DE3240174A1

DE3240174A1 - Neue plasminogen-aktivatorderivate

Info

Publication number: DE3240174A1
Application number: DE19823240174
Authority: DE
Inventors: Taketoshi Kinoshita; Tsuguji Nakahara; Kimihiro Shimizu
Original assignee: Nippon Chemiphar Co Ltd
Current assignee: Nippon Chemiphar Co Ltd
Priority date: 1981-10-30
Filing date: 1982-10-29
Publication date: 1983-05-19
Also published as: SE8206173L; US4495285A; SE8206173D0; GB2110219B; SE457800B; FR2515684B1; GB2110219A; CA1203764A; BR8206347A; DE3240174C2; FR2515684A1; CH658669A5; US4495285B1; JPH0525470B2; JPS5896026A

Description

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80OO MÜNCHEN 22 MAXlMI UANSTPASSE 43

P 17 587

Neue Plasminogen-Aktivatorderivate

Die Erfindung betrifft neue Derivate von vom Menschen
stammenden, nicht-immunisierenden Plasminogen-Aktivatoren und insbesondere solche Derivate, die mindestens
ein Polyalkylenglykol, das mit mindestens einem Kupplungsmittel an Aminosäure-Seitenketten eines Plasminogen-Aktivators des oben beschriebenen Typs verbunden ist, umfassen, wobei das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20 000 besitzt und wahlweise eine oder mehrere Alkyl-, und/oder Alkanoylgruppen als Substituenten. enthält. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung solcher neuen Derivate sowie
ein thrombolytisch.es Mittel, das ein solches neues Derivat enthält. '

Es ist bekannt, daß menschliche Gewebe eine Vielzahl von Substanzen enthalten, die Plasminogen zu einem fibrinolytischen Enzym oder Plasmin aktivieren. Unter diesen be-

BAD ORIGINAL

kannten Substanzen ist das repräsentativste ein Plasminogen- Aktivator j, d.h. Urokinase , welche im Nierengewebe gebildet und in den Urin abgesondert wird. Urokinase kann erhalten werden durch Isolieren und Reinigen von menschlichem Urin, Gewebekulturen oder durch Gentechnik. Als fibrinolytische Enzym-Aktivatoren, die heutzutage weit verbreitet handelsübliche Anwendung gefunden haben, existieren aus hämolytischem Streptococcus stammende Proteine und Urokinase, das ein von menschlichem Urin stammendes Enzym .ist«, Angesichts seines immunisierenden Verhaltens wird Urokinase, das aus einer solchen Quelle stammt, vorteilhaft für klinische Anwendungen eingesetzt, da es gegenüber dem Menschen nicht immunisierend ist. Von aus menschlichem Urin abstammender Urokinase wird angenommen, daß sie sowohl hochmolekulargewichtige Urokinase (Molekulargewicht = 54 000) als auch niedermolekulargewichtige Urokinase (Molekulargewicht = 33 000) enthält. Urokinase ist in den letzten Jahren als ein thrombolytisehes Mittel 'oder als ein Adjuvans für krebshemmende Substanzen verwendet worden, und sein Verbrauch für klinische Anwendungen steigt von Jahr zu Jahr.

Jedoch ist Urokinase unter bestimmten Bedingungen instabil, da sie ein Enzym ist und ihre enzymatische Aktivität verliert, 2J3«, im Verlauf einer Extraktion, . Isolierung und Reinigung aus einem Urokinase tragenden Rohmaterial, wie Urin; während der Lyophilisationsverarbeitung zur Herstellung dosisgerechter Formulierungen; während der Wärmebehandlung zur Desaktivierung von Viren; oder wenn sie in verdünntem Zustand in eine Tropfflasche gegeben und über einen langen Zeitraum in solch verdünntem Zustand bei Raumtemperatur für klinische Anwendung gehalten wird. Die physikalisch instabile Natur von Urokinase hat ernste Probleme bei der Herstellung und Formulierung von Urokinase in industriellem Maßstab oder bei der eigentlichen Verwendung dieser für klinische

BAD ORiGfNAL

Zwecke verursacht. Menschliches Albumin wurde als Additiv für Urokinase verwendet, um so deren Stabilität zu verbessern. Dies kann jedoch keineswegs als Durchbruch zur Lösung des eben diskutierten Problems angesehen werden, da reines Albumin, das heißt ©ine Globullnfraktion, ohne immunisierende Verunreinigung schwierig zu erhalten ist; reines Albumin teuer ist; Albumin und Urokinase unter virusdesaktivierenden Bedingungen, bei denen Urokinase einer Wärmebehandlung bei 6O°C während 10 Stunden zusammen mit Albumin, welches zur Stabilisierung der Urokinase zugegeben wurde, unterzogen wird, einen Komplex mit hohem Molekulargewicht bilden; und solch ein Stabilis.ator, falls zugegeben, bis zu einem bestimmten Ausmaß Urokinase vom Verlust ihrer enzymatischen Aktivität nach der Lyophilisation schützen kann, jedoch nicht deren Aktivitätsverlust nach der .eigentlichen klinischen Anwendung verhindern kann.

