Fab或Fab')(抗cKIT Fab或Fab')。該抗cKIT Fab或Fab'可以是本文所述的任一種Fab或Fab'，例如表1中的任一種Fab或Fab'。如本文所述，此類抗cKIT Fab或Fab'-毒素軛合物能夠消融體外和體內的人HSC細胞，但甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也不引起肥大細胞去顆粒。
相關申請的交叉引用
本申請要求2018年6月20日提交的美國臨時申請案號62/687,382的權益，將其內容藉由引用以其整體特此併入。
本揭露提供了抗體藥物軛合物，其中特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')視情況藉由接頭與藥物部分(例如細胞毒性劑)連接。那些抗體藥物軛合物可以選擇性地將細胞毒性劑遞送至表現cKIT的細胞，例如造血幹細胞，從而選擇性地消融患者，例如造血幹細胞移植受者中的那些細胞。較佳的是，cKIT抗體藥物軛合物具有藥物動力學 特性，使得它在患者的循環中不會長時間存在和/或有活性(例如，半衰期小於24-48小時)，因此它們可用於在造血幹細胞移植之前調理造血幹細胞移植受者。在一些實施方式中，本文提供了軛合物，該等軛合物包含特異性結合cKIT、視情況藉由接頭與藥物部分(例如細胞毒性劑)連接的抗體片段(例如Fab或Fab')。令人驚訝的是，本發明人發現全長抗cKIT抗體(例如，全長IgG)、F(ab')2 片段及其毒素軛合物引起肥大細胞去顆粒，但抗cKIT Fab'或Fab-毒素軛合物甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物(如在患者形成或具有預先存在的識別Fab片段的抗藥物抗體的情況下可以觀察到的)時也不引起肥大細胞去顆粒。本揭露進一步提供了包含抗體藥物軛合物的藥物組成物，以及製備和使用此類藥物組成物用於在有需要的患者(例如造血幹細胞移植受者)中消融造血幹細胞之方法。 定義
除非另外聲明，否則如本文所用以下術語和短語意在具有以下意思：
術語「烷基」係指具有指定碳原子數目的單價飽和烴鏈。例如，C1-6 烷基係指具有從1至6個碳原子的烷基基團。烷基基團可以是直鏈的或支鏈的。代表性的支鏈烷基基團具有一個、兩個或三個分支。烷基基團的實例包括但不限於甲基、乙基、丙基(正丙基和異丙基)、丁基(正丁基、異丁基、二級丁基和三級丁基)、戊基(正戊基、異戊基和新戊基)以及己基。
如本文所用，術語「抗體」係指衍生自特異性結合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白質、或多肽序列。抗體可以是多株或單株、多鏈或單鏈、或完整免疫球蛋白，並且可以衍生自天然來源或來自重組來源。天然存在的「抗體」係包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結構域(即CH1、CH2和CH3)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域(即CL)組成。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補性決定區(CDR)，它們散佈著稱為框架區(FR)的更保守的區域。每個VH和VL由從胺基末端到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或三級(包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一成分(C1q))的結合。抗體可以是單株抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝化抗體、或嵌合抗體。該等抗體可以具有任何同種型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。
「互補性決定結構域」或「互補性決定區」(「CDR」)可互換地指VL和VH的高變區。CDR係抗體鏈的靶蛋白結合位點，該結合位點攜帶針對這種靶蛋白的特異性。每種人VL或VH中存在三個CDR(CDR1-3，從N末端順序編號)，構成約15%-20%的可變結構域。CDR可以按其區域和順序提到。例如，「VHCDR1」或「HCDR1」均是指重鏈可變區的第一CDR。CDR在結構上與靶蛋白的表位互補並因此直接負責結合特異性。VL或VH的剩餘伸展段(所謂的框架區)表現出較小的胺基酸序列變異性(Kuby, Immunology [免疫學], 第4版，第4章. W.H. Freeman & Co. [W.H.弗裡曼公司]，紐約，2000)。
給定CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多熟知的方案中的任一種來確定，包括以下中所述的那些：卡巴特等人 (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學興趣的蛋白質序列]," 第5版,Public Health Service [公共衛生服務], National Institutes of Health [國立衛生研究院], Bethesda, MD(「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人，(1997) JMB 273, 927-948(「Chothia」編號方案)和免疫遺傳學(IMGT)編號(Lefranc, M.-P., The Immunologist [免疫學家], 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P.等人，Dev. Comp. Immunol. [發育免疫學與比較免疫學], 27, 55-77 (2003)(「IMGT」編號方案)。例如，對於經典形式，根據Kabat，將重鏈可變結構域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並將輕鏈可變結構域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根據Chothia，將VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並將VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。藉由結合Kabat和Chothia的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)組成。根據IMGT，VH中的CDR胺基酸殘基編號為大約26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，並且VL中的CDR胺基酸殘基編號為大約27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)(根據「Kabat」編號)。在IMGT下，可以使用程式IMGT/DomainGap Align確定抗體的CDR區。
可以將輕鏈和重鏈兩者分成結構和功能同源性區域。術語「恒定」和「可變」係在功能上使用。在這點上，應當理解輕鏈(VL)和重鏈(VH)部分兩者的可變結構域均決定抗原識別和特異性。相反地，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3，並且在一些情況下CH4)的恒定結構域賦予重要生物特性如分泌、經胎盤移動性(transplacental mobility)、Fc受體結合、補體結合、FcRn受體結合、半衰期、藥物動力學 等。按照慣例，恒定區結構域離抗體的抗原結合位點或者胺基末端越遠，它的編號越大。N末端係可變區並且在C末端係恒定區；CH3和CL結構域實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基端結構域。
如本文所用，術語「抗體片段」或「抗原結合片段」係指抗體的一個或多個部分，該一個或多個部分保留與抗原(例如cKIT)的表位特異性相互作用的能力(例如，藉由結合、空間位阻、穩定化/去穩定化、空間分佈)。抗體片段的實例包括但不限於Fab片段，該Fab片段係一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；Fab'片段，該Fab'片段係一種由VL、VH、CL、CH1結構域和鉸鏈區組成的單價片段；F(ab')2片段，該F(ab')2片段係一種包含藉由鉸鏈區處的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；半抗體，該半抗體包括藉由二硫鍵連接的單條重鏈和單條輕鏈；一臂抗體，該一臂抗體包括連接至Fc區的Fab片段；CH2結構域缺失的抗體，該抗體包括與CH3結構域二聚體連接的兩個Fab片段(參見Glaser, J Biol Chem. [生物化學雜誌] 2005；280(50):41494-503)；單鏈Fv(scFv)；二硫化物連接的Fv(sdFv)；由VH和CH1結構域組成的Fd片段；由抗體的單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；由VH結構域組成的dAb片段(Ward等人，Nature [自然] 341:544-546, 1989)；和分離的互補性決定區(CDR)、或抗體的其他表位結合片段。例如，Fab片段可包含抗體重鏈的胺基酸殘基1-222(EU編號)；而Fab'片段可包含抗體重鏈的胺基酸殘基1-236(EU編號)。抗體的Fab或Fab'片段可以重組產生或藉由酶消化親本抗體產生。可以將重組產生的Fab或Fab'工程化，以引入用於位點特異性軛合的胺基酸如半胱胺酸(Junutula, J. R.等人，Nature biotechnology [自然生物技術] 2008,26 , 925)、吡咯啉-羧基-賴胺酸(Ou, W.等人，Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊] 2011;108(26):10437-42)或非天然胺基酸(例如Tian, F.等人，Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊] 2014,111 , 1766；Axup, J. Y.等人，Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊]. 2012,109 , 16101)。類似地，可以添加突變或肽標籤以有利於藉由磷酸泛醯巰基乙胺轉移酶(Grunewald, J.等人，Bioconjugate chemistry [生物軛合化學] 2015, 26, 2554)、形成甲醯甘胺酸的酶(Drake, P. M.等人，Bioconjugate chemistry [生物軛合化學] 2014,25 , 1331)、轉麩醯胺酸酶(Strop, P.等人，Chemistry & biology [化學和生物學] 2013,20 , 161)、分選酶(Beerli, R. R.；Hell, T.；Merkel, A. S.；Grawunder, U.PloS one [公共科學圖書館·綜合] 2015,10 , e0131177)或其他酶促軛合策略進行的軛合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH係由單獨的基因編碼的，但是可以使用重組方法將這兩個結構域藉由能夠使它們形成為單條蛋白質鏈的合成接頭來相連，其中VL區和VH區配對形成單價分子(被稱為單鏈Fv(「scFv」)；參見例如，Bird等人，Science [科學] 242:423-426, 1988；和Huston等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國家科學院院刊] 85:5879-5883, 1988)。術語「抗原結合片段」也意在涵蓋此類單鏈抗體。該等抗原結合片段係使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得的，並且以與完整抗體相同的方式針對效用來篩選該等片段。
抗體片段或抗原結合片段還可以摻入到單結構域抗體、大型抗體(maxibodies)、微型抗體(minibodies)、奈米抗體、胞內抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體、v-NAR和雙-scFv中(參見例如，Hollinger和Hudson, Nature Biotechnology [自然生物技術] 23:1126-1136, 2005)。可以將抗原結合片段移植到基於多肽如III型纖連蛋白(Fn3)的支架中(參見美國專利號6,703,199，該專利描述了纖連蛋白多肽單體)。
可以將抗體片段或抗原結合片段摻入到包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，Protein Eng. [蛋白質工程] 8:1057-1062, 1995；和美國專利號5,641,870)。
如本文所用，術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」係指具有基本上相同的胺基酸序列或衍生自相同遺傳源的多肽，包括抗體和抗原結合片段等。此術語還包括具有單分子組成的抗體分子的製劑。單株抗體組成物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和力。
如本文所用，術語「人抗體」包括具有可變區的抗體，其中框架和CDR區均衍生自人源序列。此外，如果抗體含有恒定區，則恒定區也衍生自此類人序列，例如人種系序列，或人種系序列的突變形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗體，例如如Knappik等人，J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 296:57-86, 2000中所述。
本揭露的人抗體可以包含不是由人序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由在體外隨機誘變或位點特異性誘變、或藉由在體內體細胞突變、或保守取代來引入突變以促進穩定性或生產)。
如本文所用，術語「識別」係指發現其表位並與之相互作用(例如，結合)的抗體或其抗原結合片段，無論該表位是否為線性或構象的。術語「表位」係指抗原上與本揭露的抗體或抗原結合片段特異性結合的位點。表位可以從連續胺基酸或因蛋白質的立體折疊而並置的非連續胺基酸中形成。從連續胺基酸形成的表位一般在暴露於變性溶劑時保留，而因立體折疊形成的表位用變性溶劑處理時一般喪失。表位典型地包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15個處於獨特空間構象的胺基酸。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術，例如，x射線結晶學和二維核磁共振(參見，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology [分子生物學中的方法中的表位映射協議], 第66卷, G. E. Morris編輯 (1996))。「互補位」係識別抗原表位的抗體部分。
在描述抗原(例如，蛋白質)與抗體、抗體片段或抗體衍生的結合劑之間相互作用的語境中使用時，短語「特異性結合」或「選擇性結合」係指確定抗原在蛋白質異質群體和其他生物製品中例如在生物樣品(例如，血液、血清、血漿或組織樣品)中存在的結合反應。因此，在某些指明的免疫測定條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合劑與特定抗原的結合至少兩倍於背景並且該等抗體或結合劑基本上不以顯著的量與樣品中存在的其他抗原結合。在一個方面，在某些指明的免疫測定條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合劑與特定抗原的結合至少10倍於背景並且該等抗體或結合劑基本上不以顯著的量與樣品中存在的其他抗原結合。在這類條件下與抗體或結合劑特異性結合可能需要已經就其針對選擇特定蛋白質的特異性選擇抗體或結合劑。如果需要或適當，可以藉由扣除與來自其他物種(例如，小鼠或大鼠)或其他亞型的分子交叉反應的抗體，實現這種選擇。可替代地，在一些方面，選擇與某些所期望分子交叉反應的抗體或抗體片段。
如本文所用，術語「親和力」係指抗體與抗原之間在單個抗原位點處相互作用的強度。在每個抗原位點內，抗體「臂」的可變區藉由弱非共價力在許多位點處與抗原相互作用；相互作用越多，親和力越強。
術語「分離的抗體」係指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體。然而，特異性結合一種抗原的分離的抗體可以對其他抗原具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學品。
術語「相應的人種系序列」係指編碼人可變區胺基酸序列或子序列的核酸序列，與由人種系免疫球蛋白可變區序列編碼的其他全部可變區胺基酸序列相比，該人可變區胺基酸序列或子序列與參考可變區胺基酸序列或子序列共有確定的最高胺基酸序列同一性。相應的人種系序列還可以是指與全部其他評價的可變區胺基酸序列相比，與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列同一性的人可變區胺基酸序列或子序列。相應的人種系序列可以僅是框架區、僅是互補性決定區、係框架區和互補性決定區、可變區段(如上文所定義)，或包含可變區的序列或子序列的其他組合。可以使用本文所述的方法，例如，使用BLAST、ALIGN或本領域已知的另一種比對演算法比對兩個序列，確定序列同一性。相應的人種系核酸或胺基酸序列可以與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
多種免疫測定方式可以用來選擇與特定蛋白特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定常規地用來選擇與蛋白質特異性免疫反應的抗體(關於可以用來確定特異免疫反應性的免疫測定方式和條件的描述，參見例如Harlow和Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual [使用抗體：實驗室手冊] (1998))。典型地，特異性或選擇性結合反應將產生高於背景訊號至少2倍和更典型地高於背景至少10至100倍的訊號。
術語「平衡解離常數(KD [M])」係指解離速率常數(kd [s-1 ])除以締合速率常數(ka [s-1 , M-1 ])。可以使用本領域的任何已知方法，測量平衡解離常數。本揭露的抗體通常將具有小於約10-7 或10-8 M，例如，小於約10-9 M或10-10 M，在一些方面，小於約10-11 M、10-12 M或10-13 M的平衡解離常數。
術語「生物利用率」係指給予至患者的給定量的藥物的全身性利用率(即，血液/血漿水平)。生物利用率係一個絕對術語，該絕對術語指示從所給予劑型到達總循環的藥物時間(速率)和總量(程度)的度量。
如本文所用，短語「基本上由......組成」係指方法或組成物中所包含的活性藥劑以及對該方法或組成物的預期目的而言無活性的任何賦形劑的類屬或物種。在一些方面，短語「基本上由......組成」明確地排除了包含除本揭露的抗體藥物軛合物之外的一種或多種額外活性劑。在一些方面，短語「基本上由......組成」明確地排除了包含除本揭露的抗體藥物軛合物和第二共同給予的藥劑之外的一種或多種額外活性劑。
術語「胺基酸」係指天然存在的、合成的和非天然的胺基酸，以及以類似於天然存在胺基酸的方式發揮作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸係由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來經修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸和O-鄰磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫、羧基基團、胺基基團和R基團結合的α-碳)的化合物，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾的R基團(例如正亮胺酸)或經修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有如下結構的化合物，該結構與胺基酸的一般化學結構不同但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用。
術語「保守修飾的變體」適用於胺基酸和核酸序列二者。對於特定核酸序列，保守修飾的變體係指那些編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的核酸，或在該核酸不編碼胺基酸序列的情況下，係指基本相同的序列。由於遺傳密碼的簡並性，任何給定的蛋白質均可以由多個功能相同的核酸編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙胺酸。因此，在密碼子指定丙胺酸的每個位置，該密碼子可以改變為任何所述相應密碼子而不改變編碼的多肽。此類核酸變異係「沈默變異」，它們係保守修飾變異中的一種。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了核酸的每種可能的沈默變異。技術人員將認識到，核酸中的每個密碼子(除了AUG--通常是甲硫胺酸的唯一密碼子；和TGG--通常是色胺酸的唯一密碼子)均可以被修飾以產生功能相同的分子。因此，在每個所述序列中均隱含了編碼多肽的核酸的每一種沈默變異。
對於多肽序列，「保守修飾的變體」包括對多肽序列的單獨取代、缺失或添加，它們導致某個胺基酸取代為化學上相似的胺基酸。提供功能相似的胺基酸的保守取代表係本領域熟知的。此類保守修飾的變體相對於多態性變體、物種間同源物和等位基因係額外的並且不排除它們。以下8組含有互為保守替換的胺基酸： 1) 丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2) 天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3) 天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4) 精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5) 異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6) 苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7) 絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8) 半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見，例如，Creighton, Proteins [蛋白質] (1984))。在一些方面，術語「保守性序列修飾」用來指不顯著影響或改變含有該胺基酸序列的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。
如本文所用，術語「優化的」係指已經改變核苷酸序列以使用在生產性細胞或生物體(通常是真核細胞，例如酵母細胞、畢赤酵母屬(Pichia)細胞、真菌細胞、木黴屬(Trichoderma)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人細胞)中為較佳的密碼子編碼胺基酸序列。優化的核苷酸序列被工程化以完全或盡可能多地保留最初由起始核苷酸序列編碼的胺基酸序列，該起始核苷酸序列也稱為「親本」序列。
在兩個或更多個核酸序列或多肽序列的語境中，術語「相同百分比」或「同一性百分比」係指兩個或更多個序列或子序列相同的程度。如果兩個序列在正在比較的區域上具有相同的胺基酸序列或核苷酸序列，則它們係「相同的」。當在比較視窗或指定區域內進行比較和比對以尋求使用以下序列比較演算法之一或藉由手動比對和目視檢查所測量的最大對應時，如果兩個序列具有規定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸(即，在規定區域上或當沒有規定時則在整個序列上，60%同一性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性)，則兩個序列係「基本上相同的」。視情況，同一性存在於長度為至少約30個核苷酸(或10個胺基酸)的區域上，或更較佳的是在長度為100至500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)的區域上。
對於序列比較，典型地一個序列充當參考序列，測試序列與該參考序列比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列和參考序列輸入到電腦中，必要時指定子序列座標，並且指定序列演算法程式參數。可以使用預設程式參數，或者可以指定替代參數。然後，序列比較演算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，「比較視窗」包括提及選自下組的多個鄰接位置中的任何一個的區段，該組由從20至600，通常約50至約200，更通常約100至約150組成，其中在兩個序列最佳比對後，可以將序列與相同數量的鄰接位置的參考序列進行比較。用於比較的序列比對方法在本領域中係熟知的。例如藉由Smith和Waterman Adv. Appl. Math. [應用數學進展] 2:482c (1970)的局部同源性演算法，藉由Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. [分子生物學期刊] 48:443 (1970)的同源性比對演算法，藉由Pearson和Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 85:2444 (1988)的相似性方法研究，藉由該等演算法(威斯康辛州麥迪森的科學大道575號遺傳學電腦小組(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)的威斯康辛遺傳學套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的電腦實現，或藉由手動比對和目測檢查(參見例如，Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學實驗指南]，2003)，可以進行用於比較的序列的最佳比對。
適用於確定序列同一性百分比和序列相似性的演算法的兩個實例係BLAST和BLAST 2.0演算法，它們分別描述於Altschul等人，Nuc. Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402, 1977；和Altschul等人，J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 215:403-410, 1990。用於執行BLAST分析的軟體可藉由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開地獲得。該演算法包括首先藉由鑒定查詢序列中長度為W的短字來鑒定高評分序列對(HSP)，當與數據庫序列中的相同長度的字比對時，所述長度為W的短字匹配或滿足一些正值閾值得分T。T被稱為鄰域字得分閾值(Altschul等人，同上)。該等最初的鄰域字命中點作為種子，用於啟動搜索以找到包含它們的更長的HSP。字命中點沿著每個序列在兩個方向上擴展，遠至可以增加累積比對得分。對於核苷酸序列，使用參數M(一對匹配殘基的獎勵得分；總是＞0)和N(錯配殘基的罰分；總是＜0)計算累積得分。對於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累積得分。當出現以下情形時，字命中點向各方向的延伸終止：累積比對得分從其最大獲得值跌落數量X；由於一個或多個負分殘基比對的累積，累積得分走向零或更低；或到達任一序列的一端。BLAST演算法參數W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用字長(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和兩條股比較作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長3和期望值(E)10以及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 89:10915)比對(B)50、期望值(E)10、M=5、N=-4和兩條股比較作為預設值。
BLAST演算法還對兩個序列之間的相似性進行統計分析(參見例如，Karlin和Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 90:5873-5787, 1993)。BLAST演算法提供的一種相似度量度係最小總和概率(P(N))，它提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中的最小總和概率小於約0.2，更較佳的是小於約0.01，並且最較佳的是小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比也可以使用已併入ALIGN演算法(2.0版)中的E. Meyers和W. Miller, Comput. Appl. Biosci. [電腦應用生物科學], 4:11-17, (1988)的演算法，利用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12以及空位罰分4來確定。此外，兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已經併入GCG套裝軟體中的GAP程式(可從www.gcg.com獲得)中的Needleman和Wunsch, J. Mol, Biol.[分子生物學雜誌] 48:444-453, (1970)演算法，利用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來確定。
除了上述序列同一性百分比之外，兩個核酸序列或多肽基本上相同的另一個指示係由第一核酸編碼的多肽與針對由第二核酸編碼的多肽產生的抗體進行免疫交叉反應，如下所述。因此，多肽典型地與第二多肽基本上相同，例如其中兩種肽僅藉由保守取代而不同。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示係兩個分子或它們的補體在嚴格條件下彼此雜交，如下所述。兩個核酸序列基本上相同的又另一個指示係可使用相同的引物來擴增序列。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，並且是指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，該核酸係合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指出，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡並密碼子取代)、和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下文詳述，簡並密碼子取代可以藉由產生如下序列而實現，在該等序列中，一個或多個所選擇的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代(Batzer等人，(1991) Nucleic Acid Res. [核酸研究] 19:5081；Ohtsuka等人，(1985) J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 260:2605-2608；和Rossolini等人，(1994) Mol. Cell. Probes [分子與細胞探針] 8:91-98)。
術語「可操地連接」在核酸的語境中係指兩個或更多個多核苷酸(例如，DNA)區段之間的功能性關係。典型地，它係指轉錄調節序列與已轉錄序列的功能性關係。例如，如果啟動子或增強子序列在適當的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子序列與編碼序列可操作地連接。通常，與轉錄序列可操作地連接的啟動子轉錄調節序列與轉錄序列在物理上鄰接，即它們係順式作用的。然而，一些轉錄調控序列如增強子不需要在物理上鄰接或位於極為接近該等轉錄調控序列增強其轉錄的編碼序列的位置。
術語「多肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用來指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基係相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守性修飾的變體。
如本文所用，術語「軛合物」或「抗體藥物軛合物」係指抗體或其抗原結合片段與另一種藥劑如化學治療劑、毒素、免疫治療劑、成像探針等連接。該連接可以是共價鍵或非共價相互作用，如借助靜電力。可以採用本領域已知的多種接頭以形成軛合物。另外地，可以將軛合物以可能是從編碼軛合物的多核苷酸表現的融合蛋白的形式提供。如本文所用，「融合蛋白」係指藉由連接最初編碼分離的蛋白質(包括肽和多肽)的兩個或更多個基因或基因片段產生的蛋白質。融合基因的翻譯產生具有從每種原始蛋白質衍生的功能特性的單一蛋白。
術語「受試者」包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物如非人靈長類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非指出時，否則術語「患者」或「受試者」在本文中可互換地使用。
如本文所用，術語「毒素」、「細胞毒素」或「細胞毒性劑」係指對細胞的生長和增殖有害並可以發揮作用以減少、抑制或摧毀細胞或惡性腫瘤的任何藥劑。
如本文所用，術語「抗癌劑」係指可以用來治療細胞增殖性障礙如癌症的任何藥劑，包括但不限於細胞毒性劑、化學治療劑、放射療法和放射治療劑、靶向抗癌劑和免疫治療劑。
如本文所用，術語「藥物部分」或「有效負載」係指與抗體或抗原結合片段軛合或適用於與抗體或抗原結合片段軛合的化學部分，並且可以包括任何治療劑或診斷劑和具有所期望的治療或診斷特性的本文揭露的抗體藥物軛合物的代謝物，例如，抗癌劑、抗炎劑、抗感染劑(例如，抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生蟲劑、抗病毒劑)或麻醉劑。在某些方面，藥物部分選自Eg5抑制劑、V-ATP酶抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定化劑、澳瑞司他汀、朵拉司他汀(dolastatin)、類美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫胺酸胺基肽酶)、蛋白質CRM1核輸出的抑制劑、DPPIV抑制劑、線粒體中磷醯基轉移反應抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、蛋白酶體抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝結合物、RNA聚合酶抑制劑、鵝膏蕈鹼(amanitin)、剪接體抑制劑、拓撲異構酶抑制劑和DHFR抑制劑。用於將該等藥物中每種藥物連接至與本揭露抗體和方法相容的接頭的方法係本領域已知的。例如參見，Singh等人，(2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols [治療性抗體：方法和方案], 第525卷, 445-457。此外，有效負載可以是生物物理探針、螢光團、自旋標記、紅外探針、親和探針、螯合劑、光譜探針、放射性探針、脂質分子、聚乙二醇、聚合物、自旋標記、DNA、RNA、蛋白質、肽、表面、抗體、抗體片段、奈米粒子、量子點、脂質體、PLGA粒子、糖或多糖。
術語「癌症」包括原發性惡性腫瘤(例如，其細胞未移行至受試者身體中除原始腫瘤部位之外部位的那些)和繼發性惡性腫瘤(例如，因轉移、腫瘤細胞移行至與原始腫瘤部位不同的繼發部位而產生的那些)。
術語「cKIT」(也稱為KIT、PBT、SCFR、C-Kit、CD117)係指一種作為受體酪胺酸激酶III家族成員的酪胺酸激酶受體。人cKIT同種型的核酸和胺基酸序列係已知的，並且已以以下登錄號公佈於GenBank中： NM_000222.2 → NP_000213.1 肥大/幹細胞生長三級受體Kit同種型1先質； NM_001093772.1 → NP_001087241.1 肥大/幹細胞生長三級受體Kit同種型2先質。 在結構上，cKIT受體係I型跨膜蛋白，並且含有訊息肽、在細胞外結構域中的5個Ig樣C2結構域，並且在其細胞內結構域中具有蛋白激酶結構域。如本文所用，將術語「cKIT」用於共同指cKIT蛋白質的任何天然存在的同種型、或其變體。
術語「變體」係指與參考多肽具有基本上相同的胺基酸序列、或由基本上相同的核苷酸序列編碼，並且能夠具有參考多肽的一種或多種活性的多肽。例如，變體與參考多肽可以具有約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性，同時保留參考多肽的一種或多種活性。
如本文所用，術語任何疾病或障礙的「治療(treat、treating或treatment)」在一個方面係指改善疾病或障礙(即，減慢或阻止或減少疾病或其至少一種臨床症狀的發展)。在另一個方面，「治療」係指緩解或改善至少一種身體參數(包括不能被患者辨別的那些)。在又另一個方面，「治療」係指在身體上(例如，可辨別的症狀的穩定化)、在生理上(例如，身體參數的穩定化)或二者調節疾病或障礙。在又另一個方面，「治療」係指預防或延遲該疾病或障礙的發病或發展或進展。
術語「治療可接受量」或「治療有效劑量」可互換地指足以實現所期望結果(即，腫瘤尺寸減小、抑制腫瘤生長、防止轉移、抑制或防止病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染)的量。在一些方面，治療可接受量不誘導或不引起不期望的副作用。可以藉由首先給予低劑量並且隨後遞增增加該劑量直至實現所期望效果來確定治療可接受量。本揭露分子的「治療有效劑量」可以分別防止疾病症狀發作或導致疾病症狀的嚴重程度下降，該等疾病症狀包括與癌症相關的症狀。
術語「共同給予」係指個體的血液中同時存在兩種活性藥劑。共同給予的活性藥劑可以並行或依序遞送。
如本文所用，術語「硫醇-馬來醯亞胺」係指藉由硫醇與馬來醯亞胺反應形成的基團，具有以下該通式：
Figure 02_image007
其中Y和Z係經由硫醇-馬來醯亞胺鍵連接的基團，並且可以包含接頭組分、抗體或有效負載。硫醇-馬來醯亞胺可以形成以下開環結構
Figure 02_image009
和
Figure 02_image011
。
如本文所用，「可裂解的」係指藉由共價連接連接兩個部分，但是在生理學相關條件下分解以切斷部分之間的共價連接的連接基團或接頭組分，典型地，與在細胞外環境時相比可裂解的連接基團在細胞內環境內更快速地體內切斷，導致有效負載的釋放優先發生在靶細胞內。裂解可以是酶促的或非酶促的，但通常從抗體釋放有效負載而不降解抗體。裂解可以留下連接基團或接頭組分的一些部分連接至有效負載上，或者它可以釋放不具有連接基團的任何殘基的有效負載。
如本文所用，「不可裂解的」係指在生理條件下不特別易於分解的連接基團或接頭基團，例如，它至少與軛合物的抗體或抗原結合片段部分一樣穩定。此類連接基團有時被稱為「穩定的」，這意味著它們足以抵抗降解以保持有效負載與抗體或抗原結合片段連接，直到抗體或抗原結合片段本身至少部分降解，即，抗體或抗原結合片段的降解在體內裂解連接基團之前。具有穩定或不可裂解的連接基團的ADC的抗體部分的降解可以留下連接基團的一些或全部(例如，來自抗體的一個或多個胺基酸基團)連接至遞送在體內的有效負載或藥物部分上。藥物部分 (D)
在一個方面，本發明的藥物部分係具有式 (A) 之化合物：
Figure 02_image013
式 (A) 其中： R1 係
Figure 02_image015
或
Figure 02_image017
； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
在一個方面，本發明的藥物部分係具有式 (B) 之化合物：
Figure 02_image019
式 (B) 其中： R1 係
Figure 02_image015
或
Figure 02_image017
； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
本發明的藥物部分的某些方面及實例係提供在額外的枚舉型實施方式的下列列表中。應認識到，每個實施方式中指定的特徵可以與其他指定特徵組合以提供本發明的另外實施方式。
實施方式1. 具有式 (A) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (A-1) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image021
式 (A-1) 其中： R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
實施方式2. 具有式 (A) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (A-2) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image023
式 (A-2) 其中： R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
實施方式3. 具有式 (A) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (A-3) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image025
式 (A-3) 其中： R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
實施方式2. 具有式 (A) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (A-4) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image027
式 (A-4) 其中： R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
實施方式3. 具有式 (A)、式 (A-1)、式 (A-2)、式 (A-3) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H或C1 -C6 烷基。
實施方式4. 具有式 (A)、式 (A-1)、式 (A-2)、式 (A-3) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H或甲基。
實施方式5. 具有式 (A)、式 (A-1)、式 (A-2)、式 (A-3) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H。
實施方式6. 具有式 (A)、式 (A-1)、式 (A-2)、式 (A-3) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係甲基。
實施方式7. 具有式 (A)、式 (A-1) 或式 (A-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image029
。
實施方式8. 具有式 (A)、式 (A-1) 或式 (A-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image031
。
實施方式9. 具有式 (A)、式 (A-1) 或式 (A-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image033
。
實施方式10. 具有式 (A)、式 (A-1) 或式 (A-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image035
。
實施方式11. 具有式 (A)、式 (A-2) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image037
。
實施方式12. 具有式 (A)、式 (A-2) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image039
。
實施方式13. 具有式 (A)、式 (A-2) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image041
。
實施方式14. 具有式 (A)、式 (A-2) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image043
。
實施方式15. 具有式 (B) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (B-1) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image045
式 (B-1) 其中： R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
實施方式16. 具有式 (B) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (B-2) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image047
式 (B-2) 其中： R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
實施方式17. 具有式 (B) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (B-3) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image049
式 (B-3) 其中： R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
實施方式18. 具有式 (B) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (B-4) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image051
式 (B-4) 其中： R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
實施方式19. 具有式 (B)、式 (B-1)、式 (B-2)、式 (B-3) 或式 (B-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H或C1 -C6 烷基。
實施方式20. 具有式 (B)、式 (B-1)、式 (B-2)、式 (B-3) 或式 (B-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H或甲基。
實施方式21. 具有式 (B)、式 (B-1)、式 (B-2)、式 (B-3) 或式 (B-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H。
實施方式22. 具有式 (B)、式 (B-1)、式 (B-2)、式 (B-3) 或式 (B-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係甲基。
實施方式23. 具有式 (B)、式 (B-1) 或式 (B-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image053
。
實施方式24 具有式 (B)、式 (B-1) 或式 (B-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image055
。
實施方式25. 具有式 (B)、式 (B-1) 或式 (B-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image057
。
實施方式26. 具有式 (B)、式 (B-1) 或式 (B-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image059
。
實施方式27. 具有式 (B)、式 (B-2) 或式 (B-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image061
。
實施方式28. 具有式 (B)、式 (B-2) 或式 (B-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image063
。
實施方式29. 具有式 (B)、式 (B-2) 或式 (B-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image065
。
實施方式30. 具有式 (A)、式 (A-2) 或式 (A-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物係
Figure 02_image067
。接頭 - 藥物部分 (LB -(D)n )
在一個方面，本發明的接頭-藥物部分包含一種或多種共價連接至接頭(LB )的細胞毒素，其中該一種或多種細胞毒素獨立地選自具有式 (A)、式 (A-1)、式 (A-2)、式 (A-3)、式 (A-4)、式 (B)、式 (B-1)、式 (B-2)、式 (B-3) 或式 (B-4) 之化合物、或實施方式7至14中任一項或實施方式23至30中任一項所述的化合物。
在一個方面，本發明的接頭-藥物部分包含一種或多種共價連接至接頭(LB )的細胞毒素，其中該一種或多種細胞毒素獨立地選自具有式 (A)、式 (A-1)、式 (A-2)、式 (A-3) 或式 (A-4) 之化合物、或實施方式7至14中任一項所述的化合物。
在一個方面，本發明的接頭-藥物部分包含一種或多種共價連接至接頭(LB )的細胞毒素，其中該一種或多種細胞毒素獨立地選自具有式 (B)、式 (B-1)、式 (B-2)、式 (B-3) 或式 (B-4) 之化合物、或實施方式23至30中任一項所述的化合物。
在一個方面，本發明的接頭-藥物部分係具有式 (C) 之結構的化合物，或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，
Figure 02_image069
式 (C) 其中： RA 係
Figure 02_image071
或
Figure 02_image073
； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； R5 係-L1 R14 、-L1 R24 、-L1 R34 或-L1 R44 ； L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 或-X2 X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** ，其中** 指示與R14 的連接點； X1 係
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
或
Figure 02_image089
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點； X2 係
Figure 02_image091
、
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X3 係
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X4 係
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
、
Figure 02_image101
、
Figure 02_image103
、
Figure 02_image105
、
Figure 02_image107
、
Figure 02_image109
、
Figure 02_image111
、
Figure 02_image113
或
Figure 02_image115
，其中* 指示連接點朝向R14 、R24 、R34 或R44 ； R14 係
Figure 02_image117
、-N3 、-ONH2 、-NR6 C(=O)CH=CH2 、SH、-SSR7 、-S(=O)2 (CH=CH2 )、-NR6 S(=O)2 (CH=CH2 )、-NR6 C(=O)CH2 Br、-NR6 C(=O)CH2 I、-NHC(=O)CH2 Br、-NHC(=O)CH2 I、-C(=O)NHNH2 、
Figure 02_image119
、-CO2 H、-NH2 、
Figure 02_image121
、
Figure 02_image123
、
Figure 02_image125
、
Figure 02_image127
、
Figure 02_image129
、
Figure 02_image131
、
Figure 02_image133
、
Figure 02_image135
、
Figure 02_image135
、
Figure 02_image137
、
Figure 02_image139
、
Figure 02_image141
、
Figure 02_image143
、
Figure 02_image145
、
Figure 02_image147
或
Figure 02_image149
； R24 係
Figure 02_image151
、
Figure 02_image153
、
Figure 02_image155
、
Figure 02_image157
、
Figure 02_image159
、
Figure 02_image161
或
Figure 02_image163
； R34 係-N3 、-ONH2 、-NR7 C(=O)CH=CH2 、-C(=O)NHNH2 、-CO2 H、-NH2 、
Figure 02_image121
、
Figure 02_image123
、
Figure 02_image125
或
Figure 02_image127
； R44 係
Figure 02_image169
、
Figure 02_image171
、
Figure 02_image173
、
Figure 02_image175
或-NR7 C(=O)CH2 R8 ； 每個R6 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； R7 係2-吡啶基或4-吡啶基； R8 係-S(CH2 )n CHR9 NH2 ； R9 係-C(=O)OR7 ； 每個R10 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl和-OH； 每個R11 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl、-NH2 、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-N(CH3 )2 、-CN、-NO2 和-OH； 每個R12 獨立地選自H、C1-6 烷基、氟、被-C(=O)OH取代的苄氧基、被-C(=O)OH取代的苄基、被-C(=O)OH取代的C1-4 烷氧基和被-C(=O)OH取代的C1-4 烷基； 每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，並且 每個p獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
本發明的接頭-藥物部分的某些方面及實例係提供在額外的枚舉型實施方式的下列列表中。應認識到，每個實施方式中指定的特徵可以與其他指定特徵組合以提供本發明的另外實施方式。
實施方式31. 具有式 (C) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-1) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image177
式 (C-1) 其中：R2 和R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式32. 具有式 (C) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-2) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image179
式 (C-2) 其中：R2 和R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式33. 具有式 (C) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-3) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image181
式 (C-3) 其中：R2 和R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式32. 具有式 (C) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-4) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image183
式 (C-4) 其中：R2 和R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式33. 具有式 (C)、式 (C-1)、式 (C-2)、式 (C-3) 或式 (C-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H或C1 -C6 烷基。
實施方式34. 具有式 (C)、式 (C-1)、式 (C-2)、式 (C-3) 或式 (C-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H或甲基。
實施方式35. 具有式 (C)、式 (C-1)、式 (C-2)、式 (C-3) 或式 (C-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H。
實施方式36. 具有式 (C)、式 (C-1)、式 (C-2)、式 (C-3) 或式 (C-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係甲基。
實施方式37. 具有式 (C)、式 (C-1)或式 (C-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-5) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image185
式 (C-5) 其中：R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式38. 具有式 (C)、式 (C-1)或式 (C-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-6) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image187
式 (C-6) 其中：R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式39. 具有式 (C)、式 (C-1)或式 (C-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-7) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image189
式 (C-7) 其中：R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式40. 具有式 (C)、式 (C-1)或式 (C-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-8) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image191
式 (C-8) 其中：R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式41. 具有式 (C)、式 (C-1)或式 (C-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-9) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image193
式 (C-9) 其中：R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式42. 具有式 (C)、式 (C-1)或式 (C-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-10) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image195
式 (C-10) 其中：R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式43. 具有式 (C)、式 (C-1)或式 (C-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-11) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image197
式 (C-11) 其中：R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式44. 具有式 (C)、式 (C-1)或式 (C-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (C-12) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image199
式 (C-12) 其中：R5 如上文對於具有式 (C) 之化合物所定義的。
實施方式45. 具有式 (C)、式 (C-1) 或式 (C-3)、或如實施方式37所述的化合物，其中該化合物係
Figure 02_image201
。
實施方式46. 具有式 (C)、式 (C-1) 或式 (C-3)、或如實施方式37所述的化合物，其中該化合物係
Figure 02_image203
。
實施方式47. 具有式 (C)、式 (C-1) 或式 (C-3)、或如實施方式38所述的化合物，其中該化合物係
Figure 02_image205
。
實施方式48. 具有式 (C)、式 (C-1) 或式 (C-3)、或如實施方式38所述的化合物，其中該化合物係
Figure 02_image207
。
在一個方面，本發明的接頭-藥物部分係具有式 (C) 之結構的化合物，或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，
Figure 02_image209
式 (D) 其中： RA 係
Figure 02_image071
或
Figure 02_image073
； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； R5 係-L1 R14 、-L1 R24 、-L1 R34 或-L1 R44 ； L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 或-X2 X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** ，其中** 指示與R14 的連接點； X1 係
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
或
Figure 02_image089
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點； X2 係
Figure 02_image091
、
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X3 係
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X4 係
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
、
Figure 02_image101
、
Figure 02_image103
、
Figure 02_image105
、
Figure 02_image107
、
Figure 02_image109
、
Figure 02_image111
、
Figure 02_image113
或
Figure 02_image115
，其中* 指示連接點朝向R14 、R24 、R34 或R44 ； R14 係
Figure 02_image117
、-N3 、-ONH2 、-NR6 C(=O)CH=CH2 、SH、-SSR7 、-S(=O)2 (CH=CH2 )、-NR6 S(=O)2 (CH=CH2 )、-NR6 C(=O)CH2 Br、-NR6 C(=O)CH2 I、-NHC(=O)CH2 Br、-NHC(=O)CH2 I、-C(=O)NHNH2 、
Figure 02_image119
、-CO2 H、-NH2 、
Figure 02_image121
、
Figure 02_image123
、
Figure 02_image125
、
Figure 02_image127
、
Figure 02_image129
、
Figure 02_image131
、
Figure 02_image133
、
Figure 02_image135
、
Figure 02_image135
、
Figure 02_image137
、
Figure 02_image139
、
Figure 02_image141
、
Figure 02_image143
、
Figure 02_image145
、
Figure 02_image147
或
Figure 02_image149
； R24 係
Figure 02_image151
、
Figure 02_image153
、
Figure 02_image155
、
Figure 02_image157
、
Figure 02_image159
、
Figure 02_image161
或
Figure 02_image163
； R34 係-N3 、-ONH2 、-NR7 C(=O)CH=CH2 、-C(=O)NHNH2 、-CO2 H、-NH2 、
Figure 02_image121
、
Figure 02_image123
、
Figure 02_image125
或
Figure 02_image127
； R44 係
Figure 02_image169
、
Figure 02_image171
、
Figure 02_image173
、
Figure 02_image175
或-NR7 C(=O)CH2 R8 ； 每個R6 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； R7 係2-吡啶基或4-吡啶基； R8 係-S(CH2 )n CHR9 NH2 ； R9 係-C(=O)OR7 ； 每個R10 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl和-OH； 每個R11 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl、-NH2 、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-N(CH3 )2 、-CN、-NO2 和-OH； 每個R12 獨立地選自H、C1-6 烷基、氟、被-C(=O)OH取代的苄氧基、被-C(=O)OH取代的苄基、被-C(=O)OH取代的C1-4 烷氧基和被-C(=O)OH取代的C1-4 烷基； 每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，並且 每個p獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
本發明的接頭-藥物部分的某些方面及實例係提供在額外的枚舉型實施方式的下列列表中。應認識到，每個實施方式中指定的特徵可以與其他指定特徵組合以提供本發明的另外實施方式。
實施方式49. 具有式 (D) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-1) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image238
式 (D-1) 其中：R2 和R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式50. 具有式 (D) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-2) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image240
式 (D-2) 其中：R2 和R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式51. 具有式 (D) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-3) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image242
式 (D-3) 其中：R2 和R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式52. 具有式 (D) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-4) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image244
式 (D-4) 其中：R2 和R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式53. 具有式 (D)、式 (D-1)、式 (D-2)、式 (D-3) 或式 (D-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H或C1 -C6 烷基。
實施方式54. 具有式 (D)、式 (D-1)、式 (D-2)、式 (D-3) 或式 (D-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H或甲基。
實施方式55. 具有式 (D)、式 (D-1)、式 (D-2)、式 (D-3) 或式 (D-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係H。
實施方式56. 具有式 (D)、式 (D-1)、式 (D-2)、式 (D-3) 或式 (D-4) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：R2 係甲基。
實施方式57. 具有式 (D)、式 (D-1)或式 (D-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-5) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image246
式 (D-5) 其中：R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式58. 具有式 (D)、式 (D-1)或式 (D-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-6) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image248
式 (D-6) 其中：R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式59. 具有式 (D)、式 (D-1)或式 (D-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-7) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image250
式 (D-7) 其中：R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式60. 具有式 (D)、式 (D-1)或式 (D-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-8) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image252
式 (D-8) 其中：R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式61. 具有式 (D)、式 (D-1)或式 (D-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-9) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image254
式 (D-9) 其中：R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式62. 具有式 (D)、式 (D-1)或式 (D-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-10) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image256
式 (D-10) 其中：R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式63. 具有式 (D)、式 (D-1)或式 (D-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-11) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image258
式 (D-11) 其中：R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式64. 具有式 (D)、式 (D-1)或式 (D-3) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，具有式 (D-12) 之結構或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image260
式 (D-12) 其中：R5 如上文對於具有式 (D) 之化合物所定義的。
實施方式65. 具有式 (D)、式 (D-1) 或式 (D-3)、或如實施方式57所述的化合物，其中該化合物係
Figure 02_image262
。
實施方式66. 具有式 (D)、式 (D-1) 或式 (D-3)、或如實施方式57所述的化合物，其中該化合物係
Figure 02_image264
。
實施方式67. 具有式 (D)、式 (D-1) 或式 (D-3)、或如實施方式58所述的化合物，其中該化合物係
Figure 02_image266
。
實施方式68. 具有式 (D)、式 (D-1) 或式 (D-3)、或如實施方式58所述的化合物，其中該化合物係
Figure 02_image268
。抗體藥物軛合物
本揭露提供了抗體藥物軛合物，其中特異性結合cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')視情況藉由接頭與藥物部分(例如細胞毒性劑)連接。在一個方面，抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')藉由接頭經由共價連接與作為細胞毒性劑的藥物部分連接。
抗體藥物軛合物可以選擇性地將細胞毒性劑遞送至表現cKIT的細胞，例如造血幹細胞，從而選擇性地消融患者，例如造血幹細胞移植受者中的那些細胞。較佳的是，cKIT抗體藥物軛合物具有短的半衰期並且將從患者的循環中清除，因此它們可用於在造血幹細胞移植之前調理造血幹細胞移植受者。
在一些實施方式中，本文揭露的cKIT抗體藥物軛合物被修飾以甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也具有降低的誘導肥大細胞去顆粒的能力。例如，本文揭露的cKIT抗體藥物軛合物被修飾以甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也具有降低的誘導肥大細胞去顆粒的能力，與全長cKIT抗體、其F(ab')2 或F(ab)2 片段、或軛合物相比，該能力降低、降低約或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%。在一些實施方式中，本文揭露的cKIT抗體藥物軛合物可以包含抗cKIT Fab或Fab'片段。在一些實施方式中，本文揭露的抗cKIT抗體藥物軛合物甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也可以具有誘導肥大細胞去顆粒的極小活性，例如在β-己糖胺酶釋放測定中，基線校正的O.D.讀出小於0.25，例如小於0.2、小於0.15、或小於0.1。
在一些實施方式中，本文提供了軛合物，該等軛合物包含特異性結合cKIT、視情況藉由接頭與藥物部分(例如細胞毒性劑)連接的抗體片段(例如Fab或Fab')(抗cKIT Fab或Fab')。如本文所述，此類抗cKIT Fab或Fab'-毒素軛合物能夠消融體外和體內的人HSC細胞，但甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也不引起肥大細胞去顆粒。
在一個方面，本揭露提供了一種具有式 (I) 之軛合物： A-(LB -(D)n )y 式 (I)； 其中： A係特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')； LB 係接頭； D係細胞毒性劑； n係從1至10的整數，並且 y係從1至10的整數， 其中接頭-藥物部分(LB -(D)n )共價連接至抗體片段(A)。
在一個方面，本揭露涉及一種具有式 (II) 之軛合物：
Figure 02_image270
式 (II)； A1 係特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')或鏈(例如HC或LC)； A2 係特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')或鏈(例如HC或LC)； LB 係接頭； D係細胞毒性劑，並且 n係從1至10的整數， 其中接頭-藥物部分(LB -(D)n )共價偶聯抗體片段A1 和A2 。
在一個方面，本發明的軛合物包含一種或多種共價連接至接頭(LB )的細胞毒素，其中該一種或多種細胞毒素獨立地選自具有式 (A)、式 (A-1)、式 (A-2)、式 (A-3)、式 (A-4)、式 (B)、式 (B-1)、式 (B-2)、式 (B-3) 或式 (B-4) 之化合物、或如實施方式7至14中任一項或如實施方式23至30中任一項所述的化合物。
在一個方面，本發明的軛合物包含一種或多種共價連接至接頭(LB )的細胞毒素，其中該一種或多種細胞毒素獨立地選自具有式 (A)、式 (A-1)、式 (A-2)、式 (A-3) 或式 (A-4) 之化合物、或如實施方式7至14中任一項所述的化合物。
在一個方面，本發明的軛合物包含一種或多種共價連接至接頭(LB )的細胞毒素，其中該一種或多種細胞毒素獨立地選自具有式 (B)、式 (B-1)、式 (B-2)、式 (B-3) 或式 (B-4) 之化合物、或如實施方式23至30中任一項所述的化合物。
在具有式 (I) 之軛合物中，一個或多個接頭-藥物部分(LB -(D)n )可以共價連接至抗體片段A(例如Fab或Fab')，從而藉由接頭LB 將一個或多個藥物部分D共價連接至抗體片段A(例如Fab或Fab')。LB 係能夠將抗體片段A(例如Fab或Fab')與一個或多個藥物部分D連接的任何化學部分。具有式 (I) 之軛合物(其中一個或多個藥物部分D共價連接至抗體片段A(例如Fab或Fab'))可以使用具有一個或多個相同或不同的反應性官能基的雙功能或多功能接頭試劑形成。雙功能或多功能接頭試劑的反應性官能基之一用於與抗體片段A上的基團例如硫醇或胺(例如半胱胺酸、N末端或胺基酸側鏈如賴胺酸)反應以與LB 接頭的一端形成共價鍵。雙功能或多功能接頭試劑的此類反應性官能基包括但不限於馬來醯亞胺、硫醇和NHS酯。雙功能或多功能接頭試劑的一個或多個其他反應性官能基用於將一個或多個藥物部分D共價連接至接頭LB 。
在具有式 (II) 之軛合物中，藉由抗體片段A1 和A2 上的側鏈硫醇與1,3-二鹵代丙酮(如1,3-二氯丙酮、1,3-二溴丙酮、1,3-二碘丙酮)和1,3-二羥基丙酮的二磺酸酯的反應形成酮橋，該酮橋從而共價偶聯抗體片段A1 和A2 。該酮橋部分用於藉由接頭LB 將一個或多個藥物部分D共價連接至抗體片段A1 和A2 。LB 係能夠將抗體片段A1 和A2 與一個或多個藥物部分D連接的任何化學部分。具有式 (II) 之軛合物(其中一個或多個藥物部分D共價連接至抗體片段A1 和A2 )可以使用具有一個或多個相同或不同的反應性官能基的雙功能或多功能接頭試劑形成。在一個實施方式中，雙功能或多功能接頭試劑的一個反應性官能基係烷氧基胺，該烷氧基胺用於與酮橋反應以與接頭LB 的一端形成肟鍵，並且雙功能或多功能接頭試劑的一個或多個其他反應性官能基用於將一個或多個藥物部分D共價連接至接頭LB 。在另一個實施方式中，雙功能或多功能接頭試劑的一個反應性官能基係肼，該肼用於與酮橋反應以與接頭LB 的一端形成腙鍵，並且雙功能或多功能接頭試劑的一個或多個其他反應性官能基用於將一個或多個藥物部分D共價連接至接頭LB 。
在一個方面，LB 係可裂解接頭。在另一個方面，L係不可裂解接頭。在一些方面，LB 係酸不穩定接頭、光不穩定接頭、肽酶可裂解接頭、酯酶可裂解接頭、糖苷酶可裂解接頭、磷酸二酯酶可裂解接頭、二硫鍵可還原接頭、親水接頭、或基於二羧酸的接頭。
雖然對於特定軛合物分子而言，藥物對抗體比率具有確切的整數值(例如，在式 (I) 中為n和y的乘積並且在式 (II) 中為「n」)，但是應理解當用來描述含有許多分子的樣品時，該值將經常是平均值，這歸因於典型地與軛合步驟相關的某種程度的非均勻性。軛合物樣品的平均載量在本文中稱為藥物對抗體(或Fab')比率或「DAR」。在一些方面，DAR在約1與約5之間，並且典型地是約1、2、3或4。在一些方面，按重量計至少50%的樣品係具有平均DAR加或減2的化合物，並且較佳的是至少50%的樣品係含有平均DAR加或減1的軛合物。其他方面包括其中DAR係約2的軛合物。在一些方面，「約y」的DAR意指DAR的測量值在式 (I) 中n和y的乘積的20%內。在一些方面，「約n」的DAR意指DAR的測量值在式 (II) 中n的20%內。