Die physiologische Aktivität von Urokinase bei intravenöser Verabreichung an lebende Körper wird sofort durch im Blut vorhandene Protease-Inhibitoren (a^-Makroglobulin- und cc^-Plasmin-Inhibitoren und dergl.) verzögert, und der Stoffwechsel-Grundumsatz von Urokinase selbst ist sehr hoch, woraus eine extrem verkürzte HaIbwertszeit resultiert, die selbst einige Minuten nicht überschreitet. Bisher wurden keine Vorschläge zur Lösung des Problems der kurzen Halbwertszeit von Urokinase im Blut gemacht.

Im Rahmen dieser Erfindung wurden umfangreiche Forschungen hinsichtlich der Entwicklung neuer Derivate von vom Menschen stammenden, nicht-immoaisierenden Plasminogen-Aktivatoren, welche die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwinden, durchgeführt. Hieraus resultierten neue Plasminogen-Aktivator-Derivate, die stabil und durch im Blut vorhandene Inhibitoren kaum ver-

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zögerbar sind und somit eine verlängerte Halbwertszeit im Blut erreichen.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Derivat eines vom Menschen stammenden, nicht-immunisierenden Plasminogen»Aktivators zur Verfügung zu stellen, welches stabil ist und verlängerte fibrinolytische Aktivität zeigt, wenn es lebenden Körpern verabreicht wird.

Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung der neuen Plasminogen-Aktivator-Derivate zur Verfügung zu stellen»

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein therapeutisch annehmbares, thrombolytisches Mittel bereitzustellen, das das neue Plasminogen-Aktivitator-Derivat enthält.

Diese und andere Ziele und Vorteile der Erfindung werden erreicht durch die Bereitstellung eines Derivats eines vom Menschen stammenden, nicht-immunisierenden Plasminogen- Aktivators, umfassend mindestens ein Polyalkylenglykol, das mit mindestens einem Kupplungsmittel an Aminosäure-Seitenketten des Plasminogen-Aktivators verbunden ist, wobei das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20 000 besitzt und wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituenten enthält.

Ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Erfindung und viele der damit verbundenen Vorteile werden leicht durch die folgende, detaillierte Beschreibung im Zusammenhang mit den Zeichnungen erhalten. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 die optimalen pH-Bereiche von modifizierter, hochmolekulargewichtiger Urokinase (PEG-DCT-UK) und von unmodifizierter, hochmolekulargewichtiger Urokinase

(Molekulargewicht = 54 000), gemessen als Amidase-Aktivität mit einem synthetischen Substrat (S-2444), wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK und die gefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase entsprechen; Fig. 2 die optimalen pH-Bereiche von modifizierter, niedermolekulargewichtiger Urokinase (PEG-DCT-L-UK) und von unraodifizierter, niedermolekulargewichtiger Urokinase (Molekulargewicht = 33 000), gemessen als Amidase-Aktivität mit S-2444, wobei die freien Kreise der PEG-DCT-L-UK und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase entsprechen;

Fig. 3 schematisch die Stabilität von PEG-DCT-UK und von unmodifizierter Urokinase bei Raumtemperatur in entweder physiologischer Kochsalzlösung oder einer Ringer-

!5 Lösung, wobei die durchgezogenen bzw. unterbrochenen Linien der physiologischen Kochsalzlösung bzw. der Ringer-Lösung entsprechen und wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase entsprechen;

Fig. 4 die Stabilität von PEG-DCT-L-UK und von unmodifizierter Urokinase (Molekulargewicht = 33 000') gegenüber Einfrieren sowie anschließender Auftaubehandlung bei 2-, 4- und ömaliger Wiederholung, wobei die freien Kreise der PEG-DCT-L-UK und die ausgefüllten Kreis der unmodifizierten Urokinase entsprechen; Fig. 5 die variierten Mengen, als Funktion der

Ze,it, eines Plasmin-Inhibitors in einer Plasmafraktion F. jeder von zwei Gruppen von gesunden Kaninchen, wobei einer Gruppe PEG-DCT-UK und der anderen Gruppe unmodifizierte Urokinase (Molekulargewicht = 54 000) verabreicht wurde, und wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase-verabreichten Gruppe entsprechen; Fig. 6 die variierten Mengen, als Funktion der Zeit, eines Plasminogens in einer Plasmafraktion F^ jeder von zwei Gruppen von gesunden Kaninchen, wobei einer

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Gruppe PEG-DCT-UK und der anderen Gruppe unmodifizierte Urokinase (Molekulargewicht = 54 OOQ) verabreicht wurde, und wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase-verabreichten Gruppe entsprechen; und

Fig« 7 die variierten Mengen, als Funktion der Zeit, von Plasminogen in einer Plasmafraktion F, jeder von zwei Gruppen von gesunden Kaninchen, wobei das Plasma mit einer Säure und dann mit einer Base zur Inaktivierung des Plasmin-Inhibitors behandelt wurde, wobei einer Gruppe PEG-DCT-UK und der anderen Gruppe unmodifizierte Urokinase (Molekulargewicht = 54 000) verabreicht wurde, und wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinaseverabreichten Gruppe entsprechen.