在一個方面，在具有式 (I) 之軛合物中藥物對抗體片段(Fab或Fab')的平均莫耳比(即，n和y的乘積(也稱為藥物對抗體比率(DAR)的平均值)係約1至約10、約1至約6(例如0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0)、約1至約5、約1.5至約4.5、或約2至約4。
在一個方面，在具有式 (II) 之軛合物中藥物對抗體片段A1 和A2 的平均莫耳比(即，n(也稱為藥物對抗體比率(DAR)的平均值)係約1至約10、約1至約6(例如0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0)、約1至約5、約1.5至約4.5、或約2至約4。
在由本揭露提供的一個方面，軛合物具有實質上高的純度並且具有以下特徵中的一個或多個：(a) 大於約90%(例如大於或等於約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%)、較佳的是大於約95%的軛合物種類係單體的，(b) 軛合物製劑中的未軛合的接頭水平小於約10%(例如小於或等於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%)(相對於總接頭)，(c) 小於10%的軛合物種類係交聯的(例如小於或等於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%)，(d) 軛合物製劑中的游離藥物(例如澳瑞司他汀、鵝膏蕈鹼、類美登素或皂草素)水平小於約2%(例如小於或等於約1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、或0%)(相對於總細胞毒性劑的mol/mol)。
在一個方面，本發明的軛合物具有式 (E) 之結構：
Figure 02_image001
式 (E) 其中： A表示特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')； y係從1至10的整數； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 或-X2 X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** ，其中** 指示與R114 的連接點； X1 係
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
或
Figure 02_image089
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點； X2 係
Figure 02_image091
、
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X3 係
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X4 係
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
、
Figure 02_image101
、
Figure 02_image103
、
Figure 02_image105
、
Figure 02_image107
、
Figure 02_image109
、
Figure 02_image111
、
Figure 02_image113
或
Figure 02_image115
，其中* 指示連接點朝向R114 ； R114 係
Figure 02_image273
、
Figure 02_image275
、
Figure 02_image277
、
Figure 02_image279
、
Figure 02_image281
、-NR6 C(=O)CH2 -* 、-NHC(=O)CH2 -* 、-S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-(CH2 )2 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 C(=O)CH2 CH2 -* 、-NH-、-C(=O)-、-NHC(=O)-* 、-CH2 NHCH2 CH2 -* 、-NHCH2 CH2 -* 、  -S-、
Figure 02_image283
、
Figure 02_image285
、
Figure 02_image287
、
Figure 02_image289
、
Figure 02_image291
、
Figure 02_image293
、
Figure 02_image295
、
Figure 02_image297
、
Figure 02_image299
、
Figure 02_image301
、
Figure 02_image303
、
Figure 02_image305
、
Figure 02_image307
、
Figure 02_image309
、
Figure 02_image311
、
Figure 02_image313
、
Figure 02_image315
、
Figure 02_image317
、
Figure 02_image319
、
Figure 02_image321
、或
Figure 02_image323
、
Figure 02_image325
，其中* 指示與A的連接點； 每個R6 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； 每個R10 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl和-OH； 每個R11 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl、-NH2 、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-N(CH3 )2 、-CN、-NO2 和-OH； 每個R12 獨立地選自H、C1-6 烷基、氟、被-C(=O)OH取代的苄氧基、被-C(=O)OH取代的苄基、被-C(=O)OH取代的C1-4 烷氧基和被-C(=O)OH取代的C1-4 烷基； 每個R15 獨立地選自H、-CH3 和苯基； 每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，並且 每個p獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一個方面，本發明的軛合物具有式 (F) 之結構：
Figure 02_image327
式 (F) 其中： A表示特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')； y係從1至10的整數； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 或-X2 X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** ，其中** 指示與R114 的連接點； X1 係
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
或
Figure 02_image089
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點； X2 係
Figure 02_image091
、
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X3 係
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X4 係
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
、
Figure 02_image101
、
Figure 02_image103
、
Figure 02_image105
、
Figure 02_image107
、
Figure 02_image109
、
Figure 02_image111
、
Figure 02_image113
或
Figure 02_image115
，其中* 指示連接點朝向R114 ； R114 係
Figure 02_image273
、
Figure 02_image275
、
Figure 02_image277
、
Figure 02_image279
、
Figure 02_image281
、-NR6 C(=O)CH2 -* 、-NHC(=O)CH2 -* 、-S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-(CH2 )2 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 C(=O)CH2 CH2 -* 、-NH-、-C(=O)-、-NHC(=O)-* 、-CH2 NHCH2 CH2 -* 、-NHCH2 CH2 -* 、  -S-、
Figure 02_image283
、
Figure 02_image285
、
Figure 02_image287
、
Figure 02_image289
、
Figure 02_image291
、
Figure 02_image293
、
Figure 02_image295
、
Figure 02_image297
、
Figure 02_image299
、
Figure 02_image301
、
Figure 02_image303
、
Figure 02_image305
、
Figure 02_image307
、
Figure 02_image309
、
Figure 02_image311
、
Figure 02_image313
、
Figure 02_image315
、
Figure 02_image317
、
Figure 02_image319
、
Figure 02_image321
、或
Figure 02_image323
、
Figure 02_image325
，其中* 指示與A的連接點； 每個R6 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； 每個R10 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl和-OH； 每個R11 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl、-NH2 、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-N(CH3 )2 、-CN、-NO2 和-OH； 每個R12 獨立地選自H、C1-6 烷基、氟、被-C(=O)OH取代的苄氧基、被-C(=O)OH取代的苄基、被-C(=O)OH取代的C1-4 烷氧基和被-C(=O)OH取代的C1-4 烷基； 每個R15 獨立地選自H、-CH3 和苯基； 每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，並且 每個p獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一個方面，本發明的軛合物具有式 (G) 之結構：
Figure 02_image003
式 (G) 其中： A表示特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')； y係從1至10的整數； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 或-X2 X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** ，其中** 指示與R114 的連接點； X1 係
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
或
Figure 02_image089
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點； X2 係
Figure 02_image091
、
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X3 係
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X4 係
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
、
Figure 02_image101
、
Figure 02_image103
、
Figure 02_image105
、
Figure 02_image107
、
Figure 02_image109
、
Figure 02_image111
、
Figure 02_image113
或
Figure 02_image115
，其中* 指示連接點朝向R114 ； R114 係
Figure 02_image273
、
Figure 02_image275
、
Figure 02_image277
、
Figure 02_image279
、
Figure 02_image281
、-NR6 C(=O)CH2 -* 、-NHC(=O)CH2 -* 、-S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-(CH2 )2 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 C(=O)CH2 CH2 -* 、-NH-、-C(=O)-、-NHC(=O)-* 、-CH2 NHCH2 CH2 -* 、-NHCH2 CH2 -* 、  -S-、
Figure 02_image283
、
Figure 02_image285
、
Figure 02_image287
、
Figure 02_image289
、
Figure 02_image291
、
Figure 02_image293
、
Figure 02_image295
、
Figure 02_image297
、
Figure 02_image299
、
Figure 02_image301
、
Figure 02_image303
、
Figure 02_image305
、
Figure 02_image307
、
Figure 02_image309
、
Figure 02_image311
、
Figure 02_image313
、
Figure 02_image315
、
Figure 02_image317
、
Figure 02_image319
、
Figure 02_image321
、或
Figure 02_image323
、
Figure 02_image325
，其中* 指示與A的連接點； 每個R6 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； 每個R10 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl和-OH； 每個R11 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl、-NH2 、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-N(CH3 )2 、-CN、-NO2 和-OH； 每個R12 獨立地選自H、C1-6 烷基、氟、被-C(=O)OH取代的苄氧基、被-C(=O)OH取代的苄基、被-C(=O)OH取代的C1-4 烷氧基和被-C(=O)OH取代的C1-4 烷基； 每個R15 獨立地選自H、-CH3 和苯基； 每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，並且 每個p獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一個方面，本發明的軛合物具有式 (H) 之結構：
Figure 02_image332
式 (H) 其中： A表示特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')； y係從1至10的整數； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 或-X2 X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** ，其中** 指示與R114 的連接點； X1 係
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
或
Figure 02_image089
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點； X2 係
Figure 02_image091
、
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X3 係
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
，其中** 指示與-NH-的連接點； X4 係
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
、
Figure 02_image101
、
Figure 02_image103
、
Figure 02_image105
、
Figure 02_image107
、
Figure 02_image109
、
Figure 02_image111
、
Figure 02_image113
或
Figure 02_image115
，其中* 指示連接點朝向R114 ； R114 係
Figure 02_image273
、
Figure 02_image275
、
Figure 02_image277
、
Figure 02_image279
、
Figure 02_image281
、-NR6 C(=O)CH2 -* 、-NHC(=O)CH2 -* 、-S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-(CH2 )2 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 C(=O)CH2 CH2 -* 、-NH-、-C(=O)-、-NHC(=O)-* 、-CH2 NHCH2 CH2 -* 、-NHCH2 CH2 -* 、  -S-、
Figure 02_image283
、
Figure 02_image285
、
Figure 02_image287
、
Figure 02_image289
、
Figure 02_image291
、
Figure 02_image293
、
Figure 02_image295
、
Figure 02_image297
、
Figure 02_image299
、
Figure 02_image301
、
Figure 02_image303
、
Figure 02_image305
、
Figure 02_image307
、
Figure 02_image309
、
Figure 02_image311
、
Figure 02_image313
、
Figure 02_image315
、
Figure 02_image317
、
Figure 02_image319
、
Figure 02_image321
、或
Figure 02_image323
、
Figure 02_image325
，其中* 指示與A的連接點； 每個R6 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； 每個R10 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl和-OH； 每個R11 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl、-NH2 、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-N(CH3 )2 、-CN、-NO2 和-OH； 每個R12 獨立地選自H、C1-6 烷基、氟、被-C(=O)OH取代的苄氧基、被-C(=O)OH取代的苄基、被-C(=O)OH取代的C1-4 烷氧基和被-C(=O)OH取代的C1-4 烷基； 每個R15 獨立地選自H、-CH3 和苯基； 每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，並且 每個p獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
本發明的軛合物的某些方面及實例係提供在額外的枚舉型實施方式的下列列表中。應認識到，每個實施方式中指定的特徵可以與其他指定特徵組合以提供本發明的另外實施方式。
實施方式69. 具有式 (E) 之結構的軛合物係具有式 (E-1) 之結構的軛合物：
Figure 02_image334
式 (E-1) 其中：R2 、R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (E) 之軛合物所定義的。
實施方式70. 具有式 (F) 之結構的軛合物係具有式 (F-1) 之結構的軛合物：
Figure 02_image336
式 (F-1) 其中：R2 、R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (F) 之軛合物所定義的。
實施方式71. 具有式 (G) 之結構的軛合物係具有式 (G-1) 之結構的軛合物：
Figure 02_image338
式 (G-1) 其中：R2 、R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (G) 之軛合物所定義的。
實施方式72. 具有式 (H) 之結構的軛合物係具有式 (H-1) 之結構的軛合物：
Figure 02_image340
式 (H-1) 其中：R2 、R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (H) 之軛合物所定義的。
實施方式73. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 或如實施方式69至72中任一項所述的軛合物，其中R2 係H或C1 -C6 烷基。
實施方式74. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 或如實施方式69至72中任一項所述的軛合物，其中R2 係H或甲基。
實施方式75. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 或如實施方式69至72中任一項所述的軛合物，其中R2 係H。
實施方式76. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 或如實施方式69至72中任一項所述的軛合物，其中R2 係甲基。
實施方式77. 具有式 (E) 之結構的軛合物係具有式 (E-2) 之結構的軛合物：
Figure 02_image342
式 (E-2) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (E) 之軛合物所定義的。
實施方式78. 具有式 (E) 之結構的軛合物係具有式 (E-3) 之結構的軛合物：
Figure 02_image344
式 (E-3) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (E) 之軛合物所定義的。
實施方式79. 具有式 (E) 或式 (E-1) 之結構的軛合物係具有式 (E-4) 之結構的軛合物：
Figure 02_image346
式 (E-4) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (E) 之軛合物所定義的。
實施方式80. 具有式 (E) 或式 (E-1) 之結構的軛合物係具有式 (E-5) 之結構的軛合物：
Figure 02_image348
式 (E-5) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (E) 之軛合物所定義的。
實施方式81. 具有式 (F) 之結構的軛合物係具有式 (F-2) 之結構的軛合物：
Figure 02_image350
式 (F-2) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (F) 之軛合物所定義的。
實施方式82. 具有式 (F) 之結構的軛合物係具有式 (F-3) 之結構的軛合物：
Figure 02_image352
式 (F-3) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (F) 之軛合物所定義的。
實施方式83. 具有式 (F) 或式 (F-1) 之結構的軛合物係具有式 (F-4) 之結構的軛合物：
Figure 02_image354
式 (F-4) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (F) 之軛合物所定義的。
實施方式84. 具有式 (F) 或式 (F-1) 之結構的軛合物係具有式 (F-5) 之結構的軛合物：
Figure 02_image356
式 (F-5) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (F) 之軛合物所定義的。
實施方式85. 具有式 (G) 之結構的軛合物係具有式 (G-2) 之結構的軛合物：
Figure 02_image358
式 (G-2) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (G) 之軛合物所定義的。
實施方式86. 具有式 (G) 之結構的軛合物係具有式 (G-3) 之結構的軛合物：
Figure 02_image360
式 (G-3) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (G) 之軛合物所定義的。
實施方式87. 具有式 (G) 或式 (G-1) 之結構的軛合物係具有式 (G-4) 之結構的軛合物：
Figure 02_image362
式 (G-4) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (G) 之軛合物所定義的。
實施方式88. 具有式 (G) 或式 (G-1) 之結構的軛合物係具有式 (G-5) 之結構的軛合物：
Figure 02_image364
式 (G-5) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (G) 之軛合物所定義的。
實施方式89. 具有式 (H) 之結構的軛合物係具有式 (H-2) 之結構的軛合物：
Figure 02_image366
式 (H-2) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (H) 之軛合物所定義的。
實施方式90. 具有式 (H) 之結構的軛合物係具有式 (H-3) 之結構的軛合物：
Figure 02_image368
式 (H-3) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (H) 之軛合物所定義的。
實施方式91. 具有式 (H) 或式 (H-1) 之結構的軛合物係具有式 (H-4) 之結構的軛合物：
Figure 02_image370
式 (H-4) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (H) 之軛合物所定義的。
實施方式92. 具有式 (H) 或式 (H-1) 之結構的軛合物係具有式 (H-5) 之結構的軛合物：
Figure 02_image372
式 (H-5) 其中：R114 、A、y和L1 係如以上對於具有式 (H) 之軛合物所定義的。
實施方式93. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至92中任一項所述的軛合物，其中： L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 或-X1 C(=O)(CH2 )m -** ，其中** 指示與R114 的連接點； 並且 X1 係
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
或
Figure 02_image089
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點。
實施方式94. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至92中任一項所述的軛合物，其中： L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** ，其中** 指示與R114 的連接點； 並且 X1 係
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
或
Figure 02_image089
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點。
實施方式95.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至94中任一項所述的軛合物，每個m獨立地選自1、2、3、4、5和6。
實施方式96.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至94中任一項所述的軛合物，每個m獨立地選自1、2、3、4和5。
實施方式97.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至94中任一項所述的軛合物，每個m獨立地選自1、2、3和4。
實施方式98.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至94中任一項所述的軛合物，每個m獨立地選自1、2和3。
實施方式99.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至94中任一項所述的軛合物，每個m獨立地選自1和2。
實施方式100.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
實施方式101.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。
實施方式102.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
實施方式103.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
實施方式104.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7和8。
實施方式105.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6和7。
實施方式106.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3、4、5和6。
實施方式107.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3、4和5。
實施方式108.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2、3和4。
實施方式109.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至99中任一項所述的軛合物，每個n獨立地選自1、2和3。在上述實施方式中的每一項中，每個n獨立地選自1和2。
實施方式110.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
實施方式111.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。
實施方式112.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
實施方式113.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
實施方式114.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3、4、5、6、7和8。
實施方式115.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3、4、5、6和7。
實施方式116.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3、4、5和6。
實施方式117.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3、4和5。
實施方式118.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2、3和4。
實施方式119.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1、2和3。
實施方式120.具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至109中任一項所述的軛合物，每個y獨立地選自1和2。
實施方式121. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至120中任一項所述的軛合物，其中： L1 係
Figure 02_image374
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點。
實施方式121. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至120中任一項所述的軛合物，其中： L1 係
Figure 02_image376
，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點。
實施方式122. 具有式 (E)、式 (F)、式 (G)、式 (H) 之軛合物或如實施方式69至121中任一項所述的軛合物，其中： R114 係
Figure 02_image378
、
Figure 02_image380
、
Figure 02_image382
、
Figure 02_image384
或
Figure 02_image386
，其中* 指示與A的連接點。
實施方式123. 具有式 (E)、式 (E-1)、式 (E-2) 和式 (E-4) 之軛合物，該軛合物選自：
Figure 02_image388
，
Figure 02_image390
並且
Figure 02_image392
，其中y和A係如以上對於具有式 (E) 之軛合物所定義的。
實施方式124. 具有式 (E)、式 (E-1)、式 (E-3) 和式 (E-5) 之軛合物，該軛合物選自：
Figure 02_image394
，
Figure 02_image396
並且
Figure 02_image398
，其中y和A係如以上對於具有式 (E) 之軛合物所定義的。
實施方式125. 具有式 (F)、式 (F-1)、式 (F-2) 和式 (F-4) 之軛合物，該軛合物選自：
Figure 02_image400
，
Figure 02_image402
、以及
Figure 02_image404
， 其中y和A係如以上對於具有式 (F) 之軛合物所定義的。
實施方式126. 具有式 (F)、式 (F-1)、式 (F-3) 和式 (F-5) 之軛合物，該軛合物選自：
Figure 02_image406
，
Figure 02_image408
、以及
Figure 02_image410
， 其中y和A係如以上對於具有式 (F) 之軛合物所定義的。
實施方式127. 具有式 (G)、式 (G-1)、式 (G-2) 和式 (G-4) 之軛合物，該軛合物選自：
Figure 02_image412
，
Figure 02_image414
並且
Figure 02_image416
， 其中y和A係如以上對於具有式 (G) 之軛合物所定義的。
實施方式128. 具有式 (G)、式 (G-1)、式 (G-3) 和式 (G-5) 之軛合物，該軛合物選自：
Figure 02_image418
，
Figure 02_image420
並且
Figure 02_image422
， 其中y和A係如以上對於具有式 (G) 之軛合物所定義的。
實施方式129. 具有式 (H)、式 (H-1)、式 (H-2) 和式 (H-4) 之軛合物，該軛合物選自：
Figure 02_image424
，
Figure 02_image426
、以及
Figure 02_image428
， 其中y和A係如以上對於具有式 (H) 之軛合物所定義的。
實施方式130. 具有式 (H)、式 (H-1)、式 (H-3) 和式 (H-5) 之軛合物，該軛合物選自：
Figure 02_image430
，
Figure 02_image432
、以及
Figure 02_image434
， 其中y和A係如以上對於具有式 (H) 之軛合物所定義的。
本文揭露的具有任一種式(如式 (A)、式 (B)、式 (C)、式 (D)、式 (E)、式 (F)、式 (G) 和式 (H))的化合物可以使用在以下實例中所述的方法產生。以下實例旨在說明本發明，而不應被解釋為對其的限制。溫度以攝氏度給出。如果沒有另外提及，所有蒸發都在減壓下進行，典型地在約15 mm Hg與100 mm Hg(= 20-133 mbar)之間。終產物、中間體和起始物質的結構藉由標準分析方法(例如，微量分析和光譜特徵(例如，MS、IR、NMR))確認。使用的縮寫係本領域常規的縮寫。 縮寫：
Figure 108121072-A0304-0001
用以合成本發明的化合物的所有起始材料、結構單元、試劑、酸、鹼、脫水劑、溶劑及催化劑係可商購獲得的或者可藉由熟悉該項技術者已知的有機合成方法產生或可以藉由如本文描述的有機合成方法產生。中間體的合成 (S)-(3-(2-胺基-3-羥丙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(i-1) 之 合成
Figure 02_image436
(i-1) 步驟 1 ：在0o C下在攪拌下將在THF中的BH3 (1 M，10 ml)添加至在THF(10 ml)中的(S)-2-((三級丁氧基羰基)胺基)-3-(3-硝基苯基)丙酸(562 mg，1.81 mmol)中。然後將反應物在50o C下攪拌1 h。將反應混合物在0o C下冷卻，用水淬滅，用EtOAc稀釋並且用10% K2 CO3 水溶液洗滌，經MgSO4乾燥，過濾並濃縮。將粗製物藉由矽膠柱(30%-70% EtOAc-己烷)純化，獲得作為白色固體的(S)-(1-羥基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)胺基甲酸三級丁酯。MS m/z 319.1 (M+Na)。停留時間1.183分鐘。1H NMR (600 MHz, 氯仿-d) δ 8.13 - 8.04 (m, 2H), 7.57 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 8.9, 7.6 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 3.87 (dq, J = 8.0, 4.6, 4.1 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 10.9, 3.9 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 10.8, 4.7 Hz, 1H), 2.97 (td, J = 13.1, 12.5, 7.3 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H)。步驟 2 ：向在乙腈(5 ml)中的(S)-(1-羥基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)胺基甲酸三級丁酯(0.31 g，1.0 mmol)中添加10%鹽酸(5 ml)。將反應混合物在rt下攪拌48 h並且然後濃縮，得到作為HCl鹽的(S)-2-胺基-3-(3-硝基苯基)丙-1-醇。MS m/z 197.2 (M+H)。保留時間0.775 min。步驟 3 ：將(S)-2-胺基-3-(3-硝基苯基)丙-1-醇 HCl鹽(0.243 g，1.046 mmol)溶解於MeOH(10 ml)中並且添加10%鈀碳(50 mg，0.047 mmol)。附接2 L氫氣球。將反應物用H2 吹掃三次並且然後在rt下攪拌1 h。LCMS指示反應完成。將反應物藉由矽藻土墊過濾並且濃縮，得到作為HCl鹽的(S)-2-胺基-3-(3-胺基苯基)丙-1-醇。MS m/z 167.2 (M+H)。保留時間0.373 min。步驟 4 ：將(S)-2-胺基-3-(3-胺基苯基)丙-1-醇 HCl 鹽(0.212 g，1.046 mmol)和Boc2 O(228 mg，1.05 mmol)和二㗁𠮿-水-AcOH(10 : 9 : 1，20 ml)合併並且在rt下攪拌3天。LCMS指示反應完成75%。添加另外的Boc2 O(150 mg)並且將反應再攪拌6 h。然後將反應混合物濃縮並且用製備型HPLC(具有0.05% TFA的10%-40%乙腈水溶液)純化，得到作為油狀物的(S)-(3-(2-胺基-3-羥丙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(i-1) 。 MS m/z 267.2 (M+H)。保留時間1.011 min。 (3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-2) 之 合成