Durch den hierin verwendeten Ausdruck "vom Menschen stammender, nicht-iramunisierender Plasminogen-Aktivator" werden nicht nur Urokinase, sondern ebenfalls Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren umfaßt, die aus menschlichen Geweben, wie Gebärmutter- und Tumorgewebe und dergl», erhalten werden«. Diese Plasminogen-Aktivator en aus menschlichem Gewebe enthalten auch solche, die durch Gewebekultur oder Gentechnik erhalten werden. Es sei darauf hingewiesen, daß hinsichtlich der Molekulargewichte dieser Aktivatoren keine Beschränkungen bestehen, solange sie in der oben beschriebenen Weise erhalten werden. Beispielsweise kann als Urokinase, die ein von menschlichem Urin stammender Plasminogen-Aktivator ist, hochmolekulargewichtige Urokinase (Molekulargewicht = 54 000) wie auch niedermolekulargewichtige Urokinase (Molekulargewicht = 33 000) entweder einzeln oder in Kombination verwendet v/erden.

Geeignete Polyalkylenglykole, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen ein Polyäthylenglykol und ein Polypropylenglykol. Im Falle des Polypropylenglykols sind

BAD

ι sowohl geradkettige Polypropylenglykole, v;ie diejenigen der Formel HO[CH(CH,)CH₂OJ_nH, als auch verzweigtkettige Folypropylonglykole, wie diejenigen der Formel·CH [[CH₂O[CH₂CH(CH₃O]_nH]]₃ oder H[OCH(CH₃)CH₂]_nOCH[[

[OCH₂CH(CH₃)]_n0H]]₂, umfaßt.

Die Molekulargewichte der Polyalkylenglykole können im Bereich von 200 Ms 20 000 liegen. Besonders bevorzugte Molekulargewichte liegen im Bereich von 500 bis 10 000. 10

Die Polyalkylenglykole können jeweils wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituentengruppen enthalten. Typische Beispiele der Alkylgruppen sind Methyl, Äthyl, Propyl, Stearyl und dergl.. Typische Beispiele der Alkanoylgruppen sind Acetyl, Propionyl, Stearoyl und dergl.. Als ein bevorzugtes Polyalkylenglykol eignet sich ein unsubstituiertes oder methylsubstituiertes Polyalkylenglykol.

Geeignete Kupplungsmittel, die erfindungsgemäß verwendet werden können und geeignet sind, ein Polyalkylenglykol an einen nicht-immunisierendenPlasminogen-AktivatorjZ.B. Urokinase, zu binden, umfassen solche , die fähig sind, mit Aminosäure-Seitenketten des zu modifizierenden Pro-_(w 25 teins zu reagieren und zwischen diesen chemische Bindungen zu bilden, beispielsweise Acylazid, Cyanurhalogenide, p-Diazoniumbenzylä"ther, 3- (p-Diazoniumphenoxy) -2-hydroxypropylather, Dihalogenbernsteinsäureanhydrid und dergl.. Die folgenden Teilformeln können als Beispiele für die KupplungsStrukturen zwischen einem Polyalkylenglykol und Urokinase durch diese Kupplungsmittel gegeben werden.

35

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♦ » · β

-0-CH₂CO-UK

-ο- f \-w

;-UK

10 ^0H

-0-CH₂-Zy-N₂-UK

-0-CH₂CH (OH) CH₂ 15

-OCOCH₂CHaCO-UK

worin X ein Halogenatom bedeutet und UK für einen Restteil des· Urokinasemoleküls steht«

Das erfindungsgemäße neue Urokinase-Derivat kann hergestellt werden durch Umsetzung eines gekuppelten Produkts aus mindestens einem korrespondierenden Polyalkylenglykol und mindestens einem Kupplungsmittel mit Urokinase, wobei das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20 000 besitzt und wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituenten

30 enthält.

Typische Beispiele des mit dem Polyalkylenglykol-Kupplungsmittel gekuppelten Produktes umfassen Polyalkylenglykol-4,6-dichlor-1,3 _s 5-triazin, Polyalkylenglykol-4,6-difluor-1_s3,5-triazin_s Polyalkylenglykol^-chlor-e-hydroxy-1,3j5-triazin, Polyalkylenglykol-ß-CbromcarbonylJ-raono-

M- propionat, Polyalkylenglykol-azidocarbonyl-methylather, Polyalkylenglykol-(p-diazoniumberizyl)-äther, Polyalkylenglykol -3- (p-diazoniumphenoxy)-2-hydroxypropyläther und dergl..
5

Bei der Umsetzung des mit Polyalkylenglykol-Kupplungsmittel gekuppelten Produktes mit Urokinase ist es notwendig, solche Reaktionsbedingungen zu wählen, daß die enzymatische Aktivität auf einem minimalen Verlust gehalten wird. Hierzu ist es erstrebenswert, die Umsetzung bei niedrigen Temperaturen, z.B. bei einer Temperatur von O⁰C bis Raumtemperatur, in einer wäßrigen Lösung, wie ei-

"*" nem Puffer, auszuführen. Eine bevorzugte Reaktionszeit kann im Bereich von einigen Minuten bis zu 5 Stunden liegen. Der pH des Puffers liegt vorzugsweise innerhalb eines solchen Bereichs, daß die enzymatische Aktivität von Urokinase nicht herabgesetzt wird, nämlich bei 2 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9. Der bevorzugte pH-3ereich kann jedoch variieren in Abhängigkeit der Reaktivität des jeweils verwendeten Kupplungsmittels und/oder der Art des Aminosäurerestes. Das Modifizierungsausmaß von Aminosäure-Seitenketten des Plasminogen-Aktivators kann reguliert werden durch Änderung der Konzentration des PoIyalky.'lonK.lykols, das mit dem Kupplungsmittel in einem Reak-

'w ²⁶ tlonsmedium aktiviert wird. Beispielsweise wurde ein Monpmethyläther-polyäthylenglykol74,6-dichlor-i,3,5-triazin mit einem mittleren Molekulargewicht von 5000 bei pH 7,0 mit hochmolekulargewichtiger Urokinase umgesetzt, um neue Urokinase-Derivate zu erhalten, während die Konzentration des ersteren Reaktanten auf 0,4, 4,0 bzw. 6,0 mM geändert wurde. Unmodifizierte L -Aminogruppen von Lysin des resultierenden Urokinase-Derivats 'wurden unter Verwendung von Natrium-2,4,6-trinitrobenzolsulfonat quantitativ bestimmt. Deren Modifizierungsgrad wurde auf der Grundlage der durch quantitative Analysen erhaltenen Ergebnisse erforscht. Die Modifizierungs-Prozentgehalte der £ -Amino-

40-

Gruppen von Lysin, die gegenüber Natriura-2,4,6-trinitrobenzolsulfonat aktiv waren, "betrugen 6 bis 7% bei 0,4 mM, etwa kO% bei 4,0 mM und etwa 60% bei 6,0 mM. Zusätzlich wurden die Molekulargewichte dieser Reaktionsprodukte durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Die durchschnittlichen Molekulargewichte der Reaktionsprodukte betrugen etwa 60 000 bei 0,4 mM und. etwa 120 000 bei 4,0 mM. Diese Werte stimmen im wesentlichen mit den Ergebnissen überein, die oben bei den quantitativen Analysen der £.-Aminogruppen von Lysin erhalten wurden. Demzufolge ist es erforderlich, die Reaktion zwischen dem mit dem Kupplungsmittel aktivierten Polyalkylenglykol und dem Plasminogen-Aktivator bei einem hohen pH-Wert und einer hohen Konzentration des ersteren Reaktanten durchzuführen, wenn gesteigerte Modifizierungsgrade des Plasminogen-Aktivators erwünscht sind. Andererseits sollte, wenn verringerte Modifizierungsgrade bevorzugt sind, die Umsetzung bei einem relativ niedrigen pH-Wert und bei einer niedrigen Konzentration des gekuppelten Produktes erfolgen. Die Modifizierungsgrade können natürlich durch Regulierung der Reaktionszeit geändert werden. Durch geeignete Korabination dieser Reaktionsbedingungen ist es möglich, die beabsichtigten, neuen Plasminogen-AktivatornDerivate zu erhalten, die stabil sind und verlängerte fibrinolysisehe Aktivitäten besitzen»

Das mit dem Kupplungsmittel aktivierte Polyalkylenglykol kann auf folgende Weise erhalten werden« Ein endständig substituiertes Polyalkylenglykol-4,6-dihalogen-1,3,5-triazin wird erhalten durch Umsetzung seines korrespondierenden, monosubstituierten Polyalkylenglykols mit einem Cyanurhalogenid in einem wasserfreien Lösungsmittel und in Anwesenheit einer Base. Ein Polyalkylenglykol-4-halogen-6-hydroxy-1,3_s5~triazin wird gebildet, indem man zuerst sein entsprechenden Polyalkylenglykol mit Cyanurhalogenid umsetzt und dann das resultierende Reaktions-

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produkt mit Wasser behandelt. Ein Polyalkylenglykolacetoazid wird gebildet durch Umsetzung eines Anions seines entsprechenden Polyalkylenglykols mit Äthylchloracetat, nachfolgende Behandlung des Reaktionsproduktes mit Hydrazin und schließlich Aktivierung des resultierenden Hydrazide mit Salpetrigsäure. Ein Polyalkylenglykolp-diazoniumbenzylather oder ein Polyalkylenglykol-3-(pdiazoniumphenoxy)-2-hydroxypropylather wird erhalten durch Umsetzung seines korrespondierenden Polyalkylenglykols mit p-Nitrobenzylchlorid oder p-Nitrophenyl-

glyceryläther und anschließende Reduktion der Nitrogruppe in eine Aminogruppe sowie Diazotierung des resultierenden V· Produkts mit Salpetrigsaure.