Figure 02_image438
(i-2) 步驟 1 ：將Dil-OtBu HCl鹽(
Figure 02_image440
：388 mg，0.982 mmol)、(1R,3S,4S)-2-(三級丁氧基羰基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲酸(
Figure 02_image442
，287 mg，1.19 mmol)、HATU(411 mg，1.08 mmol)和DIEA(0.42 ml，2.38 mmol)和DMF(5 ml)合併並且在rt下攪拌30 min。將反應混合物用水(10 ml)稀釋並且藉由RP-C18 ISCO純化，得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-(三級丁氧基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲醯基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸三級丁酯
Figure 02_image444
。MS (m+1) = 582.5，HPLC峰值RT = 1.542 min步驟 2 ：將步驟1中獲得的產物(540 mg，0.93 mmol)在4 M HCl的1.4-二㗁𠮿溶液(10 ml)中在rt下攪拌過夜。將反應混合物濃縮，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)-N,3-二甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸，
Figure 02_image446
。MS (m+1) = 426.2，HPLC峰值RT = 0.736 min步驟 3 ：將步驟2中獲得的產物(430 mg，0.93 mmol)、37%甲醛溶液(0.38 ml，4.7 mmol)、乙酸(0.27 ml，4.65 mmol)、NaBH3CN(585 mg，9.31 mmol)和MeOH(10 ml)合併並且在rt下攪拌30 min並且然後濃縮。將殘餘物藉由RP-C18 ISCO純化，得到450 mg作為TFA鹽的(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-2) 。將TFA鹽用10 ml 12 N HCl溶液處理並且濃縮兩次，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸 HCl鹽。MS (m+1) = 440.2，HPLC峰值RT = 0.754 min。 Dap-OMe的合成：((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯啶-2-基)丙酸甲酯)(i-3)
Figure 02_image448
(i-3) 步驟 1 ：將Boc-Dap-OH(
Figure 02_image450
，3.11 g，10.8 mmol)、K2 CO3 (2.99 g，21.6 mmol)、碘甲烷(2.95 g)和丙酮(55 mL)合併。將反應物在20o C下攪拌2 h。將另外的甲基碘(2.28 g)添加至反應物中並且將反應物在40o C下攪拌3 h。將反應混合物濃縮。將殘餘物在200 mL EtOAc與100 mL H2O之間分配。將有機層分離，用50 mL飽和的NaCl水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾並濃縮，提供作為黃色油狀物的Boc-Dap-OMe，
Figure 02_image452
。MS (ESI+) m/z 計算值 324.2，實測值324.2 (M+23)。保留時間1.245 min。步驟 2 ：將Boc-Dap-OMe(3.107 g，10.3 mmol)與HCl的乙醚溶液(2 M，10 mL)合併並且濃縮。重複該操作。在第7次處理後反應完成。在濃縮之後獲得作為白色固體的Dap-OMe (i-3 ) 之HCl鹽。MS (ESI+) m/z 計算值 202.1，實測值202.2 (M+1)。保留時間0.486 min。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 4.065-4.041 (m, 1H), 3.732 (br.s, 1H), 3.706 (s, 3H), 3.615 (s, 3H), 3.368 (br.s, 1H), 3.314 (br.s, 1H), 2.795 (q, 1H, J=6.8Hz), 2.085-1.900 (m, 4H), 1.287 (d, 3H, J=7.2Hz)。 (S)-(3-(2-胺基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(i-4) 之 合成
Figure 02_image454
(i-4) 步驟 1 ：在RT下向2-(3-硝基苯基)乙酸(3 g，16.56 mmol)在DMF(無水，17 ml)的溶液中添加HATU(6.93 g，18.22 mmol)、N,O-二甲基羥基胺鹽酸鹽(1.615 g，16.56 mmol)和DIPEA(14.46 ml，83 mmol)。將反應混合物在RT下攪拌過夜。將反應混合物高真空濃縮以去除大部分溶劑。然後將殘餘物在DCM與水之間萃取。將水相用DCM萃取2次。將合併的DCM相真空濃縮。將殘餘物藉由矽膠快速柱(EtOAc/庚烷0%-70%，然後70%)分離，獲得3.5 g作為白色固體的N-甲氧基-N-甲基-2-(3-硝基苯基)乙醯胺。MS m/z 225.1 (M+1)。保留時間1.09 min。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 8.28 - 8.09 (m, 2H), 7.67 (m, 1H), 7.63 - 7.46 (m, 1H), 3.90 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.24 (s, 3H)。步驟 2 ：在N2 氣氛下在-78o C(丙酮-乾冰浴)下向TMEDA(2.63 mL，17.39 mmol)在THF(無水，30 ml)中的溶液中逐滴添加正丁基鋰(2.5 M，在己烷中)(1.028 g，16.06 mmol)。然後還在-78o C下將2-溴噻唑(2.63 g，16.06 mmol)逐滴添加至反應混合物中。將反應混合物在-78o C下攪拌1 h。在-78o C下將N-甲氧基-N-甲基-2-(3-硝基苯基)乙醯胺(3 g，13.38 mmol)在THF(30 ml)中的混合物逐滴添加至反應混合物中。將反應混合物在-78o C下攪拌1 h，然後在-10o C(丙酮-冰浴)下攪拌2 h。將反應混合物藉由添加飽和KHSO4 水溶液淬滅，然後用EtOAc萃取3次。將合併的EtOAc相經飽和NaCl、NaSO4 乾燥，並且濃縮。將殘餘物藉由矽膠快速柱(EtOAc/庚烷0%-30%，然後30%)分離，獲得1.95 g作為淺黃色油狀物的2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-酮。MS m/z 249.0 (M+1)。保留時間1.34 min。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 8.33 - 8.22 (m, 1H), 8.17 (ddd,J = 8.1, 2.3, 1.0 Hz, 1H), 8.10 (d,J = 3.0 Hz, 1H), 7.79 - 7.67 (m, 2H), 7.54 (t,J = 7.9 Hz, 1H), 4.62 (s, 2H)。步驟 3 ：在N2 氣氛下在0o C(冰水浴)下向(+)-DIP-氯化物TM (9.22 g，28.8 mmol)在乙醚(7 ml)中的溶液中逐滴添加2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-酮(2.38 g，9.59 mmol)在乙醚(37 ml)中的溶液。將反應混合物在0o C下攪拌24 h。然後在水-冰浴中將混合物用在10o C下的10% NaOH和30% H2 O2 的30 ml(1 : 1)混合物中和。將混合物在RT下攪拌1 h。然後將混合物用水稀釋，用EtOAc萃取3次。將合併的EtOAc相用飽和K2 CO3 、飽和NaCl洗滌，並且經NaSO4 乾燥，並且濃縮。將殘餘物藉由矽膠快速柱(EtOAc/庚烷0%-60%，然後60%)分離，獲得1.639 g作為淺黃色固體的(R)-2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇。MS m/z 251.1 (M+1)。保留時間1.09 min。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 8.33 - 8.07 (m, 2H), 8.07 - 7.80 (m, 1H), 7.74 - 7.55 (m, 1H), 7.55 - 7.36 (m, 2H), 5.55 (dd,J = 7.9, 4.1 Hz, 1H), 4.48 (s, 1H), 3.53 (dd,J = 13.9, 4.0 Hz, 1H), 3.32 (dd,J = 13.9, 8.1 Hz, 1H)。92% e.e.，藉由手性SFC確定的。步驟 4 ：向(R)-2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇(1.636 g，6.54 mmol)在MeOH(20 ml)中的溶液中添加Pd/C(10%，0.696 g，0.654 mmol)。在三次真空/H2 循環後，向反應混合物中通入H2 (1 atm)，並且將反應混合物在RT下攪拌。在過夜攪拌後，將反應混合物通過矽藻土過濾並且用MeOH洗滌。將濾液真空濃縮，獲得1.3 g作為固體的(R)-2-(3-胺基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇，將該固體不經進一步純化而直接用於下一個步驟。MS m/z 221.1 (M+1)。保留時間0.50 min。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.72 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 7.59 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 6.88 (t,J = 7.7 Hz, 1H), 6.46 (t,J = 1.9 Hz, 1H), 6.42 - 6.29 (m, 2H), 6.14 (d,J = 5.7 Hz, 1H), 5.03 - 4.78 (m, 3H), 3.03 (dd,J = 13.7, 4.0 Hz, 1H), 2.72 (dd,J = 13.7, 8.7 Hz, 1H)。步驟 5 ：向(R)-2-(3-胺基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇(1.3 g，5.92 mmol)在二㗁𠮿/水(1/1，16 ml/16 ml)中的混合物中添加Boc2 O(1.512 ml，6.51 mmol)和NaOH(0.284 g，7.10 mmol)。將反應混合物在RT下攪拌過夜。向反應混合物中添加10 ml 水，然後用EtOAc(3×40 ml)萃取。將有機相合併，經Na2 SO4 乾燥，然後真空濃縮。然後將殘餘物藉由矽膠快速柱(EtOAc/庚烷0%至80%，然後80%)分離，獲得1.24 g作為固體的(R)-(3-(2-羥基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯。MS m/z 321.3 (M+1)。保留時間1.26 min。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.24 (s, 1H), 7.73 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 7.60 (d,J = 3.3 Hz, 1H), 7.39 (t,J = 1.8 Hz, 1H), 7.25 (ddd,J = 8.2, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.11 (t,J = 7.8 Hz, 1H), 6.80 (dt,J = 7.7, 1.2 Hz, 1H), 6.20 (d,J = 5.7 Hz, 1H), 4.97 (ddd,J = 8.6, 5.7, 4.0 Hz, 1H), 3.13 (dd,J = 13.7, 4.0 Hz, 1H), 2.83 (dd,J = 13.7, 8.7 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H)。步驟 6 ：在N2 氣氛下向(R)-(3-(2-羥基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(1.2 g，3.75 mmol)在THF(無水，25 ml)中的冰-水浴冷卻的溶液中添加PPh3 (1.670 g，6.37 mmol)。然後在0o C下逐滴添加DEAD(40% wt，在甲苯中)(2.90 ml，6.37 mmol)，之後逐滴添加DPPA(1.372 ml，6.37 mmol)。然後移除冷浴。將反應混合物在RT下攪拌過夜。將反應混合物真空濃縮，並且然後進行快速矽膠柱分離(EtOAc/庚烷 0%至30%，然後30%)，獲得1.03 g作為油狀物的(S)-(3-(2-疊氮基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯。MS m/z 346.3 (M+1)。保留時間1.55 min。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.29 (s, 1H), 7.86 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 7.76 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 7.41 (t,J = 1.9 Hz, 1H), 7.29 (ddd,J = 8.3, 2.2, 1.1 Hz, 1H), 7.16 (t,J = 7.8 Hz, 1H), 6.86 (dt,J = 7.9, 1.2 Hz, 1H), 5.31 (dd,J = 8.7, 5.7 Hz, 1H), 3.17 (d,J = 5.3 Hz, 1H), 3.09 (dd,J = 13.9, 8.7 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H)。步驟 7 ：向(S)-(3-(2-疊氮基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(861 mg，2.493 mmol)在MeOH(4 ml)中的溶液中添加Pd/C(10%濕的，265 mg，0.249 mmol)。在三次真空/H2 循環後，向反應混合物中通入H2 (1 atm)，並且將反應混合物在RT下攪拌。在過夜攪拌後，將反應混合物濃縮並且然後通過矽藻土過濾並且用MeOH洗滌。將濾液真空濃縮，獲得781 mg作為黏性油狀物的(S)-(3-(2-胺基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(i-4) 。MS m/z 320.2 (M+1)。保留時間0.91 min。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 9.26 (s, 1H), 7.71 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 7.26 (dt, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.78 (dt, J = 7.6, 1.3 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 8.7, 4.7 Hz, 1H), 3.14 (dd, J = 21.2, 5.0 Hz, 1H), 2.73 (dd, J = 13.4, 8.7 Hz, 1H), 2.11 (s, 2H), 1.47 (s, 9H)。示例性藥物部分的合成 實例A：(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-胺基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(C1) 之 合成
Figure 02_image456
(C1) 步驟 1 ：向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(250 mg，0.346 mmol)在DMF(4 ml)中的溶液中添加(S)-(3-(2-胺基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(i-4) (110 mg，0.346 mmol)、HATU(158 mg，0.415 mmol)和DIPEA(362 µl，2.075 mmol)。將反應混合物在RT下攪拌過夜。將反應混合物真空濃縮。然後將殘餘物溶解於MeOH中，並且藉由ISCO gold C-18 100克反相柱(MeCN/H2 O 0%-100%)分離，獲得173 mg作為白色粉末的(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯。MS m/z 911.0 (M+1)。保留時間1.15 min。步驟 2 ：將(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(173 mg，0.190 mmol)溶解於1 ml二㗁𠮿中，然後將10 ml 4 N HCl的二㗁𠮿溶液添加至混合物中。將反應混合物在室溫下攪拌30 min。將反應混合物高真空濃縮，並且然後在飽和NaHCO3 與DCM之間分配以使水相pH為8。將鹼性水相用DCM萃取3次。將合併的DCM相經飽和NaCl和Na2 SO4 乾燥，並且然後高真空濃縮，獲得155 mg作為固體的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-胺基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺。MS m/z 810.5 (M+1)。保留時間0.90 min。 實例B：(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-胺基苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(C2) 之 合成
Figure 02_image458
(C2) 步驟 1 ：將DIEA(0.105 ml，0.60 mmol)和HATU(45.5 mg，0.12 mmol)添加至在DMF(2 ml)中的(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸( i-2) (57 mg，0.12 mmol)中。將反應混合物在rt下攪拌5 min並且然後添加在DMF(1 ml)中的DapOMe(i-3) (28.5 mg，0.12 mmol)。將反應混合物在rt下攪拌1 h並且然後藉由製備型HPLC(含有0.05% TFA的10%-50%乙腈-H2 O)純化，獲得(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯。MS m/z 623.5 (M+H)。保留時間1.225 min。步驟 2 ：將LiOH(30 mg，1.25 mmol)添加至在MeOH-H2 O(1 : 1，4 ml)中的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(43.2 mg，0.059 mmol)中。將反應混合物在rt下攪拌18 h，濃縮並且用HCl(1 N，1 ml)酸化。將粗製物藉由製備型HPLC(含有0.05% TFA的10%-38%乙腈-H2 O)純化，獲得作為TFA鹽的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸。MS m/z 609.5 (M+H)。保留時間0.962 min。步驟 3 ：向在DMF(1 ml)中的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(45.7 mg，0.063 mmol)中添加DIEA(0.055 ml，0.32 mmol)和HATU(24.0 mg，0.063 mmol)。將反應混合物在rt下攪拌10 min並且然後添加至在DMF(1 ml)中的(S)-(3-(2-胺基-3-羥丙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯TFA鹽(i-1) (24.1 mg，0.063 mmol)中。將反應混合物在rt下攪拌1 h並且然後濃縮。將粗製物藉由製備型HPLC(含有0.05% TFA的20%-70%乙腈-H2 O)純化，獲得作為TFA鹽的(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-羥丙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯。MS m/z 857.5 (M+H)。保留時間1.145 min。步驟 4 ： 將(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-羥丙基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(61.4 mg，0.063 mmol)在具有5% HCl的乙腈-水(1 : 1，4 ml)中的溶液在rt下攪拌24 h。然後將反應混合物濃縮並且藉由製備型HPLC(含有0.05% TFA的10%-30%乙腈-H2 O)純化，得到作為TFA鹽的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-胺基苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(C2) 。MS m/z 757.5 (M+H)。保留時間0.744 min。示例性接頭 - 藥物化合物的合成 實例C：(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(LP1) 之 合成
Figure 02_image460
(LP1) 步驟 1 ：向(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-胺基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(C1) (154 mg，0.190 mmol)和Boc-Val-Cit-OH(
Figure 02_image462
，92 mg，0.247 mmol)在DCM(5 ml)/MeOH(0.1 ml)中的混合物中添加EEDQ(94 mg，0.380 mmol)。將反應混合物在RT下攪拌過夜。將反應混合物真空濃縮。然後將殘餘物溶解於MeOH中，並且藉由ISCO gold C-18 50克反相柱(含有0.05% TFA的MeCN/H2 O，0%-100%)分離，獲得232 mg作為TFA鹽的((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸三級丁酯。MS m/z 1167.3 (M+1)。保留時間1.10 min。步驟 2 ： 在0o C下在冰-水浴的情況下將((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸三級丁酯(232 mg，0.181 mmol)添加至TFA/DCM(25%，6 ml)的冷溶液中，然後將混合物在0o C下攪拌15 min，然後溫熱至RT。將混合物在RT下攪拌30 min。將反應混合物真空濃縮。然後將殘餘物溶解於DMSO中並且藉由ISCO gold C-18 50克反相柱(含有0.05% TFA的MeCN/H2 O，0%-100%)分離，獲得219 mg作為TFA鹽的((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺。MS m/z 1067.2 (M+1)。保留時間0.88 min。步驟 3 ：將((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(219 mg 0.18 mmol)溶解於DMF(2 ml)中，然後添加MAL-PEG1-NHS酯(
Figure 02_image464
，73.1 mg，0.236 mmol)和DIPEA(190 µl，1.087 mmol)。將反應混合物在RT下攪拌1 h。將反應混合物真空濃縮。然後將殘餘物溶解於DMSO中並且藉由ISCO gold C-18 50克反相柱(含有0.05% TFA的MeCN/H2 O，0%-100%)分離，獲得174 mg作為TFA鹽的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(LP1) 。MS m/z 1262.4 (M+1)。保留時間1.02 min。 實例D：(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(LP2) 之 合成
Figure 02_image466
(LP2) 步驟 1 ：向Fmoc-Cit-OH(
Figure 02_image468
, 10.0 mg，0.025 mmol)在DMF(1 ml)中的溶液中添加DIEA(13.0 mg，0.10 mmol)並且然後添加HATU(9.6 mg，0.025 mmol)，並且將反應混合物在rt下攪拌5 min並且然後將溶液添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-胺基苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(C2) (20 mg，0.025 mmol)中。將該反應混合物在rt下攪拌1小時並且然後使用C18柱藉由反相HPLC純化，用含有0.05% TFA的10%-45%乙腈-H2 O洗脫。將含有所期望產物的級分濃縮，獲得作為TFA鹽的((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-羥丙基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯。LCMS MS m/z 1136.6 (M+1)，保留時間1.042分鐘。步驟 2 ：將((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-羥丙基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(31.5 mg，0.025 mmol)TFA鹽溶解於MeOH(1 mL)中。然後添加Pd/C(10 mg，9.40 µmol)。附接2 L氫氣球並且將反應混合物用H2 真空吹掃三次並且然後在rt下在H2 下攪拌30 min。然後將催化劑通過矽藻土過濾去除並且將混合物濃縮並用1 N NaOH處理。將粗製混合物使用C18柱藉由反相HPLC純化，用含有0.05% TFA的5%-37%乙腈-H2 O洗脫。將含有所期望產物的級分凍乾，獲得作為TFA鹽的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-胺基-5-脲基戊醯胺基)苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺。LCMS m/z 914.6 (M+1)，保留時間0.773 min。步驟 3 ：向Cbz-Val-OH(
Figure 02_image470
，2.6 mg，0.011 mmol)在DMF(1 ml)中的溶液中添加DIEA(0.011 ml，0.061 mmol)並且然後添加HATU(3.86 mg，0.011 mmol)。將反應混合物在rt下攪拌5 min並且然後添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-胺基-5-脲基戊醯胺基)苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(11.6 mg，0.011 mmol)TFA鹽在DMF(1 ml)中的溶液中。將反應混合物在rt下攪拌1小時並且然後將粗製物使用C18柱藉由反相HPLC純化，用含有0.05% TFA的10%-50%乙腈-H2 O洗脫。將含有所期望產物的級分凍乾，獲得作為TFA鹽的((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-羥丙基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸苄酯。LCMS m/z 1147.6 (M+1)，保留時間0.986 min。步驟 4 ：將((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-羥丙基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸苄酯(7.7 mg，0.006 mmol)TFA鹽溶解於MeOH(2 ml)中並且然後添加Pd/C(5 mg，4.70 µmol)。附接2 L氫氣球並且將反應混合物用H2 真空吹掃三次並且然後在H2 下攪拌30 min。LCMS指示反應完成。然後將催化劑通過矽藻土過濾去除並且然後將混合物濃縮，得到作為TFA鹽的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺。LCMS m/z 1013.6 (M+1) 停留時間0.774 min。步驟 5 ： 向Mal-PEG1-酸(
Figure 02_image472
，1.0 mg，0.005 mmol)在DMF(0.5 ml)中的溶液中添加DIEA(2.8 mg，0.022 mmol)並且然後添加HATU(1.8 mg，0.005 mmol)。將反應物在rt下攪拌5 min並且然後添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺(4.8 mg，0.005 mmol)TFA鹽在DMF(1 ml)中的溶液中。將反應物在rt下攪拌1小時並且然後將粗製物使用C18柱藉由反相HPLC純化，用含有0.05% TFA的10%-38%乙腈-H2 O洗脫。將含有所期望產物的級分凍乾，獲得作為TFA鹽的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)-3-羥基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-2-甲基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-甲醯胺 (LP-2)。LCMS m/z 1208.5 (M+1) 停留時間0.882 min。 3. ADC 的軛合和製備 用於製備具有式 (I) 之抗體軛合物的方法
用於形成具有式 (I) 之軛合物的一般反應方案示出在以下方案1中： 方案1
Figure 02_image474
其中：RG1 係反應性基團(僅舉例來說，硫醇或胺或酮)，該反應性基團與連接至接頭-藥物部分的相容性反應性基團RG2 反應，從而將抗體片段A與一個或多個接頭-藥物部分共價連接。RG1 和RG2 基團的此類反應的非限制性實例係馬來醯亞胺(RG2 )與硫醇(RG1 )反應得到琥珀醯亞胺環，或羥胺(RG2 )與酮(RG1 )反應得到肟。
用於形成具有式 (II) 之軛合物的一般反應方案示出在以下方案2中： 方案2
Figure 02_image476
其中：A1 、A2 、LB 、D和n如本文所定義的，1,3-二鹵代丙酮選自1,3-二氯丙酮、1,3-二溴丙酮和1,3-二碘丙酮，並且還原步驟使用選自二硫蘇糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP-HCl)的還原劑完成。 ADC 的軛合和製備 用於製備具有式 (I) 之抗體軛合物的方法
用於形成具有式 (I) 之軛合物的一般反應方案示出在以下方案1中： 方案1
Figure 02_image478
其中：RG1 係反應性基團(僅舉例來說，硫醇或胺或酮)，該反應性基團與連接至接頭-藥物部分的相容性反應性基團RG2 反應，從而將抗體片段A與一個或多個接頭-藥物部分共價連接。RG1 和RG2 基團的此類反應的非限制性實例係馬來醯亞胺(RG2 )與硫醇(RG1 )反應得到琥珀醯亞胺環，或羥胺(RG2 )與酮(RG1 )反應得到肟。
用於形成具有式 (II) 之軛合物的一般反應方案示出在以下方案2中： 方案2
Figure 02_image480
其中：A1 、A2 、LB 、D和n如本文所定義的，1,3-二鹵代丙酮選自1,3-二氯丙酮、1,3-二溴丙酮和1,3-二碘丙酮，並且還原步驟使用選自二硫蘇糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP-HCl)的還原劑完成。
用於形成具有式 (E) 之軛合物的一般反應方案示出在以下方案3中： 方案3
Figure 02_image482
其中：R5 係-L1 R14 、-L1 R24 、-L1 R34 或-L1 R44 並且RG1 係反應性基團(僅舉例來說，硫醇或胺或酮)，該反應性基團與具有式 (C-1) 之化合物的相容性R14 、R24 、R34 或R44 基團反應形成相應的R114 基團。舉例來說，馬來醯亞胺與硫醇反應得到琥珀醯亞胺環，或者羥胺與酮反應得到肟。A、y、L1 、R2 、R5 和R114 如本文所定義的。
用於形成具有式 (F) 之軛合物的一般反應方案示出在以下方案4中： 方案4
Figure 02_image484
其中：R5 係-L1 R14 、-L1 R24 、-L1 R34 或-L1 R44 並且RG1 係反應性基團(僅舉例來說，硫醇或胺或酮)，該反應性基團與具有式 (C-2) 之化合物的相容性R14 、R24 、R34 或R44 基團反應形成相應的R114 基團。舉例來說，馬來醯亞胺與硫醇反應得到琥珀醯亞胺環，或者羥胺與酮反應得到肟。A、y、L1 、R2 、R5 和R114 如本文所定義的。
用於形成具有式 (G) 之軛合物的一般反應方案示出在以下方案5中： 方案5
Figure 02_image486
其中：R5 係-L1 R14 、-L1 R24 、-L1 R34 或-L1 R44 並且RG1 係反應性基團，例如僅是硫醇或胺或酮，該反應性基團與具有式 (D-1) 之化合物的相容性R14 、R24 、R34 或R44 基團反應形成相應的R114 基團。舉例來說，馬來醯亞胺與硫醇反應得到琥珀醯亞胺環，或者羥胺與酮反應得到肟。A、y、L1 、R2 、R5 和R114 如本文所定義的。
用於形成具有式 (H) 之軛合物的一般反應方案示出在以下方案6中： 方案6
Figure 02_image488
其中：R5 係-L1 R14 、-L1 R24 、-L1 R34 或-L1 R44 並且RG1 係反應性基團，例如僅是硫醇或胺或酮，該反應性基團與具有式 (D-2) 之化合物的相容性R14 、R24 、R34 或R44 基團反應形成相應的R114 基團。舉例來說，馬來醯亞胺與硫醇反應得到琥珀醯亞胺環，或者羥胺與酮反應得到肟。A、y、L1 、R2 、R5 和R114 如本文所定義的。 4. 對所期望抗 cKIT ADC 的表徵和選擇 ADC 的 DAR 和聚集性的確定
藉由液相層析-質譜法(LC-MS)評價cKIT ADC的DAR值。從針對還原和去糖基化(適當時，即當包含Fc時)樣品的LC-MS數據外推化合物對抗體比率。LC-MS允許定量軛合物樣品中連接至抗體的接頭-有效負載(化合物)的平均分子數。
使用分析方法評價本發明的抗體藥物軛合物。這種分析方法和結果可以證明軛合物具有有利的特性，例如使它們更容易製造、更容易給予至患者、對患者更有效和/或潛在更安全的特性。一個實例係藉由尺寸排阻層析法(SEC)測定分子大小，其中樣品中所期望抗體種類的量相對於樣品中存在的高分子量污染物(例如，二聚體、多聚體或聚集抗體)或低分子量污染物(例如，抗體片段、降解產物或單獨抗體鏈)的量來確定。通常，期望具有更高量的單體和更低量的例如聚集的抗體，這係由於例如聚集體對抗體樣品的其他特性的影響，該等其他特性如但不限於清除率、免疫原性和毒性。另一個實例係藉由疏水相互作用層析法(HIC)測定疏水性，其中相對於一組已知特性的標準抗體評估樣品的疏水性。通常，期望具有低疏水性，這係由於疏水性對抗體樣品的其他特性的影響，該等其他特性如但不限於聚集性、隨時間的聚集性、對表面的黏附性、肝毒性、清除率和藥物動力學暴露。參見Damle, N.K., Nat Biotechnol. [自然生物技術] 2008；26(8):884-885；Singh, S.K., Pharm Res. [藥物研究] 2015；32(11):3541-71。 對抗 cKIT ADC 的選擇
為了選擇適用於本文所述方法中的抗cKIT ADC，可以使用體外人造血幹細胞殺傷試驗來篩選抗cKIT ADC的功效和效力。例如，實例5中描述的方法可用於篩選抗cKIT ADC。可基於EC50，例如抗cKIT ADC具有小於500 μg/ml，例如小於100 μg/ml、小於50 μg/ml、小於10 μg/ml、或小於5 μg/ml的EC50，來選擇合適的抗cKIT ADC。
此外，據報導cKIT在肥大細胞上表現，而cKIT的配位基幹細胞因子(SCF)在體外和體內誘導大鼠腹膜肥大細胞的直接去顆粒(Taylor等人，Immunology [免疫學]. 1995年11月;86(3):427-33)。SCF還在體內誘導人肥大細胞去顆粒(Costa等人，J Exp Med. [實驗醫學雜誌] 1996；183(6): 2681-6)。為了避免移植受者中肥大細胞去顆粒引起的潛在有害影響，可以測試所選擇的cKIT ADC在體外誘導肥大細胞去顆粒的能力。例如，實例6中描述的實驗可用於篩選cKIT ADC，並且可基於極小肥大細胞去顆粒，例如，在β-己糖胺酶釋放測定中基線校正的O.D.讀出小於0.25，例如小於0.2、小於0.15或小於0.1，來選擇合適的抗cKIT ADC。cKIT 抗體和抗體片段
本揭露提供了特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)。本揭露的抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)包括但不限於下文所述的人單株抗體或其片段。
在一些實施方式中，本揭露的抗cKIT抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也具有與全長抗cKIT抗體相比降低的引起肥大細胞去顆粒的能力。在一些實施方式中，本文揭露的抗cKIT抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)被修飾以甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也具有降低的誘導肥大細胞去顆粒的能力。例如，本文揭露的抗cKIT抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)被修飾以甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也具有降低的誘導肥大細胞去顆粒的能力，與全長抗cKIT抗體或其F(ab')2 或F(ab)2 片段相比，該能力降低、降低約或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。在一些實施方式中，本文揭露的抗cKIT抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)可以包含抗cKIT Fab或Fab'片段。在一些實施方式中，本文揭露的抗cKIT抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)甚至當交聯和/或多聚化成較大的複合物時也可以具有誘導肥大細胞去顆粒的極小能力，例如在β-己糖胺酶釋放測定中，基線校正的O.D.讀出小於0.25，例如小於0.2、小於0.15、或小於0.1。