Nach Beendigung der Umsetzung des mit dem Kupplungsmittel aktivierten Polyalkylenglykols und des Plasminogen-Aktivators können die Isolierung und Reinigung des Reaktionsproduktes auf biochemische Weise, wie per se in der Technik bekannt, erfolgen, z.B. unter Verwendung (einzeln oder in Kombination) einer Gelfiltration, Dialyse, Ionenaustauscherchromatographie , Affinitätschromatographie und dergl.. Vorzugsweise wird das Konjugat als Lösung mit einem Gehalt eines Puffers oder eines physiolo- ... · gischen Salzes aufbewahrt, indem man die Lösung unter , 25 -20⁰C einfriert oder die Lösung lyophilisiert.

Die optimalen pH-Werte für die neuen, wie oben beschrieben hergestellten Urokinase-Derivate variieren in Abhängigkeit der Molekulargewichte und der Arten der verwendeten Polyalkylenglykole, der Arten der verwendeten Kupplungsmittel, der Modifizierungsgrade der Urokinase, der Modifizierungsbedingungen und Msßbedingungen, wie etwa den verwendeten Substraten. Bei Messung als Amidase-Aktivität unter Verwendung eines synthetischen Substrates S-2444 liegt der optimale pH-Wert im Bereich von etwa 8 bis 9. Im Falle hochmolekulargewichtiger Urokinase, die

durch Umsetzung mit Monome thyläther-polyäthylenglykol-4·, 6-dichlor-1,3j5~triazin mit einem mittleren Molekulargewicht von 5000 bei pH 7,0 und bei einer Temperatur von 0⁰C während 3 h unter Verwendung einer Konzentration des letzteren Reaktanten von 4,.0-inM (nachfolgend abgekürzt als PEG-DCT-UK) modifiziert wurde, beträgt der optimale pH, gemessen als Amidase-Aktivität, 8,2, wie in Fig. 1 gezeigt. Der optimale pH von niedermolekulargewichtiger Urokinase, die unter den gleichen Bedingungen modifiziert wurde (nachfolgend als PEG-DCT-L-UK bezeichnet), beträgt, gemessen als Amidase-Aktivität, 8,2, wie in Fig« 2 gezeigt«

Die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase-Derivate besitzen eine extrem gesteigerte Stabilität,, verglichen mit unmodifizierter Urokinase. Beispielsweise zeigt Fig. 3 die Ergebnisse der Rest-Urokinase-Aktivität, wie sie erhalten wurden im Verlauf der ZeIt₉ wenn Urokinase mit einer Ringer-Lösung oder einer physiologischen Lösung auf eine solche Konzentration verdünnt wurde, wie sie bei Verabreichung in Tropfenform für klinische Anwendung verwendet wirdj und dann bei Raumtemperatur stehengelassen wurde« Als Ergebnis hat sich gezeigt, daß PEG-DCT-UK, gelöst in der Ringer-Lösung bei einer Konzentration von 105,3 ΙΕ/ml, eine Aktivität von 73₍4% selbst 6 h nach Beginn des Versuchs beibehält» Weiterhin behält PEG-DCT-UK eine anfängliche Aktivität von 79A% in der physiologischen Salzlösung b©i. Andererseits behMlt unmodifizierte Urokinase, gelöst in einer Ringer-Lösung bei einer Konzentration von 76,1 IE/ml, nur 33,3% ihrer anfänglichen Aktivität selbst nach 2 h bei» In einer physiologischen Salzlösung beträgt die Restaktivität nur 26,3%»

Fig» 4 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden durch Vergleichen der Stabilität von PEG-DCT-L-UK und unmodifizierter, niedermolekulargewichtiger Urokinase im Vor-

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lauf des Einfrierens und der anschließenden Auftaubehandlunß. Die Ergebnisse bestätigen, 'daß die vorzügliche Stabilität von PEG-DCT-L-UK selbst unter solchen Bedingungen erreicht wird.
5

Des weiteren besitzen die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase-Derivate verlängerte Urokinase-Aktivitäten im Blut, verglichen mit unmodifizierter Urokinase. Die Wirksamkeit von Urokinase wurde beispielsweise erforscht durch Verabreichung von 8000 IE/kg von sowohl PEG-DCT-UK als auch unmodifizierter Urokinase an gesunde Kaninchen durch intravenöse Einspritzung, periodische Blutprobenentnahme w vor der Dosierung und nach Ablauf von 4 h sowie Messen der Mengen des in dem citratierten Plasma vorhandenen Plasmin-Inhibitors und Plasminogens. Die Ergebnisse sind in den Fig. 5, 6 und 7 gezeigt. Diese Ergebnisse bestätigen, daß PEG-DCT-UK bis zu einem wesentlichen Ausmaß die biochemischen Parameter, wie Plasmin-Inhibitor und Plasminogen, ändert und diese Parameter bei erniedrigten Werten über eine ausgedehnte Zeitspanne beibehält, verglichen mit unmodifizierter Urokinase.