本文提供的抗體藥物軛合物包含結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')。在一些實施方式中，本文提供的抗體藥物軛合物包含特異性結合人cKIT的人或人源化抗體片段(例如Fab或Fab')。在一些實施方式中，本文提供的抗體藥物軛合物包含特異性結合人cKIT的人或人源化Fab'。在一些實施方式中，本文提供的抗體藥物軛合物包含特異性結合人cKIT的人或人源化Fab。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含具有表1中所述的任何VH結構域的胺基酸序列(例如SEQ ID NO: 10、36、54、69、95)的VH結構域。其他合適的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')可以包含與表1中所述的任何VH結構域具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的VH結構域。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含具有表1中列出的任一個VH CDR(或HCDR)的胺基酸序列的VH CDR(或HCDR)。在特定方面，本揭露提供了抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')，該抗體或抗體片段包含以下(或另選地，由以下組成)：一個、兩個、三個、四個、五個或更多個具有表1中列出的任一個VH CDR(或HCDR)的胺基酸序列的VH CDR(或HCDR)。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含具有表1中所述的任何VL結構域的胺基酸序列(例如SEQ ID NO: 23、47、82、108)的VL結構域。其他合適的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')可以包含與表1中所述的任何VL結構域具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的VL結構域。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含具有表1中列出的任一個VL CDR(或LCDR)的胺基酸序列的VL CDR(或LCDR)。在特定方面，本揭露提供了抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')，該抗體或抗體片段包含以下(或另選地，由以下組成)：一個、兩個、三個、四個、五個或更多個具有表1中列出的任一個VL CDR(或LCDR)的胺基酸序列的VL CDR(或LCDR)。
本文揭露的其他抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含如下胺基酸，該等胺基酸已經突變，但在CDR區中與表1中所述的序列中繪示的CDR區具有至少60%、70%、80%、90%或95%序列同一性。在一些方面，它包括突變胺基酸序列，其中當與表1所述序列中繪示的CDR區相比時，CDR區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已經突變。
本揭露還提供了編碼特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的VH、VL、重鏈和輕鏈的核酸序列。此類核酸序列可以針對哺乳動物細胞中的表現進行優化。[ 表 1]. 示例性抗 cKIT 抗體和抗體片段的序列
本文揭露的其他抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包括如下那些抗體或抗體片段，其中胺基酸或編碼胺基酸的核酸已經突變，但與表1中所述的序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%同一性。在一些方面，它包括突變胺基酸序列，其中當與表1所述序列中繪示的可變區相比時，可變區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已經突變，同時保留基本上相同的治療活性。
因為該等抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')中的每一種均可以結合cKIT，所以VH、VL、重鏈和輕鏈序列(胺基酸序列和編碼胺基酸序列的核苷酸序列)可以「混合且匹配」以產生其他結合cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。可以使用本領域已知的結合測定(例如，ELISA和實例部分中描述的其他測定)來測試這種「混合且匹配的」結合cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。當該等鏈被混合且匹配時，來自特定VH/VL配對的VH序列應當用結構上相似的VH序列替代。同樣，來自特定重鏈/輕鏈配對的重鏈序列應當替換為結構上相似的重鏈序列。同樣，來自特定VH/VL配對的VL序列應當用結構上相似的VL序列替代。同樣，來自特定重鏈/輕鏈配對的輕鏈序列應當替換為結構上相似的輕鏈序列。
因此，在一個方面，本揭露提供了一種分離的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')，該分離的抗體或抗體片段具有：重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 10、36、54、69和95(表1)組成的組的胺基酸序列；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 23、47、82和108(表1)組成的組的胺基酸序列；其中抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')特異性結合人cKIT。
在另一個方面，本揭露提供了一種分離的抗體，該分離的抗體具有：重鏈，該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 12、38、56、71和97組成的組的胺基酸序列；和輕鏈，該輕鏈包含選自由SEQ ID NO: 25、49、84和110組成的組的胺基酸序列。
在另一個方面，本揭露提供了一種分離的抗體片段(例如Fab')，該分離的抗體片段具有：重鏈，該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 14、40、58、73和99組成的組的胺基酸序列；和輕鏈，該輕鏈包含選自由SEQ ID NO: 25、49、84和110組成的組的胺基酸序列。
在另一個方面，本揭露提供了結合cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')，該抗體或抗體片段包含如表1中所述的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3、或其組合。抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的VH CDR1(或HCDR1)的胺基酸序列在SEQ ID NO: 1、4、6、7、27、30、32、33、60、63、65、66、86、89、91和92中示出。抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的VH CDR2(或HCDR2)的胺基酸序列在SEQ ID NO: 2、5、8、28、31、34、51、52、53、61、64、67、87、90和93中示出。抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的VH CDR3(或HCDR3)的胺基酸序列在SEQ ID NO: 3、9、29、35、62、68、88和94中示出。抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的VL CDR1(或LCDR1)的胺基酸序列在SEQ ID NO: 16、19、22、42、44、46、75、78、81、101、104和107中示出。抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的VL CDR2(或LCDR2)的胺基酸序列在SEQ ID NO: 17、20、76、79、102和105中示出。抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的VL CDR3(或LCDR3)的胺基酸序列在SEQ ID NO: 18、21、43、45、77、80、103和106中示出。
鑒於該等抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')中的每一種均可以結合人cKIT並且抗原結合特異性主要由CDR1、2和3區提供，VH CDR1、2和3序列(或HCDR1、2、3)以及VL CDR1、2和3序列(或LCDR1、2、3)可以「混合且匹配」(即，來自不同抗體的CDR可以混合且匹配)，但每種抗體必須含有VH CDR1、2和3以及VL CDR1、2和3以產生結合cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。可以使用本領域已知的結合測定來測試這種「混合且匹配的」結合cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。當混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列應當替換為一種或多種結構上相似的CDR序列。同樣，當混合並匹配VL CDR序列時，來自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列應當替換為一種或多種結構上相似的CDR序列。對於熟悉該項技術者來說容易清楚的是，可以藉由用來自本文所示CDR序列的結構相似序列取代一個或多個VH和/或VL CDR區序列來產生新穎的VH和VL序列。
因此，本揭露提供了一種分離的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')，該分離的抗體或抗體片段包含重鏈CDR1(HCDR1)，該重鏈CDR1包含選自由SEQ ID NO: 1、4、6、7、27、30、32、33、60、63、65、66、86、89、91和92組成的組的胺基酸序列；重鏈CDR2(HCDR2)，該重鏈CDR2包含選自由SEQ ID NO: 2、5、8、28、31、34、51、52、53、61、64、67、87、90和93組成的組的胺基酸序列；重鏈CDR3(HCDR3)，該重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO: 3、9、29、35、62、68、88和94組成的組的胺基酸序列；輕鏈CDR1(LCDR1)，該輕鏈CDR1包含選自由SEQ ID NO: 16、19、22、42、44、46、75、78、81、101、104和107組成的組的胺基酸序列；輕鏈CDR2(LCDR2)，該輕鏈CDR2包含選自由SEQ ID NO: 17、20、76、79、102和105組成的組的胺基酸序列；和輕鏈CDR3(LCDR3)，該輕鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO: 18、21、43、45、77、80、103和106組成的組的胺基酸序列；其中抗體特異性結合cKIT。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 1的HCDR1；SEQ ID NO: 2的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 16的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 4的HCDR1；SEQ ID NO: 5的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 19的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 21的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 6的HCDR1；SEQ ID NO: 2的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 16的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 7的HCDR1；SEQ ID NO: 8的HCDR2；SEQ ID NO: 9的HCDR3；SEQ ID NO: 22的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 27的HCDR1；SEQ ID NO: 28的HCDR2；SEQ ID NO: 29的HCDR3；SEQ ID NO: 42的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 43的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 30的HCDR1；SEQ ID NO: 31的HCDR2；SEQ ID NO: 29的HCDR3；SEQ ID NO: 44的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 45的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 32的HCDR1；SEQ ID NO: 28的HCDR2；SEQ ID NO: 29的HCDR3；SEQ ID NO: 42的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 43的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 33的HCDR1；SEQ ID NO: 34的HCDR2；SEQ ID NO: 35的HCDR3；SEQ ID NO: 46的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 43的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 1的HCDR1；SEQ ID NO: 51的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 16的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 4的HCDR1；SEQ ID NO: 52的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 19的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 21的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 6的HCDR1；SEQ ID NO: 51的HCDR2；SEQ ID NO: 3的HCDR3；SEQ ID NO: 16的LCDR1；SEQ ID NO: 17的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 7的HCDR1；SEQ ID NO: 53的HCDR2；SEQ ID NO: 9的HCDR3；SEQ ID NO: 22的LCDR1；SEQ ID NO: 20的LCDR2；和SEQ ID NO: 18的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 60的HCDR1；SEQ ID NO: 61的HCDR2；SEQ ID NO: 62的HCDR3；SEQ ID NO: 75的LCDR1；SEQ ID NO: 76的LCDR2；和SEQ ID NO: 77的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 63的HCDR1；SEQ ID NO: 64的HCDR2；SEQ ID NO: 62的HCDR3；SEQ ID NO: 78的LCDR1；SEQ ID NO: 79的LCDR2；和SEQ ID NO: 80的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 65的HCDR1；SEQ ID NO: 61的HCDR2；SEQ ID NO: 62的HCDR3；SEQ ID NO: 75的LCDR1；SEQ ID NO: 76的LCDR2；和SEQ ID NO: 77的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 66的HCDR1；SEQ ID NO: 67的HCDR2；SEQ ID NO: 68的HCDR3；SEQ ID NO: 81的LCDR1；SEQ ID NO: 79的LCDR2；和SEQ ID NO: 77的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 86的HCDR1；SEQ ID NO: 87的HCDR2；SEQ ID NO: 88的HCDR3；SEQ ID NO: 101的LCDR1；SEQ ID NO: 102的LCDR2；和SEQ ID NO: 103的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 89的HCDR1；SEQ ID NO: 90的HCDR2；SEQ ID NO: 88的HCDR3；SEQ ID NO: 104的LCDR1；SEQ ID NO: 105的LCDR2；和SEQ ID NO: 106的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 91的HCDR1；SEQ ID NO: 87的HCDR2；SEQ ID NO: 88的HCDR3；SEQ ID NO: 101的LCDR1；SEQ ID NO: 102的LCDR2；和SEQ ID NO: 103的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含SEQ ID NO: 92的HCDR1；SEQ ID NO: 93的HCDR2；SEQ ID NO: 94的HCDR3；SEQ ID NO: 107的LCDR1；SEQ ID NO: 105的LCDR2；和SEQ ID NO: 103的LCDR3。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)，和含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO: 47的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 54的胺基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO: 108的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有SEQ ID NO: 99的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 119、120或121的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 125、126或127的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 131、132或133的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 137、138或139的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab')包含含有選自SEQ ID NO: 142、143或144的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，該特異性結合人cKIT的抗體包含含有SEQ ID NO: 97的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的輕鏈。
在某些方面，該特異性結合人cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')係表1中所述的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。 1. 結合相同表位的抗體
本揭露提供了特異性結合人cKIT受體的細胞外結構域內的表位的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。在某些方面，抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')可以結合人cKIT細胞外結構域的結構域1-3內的表位。
本揭露還提供了與表1中所述的抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')結合相同的表位的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。因此，另外的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')可以基於它們在cKIT結合測定中與其他抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的交叉競爭(例如，以統計學上顯著的方式競爭性地抑制其他抗體或抗體片段的結合)的能力進行鑒定。在國際專利申請案號WO 2003/48731中描述了基於抗體的交叉競爭將該等抗體「分箱」的高通量方法。測試抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')抑制本文揭露的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')結合cKIT蛋白(例如人cKIT)的能力證明了測試抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')可以與該抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')競爭結合cKIT；根據非限制性理論，這種抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')可以結合cKIT蛋白上與該抗體或抗體片段競爭的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')相同或相關(例如，結構上相似或空間上接近)的表位。在某些方面，結合cKIT上與本文揭露的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')相同的表位的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')係人或人源化抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。這種人或人源化抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')可以如本文所述那樣製備和分離。 2. 框架的修飾
本文揭露的抗體藥物軛合物可以包含經修飾的結合cKIT的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')，該抗體或抗體片段包含對VH和/或VL內的框架殘基的修飾，例如以改善抗體藥物軛合物的特性。
在一些實施方式中，進行框架修飾以降低抗體或抗體藥物軛合物的免疫原性。例如，一種方法係將一個或多個框架殘基「回復突變」為相應的種系序列。可以藉由將抗體框架序列與衍生出抗體的種系序列進行比較來鑒定此類殘基。為了使框架區序列「匹配」於所期望的種系構型，可以藉由例如定點誘變將殘基「回復突變」為相應的種系序列。此類「回復突變的」抗體或抗體藥物軛合物也旨在為本發明所涵蓋。
另一種類型的框架修飾包括使框架區內、或甚至一個或多個CDR區內的一個或多個殘基突變以去除T細胞表位，從而降低抗體或抗體藥物軛合物的潛在免疫原性。這種方法也稱為「去免疫化」，並且在Carr等人的美國專利公開號2003/0153043中有進一步詳細描述。
除了在框架區或CDR區內進行的修飾之外或作為在框架區或CDR區內進行的修飾的替代方案，可以將抗體工程化以改變抗體的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補體固定。此外，抗體可以經化學修飾(例如，一個或多個化學部分可以連接至抗體)或經修飾以改變其糖基化，從而再次改變抗體的一種或多種功能特性。下文進一步詳細描述該等方面的每一項。
在一個方面，修飾CH1的鉸鏈區，使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目改變，例如增加或減少。這種方法進一步描述於Bodmer等人的美國專利號5,677,425中。將CH1的鉸鏈區中的半胱胺酸殘基的數目改變，以例如有利於輕鏈和重鏈的組裝、以增加或減少抗體的穩定性、或以使得軛合至另一分子。
在一些實施方式中，本文揭露的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包括經修飾或經工程化的胺基酸殘基，例如一個或多個半胱胺酸殘基，以作為用於軛合至藥物部分的位點(Junutula JR等人: Nat Biotechnol [自然生物技術] 2008, 26:925-932)。在一個實施方式中，本發明提供了一種經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')，該經修飾的抗體或抗體片段包含在本文所述的位置處用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代。用於半胱胺酸取代的位點係在抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的恒定區中並且因此適用於多種抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')，並且選擇位點以提供穩定且均勻的軛合物。經修飾的抗體或片段可以具有一個、兩個或更多個半胱胺酸取代，並且該等取代可以與如本文所述的其他修飾和軛合方法組合使用。用於將半胱胺酸插入在抗體的特定位置處的方法係本領域已知的，參見例如Lyons等人，(1990) Protein Eng. [蛋白質工程], 3:703-708、WO 2011/005481、WO2014/124316、WO 2015/138615。在某些實施方式中，經修飾的抗體包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體的重鏈的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，並且其中位置係根據EU系統編號的。在某些實施方式中，經修飾的抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體片段(例如Fab或Fab')的重鏈的位置121、124、152、153、155、157、164、169、171、174、189和207，並且其中位置係根據EU系統編號的。在某些實施方式中，經修飾的抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體片段(例如Fab或Fab')的重鏈的位置124、152、153、155、157、164、174、189和207，並且其中位置係根據EU系統編號的。
在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的輕鏈的位置107、108、109、114、126、127、129、142、143、145、152、154、156、157、159、161、165、168、169、170、182、183、188、197、199和203，其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係人κ輕鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的輕鏈的位置107、108、114、126、127、129、142、159、161、165、183和203，其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係人κ輕鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的輕鏈的位置114、129、142、145、152、159、161、165和197，其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係人κ輕鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的輕鏈的位置107、108、109、126、143、145、152、154、156、157、159、182、183、188、197、199和203，其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係人κ輕鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的輕鏈的位置145、152和197，其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係人κ輕鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的輕鏈的位置114和165，其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係人κ輕鏈。
在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的輕鏈的位置143、145、147、156、159、163、168，其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係人λ輕鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的輕鏈的位置143(根據EU編號)處的半胱胺酸，其中輕鏈係人λ輕鏈。
在某些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在其恒定區上用半胱胺酸對兩個或更多個胺基酸的取代的組合，並且位置組合可以選自上文列出的任一個位置。
在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在以下位置中的一個或多個處的半胱胺酸：重鏈的位置124、重鏈的位置152、重鏈的位置153、重鏈的位置155、重鏈的位置157、重鏈的位置164、重鏈的位置174、輕鏈的位置114、輕鏈的位置129、輕鏈的位置142、輕鏈的位置159、輕鏈的位置161、或輕鏈的位置165，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在以下位置中的四個處的半胱胺酸：重鏈的位置124、重鏈的位置152、重鏈的位置153、重鏈的位置155、重鏈的位置157、重鏈的位置164、重鏈的位置174、輕鏈的位置114、輕鏈的位置129、輕鏈的位置142、輕鏈的位置159、輕鏈的位置161、或輕鏈的位置165，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。
在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在重鏈的位置152處的半胱胺酸，其中位置係根據EU系統編號的。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在重鏈的位置124處的半胱胺酸，其中位置係根據EU系統編號的。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在輕鏈的位置165處的半胱胺酸，其中位置係根據EU系統編號的並且其中輕鏈係κ鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在輕鏈的位置114處的半胱胺酸，其中位置係根據EU系統編號的並且其中輕鏈係κ鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在輕鏈的位置143處的半胱胺酸，其中位置係根據EU系統編號的並且其中輕鏈係λ鏈。
在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在重鏈的位置152處和在輕鏈的位置165處的半胱胺酸，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在重鏈的位置152處和在輕鏈的位置114處的半胱胺酸，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在重鏈的位置152處和在輕鏈的位置143處的半胱胺酸，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係λ鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在重鏈的位置124和位置152處的半胱胺酸，並且其中位置係根據EU系統編號的。
在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在以下位置中的一個或多個處的半胱胺酸：重鏈的位置155、重鏈的位置189、重鏈的位置207、輕鏈的位置145、輕鏈的位置152、或輕鏈的位置197，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在以下位置中的兩個或更多個(例如2、3、4個)處的半胱胺酸：重鏈的位置155、重鏈的位置189、重鏈的位置207、輕鏈的位置145、輕鏈的位置152、或輕鏈的位置197，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。
在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在以下位置中的一個或多個處的半胱胺酸：重鏈的位置124、重鏈的位置152、重鏈的位置153、重鏈的位置155、重鏈的位置157、重鏈的位置164、重鏈的位置174、輕鏈的位置114、輕鏈的位置129、輕鏈的位置142、輕鏈的位置159、輕鏈的位置161、或輕鏈的位置165，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')包含在以下位置中的兩個或更多個(例如2、3、4個)處的半胱胺酸：重鏈的位置124、重鏈的位置152、重鏈的位置153、重鏈的位置155、重鏈的位置157、重鏈的位置164、重鏈的位置174、輕鏈的位置114、輕鏈的位置129、輕鏈的位置142、輕鏈的位置159、輕鏈的位置161、或輕鏈的位置165，並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的經修飾的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 118的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 122的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的經修飾的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 118的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 123的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的經修飾的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 124的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 128的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的經修飾的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 124的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 129的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的經修飾的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 130的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 134的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的經修飾的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 130的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 135的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的經修飾的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 136的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 140的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方式中，特異性結合人cKIT的經修飾的抗體片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO: 141的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 145的胺基酸序列的輕鏈。 3. cKIT 抗體或抗體片段的產生
可以藉由本領域已知的任何手段產生抗cKIT抗體或抗體片段(例如，Fab或Fab')，該等手段包括但不限於重組表現、化學合成或酶促消化全長單株抗體，該等全長單株抗體可以藉由例如雜交瘤或重組產生獲得。重組表現可以來自本領域已知的任何適當宿主細胞，例如，哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞，或由無細胞系統(例如蘇特羅公司(Sutro)的Xpress CFTM 平台，http://www.sutrobio.com/technology/)製備。
本揭露進一步提供了編碼本文所述的抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的多核苷酸，例如，編碼包含如本文所述的互補性決定區的重鏈或輕鏈可變區或區段的多核苷酸。在一些方面，編碼重鏈可變區(VH)的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 11、37、55、70和96組成的組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。在一些方面，編碼輕鏈可變區(VL)的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 24、48、83和109組成的組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
在一些方面，編碼抗體重鏈的多核苷酸與SEQ ID NO: 13、39、57、72和98的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。在一些方面，編碼抗體輕鏈的多核苷酸與SEQ ID NO: 26、50、85和111的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
在一些方面，編碼Fab'重鏈的多核苷酸與SEQ ID NO: 15、41、59、74和100的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。在一些方面，編碼Fab'輕鏈的多核苷酸與SEQ ID NO: 26、50、85和111的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
本揭露的多核苷酸可以僅編碼抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的可變區序列。它們還可以編碼抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的可變區和恒定區。一些多核苷酸序列編碼包含一種所例舉抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的重鏈和輕鏈的可變區的多肽。