Die erfindungsgeraäßen, neuen Urokinase-Derivate sind daher ausgezeichnete Plasminogen-Aktivatoren, die .unter ' 25 Beibehaltung der Plasminogen-aktivierenden Fähigkeit, wie bei unmodifizierter Urokinase der Fall, die Nachteile von Urokinase, wie geringe Stabilität und kurze Halbwertszeit im Blut, überwunden haben.

Die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase-Derivate können als pharmazeutische Produkte für die Behandlung einer Reihe von Krankheiten verwendet,v/erden, die sich herleiten aus der übermäßigen Koagulierbarkeit bzw. Gerinnungsfähigkeit des Bluts, wie arterielle und venöse Thrombosen, Kranzarteriengerinnung, Myocardinfarkt, Intracerebralinfarkt, Lungenembolie, Nephritis und dergl.. Diese Uroki-

nase-Derivate können geeigneterweise durch intravenöse Einspritzung oder Tropfen oder auf oralem Weg verabreicht werden. Die intravenöse Einspritzung ist besonders bevorzugt. Als dosisgerechte Form ist insbesondere eine lyophilisierte Form geeignet·: Bei Bereitstellung entweder in reinem Zustand oder mit einem physiologischen Salz, wie einem Salz einer Ringer-Lösung, oder Natriumchlorid, können die lyophilisierten Produkte für klinische Anwendung durch Auflösen mit sterilem., destilliertem Wasser oder weiterer Verdünnung mit sterilem, destilliertem Wasser, um deren osmotischen Druck vor der eigentlichen Verwendung einzustellen, eingesetzt werden. Da die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase-Derivate stabil sind, benötigen sie keinen Stabilisator, wie Albumin. Die Zugabe eines solchen Stabilisators verursacht jedoch keinerlei Probleme oder Unannehmlichkeiten. Beim Unterziehen der neuen Urokinase-Derivate einer Lyophilisierung kann ebenfalls ein Träger zugesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung wurde vorstehend im allgemeinen beschrieben. Die Erfindung wird im einzelnen unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher erläutert,ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die Modifizierungsbehandlung kann in jeder der Herstellungsstufen des Plsminogen-Aktivators ausgeführt werden.

Beispiel 1 "" -

Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6™dichlor-1, 3 ? 5-triazjfo -, _{iimii l}

Polyäthylenglykolmonomethyläther mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000 (25,0 gj 0,05 Mol) wurde unter Erwärmen in 200 ml trockenem Benzol gelöst. Nach Abkühlen der resultierenden Lösung auf Zimmertemperatur wurden 5,0 g wasserfreies Natriumcarbonat und 2,75 g (0,015 Mol) Cyanursäurechlorid zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ver-

45·

/ff-

ι vollständigunß der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung filtriert und das Filtrat mit 6OÖ ml Petroläther versetzt. Das erhaltene Präzipitat wurde durch Saugfiltration gesammelt und mit einer geringen Menge Petroläther gewaschen. Der Niederschlag wurde durch dreimaliges Ausfällen aus trockenem Benzol und Petroläther gereinigt, um überschüssiges Cyanursäurechlorid zu entfernen, wobei in stöchiometrischen Mengen Monomethyläther-polyäthy lenglykol~4,6-dichlor~1,3,5-triazin als weißes Pulver erhalten wurde. Das Produkt zeigte nach der Hydrolysierung die qualitativen Reaktionseigenschaften von Chlorionen

In ähnlicher Weise wurden Polyäthylenglykol-monomethyläther mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 550, 700, 2000 bzw. 20 000 jeweils mit Cyanursäurechlorid

umgesetzt, um stöchiometrische Mengen an Monomethylather-' polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazinen mit den entsprechenden durchschnittlichen Molekulargewichten _zu erhalten.

Beispiel 2

Monomethyläther-polyäthylenglykol-Ajö-dichlor-i,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht ihrer Polyäthylen-

fflyko!-Anteile = 10 000 und 15 000) ,

Polyäthylenglykol-monomethyläther mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 10 000 (25,0 g; 0,025 Mol) wurde unter Erwärmen in 200 ml trockenem Benzol aufgenommen. Nach Abkühlen der resultierenden Lösung wurden 2,5 g wasserfreies Natriumcarbonat und 1,38 g (0,0075 Mol) Cyanursäurechlorid zugesetzt. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei 33⁰C gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurden nichtgelöste Bestandteile abfiltriert. Das Filtrat wurde mit etwa 600 ml η-Hexan versetzt, um eine Ausfällung einzuleiten. 100 ml trockenes Benzol wurden dem Präzipitat zugesetzt, das dann erwärmt und gelöst

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wurde. Dann wurden 500 ml ji-Hexan zur Einleitung der Ausfällung zugesetzt. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt. Die so erhaltene Präzipitat wurde über Wacht bei 50⁰C im Vakuum getrocknet, wobei stöchiometrische Mengen an Monomethyläther-polyäthylenglykol-Ajö-dichlor-i,3,5_rtriazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils =10 000) als weißes Pulver erhalten wurden. Auf ähnliche Weise wurde Polyäthylenglykol-monomethyläther mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 15 000 mit Cyanursäurechlorid umgesetzt, wobei stöchiometrische Mengen an Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des PoIyäthylenglykol-Anteils =15 000) erhalten wurden.

Beispiel 3

Monostearyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-

Polyäthylenglykol-raonostearyläther mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 3200 (16,O g; 0,005 Mol) wurde in 200 ml trockenem Benzol aufgelöst. Anschließend wurden 5,0g wasserfreies Natriumcarbonat und 2,75 g (0,015 Mol) Cyanursäurechlorid unter Rühren zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurden ungelöste Bestandteile durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit etwa 600 ml η-Hexan zur Einleitung der erneuten Ausfällung versetzt. 100 ml trockenes Benzol wurde dem Präzipitat zugesetzt, um das letztere aufzulösen. 500 ml η-Hexan wurden zur Einleitung der erneu-

^O ten Ausfällung zugegeben» Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei stöchiometrische Mengen an Monostearyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor~1,3,5-triazin (Durch-Schnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils =

3200) als weißes Pulver erhalten wurden. 35

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3.24 Q Π 4.

Beispiel 4

Polyäthylenglykol-fo-chlor-o-hydroxy-i,ff,5-triazin Polyäthyleiiglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 6000 (33»6 g) wurde unter Erwärmen in 150 ml trockenem Benzol aufgelöst. Nach Abkühlen der resultierenden Lösung wurden 1,6 g wasserfreies Natriumcarbonat und 0,74 g Cyanursäurechlorid zugesetzt und das resultierende Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend gab man 1,0 ml Wasser zu, rührte das Gemisch ■ 6h bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 40°C.

. Ungelöste Bestandteile wurden durch Zentrifugieren (2000 U/min; 10 min) entfernt, und der überstehende Teil wurde der Kondensation unter vermindertem Druck unterzogen. Der Rückstand wurde unter Erwärmen in trockenem Benzol aufgenommen und das Lösungsmittel anschließend abgedampft. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt. Der Rückstand wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man Polyäthylenglykol-4~chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin erhielt (Durchschnittsmolekulargewicht des PoIyäthylenglykol-Anteils = 6000).

Polyäthylenglykole mit unterschiedlichen Durchschnittsmolekulargewichten von 1000 und 4000 wurden jeweils auf gleiche Weise, wie oben mit Cyanursäurechlorid und Wasser umgesetzt, was zur stöchiometrischen Bildung von PoIyäthylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3»5-triazinen mit ihren korrespondierenden Durchschnittsmolekulargewichten führte*

Beispiel 5

Stearoylpolyäthylen^lykol-4,6-dichlor-1,3.5-triazin Polyäthylenglykol-monostearat mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 2700 (6,765 g) wurde in 100 ml wasserfreiem Benzol aufgelöst und anschließend mit 2,5 g wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt. Unter Rühren der resultierenden Mischung wurden weiterhin 1,38 g Cyanursäurechlorid zugegeben. Die entstehende Mischung wurde über

BAD ORIGINAL

32AG174

ie-

Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert, wobei stöchiometrische Mengen an Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 2700) erhalten wurden, und zwar in Form einer weißen, wachsartigen Substanz.

Beispiel 6

Polypropylenglykol~4"Chlor"6-hydroxy-'1,3,5-triazin Polypropylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 1000 (4,0 g) wurde in 50 ml wasserfreiem Benzol aufgenommen und anschließend mit 1,27 g wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt. Unter Rühren wurden weiterhin 0,552 g Cyanursäurechlorid zugesetzt. Nach dem Rühren der resultierenden Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur setzte man 1 ml Wasser zu. Das Gemisch wurde weitere 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Benzol und wasserfreiem Natriumsulfat versetzt. Die Mischung wurde anschließend 10 min bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Filtration der Mischung wurde das Lösungsmittel • von dem Filtrat abgedampft. Der Rückstand wurde unter verringertem Druck getrocknet, wobei man stöchiometrisehe Mengen an Polypropylenglykol-^-chlor-ö-hydroxy-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des PoIypropylenglykol-Anteils = 1000) in Form eines farblosen, viskosen Öls erhielt.

Nach der oben beschriebenen Arbeitsweise erhielt man ein Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht 'des Polypropylenglykol-Anteils ~ 4000) sowie ©in weiteres Polypropylenglykol-4-chlor-6~hydroxy--1 _s3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol-Anteils =10 000).

BAD ORSGSNAL

4fr-

Die in den obigen Beispielen verwendeten Polypropylenglykole waren vom geradkettigen Typ, nämlich solche der Formel HO[Ch(CH₃)CH₂O]_nH.