多核苷酸序列可以藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼抗cKIT抗體或其結合片段的現有序列(例如，如下文實例中所述的序列)來產生。核酸的直接化學合成可以藉由本領域已知的方法完成，該等方法如Narang等人，Meth. Enzymol. [酶學方法] 68:90, 1979的磷酸三酯方法；Brown等人，Meth. Enzymol. [酶學方法] 68:109, 1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人，Tetra. Lett. [四面體通訊], 22:1859, 1981的二乙基亞磷醯胺方法；以及美國專利號4,458,066的固體支持物方法。藉由PCR將突變引入至多核苷酸序列可以如以下中所述那些進行：例如，PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification [PCR技術：DNA擴增的原理和應用], H.A. Erlich (編輯)，Freeman Press [弗裡曼出版社]，紐約，紐約州，1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications [PCR方案：方法和應用指南]，Innis等人(編輯)，Academic Press [學術出版社]，San Diego, CA [加利福尼亞州聖地牙哥]，1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res. [核酸研究] 19:967, 1991；和Eckert等人，PCR Methods and Applications [PCR方法和應用] 1:17, 1991。
在本揭露中還提供了用於產生上文所述的抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的表現載體和宿主細胞。多種表現載體可以用來表現編碼抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的多核苷酸。基於病毒的載體和非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體和系統包括質粒、附加型載體(典型地具有用於表現蛋白質或RNA的表現盒)以及人類人工染色體(參見例如，Harrington等人，Nat Genet. [自然遺傳學] 15:345, 1997)。例如，可用於哺乳動物(例如人)細胞中表現抗cKIT多核苷酸和多肽的非病毒載體包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(英傑公司(Invitrogen)，加利福尼亞州聖地牙哥)、MPSV載體和本領域已知用於表現其他蛋白質的許多其他載體。有用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒的載體，基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP EB病毒、牛痘病毒載體和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(SFV)的載體。參見，Brent等人，同上；Smith, Annu. Rev. Microbiol. [微生物學年鑒] 49:807, 1995；和Rosenfeld等人，Cell [細胞] 68:143, 1992。
表現載體的選擇取決於待表現該載體的預期宿主細胞。典型地，表現載體含有與編碼抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')的多核苷酸可操作地連接的啟動子和其他調節序列(例如，增強子)。在一些方面，使用誘導型啟動子以防止插入的序列在誘導條件之外的條件下表現。誘導型啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可以在非誘導條件下、而不在偏向宿主細胞更好耐受其表現產物的編碼序列的群體的情況下擴大經轉化的生物體的培養。除啟動子之外，也可能要求或需要其他調節元件用於高效表現抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')。該等元件典型地包括ATG起始密碼子和相鄰的核糖體結合位點或其他序列。此外，藉由包含適合於使用中的細胞系統的增強子，可以提高表現效率(參見例如，Scharf等人，Results Probl. Cell Differ. [細胞分化中的結果和問題] 20:125, 1994；和Bittner等人，Meth. Enzymol. [酶學方法], 153:516, 1987)。例如，SV40增強子或CMV增強子可以用來增加哺乳動物宿主細胞中的表現。
表現載體還可以提供分泌訊號序列位置，以與藉由插入的抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')序列編碼的多肽形成融合蛋白。更經常地，插入的抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')序列在包含在載體中之前與訊號序列連接。待用來接受編碼抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的序列的載體有時還編碼恒定區或其部分。此類載體允許將可變區表現為具有恒定區的融合蛋白，從而導致產生完整抗體或其片段。
用於攜帶並表現抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')鏈的宿主細胞可以是原核或真核的。大腸桿菌係一種可用於選殖並表現本揭露多核苷酸的原核宿主。適合使用的其他微生物宿主包括桿菌(如枯草桿菌)和其他腸桿菌科(如沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬)以及各種假單胞菌屬的種。在該等原核宿主中，還可以製備表現載體，該等表現載體典型地含有與宿主細胞相容的表現控制序列(例如，複製的起點)。此外，將存在任何數量的各種公知的啟動子，如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子典型地視情況使用操縱基因序列控制表現，並且具有核糖體結合位點序列等，以用於啟動和完成轉錄和翻譯。也可以採用其他微生物，如酵母來表現抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')多肽。也可以使用與桿狀病毒載體組合的昆蟲細胞。
在其他方面，哺乳動物宿主細胞用來表現並產生本揭露的抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')多肽。例如，它們可以是表現內源性免疫球蛋白基因的雜交瘤細胞系(例如，如實例中所述的骨髓瘤雜交瘤殖株)或攜帶外源表現載體的哺乳動物細胞系(例如，下文例舉的SP2/0骨髓瘤細胞)。該等包括任何正常的必死或正常或異常的永生的動物或人類細胞。例如，已經開發出能夠分泌完整免疫球蛋白的眾多合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞和雜交瘤。利用哺乳動物組織細胞培養物表現多肽在例如Winnacker, From Genes to Clones [從基因到選殖], VCH出版商, 紐約，紐約州，1987中進行了大體論述。用於哺乳動物宿主細胞的表現載體可包含表現控制序列，如複製起點、啟動子和增強子(參見例如，Queen等人，Immunol. Rev. [免疫學評論] 89:49-68, 1986)，和必要的處理資訊位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或衍生自哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可以是組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的和/或可調控的或可調節的。可用啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松(dexamethasone)誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素誘導型CMV啟動子(如人CMV立即早期啟動子)、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-增強子組合。
用於引入含有目的多核苷酸序列的表現載體的方法根據細胞宿主的類型而變化。例如，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可以用於其他細胞宿主(通常參見Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導的轉化、注射和顯微注射、衝擊法、病毒體、免疫脂質體、聚陽離子:核酸軛合物、裸DNA、人工病毒粒子、與皰疹病毒結構蛋白VP22的融合物(Elliot和O'Hare, Cell [細胞] 88:223, 1997)、藥劑增強的DNA攝取和離體轉導。對於重組蛋白的長期高產量生產，通常期望穩定的表現。例如，可以使用含有病毒複製起點或內源性表現元件和選擇標記基因的表現載體，製備穩定表現抗cKIT抗體或抗體片段(例如Fab或Fab')鏈的細胞系。在引入載體之後，可以使細胞在富集的培養基中生長1-2天，之後將它們轉換至選擇性培養基。選擇性標記物的目的是賦予選擇抗性，並且它的存在允許在選擇性培養基中成功地表現引入的序列的細胞的生長。可以使用適合於細胞類型的組織培養技術來增殖抗性、穩定轉染的細胞。
抗體片段，如Fab或Fab'可藉由使用酶如木瓜蛋白酶(用於產生Fab片段)或胃蛋白酶(用於產生Fab'片段)等蛋白水解裂解免疫球蛋白分子來產生。與Fab片段相比，Fab'片段還含有鉸鏈區，該鉸鏈區包含在免疫球蛋白分子的兩個重鏈之間形成二硫鍵的兩個天然半胱胺酸。治療用途
本揭露的軛合物可用於多種應用，包括但不限於用於在有需要的患者(例如造血幹細胞移植受者)中消融造血幹細胞。因此，本文提供了藉由以下方式在有需要的患者中消融造血幹細胞之方法：向患者給予有效量的本文所述的任何軛合物。本文還提供了藉由以下方式調理造血幹細胞移植患者(例如，移植受者)之方法：向患者給予有效量的本文所述的任何軛合物，並且在對患者進行造血幹細胞移植之前允許有足夠的時間段來使軛合物從患者的循環中清除。軛合物可以靜脈內給予至患者。還提供了本文所述的軛合物或藥物組成物中的任一種用於在有需要的患者中消融造血幹細胞之用途。進一步提供了本文所述的軛合物或藥物組成物中的任一種在製造用於在有需要的患者中消融造血幹細胞的藥物中之用途。
內源性造血幹細胞通常駐留於骨髓竇內。幹細胞所駐留的這種物理環境被稱為幹細胞微環境或幹細胞生態位。涉及該生態位的基質細胞和其他細胞提供了可溶性和結合三級，該等三級具有多種作用。已經提出了各種模型用於造血幹細胞與它們的生態位之間的相互作用。例如，已經提出了一種模型，其中當幹細胞分裂時，只有一個子代留在生態位中而另一個子細胞離開生態位以進行分化。已經提出藉由選擇性消耗內源性造血幹細胞，從而開放用於植入供者幹細胞的幹細胞生態位，可以增強植入效率(參見例如，WO 2008/067115)。
造血幹細胞(HSC)移植、或骨髓移植(如前所述)係用於影響身體的血液幹細胞的大範圍疾病的既定療法，該等疾病如白血病、嚴重貧血、免疫缺陷和一些酶缺乏病。該等疾病常常導致患者需要用新的健康血細胞替代其骨髓。
HSC移植常常是同種異體的，這意味著患者接受來自同一物種的另一個體的幹細胞，該另一個體係兄弟姐妹、匹配親緣、半相合親緣或非親緣的志願者供者。據估計，大約30%需要造血幹細胞移植的患者可以具有其組織類型合適的兄弟姐妹。另外70%的患者必須依靠非親緣志願者供者的匹配或者半相合親緣供者的可得性。重要的是，供者細胞和患者細胞的特徵係相當的。造血幹細胞移植也可以是自體的，其中移植的細胞源自受試者自身，即供者和受者係同一個體。此外，移植可以是同基因的，即來自遺傳上相同的個體，如雙胞胎。在另一個方面，移植可以是異種的，即源自不同的物種，如對於器官移植，當沒有足夠的相同物種的供者時，該移植係令人感興趣的。
在HSC移植之前，患者通常經歷預處理或調理方法。這種預處理或調理的目的是盡可能多地去除體內不需要的細胞(例如，惡性/癌細胞)，以最小化排斥，和/或藉由消耗內源性HSC來開放幹細胞生態位，以便將供者幹細胞高效植入到該等生態位中。然後將供者的健康HSC靜脈內、或在一些情況下骨內給予至患者。然而，許多風險與HSC移植相關，包括移植不良、免疫排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、或感染。儘管供者細胞和患者細胞在組織類型方面似乎等同，例如，MHC分子匹配(或半相合)；但該等個體之間仍然存在免疫細胞可視為危險的微小差異。這意味著新的免疫系統(來自新幹細胞的白血球)將新身體視為「外來的」，從而引發免疫攻擊。這種稱為移植物抗宿主病(GVHD)的反應可能變得危及患者的生命。HSC移植後的患者在新骨髓開始發揮作用之前由於缺乏白血球而具有增加的感染風險。在某些情況下，這段時間可持續數月，直到新的免疫系統成熟為止。其中一些機會性感染可能是危及生命的。
因此，需要改進調理和移植方法並且降低與HSC移植相關的風險並增加其對各種障礙的有效性。本文提供了新的抗體藥物軛合物，該等抗體藥物軛合物藉由在移植之前特異性殺傷受者的內源性HSC而不是所有其他免疫細胞，就在移植後保持部分活性免疫防禦以對抗感染，但由於受試者無法從其自身的HSC中形成新的免疫細胞而同時提供間接免疫抑制作用。由於該預處理可比化學療法或放射更溫和，並且副作用不太嚴重，因此可能在移植患者中誘導較少的GVHD。
本文所述的抗體藥物軛合物可用於例如在造血幹細胞移植之前的預處理/調理方法中消融內源性造血幹細胞。例如，本發明的軛合物可用於治療其中幹細胞移植可能有益的任何非惡性病症/障礙，如嚴重再生障礙性貧血(SAA)、偉－爾二氏症候群(Wiskott Aldrich Syndrome)、胡勒爾綜合症(Hurlers Syndrome)、家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(FHL)、慢性肉芽腫病(CGD)、柯士文綜合症(Kostmanns syndrome)、嚴重免疫缺乏症候群(SCID)、其他自體免疫疾病，如SLE、多發性硬化症、IBD、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、休格倫氏症候群(Sjogrens syndrome)、血管炎、狼瘡、重症肌無力、韋格納病(Wegeners disease)、先天性代謝異常和/或其他免疫缺陷。
此外，本發明的軛合物可用於治療其中幹細胞移植可能有益的任何惡性病症/障礙，如血液病、血液惡性腫瘤或實體瘤(例如，腎癌、肝癌、胰腺癌)。可以用要求保護的方法和抗體治療的常見類型的血液疾病/惡性腫瘤係白血病、淋巴瘤和骨髓增生異常綜合症。白血病係一種血液或骨髓的癌症類型，其特徵係未成熟白血球(稱為胚細胞)異常增加，並且術語白血病包括：急性淋巴母細胞性白血病 (ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性單核細胞性白血病(AMoL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)和其他白血病，如毛細胞白血病(HCL)、T細胞幼淋巴細胞白血病(T-PLL)、大顆粒淋巴細胞白血病和成人T細胞白血病。在本發明的一個方面，治療的白血病係急性白血病。在另一個方面，白血病係ALL、AML或AMoL。淋巴瘤包括先質T細胞白血病/淋巴瘤、柏基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、套膜細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、蕈樣真菌病(Mycosis fungoides)、外周T細胞淋巴瘤非特指型、結節性硬化型霍奇金氏淋巴瘤、混合細胞亞型霍奇金氏淋巴瘤。骨髓增生異常綜合症(MDS)係當骨髓中的血液形成細胞受損時發生的一組病症的名稱。這種損傷導致一種或多種血細胞數量較少。MDS細分為7個類別；難治性血細胞減少症伴單系發育異常(RCUD)、難治性貧血伴環狀鐵粒幼紅血球(RARS)、難治性血細胞減少症伴多系發育異常(RCMD)、難治性貧血伴原始細胞增多1型(RAEB-1)、難治性貧血伴原始細胞增多2型(RAEB-2)、未分類的骨髓增生異常綜合症(MDS-U)和與孤立del(5q)相關的骨髓增生異常綜合症。
在一些實施方式中，需要消融造血幹細胞的患者(例如，造血幹細胞移植受者)可具有先天性免疫缺陷疾病、自體免疫疾病、造血障礙或先天性代謝異常。
在一些實施方式中，造血障礙可選自以下中的任一種：急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病 (ALL)、急性單核細胞性白血病(AMoL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、骨髓增生性障礙、骨髓增生異常綜合症、多發性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、再生障礙性貧血、單純紅血球形成不全、陣發性夜間血紅素尿、範可尼貧血(Fanconi anemi)、地中海重貧血症、鐮狀細胞貧血、嚴重合併性免疫缺失、偉－爾二氏症候群、噬血細胞性淋巴組織細胞增多症。
先天性代謝異常也稱為遺傳性代謝疾病(IMB)或先天性代謝性疾病，係一類遺傳性疾病，包括碳水化合物代謝、胺基酸代謝、有機酸代謝的先天性障礙、或溶酶體貯積病。在一些實施方式中，先天性代謝異常選自粘多醣貯積病、高歇氏病(Gaucher disease)、異染性白質失養症或腎上腺腦白質病。
在一些實施方式中，本文所述的抗體藥物軛合物可用於消融內源性造血幹細胞，以作為在先前已針對本文揭露的疾病或病症用自體幹細胞移植進行治療的患者中進行同種異體幹細胞移植之前的降低強度的調理方法。例如，本文所述的抗體藥物軛合物可在同種異體幹細胞移植中用於先前已用自體幹細胞移植治療的患者，如Chen等人，Biol Blood Marrow Transplant [血液與骨髓移植生物學] 21 (2015) 1583e1588中所述。在一些實施方式中，可以在患者接受自體幹細胞移植後1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長時間，進行同種異體幹細胞移植。
此外，本發明的軛合物可用於治療胃腸道間質瘤(GIST)，如cKIT陽性的GIST。在一些實施方式中，本發明的軛合物可用於治療表現野生型cKIT的GIST。在一些實施方式中，本發明的軛合物可用於治療對治療例如伊馬替尼(Glivec®/Gleevec®)有抗性的GIST。 組合療法
在某些情況下，本揭露的抗體藥物軛合物可以與另一種調理方案(如放射療法或化學療法)組合使用。
在某些情況下，本揭露的抗體藥物軛合物可以與另一種治療劑(如抗癌劑、抗噁心劑(或止吐劑)、止痛劑、動員劑或其組合)組合使用。
考慮用於組合療法中的一般化學治療劑包括阿那曲唑(Arimidex® )、比卡魯胺(Casodex® )、硫酸博萊黴素(Blenoxane® )、白消安(Myleran® )、白消安注射液(Busulfex® )、卡培他濱(Xeloda® )、N4-戊氧羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(Paraplatin® )、卡莫司汀(BiCNU® )、苯丁酸氮芥(Leukeran® )、順鉑(Platinol® )、克拉屈濱(Leustatin® )、環孢黴素(Sandimmune®、Neoral®或Restasis®)、環磷醯胺(Cytoxan® 或Neosar® )、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U® )、阿糖胞苷脂質體注射液(DepoCyt® )、達卡巴嗪(DTIC-Dome® )、更生黴素(放線菌素D、Cosmegan)、鹽酸柔紅黴素(Cerubidine® )、檸檬酸柔紅黴素脂質體注射液(DaunoXome® )、地塞米松、多西他賽(Taxotere® )、鹽酸阿黴素(Adriamycin® 、Rubex® )、依託泊苷(Vepesid® )、磷酸氟達拉濱(Fludara® )、5-氟尿嘧啶(Adrucil® 、Efudex® )、氟他胺(Eulexin® )、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(雙氟去氧胞苷)、羥基脲(Hydrea® )、伊達比星(Idamycin® )、異環磷醯胺(IFEX® )、伊立替康(Camptosar® )、L-天冬醯胺酶(ELSPAR® )、亞葉酸鈣、美法侖(Alkeran® )、6-巰嘌呤(Purinethol® )、胺甲喋呤(Folex® )、米托蒽醌(Novantrone® )、mylotarg、紫杉醇(Taxol® )、phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、噴司他丁(pentostatin)、聚苯丙生(polifeprosan)20與卡莫司汀的植入物(Gliadel(r))、枸櫞酸它莫西芬(Nolvadex® )、替尼泊苷(Vumon® )、6-硫代鳥嘌呤、噻替派、替拉紮明(Tirazone® )、注射用鹽酸托泊替康(Hycamptin® )、長春花鹼(Velban® )、長春新鹼(Oncovin® )和長春瑞濱(Navelbine® )。
在一些實施方式中，本揭露的抗體藥物軛合物可以與CD47阻斷劑，例如抗CD47抗體或其片段組合使用。據報導，阻斷CD47與訊號調節蛋白α(SIRPα)之間相互作用的抗CD47微體可以藉由裸抗c-Kit抗體增強內源性HSC的消耗(Chhabra等人，Science Translational Medicine [科學轉化醫學]8 (351), 351ra105)。
在一些實施方式中，本揭露的抗體藥物軛合物可以與另一種特異性結合造血幹細胞或造血先驅細胞的抗體或其片段組合使用，該抗體或其片段例如抗CD45抗體或其片段、抗CD34抗體或其片段、抗CD133抗體或其片段、抗CD59抗體或其片段、或抗CD90抗體或其片段。在一些實施方式中，本揭露的抗體藥物軛合物可以與Dyrk1a抑制劑組合使用，該Dyrk1a抑制劑如哈爾明鹼、INDY，ML 315鹽酸鹽、ProINDY、TocrisTM TC-S 7044、TocrisTM TG 003、FINDY、TBB、DMAT、CaNDY等。
在一些實施方式中，本揭露的抗體藥物軛合物可以與以下組合使用：一種或多種免疫抑制劑如糖皮質激素，例如潑尼松、地塞米松和氫化可的松；細胞抑制劑，例如烷化劑、抗代謝物、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、巰嘌呤、更生黴素(dactinomycin)等；作用於免疫親和素的藥物，例如他克莫司(Prograf®、Astograf XL®或Envarsus XR®)、西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin)或Rapamune®)和依維莫司(everolimus)；干擾素；藥片類藥物；TNF結合蛋白；麥考酚酯(mycophenolate)；芬戈莫德(fingolimod)；多球殼菌素(myriocin)；等等。在一些實施方式中，本揭露的抗體藥物軛合物可以與一種或多種特異性消耗T細胞的藥劑組合使用，該一種或多種藥劑如氟達拉濱、環孢素、抗CD52抗體(例如阿侖單抗)、抗胸腺細胞球蛋白(ATG)、抗-CD3抗體或其片段、抗CD4抗體或其片段、抗CD8抗體或其片段、或抗人TCRα/β抗體或其片段。T細胞消耗療法可以減少宿主抗移植物的反應，該反應可能導致移植物的排斥。
在一些實施方式中，本揭露的抗體藥物軛合物可以與一種或多種選自以下的藥劑組合使用：普樂沙福(plerixafor)(也稱為AMD3100、Mozobil® )、粒細胞-巨噬細胞集落刺激三級(GM-CSF)，例如沙格司亭(Leukine®)、或粒細胞集落刺激三級(G-CSF)，例如非格司亭或培非格司亭(Zarzio® 、Zarxio® 、Neupogen® 、Neulasta® 、Nufil® 、Religrast® 、Emgrast® 、Neukine® 、Grafeel® 、Imumax® 、Filcad® )。
在一個方面，本揭露的抗體藥物軛合物在藥物組合配製物或作為組合療法的給藥方案中與具有抗癌特性的第二化合物組合。藥物組合配製物或給藥方案的第二化合物可以對該組合的軛合物具有互補活性，使得它們不彼此不利地影響。
如本文所用，術語「藥物組合」係指在一個劑量單位形式中的固定組合、或用於組合給予的非固定組合或成套藥盒，其中兩種或更多種治療劑可以在同一時間獨立地給予或在時間間隔內分別給予，特別地其中該等時間間隔允許組合配偶體顯示合作性例如協同效應。
術語「組合療法」係指給予兩種或更多種治療劑以治療本揭露中描述的治療性病症或障礙。這種給予涵蓋以基本上同時的方式共同給予該等治療劑，如以具有固定比率的活性成分的單個膠囊給予。可替代地，這種給予涵蓋在多個容器中或在每種活性成分的獨立容器(例如，膠囊、粉末和液體)中共同給予。可以將粉末和/或液體在給予之前重構或稀釋到所需的劑量。此外，這類給予也涵蓋在大致相同的時間或在不同的時間順序使用每種類型的治療劑。在任何一種情況下，治療方案將在治療本文所述的病症或障礙方面提供藥物組合的有益作用。
組合療法可以提供「協同」並且證明係「協同的」，即，當活性成分一起使用時所實現的效應大於由分別使用該等化合物所產生的效應的總和。當將活性成分為下述情形時可以獲得協同效應：(1) 以組合的單位劑量配製物的形式共同配製並同時給予或遞送；(2) 以單獨配製物的形式交替或平行遞送；或 (3) 藉由一些其他方案進行。當以交替療法遞送時，可以在依序(例如藉由在單獨注射器中不同的注射)給予或遞送化合物時獲得協同效應。通常，在交替療法期間，將有效劑量的每種活性成分依序地即順次地給予，而在組合療法中，將有效劑量的兩種或更多種活性成分一起給予。藥物組成物
為了製備包含一種或多種本文所述的抗體藥物軛合物的藥物或無菌組成物，可以將提供的一種或多種軛合物與藥學上可接受的載劑或賦形劑混合。
治療劑和診斷劑的配製物可以藉由與生理學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑以例如凍乾粉末、漿液、水性溶液、洗劑或懸浮液的形式混合來製備(參見例如，Hardman等人，Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics [古德曼·吉爾曼治療學的藥理學基礎]，McGraw-Hill [麥格勞-希爾集團], 紐約，紐約州，2001；Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥物科學與實踐], Lippincott, Williams, and Wilkins [利平科特•威廉斯和威爾金斯出版公司]，紐約，紐約州，2000；Avis等人 (編輯)，Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications [藥物劑型：腸胃外藥物], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司]，紐約，1993；Lieberman等人 (編輯.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets [藥物劑型：片劑], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司]，紐約，1990；Lieberman等人 (編輯) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems [藥物劑型：分散系統], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司]，紐約，1990；Weiner和Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety [賦形劑毒性和安全性], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司]，Inc., 紐約，紐約州，2000)。
在一些實施方式中，包含本發明的抗體軛合物的藥物組成物係凍乾物製劑。在某些實施方式中，包含抗體軛合物的藥物組成物係在小瓶中的含有抗體軛合物、組胺酸、蔗糖和聚山梨醇酯20的凍乾物。在某些實施方式中，包含抗體軛合物的藥物組成物係在小瓶中的含有抗體軛合物、琥珀酸鈉和聚山梨醇酯20的凍乾物。在某些實施方式中，包含抗體軛合物的藥物組成物係在小瓶中的含有抗體軛合物、海藻糖、檸檬酸鹽和聚山梨醇酯8的凍乾物。凍乾物可以例如用水、鹽水重構用於注射。在一個具體實施方式中，溶液包含pH為約5.0的抗體軛合物、組胺酸、蔗糖和聚山梨醇酯20。在另一個具體實施方式中，溶液包含抗體軛合物、琥珀酸鈉和聚山梨醇酯20。在另一個具體實施方式中，溶液包含pH為約6.6的抗體軛合物、脫水海藻糖、檸檬酸鹽脫水物、檸檬酸和聚山梨醇酯8。為了靜脈內給予，將獲得的溶液通常進一步稀釋於載劑溶液中。
為治療劑選擇給予方案取決於幾種因素，包括實體的血清或組織周轉速率、症狀水平、實體的免疫原性和生物基質中的靶細胞可及性。在某些實施方式中，給予方案使遞送至患者的治療劑的量最大化，與可接受水平的副作用一致。因此，遞送的生物製品的量部分地取決於具體實體和正在治療的病症的嚴重程度。選擇適當劑量的抗體、細胞因子和小分子的指南係可獲得的(參見例如，Wawrzynczak, Antibody Therapy [抗體療法], Bios Scientific Pub. Ltd [Bios科學出版社有限公司]，Oxfordshire [牛津郡], 英國，1996；Kresina (編輯)，Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis [單株抗體、細胞因子和關節炎], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司]，紐約，紐約州，1991；Bach (編輯)，Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases [自免疫疾病中的單株抗體和肽療法], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司]，紐約，紐約州，1993；Baert等人，New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 348:601-608, 2003；Milgrom等人，New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 341:1966-1973, 1999；Slamon等人，New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 344:783-792, 2001；Beniaminovitz等人，New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 342:613-619, 2000；Ghosh等人，New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 348:24-32, 2003；Lipsky等人，New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 343:1594-1602, 2000)。
由臨床醫生，例如，使用本領域已知或疑似影響治療或預計影響治療的參數或因素確定適當的劑量。通常，劑量始於或多或少小於最佳劑量的量並此後將它以小增量增加，直至相對於任何不利副作用，實現所期望的或最佳的效果。重要的診斷量值包括症狀(例如炎症)的那些量值或產生的炎性細胞因子的水平。
可以改變本發明藥物組成物中活性成分的實際劑量水平，以便獲得一定量的活性成分，該活性成分的量有效地實現對於特定的患者、組成物和給藥方式的所期望的治療應答，而對患者沒有毒性。所選擇的劑量水平取決於多種藥物動力學 因素，包括所採用的本發明特定組成物的活性、給予途徑、給予時間、所採用的特定化合物的排泄速率、治療持續時間、與所用特定組成物組合的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和先前病史、以及醫學領域中已知的類似因素。
包含本發明的抗體軛合物的組成物可藉由連續輸注提供，或藉由例如一天、一週、或每週1-7次、每一週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、或每八週一次的間隔劑量提供。劑量可以靜脈內、皮下或骨內方式提供。特定劑量方案係一個涉及避免明顯不希望的副作用的最大劑量或給藥頻率的方案。
對於本發明的抗體軛合物，給予至患者的劑量可以是0.0001 mg/kg至100 mg/kg患者體重。該劑量可以在0.001 mg/kg患者體重與50 mg/kg患者體重之間、在0.005 mg/kg患者體重與20 mg/kg患者體重之間、在0.01 mg/kg患者體重與20 mg/kg患者體重之間、在0.02 mg/kg患者體重與10 mg/kg患者體重之間、在0.05mg/kg患者體重與5 mg/kg患者體重之間、在0.1 mg/kg患者體重與10 mg/kg患者體重之間、在0.1 mg/kg患者體重與8 mg/kg患者體重之間、在0.1 mg/kg患者體重與5 mg/kg患者體重之間、在0.1 mg/kg患者體重與2 mg/kg患者體重之間、在0.1 mg/kg患者體重與1 mg/kg患者體重之間。可以使用以千克(kg)計的患者體重乘以按mg/kg計的待給予的劑量，計算抗體軛合物的劑量。
可以重複本發明的抗體軛合物的劑量並且各次給予可以相隔少於1天、至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月、4個月、5個月、或至少6個月。在一些實施方式中，本發明的抗體軛合物每週給予兩次、每週給予一次、每兩週給予一次、每三週給予一次、每四週給予一次或較小頻率地給予。
特定患者的有效量可以根據如以下的因素改變：所治療的病症、患者的總體健康狀況、給予的方法、途徑和劑量和副作用的嚴重程度(參見，例如，Maynard等人，A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice [用於良好臨床實踐的SOP指南]，Interpharm Press [國際藥物出版社]，Boca Raton, Fla. [佛羅里達州波卡拉頓]，1996；Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice [良好實驗和良好臨床實踐], Urch Publ. [厄奇出版社]，倫敦，英國，2001)。
給予途徑可以是藉由例如局部或皮膚應用、藉由皮下、靜脈內、腹膜內、腦內、肌內、眼內、動脈內、腦脊內、病灶內給予進行的注射或輸注、或藉由緩釋系統或植入物(參見例如，Sidman等人，Biopolymers [生物聚合物] 22:547-556, 1983；Langer等人，J. Biomed. Mater. Res. [生物醫學材料研究雜誌] 15:167-277, 1981；Langer, Chem. Tech. [化學技術] 12:98-105, 1982；Epstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 82:3688-3692, 1985；Hwang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 77:4030-4034, 1980；美國專利號6,350,466和6,316,024)。必要時，組成物也可以包含增溶劑或用於減輕注射部位疼痛的局部麻醉藥如利多卡因，或兩者。此外，也可以採用肺部給予，例如藉由使用吸入器或霧化器以及具有霧化劑的配製物。參見例如，美國專利號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，將該等專利中的每一個藉由引用以其整體併入本文。
用於與第二治療劑，例如細胞因子、類固醇、化學治療劑、抗生素或放射(如全身放射治療(TBI))共同給予或治療的方法係本領域已知的(參見例如，Hardman等人，(編輯) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics [古德曼 吉爾曼治療學的藥理基礎]，增刊第10版，McGraw-Hill [麥格勞-希爾集團], 紐約，紐約州；Poole和Peterson (編輯) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach [藥物治療學高級實踐：實踐方法], Lippincott, Williams & Wilkins [利平科特 威廉姆斯和威爾金斯出版社]，Phila., Pa. [賓夕法尼亞州費城]；Chabner和Longo (編輯) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy [癌症化學療法和生物療法], Lippincott, Williams & Wilkins [利平科特 威廉姆斯和威爾金斯出版社]，Phila., Pa. [賓夕法尼亞州費城])。治療劑的有效量可以將症狀減少至少10%；至少20%；至少約30%；至少40%、或至少50%。
可以與本發明的抗體軛合物組合給予的另外療法可以與本發明的抗體軛合物相隔少於5分鐘、相隔少於30分鐘、相隔1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔約12小時至18小時、相隔18小時至24小時、相隔24小時至36小時、相隔36小時至48小時、相隔48小時至52小時、相隔52小時至60小時、相隔60小時至72小時、相隔72小時至84小時、相隔84小時至96小時、或相隔96小時至120小時進行給予。兩種或更多種療法可以在同一患者訪視中給予。
本發明提供了用於向有需要的受試者單獨或與其他療法組合給予包含本發明的抗體軛合物的藥物組成物的方案。本發明的組合療法的療法可以同時或依序給予至受試者。本發明的組合療法的療法也可以循環給予。循環療法涉及給予第一療法一段時間，隨後給予第二療法一段時間並重複這種依序給予，即，該循環，以減少對一種療法(例如藥劑)的耐藥性形成，以避免或減少一種療法(例如藥劑)的副作用和/或以改善療法的功效。
本發明的組合療法的療法可以並行給予至受試者。
術語「並行」不限於在完全相同的時間給予療法，而是意指將包含抗體或其片段的藥物組成物以這樣的順序並在這樣的時間間隔內給予至受試者，該順序和該時間間隔使得本發明的抗體或抗體軛合物可以與一種或多種其他療法一起發揮作用，以提供與如果另外給予它們相比增加的益處。例如，可以將每種療法在相同的時間或以任何次序依序在不同的時間點給予至受試者；然而，如果不在相同的時間給予，則它們應當在時間上充分接近地給予，從而以提供所期望的治療效果。可以將每種療法以任何適當的形式和藉由任何合適的途徑分別給予至受試者。在各種實施方式中，將療法相隔少於5分鐘、相隔少於15分鐘、相隔少於30分鐘、相隔少於1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔24小時、相隔48小時、相隔72小時、或相隔1週給予至受試者。在其他實施方式中，將兩種或更多種療法在同一患者訪視中給予。
組合療法可以在相同的藥物組成物中給予至受試者。可替代地，組合療法的治療劑可以在單獨的藥物組成物中並行給予至受試者。治療劑可以藉由相同或不同給予途徑給予至受試者。
應理解，本文描述的實例和實施方式僅用於舉例說明目的，其各種修飾或改變對於熟悉該項技術者將是明瞭的，並包括在本申請的精神和範圍內和所附申請專利範圍的範圍內。實例 實例 1 ：抗 cKIT ADC 的產生 具有或不具有位點特異性半胱胺酸突變的抗 cKit 抗體和抗體片段的製備
人抗cKIT抗體和抗體片段如先前在WO 2014150937和WO 2016020791中所述那樣產生。
從在基於噬菌體展示的篩選中分離的載體擴增編碼抗cKit抗體的重鏈和輕鏈的可變區的DNA，並且將該DNA選殖到含有人IgG1重鏈和人κ輕鏈或λ輕鏈的恒定區的哺乳動物表現載體中。載體含有CMV啟動子和針對重鏈的訊息肽(MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO: 149)和針對輕鏈的MSVLTQVLALLLLWLTGTRC(SEQ ID NO: 150)，以及用於在細菌宿主(例如大腸桿菌DH5α細胞)中擴增DNA、在哺乳動物細胞(例如HEK293細胞)中暫態表現，或穩定轉染到哺乳動物細胞(例如CHO細胞)中的適當訊號和選擇序列。為了引入Cys突變，使用設計用於取代重鏈或輕鏈編碼序列的恒定區中的某一位點處的單一Cys殘基的寡核苷酸進行定點誘變PCR。Cys取代突變的實例係重鏈的E152C或S375C；κ輕鏈的E165C或S114C；或λ輕鏈的A143C(所有EU編號)。在一些情況下，組合兩個或更多個Cys突變以製備具有多個Cys取代的抗體，例如HC-E152C-S375C、λLC-A143C-HC-E152C、κLC-E165C-HC-E152C或κL-S114C-HC-E152C(所有EU編號)。為了產生編碼抗體片段的質粒，用設計用於去除或修飾重鏈恒定區的一部分的寡核苷酸進行誘變PCR。例如，進行PCR以去除重鏈恒定區的殘基222-447(EU編號)，使得終止密碼子直接在殘基221(EU編號)之後編碼，以製備Fab片段的表現構建體。例如，進行PCR以去除重鏈恒定區的殘基233-447(EU編號)，使得終止密碼子直接在殘基232(EU編號)之後編碼，以製備包含IgG1鉸鏈的兩個Cys殘基的Fab'片段的表現構建體。
藉由使用如前所述的暫態轉染方法共轉染重鏈和輕鏈質粒，在293 FreestyleTM 細胞中表現抗cKit抗體、抗體片段和Cys突變抗體或抗體片段(Meissner等人，Biotechnol Bioeng. [生物技術與生物工程]75:197-203 (2001))。使用適當的樹脂如蛋白A、蛋白G、Capto-L或LambdaFabSelect樹脂，藉由標準親和層析法從細胞上清液中純化表現的抗體。可替代地，藉由將重鏈載體和輕鏈載體共轉染到CHO細胞中，在CHO中表現抗cKit抗體、抗體片段和Cys突變抗體或抗體片段。對細胞進行選擇，並且然後在針對抗體產生優化的條件下培養穩定轉染的細胞。如上所述從細胞上清液中純化抗體。抗 cKit 抗體和抗體片段的還原、再氧化和與毒素的軛合
使用先前(例如，在WO 2014124316、WO 2015138615、Junutula JR等人，Nature Biotechnology [自然生物技術] 26:925-932 (2008)中)描述的方法將由用於對抗體或抗體片段上的硫醇基團(Cys側鏈)反應的反應性部分(例如馬來醯亞胺基團)、如所述的接頭和功能部分(如澳瑞司他汀或其他毒素)組成的化合物與抗體中天然的Cys殘基或工程化到抗體中的Cys殘基軛合。
因為在哺乳動物細胞中表現的抗體中的工程化Cys殘基在生物合成期間藉由加合物(二硫化物)如麩胱甘肽 (GSH)和/或半胱胺酸修飾(Chen等人 2009)，所以最初表現的經修飾的Cys對硫醇反應性試劑(如馬來醯亞胺基或溴乙醯胺或碘乙醯胺基團)不起反應。為了軛合工程化的Cys殘基，需要藉由還原二硫化物除去麩胱甘肽 或半胱胺酸加合物，這通常需要還原表現的抗體中的所有二硫化物。因為抗體和抗體片段中的天然Cys殘基通常與抗體或抗體片段中的其他Cys殘基形成二硫鍵，所以它們也對硫醇反應性試劑不起反應，直到二硫化物被還原。二硫化物的還原可以藉由首先將抗體暴露於還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)、半胱胺酸或三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP-HCl)來完成。視情況，可以去除還原劑以允許再氧化抗體或抗體片段的所有天然二硫鍵，從而恢復和/或穩定化功能性抗體結構。
在抗體或抗體片段僅在工程化Cys殘基處軛合的情況下，為了還原天然二硫鍵和一個或多個工程化Cys殘基的半胱胺酸或GSH加合物之間的二硫鍵，將新鮮製備的DTT添加至純化的Cys突變抗體中，至最終濃度為10 mM或20 mM。在將抗體與DTT在37o C下孵育1小時後，將混合物用PBS透析3天，每天更換緩衝液以除去DTT並再次氧化天然二硫鍵。藉由反相HPLC監測再氧化過程，該反相HPLC能夠將抗體四聚體與各個重鏈和輕鏈分子分離。在加熱至80o C的PRLP-S 4000A柱(50 mm×2.1 mm，安捷倫(Agilent))上分析反應物，並且藉由含有0.1% TFA的30%-60%乙腈的水溶液的線性梯度進行柱洗脫，流速為1.5 ml/min。在280 nm處監測來自柱的蛋白質的洗脫。使透析繼續直至再氧化完成。再氧化恢復鏈內和鏈間二硫化物，而透析允許與新引入的一個或多個Cys殘基連接的半胱胺酸和麩胱甘肽 透析掉。再氧化後，將含馬來醯亞胺的化合物以典型地為1.5 : 1、2 : 1、或5 : 1的與工程化Cys的比率添加至在PBS緩衝液(pH 7.2)中的再氧化抗體或抗體片段中，並且進行孵育1小時。典型地，藉由標準方法在蛋白A或其他適當的樹脂上純化除去過量的游離化合物，然後將緩衝液更換成PBS。
可替代地，使用樹脂上方法還原並再氧化具有工程化Cys位點的抗體或抗體片段。將蛋白A瓊脂糖珠(每10 mg抗體1 ml)在PBS(無鈣或鎂鹽)中平衡，並且然後以分批模式添加至抗體樣品中。藉由將850 mg半胱胺酸HCl溶解在10 ml藉由將3.4 g NaOH添加至250 ml 0.5 M磷酸鈉 pH 8.0中製備的溶液中製備0.5 M半胱胺酸原液，並且然後將20 mM半胱胺酸添加至抗體/珠中，並且在室溫下輕輕混合30-60分鐘。將珠載入到重力柱上並且在不到30分鐘內用50床體積的PBS洗滌。然後用重懸於一個床體積的PBS中的珠對柱封頂。為了調節再氧化速率，視情況添加50 nM至1 μM氯化銅。藉由以下方式監測再氧化過程：藉由取出樹脂的小測試樣品、在IgG洗脫緩衝液(賽默公司(Thermo))中洗脫、並如上所述藉由RP-HPLC分析。一旦再氧化進行到所期望的完全性，可以藉由添加相對於工程化半胱胺酸2-3莫耳過量的化合物立即引發軛合，並且使混合物在室溫下反應5-10分鐘，然後用至少20個柱體積的PBS洗滌柱。用IgG洗脫緩衝液洗脫抗體軛合物，並且用0.1體積0.5 M磷酸鈉pH 8.0中和，並且將緩衝液更換成PBS。在一些情況下，不是在樹脂上引發與抗體的軛合，而是用至少20個柱體積的PBS洗滌柱，並且用IgG洗脫緩衝液洗脫抗體並用pH 8.0的緩衝液中和。然後將抗體用於軛合反應或快速冷凍以備將來使用。
在一些情況下，在不存在工程化Cys殘基的情況下，或者在也引導與工程化Cys殘基的軛合的同時，期望與天然Cys殘基，如通常形成重鏈與輕鏈鏈間二硫鍵的那些Cys殘基和抗體鉸鏈區中通常形成重鏈與重鏈鏈間二硫鍵的Cys殘基軛合。在該等情況下，藉由向二硫鍵添加5倍過量的TCEP來還原抗體或抗體片段，並且將樣品在37o C下孵育1小時。然後將樣品立即軛合或在＜-60o C下冷凍以備將來軛合。將含馬來醯亞胺的化合物以典型地2 : 1的與Cys殘基的比率添加至在PBS緩衝液(pH 7.2)中的抗體或抗體片段中，並且進行孵育1小時。典型地，藉由脫鹽柱除去過量的游離化合物，之後將緩衝液更大量地更換成PBS。由全長抗體產生抗體片段
在一些情況下，藉由如上所述遺傳操縱抗體重鏈編碼序列，使得表現產物係抗體片段，來產生抗體片段。在其他情況下，藉由酶消化全長抗體產生抗體。
為了產生包含起始抗體的殘基1-222(EU編號)的Fab片段，根據製造商的方案用固定的木瓜蛋白酶樹脂(賽默飛世爾科技公司(ThermoFisher Scientific))處理完整抗體。簡而言之，藉由在消化緩衝液中平衡新鮮溶解的20 mM半胱胺酸-HCl以調節至pH 7.0來製備固定化木瓜蛋白酶樹脂。將抗體調節至大約10 mg/ml並將緩衝液交換成消化緩衝液，並且以4 mg IgG/ml樹脂的比率添加至樹脂中並在37o C下孵育5-7小時。然後除去樹脂，並且藉由適當的親和樹脂純化抗體片段，例如藉由與蛋白A樹脂結合將完整的IgG和Fc片段與Fab片段分離，或藉由尺寸排阻層析法進行分離。
為了產生包含起始抗體的殘基1-236(EU編號)的F(ab')2 片段，用蛋白水解酶處理完整抗體。簡而言之，將抗體在PBS中以大約10 mg/ml製備。將酶以1 : 100重量/重量比添加，並且在37o C下孵育2小時。藉由適當的親和樹脂純化抗體片段，例如藉由與蛋白A樹脂結合將完整的IgG和Fc片段與Fab'片段分離，或藉由尺寸排阻層析法進行分離。抗 cKit- 毒素抗體和抗體片段軛合物的特性
分析抗體和抗體片段軛合物以確定軛合的程度。從針對還原和去糖基化(適當時)樣品的LC-MS數據外推化合物對抗體比率。LC/MS允許定量軛合物樣品中連接至抗體的接頭-有效負載(化合物)的平均分子數。高壓液相層析法(HPLC)將抗體分離成輕鏈和重鏈，並且在還原條件下，根據每條鏈的接頭-有效負載基團的數量分離重鏈(HC)和輕鏈(LC)。質譜數據能夠鑒定混合物中的組分種類，例如LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。根據LC和HC鏈上的平均負載，可以計算抗體軛合物的平均化合物對抗體比率。給定軛合物樣品的化合物對抗體比率表示與含有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體抗體連接的化合物(接頭-有效負載)分子的平均數。
使用分析型尺寸排阻層析法(AnSEC)在Superdex 200 10/300 GL(GE醫療集團(GE Healthcare))和/或蛋白質KW-803 5 µm 300×8 mm(昭和電工公司(Shodex))柱上概要分析軛合物；基於分析型尺寸排阻層析法分析聚集性。示例性抗 cKIT Fab- 毒素軛合物的製備
為了產生抗cKIT Fab'-毒素DAR4軛合物或抗Her2 Fab-毒素DAR4對照軛合物，用蛋白水解酶消化50 mg全長IgG(WT，未引入半胱胺酸)。在Superdex-S200(GE醫療集團)柱上藉由SEC純化F(ab')2 片段。可替代地，為了產生抗HER2對照軛合物或抗cKit Fab'-毒素DAR4軛合物，將編碼Fab' HC的載體與編碼Fab' LC的載體共轉染在CHO中。藉由在蛋白G樹脂上捕獲來純化表現的Fab'。F(ab')2 或Fab'藉由添加TCEP(相對於鏈間二硫化物5倍過量)進行還原，並且立即與本發明化合物(相對於游離Cys殘基2.5倍過量)反應。藉由RP-HPLC監測反應，並且添加另外的1x當量化合物直至反應完成。藉由PD10脫鹽柱(GE醫療集團)除去游離化合物。藉由實驗確定DAR ≥ 3.9。在所提供的實例中進一步研究的特異性軛合物列於表2中。
為了產生抗cKIT Fab-毒素DAR2軛合物，將編碼具有引入的Cys殘基的Fab HC(根據EU編號具有E152C的HC 1-221)的載體與編碼具有引入的Cys殘基(根據EU編號的κLC K107C、κLC S114C、或κLC E165C)的Fab LC的載體共轉染在HEK293中。為了產生抗Her2 Fab-毒素DAR2軛合物，將編碼具有引入的Cys殘基的Fab HC(根據EU編號具有E152C和C末端His6 標籤(SEQ ID NO: 151)的HC 1-222)的載體與編碼具有引入的Cys殘基(根據EU編號的κLC K107C、κLC S114C、或κLC E165C)的Fab LC的載體共轉染在HEK293中。藉由在Capto-L樹脂(GE醫療集團)上捕獲並用標準IgG洗脫緩衝液(賽默公司)洗脫來純化表現的Fab。使用Amicon ultra裝置將Fab緩衝液更換成PBS。將Fab用DTT還原並且在室溫下再氧化。在鏈間二硫鍵重新形成後，將Fab與化合物6(相對於游離Cys殘基3倍過量)軛合。使反應在室溫下進行30 min，並且藉由RP-HPLC監測，在310 nm處檢測。將軛合的Fab在蛋白A(抗her2)或capto-L(抗cKit)樹脂上純化，並且用PBS + 1% Triton X-100洗滌，並用大量的PBS洗滌，然後在IgG洗脫緩衝液中洗脫。然後使用Amicon ultra裝置將Fab緩衝液更換成PBS。在所提供的實例中進一步研究的特異性軛合物列於下表2中，具有實驗確定的DAR值。
為了產生抗cKIT F(ab')2 -毒素DAR2軛合物，將編碼具有引入的Cys殘基(根據EU編號的E152C和S375C)的HC的載體與編碼Fab LC的載體共轉染在CHO中。為了產生抗Her2 F(ab')2 -毒素DAR2對照軛合物，將編碼具有引入的Cys殘基(根據EU編號的E152C和S375C)的HC的載體與編碼Fab LC的載體共轉染在HEK293中。藉由在蛋白A或mabselectsure樹脂(GE醫療集團)上捕獲並用標準IgG洗脫緩衝液(賽默公司)洗脫來純化表現的IgG。將全長IgG在室溫下用DTT還原，並且在如藉由RP-HPLC監測除去DTT後再氧化。然後用蛋白水解酶消化再氧化的IgG以產生F(ab')2 片段。對於抗cKIT片段，使用Amicon ultra裝置將F(ab')2 緩衝液更換成PBS。對於抗HER2片段，藉由製備型HIC富集F(ab')2 級分，並且然後使用Amicon ultra裝置將緩衝液更換成PBS。使F(ab')2 與化合物(LP1 )或化合物(LP2 )(相對於游離Cys殘基4倍過量)軛合。使反應在室溫下進行30 min，並且藉由RP-HPLC監測，在310 nm處檢測。將軛合的F(ab')2 在Capto-L樹脂上純化(抗cKit抗體3)，並且用PBS + 1% Triton X-100洗滌，並用大量的PBS洗滌，然後在IgG洗脫緩衝液中或藉由製備型SEC洗脫(抗her2和抗cKIT抗體4)。然後使用Amicon Ultra裝置濃縮F(ab')2 並將緩衝液更換成PBS。在所提供的實例中進一步研究的特異性軛合物列於下表2中，具有實驗確定的DAR值。
[ 表 2]. 示例性抗cKIT或對照軛合物
Figure 108121072-A0304-0002
 實例 2 ：用於結合測定的人、食蟹猴、小鼠和大鼠 cKIT 細胞外結構域蛋白，以及 cKIT 亞結構域 1-3 和 4-5 的產生
基於來自GenBank或Uniprot數據庫的胺基酸序列，基因合成了人、小鼠和大鼠cKIT細胞外結構域(ECD)(參見下表3)。基於使用來自各種食蟹猴組織的mRNA產生的胺基酸序列資訊，基因合成了食蟹猴cKIT和1個ECD cDNA模板(例如Zyagen Laboratories；下表4)。將所有合成的DNA片段選殖到合適的表現載體中，例如，基於hEF1-HTLV的載體(pFUSE-mIgG2A-Fc2)，該載體具有C末端標籤以允許純化。[ 表 3] 人、小鼠、大鼠 cKIT 構建體的序列
Figure 108121072-A0304-0003
 [ 表 4] 食蟹猴 cKIT 蛋白的序列
Figure 108121072-A0304-0004
 重組 cKIT ECD 蛋白的表現
將期望的cKIT重組蛋白在先前適於懸浮培養的HEK293衍生細胞系(293FS)中表現，並且在無血清培養基FreeStyle-293(吉博克公司(Gibco)，目錄號12338018)中生長。將小規模和大規模蛋白質產生均經由暫態轉染進行，並且在多個搖瓶(Nalgene)中進行，每個高達1 L，使用293Fectin®(生命技術公司(Life Technologies)，目錄號12347019)作為質粒載體。將總DNA和293Fectin以1 : 1.5(w : v)的比率使用。DNA對培養物的比率為1 mg/L。將細胞培養物上清液在轉染後3-4天收穫，離心並無菌過濾，之後進行純化。加標籤的 EDC 蛋白純化
將重組的加Fc標籤的cKIT細胞外結構域蛋白(例如，人cKIT ECD-Fc、人cKIT(ECD亞結構域1-3、4-5)-Fc、食蟹猴cKIT-mFc、大鼠cKIT-mFc、小鼠cKIT-mFc)從細胞培養上清液中純化。使澄清的上清液通過已用PBS平衡的蛋白A Sepharose®柱。在洗滌至基線後，將結合的物質用Pierce Immunopure®低pH洗脫緩衝液或100 mM甘胺酸(pH 2.7)洗脫，並且立即用1/8洗脫體積的1 M Tris pH 9.0中和。如果需要，使用具有10 kD或30 kD標稱分子量截留值的Amicon® Ultra 15 mL離心濃縮器濃縮彙集的蛋白質。然後使用Superdex® 200 26/60柱藉由SEC純化彙集物以除去聚集體。然後藉由SDS-PAGE和SEC-MALLS(多角度雷射散射)表徵純化的蛋白質。使用藉由Vector NTI從序列計算的理論吸收係數，藉由280 nm處的吸光度測定濃度。實例 3 ： cKIT Fab 與 cKIT ECD 亞結構域的結合
為了幫助確定cKIT抗體的結合位點，將人cKIT ECD分成亞結構域1-3(配位基結合結構域)和亞結構域4-5(二聚化結構域)。為了確定結合哪個亞結構域，採用夾心ELISA測定。將在1X磷酸鹽緩衝鹽水中稀釋的1 μg/ml ECD(對應於cKIT亞結構域1-3、亞結構域4-5或全長cKIT ECD)包被在96孔Immulon® 4-HBX平板上(賽默科技公司(Thermo Scientific)目錄號3855，伊利諾州羅克福德(Rockford, IL))並且在4o C下孵育過夜。將板用洗滌緩衝液(具有0.01% 吐溫-20(伯樂公司(Bio-Rad)101-0781)的1X磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))洗滌三次。將板用在1XPBS中稀釋的280 μl/孔3%牛血清白蛋白在室溫下封閉2小時。將板用洗滌緩衝液洗滌三次。在洗滌緩衝液中在2 μg/ml下以5倍稀釋度針對8個點製備抗體，並且將該等抗體以100 μl/孔一式三份添加至ELISA板中。將板在室溫下、在以200 rpm振盪的軌道式振盪器上孵育1小時。用洗滌緩衝液將測定板洗滌三次。將二抗F(ab')2 片段山羊抗人IgG(H+L)(傑克森免疫研究公司(Jackson Immunoresearch)目錄號109-036-088，賓夕法尼亞州西格羅夫(West Grove, PA))在洗滌緩衝液中以1 : 10,0000製備，並且以100 µl/孔添加至ELISA板中。將板與二抗一起在室溫下孵育1小時，在軌道振盪器上以200 rpm振盪。用洗滌緩衝液將測定板洗滌三次。為了形成ELISA訊號，將100 μl/孔的Sure blue®TMB底物(KPL目錄號52-00-03，馬里蘭州蓋瑟斯堡(Gaithersburg, MD))添加至板中，並且在室溫下孵育10分鐘。為了終止反應，向每個孔中添加50 μl的1 N鹽酸。使用分子儀器公司(Molecular Devices) SpectraMax® M5板讀出器在450 nm下測量吸光度。為了確定每種抗體的結合應答，對光密度測量值求平均，產生標準差值並使用Excel作圖。單獨的抗cKIT抗體與cKIT的結合特徵可以在表6中找到。實例 4 ： cKIT 抗體的親和力測量
使用Biacore® 2000儀器(GE醫療集團，賓夕法尼亞州匹茲堡市(Pittsburgh, PA))和CM5感測器晶片，使用SPR技術測定抗體對cKIT種類直向同源物以及人cKIT的親和力。
簡而言之，使用補充有2% Odyssey®封閉緩衝液(Li-Cor Biosciences，內布拉斯加州林肯(Lincoln, NE))的HBS-P(0.01 M HEPES，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.005%表面活性劑P20)作為所有實驗的運行緩衝液。藉由響應單位(RU)測量固定化水平和分析物相互作用。進行預試驗以測試和證實固定化抗人Fc抗體(目錄號BR100839，GE醫療集團，賓夕法尼亞州匹茲堡市)和捕獲測試抗體的可行性。
對於動力學測量，進行實驗，其中經由固定化的抗人Fc抗體將抗體捕獲到感測器晶片表面，並且測定cKIT蛋白在游離溶液中結合的能力。簡而言之，將pH 5下的25 μg/ml抗人Fc抗體藉由胺偶聯固定化在CM5感測器晶片上，在兩個流動池上的流速為5 μl/min，至達到10,500 RU。然後以10 μl/ min注射0.1-1 μg/ml的測試抗體，持續1分鐘。捕獲的抗體水平通常保持在200 RU以下。隨後，將3.125-50 nM的cKIT受體細胞外結構域(ECD)以2倍系列稀釋，並且以40 μl/min的流速在參比流動池和測試流動池上注射3分鐘。下面列出了測試的ECD表(表5)。跟蹤ECD結合的解離10分鐘。在每個注射循環後，將晶片表面用3 M MgCl2 以10 µl/min再生30秒。所有實驗均在25°C下進行，並且響應數據用簡單的1 : 1交互作用模型全面擬合(使用Scrubber 2 ®軟體版本2.0b(BioLogic軟體))以獲得締合速率(ka )、解離速率(kd )和親和力(KD )。表6列出了所選擇的抗cKIT抗體的結構域結合和親和力。[ 表 5] cKIT ECD 同種型和來源
Figure 108121072-A0304-0005
 [ 表 6]- 抗體親和力和交叉反應性
Figure 108121072-A0304-0006
 實例 5 藉由 cKIT ADC 進行的體外人 HSC 細胞殺傷測定 體外 HSC 生活力測定
從HemaCare(目錄號M001F-GCSF-3)獲得人動員的外周血造血幹細胞(HSC)。將每個約1百萬個細胞的小瓶解凍並且稀釋到10 ml的1X HBSS中並以1200 rpm離心7分鐘。將細胞沈澱重懸於18 ml含有三種生長三級的生長培養基中(StemSpan SFEM(幹細胞技術有限公司(StemCell Technologies)，目錄號09650)，具有各50 ng/ml的TPO(R＆D Systems，目錄號288-TP)、Flt3配位基(生命技術公司，目錄號PHC9413)、和IL-6(生命技術公司，目錄號PHC0063)，補充有胺基酸(吉博克公司，目錄號10378-016))。
將測試試劑一式兩份地稀釋到384孔黑色測定板中，終體積為5 μl，從10 μg/ml開始並且使用1 : 3系列稀釋度。將來自上面的細胞以45 μl的最終體積添加至每個孔中。將細胞在37°C和5%氧氣下孵育7天。在培養結束時，藉由將測定板以1200 rpm離心4分鐘來收穫細胞用於染色。然後吸出上清液並且將細胞洗滌並轉移到不同的384孔板(萊娜第一生化有限公司(Greiner Bio-One)TC處理的黑色透明平板，目錄號781092)。
對於人細胞測定，將每個孔用抗CD34-PerCP(貝克頓-迪金遜公司(Becton Dickinson)，目錄號340666)和抗CD90-APC(貝克頓-迪金遜公司，目錄號559869)染色、洗滌，並重懸於FACS緩衝液中至終體積為50 μl。然後在貝克頓-迪金遜公司Fortessa流式細胞儀上分析細胞並且進行定量分析。
如在該測定中確定的，識別cKIT的抗體和抗體片段的毒素軛合物殺傷HSC。藉由FACS定量細胞顯示用抗cKIT-毒素軛合物處理的孔中的活細胞少於用PBS處理或用抗體或抗體片段的同種型對照毒素軛合物處理的對照孔中的活細胞。數據示出在圖1中並匯總在表7中。本文使用的命名約定係J＃，對應於表2中描述的特定軛合物編號。[ 表 7]. 在抗 -cKIT Fab- 毒素軛合物處理後的細胞生活力
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 實例 6 對人肥大細胞去顆粒的體外測定
使用來自動員的外周血的CD34+ 先驅細胞產生成熟肥大細胞。將CD34+ 細胞在補充有以下的StemSpan SFEM(幹細胞技術有限公司)中培養：重組人幹細胞因子(rhSCF，50 ng/ml，吉博克公司)、重組人白介素6(rhIL-6，50 ng/ml，吉博克公司)、重組人IL-3(30 ng /ml，派普泰克公司(Peprotech))、GlutaMAX(2 nM，吉博克公司)、青黴素(100 U/ml，海選殖公司(Hyclone))和鏈黴素(100 μg/ml，海選殖公司)。僅在培養的第一週期間添加重組hIl-3。第3週後，每週用含有rhIL-6(50 ng/ml)和rhSCF(50 ng/ml)的新鮮培養基更換一半培養基。藉由高親和力IgE受體(FCεRI，eBioscience)和CD117(BD)的表面染色評價成熟的肥大細胞純度。使用在培養的第8週與第12週之間的細胞。
將衍生的肥大細胞洗滌一次以除去SCF，並且將所需量的細胞在含有rhIL-6(50 ng/ml)、有或沒有rhSCF(50 ng/ml)的肥大細胞培養基中孵育過夜。作為肥大細胞去顆粒的陽性對照，將一部分細胞用人骨髓瘤IgE(100 ng/ml，EMD密理博公司(EMD Millipore))敏化。第二天，在補充有0.04%牛血清白蛋白(BSA，西格瑪公司)的HEPES去顆粒緩衝液(10 mM HEPES、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、0.4 mM磷酸氫二鈉、5.6 mM葡萄糖，pH調節為7.4並且與1.8 mM氯化鈣和1.3 mM硫酸鎂混合)中製備抗cKIT抗體或其抗體片段或毒素軛合物、小鼠單株抗人IgG1(Fab特異性，西格瑪公司)、山羊抗人IgE(艾博抗公司(Abcam))和化合物48/80(西格瑪公司)稀釋液。將測試試劑和抗IgG1在V底384孔測定板中混合在一起，同時單獨測試抗IgE和化合物48/80。將測定板在37°C下孵育30 min。在孵育期間，用HEPES去顆粒緩衝液 + 0.04% BSA洗滌細胞3次以除去培養基和未結合的IgE。將細胞重懸於HEPES去顆粒緩衝液 + 0.04% BSA中，並且以每孔3000個細胞接種在測定板中，最終反應體積為50 μl。用IgE敏化的細胞僅與抗IgE一起用作脫顆粒的陽性對照。將測定板在37°C下孵育30 min以發生去顆粒。在該孵育期間，將對硝基-N -乙醯基-β-ᴅ-葡糖胺(pNAG，西格瑪公司)緩衝液藉由在檸檬酸鹽緩衝液(40 mM檸檬酸、20 mM磷酸氫二鈉，pH 4.5)中超音波處理3.5 mg/ml pNAG來製備。藉由將20 μl細胞上清液與40 μl pNAG溶液在平底384孔板中混合來測量β-己糖胺酶釋放。將該板在37°C下孵育1.5小時，並且藉由添加40 μl終止溶液(400 mM甘胺酸，pH 10.7)終止反應。使用板讀出器在λ = 405 nm處讀出吸光度，其中參比濾光器在λ = 620 nm處。
表8中描述了肥大細胞去顆粒測定中使用的全長IgG對照。[ 表 8]. 肥大細胞去顆粒測定中使用的全長 IgG 對照
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 實例 7 對全長抗 cKIT 抗體及其 F(ab')2 和 Fab 片段進行的人肥大細胞去顆粒的體外測定
如實例6中所述，產生成熟肥大細胞並且用抗cKIT抗體和F(ab')2 和Fab片段測試。
如圖2A-2C中所示，全長抗cKIT抗體4和F(ab'4)2 片段在交聯時引起肥大細胞去顆粒，而在所有測試濃度下的Fab4(HC-E152C)片段沒有觸發肥大細胞去顆粒。圖2D-2F顯示全長抗cKIT抗體1和F(ab'1)2 片段在交聯時引起肥大細胞去顆粒，而在所有測試濃度下的Fab1(HC-E152C)片段沒有觸發肥大細胞去顆粒。圖2G-2I顯示全長抗cKIT抗體2和F(ab'2)2 片段在交聯時引起肥大細胞去顆粒，而在所有測試濃度下的Fab2(HC-E152C)片段沒有觸發肥大細胞去顆粒。圖2J-2L顯示全長抗cKIT抗體3和F(ab'3)2 片段在交聯時引起肥大細胞去顆粒，而在所有測試濃度下的Fab3(HC-E152C)片段沒有觸發肥大細胞去顆粒。這表明Fab片段甚至當結合並多聚化成較大的複合物(如在患者形成或具有預先存在的識別Fab片段的抗藥物抗體的情況下可以觀察到的)時也不會引起肥大細胞去顆粒。另一方面，當結合並多聚化成較大的複合物時，F(ab')2 確實引起水平與全長抗cKIT抗體類似的肥大細胞去顆粒。 實例 8 從小鼠宿主中體外消融人 HSC
為了評估測試試劑對人HSC的體內功效，從傑克遜實驗室(Jackson Laborator)購買用人CD34+ 細胞人源化的嚴重免疫受損的NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl /SzJ小鼠。藉由血液樣品的流式細胞術確定人類嵌合性百分比。為此，將血液用以下抗體染色：抗人CD45-e450(eBioscience，目錄號48-0459-42)、抗小鼠CD45-APC(貝克頓-迪金遜公司，目錄號559864)、抗人CD33-Pe(貝克頓-迪金遜公司，目錄號347787)、抗-人CD19-FITC(貝克頓-迪金遜公司，目錄號555422)和抗人CD3-PeCy7(貝克頓-迪金遜公司，目錄號557851)。一旦確認人類嵌合性，將人源化NSG小鼠腹膜內每天兩次(b.i.d)給予測試試劑藥物。給藥後重新評估人類嵌合性的程度。為了評估人HSC的存在或不存在，將小鼠安樂死並且將骨髓分離並用以下抗體染色：抗人CD45-e450(eBioscience，目錄號48-0459-42)、抗小鼠CD45-APC(B貝克頓-迪金遜公司，目錄號559864)、抗人CD34-PE(貝克頓-迪金遜公司，目錄號348057)、抗人CD38-FITC(貝克頓-迪金遜公司，目錄號340926)、抗人CD11b-PE(貝克頓-迪金遜公司，目錄號555388)、抗人CD33-PeCy7(貝克頓-迪金遜公司，目錄號333946)、抗人CD19-FITC(貝克頓-迪金遜公司，目錄號555412)和抗人CD3-PeCy7(貝克頓-迪金遜公司，目錄號557851)。將細胞群經由流式細胞術評估並且用FlowJo分析。
在一個特定實驗中，向小鼠每天兩次給予10 mg/kg抗cKIT軛合物J26、J29或J30或同種型對照軛合物J31，持續2天。在第21天對小鼠進行安樂死並且分析它們的骨髓。如圖3所示，用抗cKIT軛合物J26、J29或J30處理的小鼠顯示減少的人HSC(人CD45+、人CD34+、人CD38-)，而用同種型對照軛合物J31處理的小鼠顯示可變的嵌合性。
該實驗顯示抗cKit Fab'-毒素軛合物能夠從骨髓中消耗HSC。抗cKIT Fab'-澳瑞司他汀軛合物(例如，J26、J29、J30)能夠消融體內的人HSC。
除非另外定義，否則本文使用的技術術語和科學術語具有與熟悉本揭露所屬領域的技術人員通常理解的相同含義。
除非另外指明，否則沒有詳細地具體描述的所有方法、步驟、技術和操作可以並且已經按照本身已知的方式進行，這應是技術人員所清楚的。再次對例如本文提及的標準手冊和普通背景技術和其中引用的另外的參考文獻進行引用。除非另外指明，否則本文引用的每個參考文獻都藉由引用以其整體而併入。
本發明的申請專利範圍係非限制性的並且提供於下文中。
儘管本文已經詳細揭露了具體方面和申請專利範圍，但是這僅是出於說明的目的以舉例方式來進行的，並且這並不旨在對所附申請專利範圍的範圍或任何相應的未來申請的申請專利範圍主題的範圍加以限制。具體而言，本發明人考慮到，在不脫離如由申請專利範圍定義的本揭露的精神和範圍的情況下，可以對本揭露進行多種替代、改變和修飾。核酸起始材料、目的殖株或文庫類型的選擇被認為對於具有本文描述的方面的知識的熟悉該項技術者而言是常規的。其他方面、優點和修飾被認為落入下列申請專利範圍的範圍內。使用不超過常規的實驗，熟悉該項技術者應認識到或能夠確認本文描述的本發明的具體方面的很多等效物。此類等效物旨在為下列申請專利範圍所涵蓋。在今後提交的相應申請中重寫申請專利範圍的範圍可能是由於不同國家專利法的限制，而不應當被理解為放棄申請專利範圍的主題。
[圖 1A-1C ]示出了抗cKIT Fab'-DAR4軛合物樣品(對於軛合物細節參見表2)的子集以大致相等的效力體外殺傷人幹細胞和先驅細胞(cKIT+ /CD90+ 細胞)之線形圖。圖 1A 示出了來自J4(菱形)、J5(空心圓圈，短劃線)、J8(正方形)和J9(空心三角形，點劃線)之數據。圖 1B 示出了來自J10(空心正方形)和J11(圓圈)之數據。圖 1C 示出了相對於同種型對照抗HER2 Fab'-DAR4軛合物和未處理細胞(正方形，點劃線)之抗cKit Fab'1-DAR4和抗cKit Fab'2-DAR4軛合物：J10(菱形)、J15(圓圈)、J16(空心正方形)、J19(空心圓圈，短劃線)和J20(空心三角形)。
[圖 2A-2O ]係顯示體外人肥大細胞去顆粒測定的代表性結果之線形圖，該等測定使用人外周血HSC衍生的肥大細胞並且使用β-己糖胺酶釋放作為讀出(藉由基於620 nm處的參考吸光度進行基線摳出所得的405 nm處的吸光度評估)。此處示出的數據係在不存在SCF的情況下收集的。線形圖示出了當使用對抗體測試試劑(在x軸上滴定的)上的Fab部分特異的抗體使測試試劑交聯時，由以下各種濃度的抗體或抗體片段觸發的肥大細胞去顆粒水平：0.006 nM(三角形)；0.098 nM(菱形)；1.6 nM(圓圈)；25 nM(正方形)。對於參考，將單獨的交聯劑抗體繪製在每個圖上(空心菱形，短劃線)。圖 2A-2C 顯示全長抗cKIT抗體4(圖2A)和抗cKIT F(ab'4)2 片段(圖2B)在交聯時引起肥大細胞去顆粒，而在所有測試濃度下的抗cKIT Fab4(HC-E152C)片段沒有觸發肥大細胞去顆粒(圖2C)。圖 2D-2F 顯示全長抗cKIT抗體1(圖2D)和抗cKIT F(ab'1)2 片段(圖2E)在交聯時引起肥大細胞去顆粒，而在所有測試濃度下的抗cKIT Fab1(HC-E152C)片段沒有觸發肥大細胞去顆粒(圖2F)。圖 2G-2I 顯示全長抗cKIT抗體2(圖2G)和抗cKIT F(ab'2)2 片段(圖2H)在交聯時引起肥大細胞去顆粒，而在所有測試濃度下的抗cKIT Fab2(HC-E152C)片段沒有觸發肥大細胞去顆粒(圖2I)。圖 2J-2L 顯示全長抗cKIT抗體3(圖2J)和抗cKIT F(ab'3)2 片段(圖2K)在交聯時引起肥大細胞去顆粒，而在所有測試濃度下的抗cKIT Fab3(HC-E152C)片段沒有觸發肥大細胞去顆粒(圖2L)。圖 2M-2O 係示出抗Her2抗體(圖2M)、抗Her2-F(ab')2 片段(圖2N)、或抗Her2-Fab(HC-E152C)片段(圖2O)在交聯時未引起肥大細胞去顆粒之線形圖。
[圖 3 ]係示出了使用抗cKit軛合物從小鼠宿主體內消融人HSC之點圖。
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Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 108121072-A0101-11-0002-1

Claims (39)

  1. 一種具有式 (I) 之軛合物或其藥學上可接受的鹽； A-(LB -(D)n )y 式 (I) 其中： A係特異性結合人cKIT的抗體片段； LB 係接頭； n係從1至10的整數； y係從1至10的整數，並且 D係選自式 (A) 之化合物的細胞毒性劑：
    Figure 03_image013
    式 (A) 其中： R1 係
    Figure 03_image015
    或
    Figure 03_image017
    ； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； 或者D係選自式 (B) 之化合物的細胞毒性劑：
    Figure 03_image493
    式 (B) 其中： R1 係
    Figure 03_image015
    或
    Figure 03_image017
    ； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 並且 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基。
  2. 如請求項1之軛合物，其中n係1、2、3、4、5、6、7或8。
  3. 如請求項1或2之軛合物，其中y係1、2、3或4。
  4. 如請求項1或2之軛合物，其中每個LB 獨立地選自可裂解接頭或不可裂解接頭。
  5. 如請求項1或2之軛合物，其中每個LB 係可裂解接頭。
  6. 如請求項1或2之軛合物，其中每個LB 係不可裂解接頭。
  7. 一種具有式 (E) 之結構的軛合物：
    Figure 03_image001
    式 (E) 其中： A表示特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')； y係從1至10的整數； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 或-X2 X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** ，其中** 指示與R114 的連接點； X1 係
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    或
    Figure 03_image089
    ，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點； X2 係
    Figure 03_image091
    、
    Figure 03_image093
    或
    Figure 03_image095
    ，其中** 指示與-NH-的連接點； X3 係
    Figure 03_image093
    或
    Figure 03_image095
    ，其中** 指示與-NH-的連接點； X4 係
    Figure 03_image097
    、
    Figure 03_image099
    、
    Figure 03_image101
    、
    Figure 03_image103
    、
    Figure 03_image105
    、
    Figure 03_image107
    、
    Figure 03_image109
    、
    Figure 03_image111
    、
    Figure 03_image113
    或
    Figure 03_image115
    ，其中* 指示連接點朝向R114 ； R114 係
    Figure 03_image273
    、
    Figure 03_image275
    、
    Figure 03_image277
    、
    Figure 03_image279
    、
    Figure 03_image281
    、-NR6 C(=O)CH2 -* 、-NHC(=O)CH2 -* 、-S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-(CH2 )2 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 C(=O)CH2 CH2 -* 、-NH-、-C(=O)-、-NHC(=O)-* 、-CH2 NHCH2 CH2 -* 、-NHCH2 CH2 -* 、-S-、
    Figure 03_image283
    、
    Figure 03_image285
    、
    Figure 03_image287
    、
    Figure 03_image289
    、
    Figure 03_image291
    、
    Figure 03_image293
    、
    Figure 03_image295
    、
    Figure 03_image297
    、
    Figure 03_image299
    、
    Figure 03_image301
    、
    Figure 03_image303
    、
    Figure 03_image305
    、
    Figure 03_image307
    、
    Figure 03_image309
    、
    Figure 03_image311
    、
    Figure 03_image313
    、
    Figure 03_image315
    、
    Figure 03_image317
    、
    Figure 03_image319
    、
    Figure 03_image321
    、或
    Figure 03_image323
    、
    Figure 03_image325
    ，其中* 指示與A的連接點； 每個R6 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； 每個R10 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl和-OH； 每個R11 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl、-NH2 、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-N(CH3 )2 、-CN、-NO2 和-OH； 每個R12 獨立地選自H、C1-6 烷基、氟、被-C(=O)OH取代的苄氧基、被-C(=O)OH取代的苄基、被-C(=O)OH取代的C1-4 烷氧基和被-C(=O)OH取代的C1-4 烷基； 每個R15 獨立地選自H、-CH3 和苯基； 每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，並且 每個p獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
  8. 如請求項7之軛合物，該軛合物選自
    Figure 03_image535
    ，
    Figure 03_image536
    以及
    Figure 03_image537
    ， 其中： A表示特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')，並且 y係從1至10的整數。
  9. 一種具有式 (G) 之結構的軛合物：
    Figure 03_image003
    式 (G) 其中： A表示特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')； y係從1至10的整數； R2 係H、C1 -C6 烷基、-C(=O)R3 、-(CH2 )m OH、-C(=O)(CH2 )m OH、-C(=O)((CH2 )m O)n R4 、-((CH2 )m O)n R4 或視情況被-CN、-C(=O)NH2 或1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R3 獨立地選自C1 -C6 烷基和視情況被1至5個羥基取代的C1 -C6 烷基； 每個R4 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； L1 係-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m NHC(=O)(CH2 )m -** 、-X3 C(=O)(CH2 )m -** 、-X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** 、-X2 X1 C(=O)((CH2 )m O)p (CH2 )m X4 (CH2 )m -** 或-X2 X1 C(=O)(CH2 )m X4 (CH2 )m -** ，其中** 指示與R114 的連接點； X1 係
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    或
    Figure 03_image089
    ，其中** 指示與-NH-或與X2 的連接點； X2 係
    Figure 03_image091
    、
    Figure 03_image093
    或
    Figure 03_image095
    ，其中** 指示與-NH-的連接點； X3 係
    Figure 03_image093
    或
    Figure 03_image095
    ，其中** 指示與-NH-的連接點； X4 係
    Figure 03_image097
    、
    Figure 03_image099
    、
    Figure 03_image101
    、
    Figure 03_image103
    、
    Figure 03_image105
    、
    Figure 03_image107
    、
    Figure 03_image109
    、
    Figure 03_image111
    、
    Figure 03_image113
    或
    Figure 03_image115
    ，其中* 指示連接點朝向R114 ； R114 係
    Figure 03_image273
    、
    Figure 03_image275
    、
    Figure 03_image277
    、
    Figure 03_image279
    、
    Figure 03_image281
    、-NR6 C(=O)CH2 -* 、-NHC(=O)CH2 -* 、-S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-(CH2 )2 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 S(=O)2 CH2 CH2 -* 、-NR6 C(=O)CH2 CH2 -* 、-NH-、-C(=O)-、-NHC(=O)-* 、-CH2 NHCH2 CH2 -* 、-NHCH2 CH2 -* 、    -S-、
    Figure 03_image283
    、
    Figure 03_image285
    、
    Figure 03_image287
    、
    Figure 03_image289
    、
    Figure 03_image291
    、
    Figure 03_image293
    、
    Figure 03_image295
    、
    Figure 03_image297
    、
    Figure 03_image299
    、
    Figure 03_image301
    、
    Figure 03_image303
    、
    Figure 03_image305
    、
    Figure 03_image307
    、
    Figure 03_image309
    、
    Figure 03_image311
    、
    Figure 03_image313
    、
    Figure 03_image315
    、
    Figure 03_image317
    、
    Figure 03_image319
    、
    Figure 03_image321
    、或
    Figure 03_image323
    、
    Figure 03_image325
    ，其中* 指示與A的連接點； 每個R6 獨立地選自H和C1 -C6 烷基； 每個R10 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl和-OH； 每個R11 獨立地選自H、C1 -C6 烷基、F、Cl、-NH2 、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-N(CH3 )2 、-CN、-NO2 和-OH； 每個R12 獨立地選自H、C1-6 烷基、氟、被-C(=O)OH取代的苄氧基、被-C(=O)OH取代的苄基、被-C(=O)OH取代的C1-4 烷氧基和被-C(=O)OH取代的C1-4 烷基； 每個R15 獨立地選自H、-CH3 和苯基； 每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，並且 每個p獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
  10. 如請求項9之軛合物，該軛合物選自
    Figure 03_image538
    ，
    Figure 03_image539
    以及
    Figure 03_image540
    ， 其中： A表示特異性結合人cKIT的抗體片段(例如Fab或Fab')，並且 y係從1至10的整數。
  11. 2和7至10中任一項之軛合物，其中該抗體片段特異性結合人cKIT的細胞外結構域(SEQ ID NO: 112)。
  12. 2和7至10中任一項之軛合物，其中該抗體片段特異性結合人cKIT的結構域1-3(SEQ ID NO: 113)中的表位。
  13. 2和7至10中任一項之軛合物，其中該抗體片段係Fab或Fab'。
  14. 2和7至10中任一項之軛合物，其中該抗體片段選自以下中的任一種： (1) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1(重鏈互補性決定區1)、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2(重鏈互補性決定區2)、和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3(重鏈互補性決定區3)；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 16的LCDR1(輕鏈互補性決定區1)、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2(輕鏈互補性決定區2)、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3(輕鏈互補性決定區3)； (2) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 4的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 5的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 19的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 21的LCDR3； (3) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 6的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 16的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3； (4) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 22的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3； (5) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 27的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 28的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 29的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 42的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 43的LCDR3； (6) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 30的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 31的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 29的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 45的LCDR3； (7) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 32的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 28的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 29的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 42的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 43的LCDR3； (8) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 33的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 34的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 35的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 46的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 43的LCDR3； (9) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 51的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 16的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3； (10) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 4的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 52的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 19的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 21的LCDR3； (11) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 6的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 51的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 16的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3； (12) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 53的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 22的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3； (13) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 60的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 61的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 62的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 75的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 76的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 77的LCDR3； (14) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 63的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 64的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 62的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 78的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 79的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 80的LCDR3； (15) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 61的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 62的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 75的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 76的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 77的LCDR3； (16) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 66的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 67的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 68的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 81的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 79的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 77的LCDR3； (17) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 86的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 87的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 88的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 101的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 102的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 103的LCDR3； (18) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 89的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 90的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 88的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 104的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 105的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 106的LCDR3； (19) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 91的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 87的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 88的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 101的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 102的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 103的LCDR3； (20) Fab或Fab'，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 92的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 93的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 94的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 107的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 105的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 103的LCDR3； (21) Fab或Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 10的重鏈可變區(VH)，和含有SEQ ID NO: 23的輕鏈可變區(VL)； (22) Fab或Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 36的VH，和含有SEQ ID NO: 47的VL； (23) Fab或Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 54的VH，和含有SEQ ID NO: 23的VL； (24) Fab或Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 69的VH，和含有SEQ ID NO: 82的VL； (25) Fab或Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 95的VH，和含有SEQ ID NO: 108的VL； (26) Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 14的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的輕鏈； (27) Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 40的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的輕鏈； (28) Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 58的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的輕鏈； (29) Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 73的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的輕鏈； (30) Fab'，其包含含有SEQ ID NO: 99的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的輕鏈； (31) Fab，其包含含有SEQ ID NO: 118的重鏈，和含有SEQ ID NO: 122的輕鏈； (32) Fab，其包含含有SEQ ID NO: 118的重鏈，和含有SEQ ID NO: 123的輕鏈； (33) Fab，其包含含有SEQ ID NO: 124的重鏈，和含有SEQ ID NO: 128的輕鏈； (34) Fab，其包含含有SEQ ID NO: 124的重鏈，和含有SEQ ID NO: 129的輕鏈； (35) Fab，其包含含有SEQ ID NO: 130的重鏈，和含有SEQ ID NO: 134的輕鏈； (36) Fab，其包含含有SEQ ID NO: 130的重鏈，和含有SEQ ID NO: 135的輕鏈； (37) Fab，其包含含有SEQ ID NO: 136的重鏈，和含有SEQ ID NO: 140的輕鏈； (38) Fab，其包含含有SEQ ID NO: 141的重鏈，和含有SEQ ID NO: 145的輕鏈； (39) Fab，其包含含有選自SEQ ID NO: 119、120或121的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈； (40) Fab，其包含含有選自SEQ ID NO: 125、126或127的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的胺基酸序列的輕鏈； (41) Fab，其包含含有選自SEQ ID NO: 131、132或133的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈； (42) Fab，其包含含有選自SEQ ID NO: 137、138或139的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的輕鏈；或 (43) Fab，其包含含有選自SEQ ID NO: 142、143或144的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的輕鏈。
  15. 2和7至10中任一項之軛合物，其中該抗體片段係人或人源化Fab或Fab'。
  16. 如請求項1或2之軛合物，其中該抗體片段係Fab'並且該接頭(LB )連接至該Fab'的鉸鏈區中的天然半胱胺酸殘基。
  17. 如請求項1或2之軛合物，其中該抗體片段包含至少一個引入到恒定區中的非天然半胱胺酸，並且該接頭(LB )連接至該非天然半胱胺酸。
  18. 如請求項7至10中任一項之軛合物，其中該抗體片段係Fab'並且R114 連接至該Fab'的鉸鏈區中的天然半胱胺酸殘基。
  19. 如請求項7至10中任一項之軛合物，其中該抗體片段包含至少一個引入到恒定區中的非天然半胱胺酸，並且R114 連接至該非天然半胱胺酸。
  20. 如請求項17中任一項之軛合物，其中該抗體片段包含在以下位置(所有位置根據EU編號)中的一個或多個處的半胱胺酸： (a) 重鏈的位置152， (b) κ輕鏈的位置114或165，或 (c) λ輕鏈的位置143。
  21. 2和7至10中任一項之軛合物，其中該軛合物的半衰期小於約24-48小時。
  22. 2和7至10中任一項之軛合物，其中該軛合物不誘導肥大細胞去顆粒。
  23. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至22中任一項之軛合物，及藥學上可接受的載劑。
  24. 如請求項23之藥物組成物，其進一步包含另一種治療劑。
  25. 如請求項23或24之藥物組成物，其中該組成物係凍乾物。
  26. 一種如請求項1至22中任一項之軛合物或如請求項23或24之藥物組成物之用途，其用於製造供調理造血幹細胞移植患者的藥物。
  27. 如請求項26之用途，其中該患者患有先天性免疫缺陷疾病、自體免疫疾病、造血障礙、先天性代謝異常、或先前已接受自體幹細胞移植治療。
  28. 如請求項27之用途，其中該造血障礙選自：急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病 (ALL)、急性單核細胞性白血病(AMoL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、骨髓增生性障礙、骨髓增生異常綜合症、多發性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、霍奇金氏病(Hodgkin disease)、再生障礙性貧血、單純紅血球形成不全、陣發性夜間血紅素尿、範可尼貧血(Fanconi anemi)、地中海重貧血症、鐮狀細胞貧血、嚴重合併性免疫缺失、偉－爾二氏症候群(Wiskott-Aldrich Syndrome)、噬血細胞性淋巴組織細胞增多症。
  29. 如請求項27之用途，其中該先天性代謝異常選自粘多醣貯積病、高歇氏病(Gaucher disease)、異染性白質失養症或腎上腺腦白質病。
  30. 如請求項26之用途，其中該患者患有選自以下的非惡性疾病或病症：嚴重再生障礙性貧血(SAA)、偉－爾二氏症候群、胡勒爾綜合症(Hurlers Syndrome)、FHL、CGD、柯士文綜合症(Kostmanns syndrome)、嚴重免疫缺乏症候群(SCID)、其他自體免疫疾病，如SLE、多發性硬化症、IBD、克羅恩氏病(Crolms Disease)、休格倫氏症候群(Sjogrens syndrome)、血管炎、狼瘡、重症肌無力、韋格納病(Wegeners disease)、先天性代謝異常和/或其他免疫缺陷。
  31. 如請求項26之用途，其中該患者患有選自以下的惡性疾病或病症：骨髓增生異常綜合症(MDS)、急性淋巴母細胞性白血病 (ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性單核細胞性白血病(AMoL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病(HCL)、T細胞幼淋巴細胞白血病(T-PLL)、大顆粒淋巴細胞白血病、成人T細胞白血病、先驅T細胞白血病/淋巴瘤、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、套膜細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、蕈樣真菌病、外周T細胞淋巴瘤非特指型、結節性硬化型霍奇金氏淋巴瘤、混合細胞亞型霍奇金氏淋巴瘤。
  32. 一種如請求項1至22中任一項之軛合物或如請求項23或24之藥物組成物之用途，其用於製造供在有需要的患者中消融造血幹細胞的藥物。
  33. 如請求項32之用途，其中該患者係造血幹細胞移植受者。
  34. 如請求項33之用途，其中在對該患者進行造血幹細胞移植之前給予該藥物。
  35. 一種抗體或抗體片段，其特異性結合人cKIT，其中該抗體或抗體片段選自以下中的任一種： (1) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1(重鏈互補性決定區1)、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2(重鏈互補性決定區2)、和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3(重鏈互補性決定區3)；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 16的LCDR1(輕鏈互補性決定區1)、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2(輕鏈互補性決定區2)、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3(輕鏈互補性決定區3)； (2) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 4的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 5的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 19的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 21的LCDR3； (3) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 6的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 16的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3； (4) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 22的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 18的LCDR3； (5) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 27的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 28的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 29的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 42的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 43的LCDR3； (6) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 30的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 31的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 29的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 45的LCDR3； (7) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 32的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 28的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 29的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 42的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 17的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 43的LCDR3； (8) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 33的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 34的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 35的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 46的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 20的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 43的LCDR3； (9) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 60的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 61的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 62的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 75的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 76的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 77的LCDR3； (10) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 63的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 64的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 62的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 78的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 79的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 80的LCDR3； (11) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 61的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 62的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 75的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 76的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 77的LCDR3； (12) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 66的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 67的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 68的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 81的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 79的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 77的LCDR3； (13) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 86的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 87的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 88的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 101的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 102的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 103的LCDR3； (14) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 89的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 90的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 88的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 104的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 105的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 106的LCDR3； (15) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 91的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 87的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 88的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 101的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 102的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 103的LCDR3； (16) 抗體或抗體片段，其包含 (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 92的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 93的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 94的HCDR3；和 (ii) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 107的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 105的LCDR2、和 (f) SEQ ID NO: 103的LCDR3； (17) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 10的重鏈可變區(VH)，和含有SEQ ID NO: 23的輕鏈可變區(VL)； (18) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 36的VH，和含有SEQ ID NO: 47的VL； (19) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 69的VH，和含有SEQ ID NO: 82的VL； (20) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 95的VH，和含有SEQ ID NO: 108的VL； (21) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 14的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的輕鏈； (22) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 40的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的輕鏈； (23) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 73的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的輕鏈； (24) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 99的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的輕鏈； (25) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 118的重鏈，和含有SEQ ID NO: 122的輕鏈； (26) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 118的重鏈，和含有SEQ ID NO: 123的輕鏈； (27) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 124的重鏈，和含有SEQ ID NO: 128的輕鏈； (28) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 124的重鏈，和含有SEQ ID NO: 129的輕鏈； (29) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 130的重鏈，和含有SEQ ID NO: 134的輕鏈； (30) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 130的重鏈，和含有SEQ ID NO: 135的輕鏈； (31) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 136的重鏈，和含有SEQ ID NO: 140的輕鏈； (32) 抗體或抗體片段，其包含含有SEQ ID NO: 141的重鏈，和含有SEQ ID NO: 145的輕鏈； (33) 抗體，其包含含有SEQ ID NO: 12的重鏈，和含有SEQ ID NO: 25的輕鏈； (34) 抗體，其包含含有SEQ ID NO: 38的重鏈，和含有SEQ ID NO: 49的輕鏈； (35) 抗體，其包含含有SEQ ID NO: 71的重鏈，和含有SEQ ID NO: 84的輕鏈；或 (36) 抗體，其包含含有SEQ ID NO: 97的重鏈，和含有SEQ ID NO: 110的輕鏈。
  36. 一種核酸，其編碼如請求項35之抗體或抗體片段。
  37. 一種載體，其包含如請求項36之核酸。
  38. 一種宿主細胞，其包含如請求項37之載體。
  39. 一種產生抗體或抗體片段之方法，該方法包括培養如請求項38之宿主細胞，並且從該培養中回收該抗體或抗體片段。
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