Beispiel 7

Polvpropylenp:lykol"4-chlor-6~hydroxy-«i ,3 »5-triazin Gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 wurde Polypropylenglykol-4-chlor-6~hydro3cy-1,3»5-triazin (Diirchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol-Anteils = 4000) in stöchiometrischen Mengen als weiße Substanz aus PoIypropylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 4000 (8,0 g), 80 ml wasserfreiem Benzol, 0,636 g ''*"" wasserfreiem Natriumcarbonat und 0,368 g Cyanursäure-

chlorid erhalten.
15

Das in diesem Beispiel verwendete Polypropylenglykol war vom verzweigtkettigen Typ, nämlich ein solches der Formel CH₃CH₂C[[CH₂O[CH₂CH(CH₃)O]_nH]]₃.

Ferner wurde unter Verwendung eines Polypropylenglykols der Formel

CH₂O[CH₂CH(CH₃)0]_nH

CHO[CH₂CH(CH₃)O]_nH

CH₂O[CH₂CH(CH₅)O]_nH

ι -w, ²⁵

und mit einem Durchschnittsmolekulargev/icht von 3000 ein Polypropylenglykol^-chlor-ö-hydroxy-i,3»5-triazin (Durchschnittsmolekular gewicht des Polypropylenglykol-Anteils =» 3000) erhalten.

30

Beispiel 8

Monomethylather-pplyathylenglykpl-methoxs^carbohydrazid Polyäthylenglykol-monome'thyläther mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 5000 (13,3 g; 0,0027 Mol) wurde unter Stickstoff in 400 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran aufgenommen, Eine kleine Menge Diphenylessig-

BAD ORfGSfMAL

säure wurde als Indikator zugegeben und n-Butyllithium unter Kühlen mit Eis zugetropft, bis die Reaktionslösung in schwaches Gelb umschlug. Danach wurden 5 ml (0,047 Mol) Äthylchloracetat bei Raumtemperatur zugetropft, die resultierende Lösung über Nacht gerlihrt und dann 1 h unter Rückfluß gehalten. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgetrieben und der Rückstand in 200 ml wäßrigem Aceton aufgenommen. Die resultierende Lösung wurde mit HoIzkohle (Aktivkohle) behandelt. Nach Filtration und anschließender Konzentration des Filtrat wurde Benzol zugesetzt. Nach Entfernung des Wassers durch azeotrope Destillation wurde der Rückstand erneut, aus Benzol und n-Hexan ausgefällt, um ein gelbliches Pulver zu erhalten.

Das so erhaltene Pulver wurde in 150 ml Methanol gelöst und dann mit 15 ml Hydrazinhydrat versetzt. Die Mischung wurde über Nacht unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach Abtreiben des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden 150 ml Wasser zugegeben und überschüssiges Hydrazin durch azeotrope Destillation entfernt. Im Rückstand verbleibendes Wasser wurde zusammen mit Benzol azeotropisch entfernt. Der Rückstand wurde erneut in Benzol gelöst und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel abgetrieben und der Rückstand in warmem Benzol gelöst. Die Benzollösung wurde mit Aktivkohle behandelt und dann konzentriert. Das Reaktionsprodukt wurde zweimal aus Benzol und n-Hexan ausgefällt, mit Aktivkohle erneut behandelt, mit Silikagel behandelt und dann erneut aus Benzol und η-Hexan ausgefällt, wobei Monomethyläther-polyäthylenglykol-methoxycarbohydrazid als weißes Pulver erhalten wurde. Auf gleiche Weise wurde eine Vielzahl von Hydraziden unter Verwendung von Polyäthylenglykol-monomethyläthern mit Durchschnittsmolekulargewichten von 550, 700, 2000, 10 000, 15 000 bzw. 20 000 als Ausgangsmaterialien erhalten.

Beispiel 9

Monomethylä ther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor~1,3,5-tri-

azin-modifizierte Urokinase (PEG-DCT-UK)

Ein 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 7,0 (2,0 ml) wurde unter Kühlen mit Eis zu 0,61 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht = 54 000; 66 300 ΙΕ/ml) gegeben. Danach wurde Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des PoIyäthylenglykol-Anteils = 5000) in einer solchen Menge zugesetzt, daß die Konzentration des Triazins auf 4 mM gebracht wurde. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und überschüssiges Triazinderivat durch Dialyse entfernt.

Die Dialyse wurde 3 h unter Eiskühlung gegenüber 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) und dann eine weitere Stunde gegenüber physiologischer Salzlösung ausgeführt. Der Inhalt der Röhre wurde dann auf 4 ml aufgefüllt und in gefrorenem Zustand bei -80⁰C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so erhaltenen, Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierten Urokinase (PEG-DCT-UK) wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 4550 IE/ml bestimmt. Somit betrug die Gesamtaktivität 18 200 IE. Da die Aktivität der Ausgangs-Urokinase 40 443 IE betrug, war ein Aktivitätsverlust von 55% festzustellen.

Das obige Verfahren wurde mit der Ausnahme wiederholt,daß das Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 5000) durch Monomethyläther-polyäthylen* glykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 550, 700 bzw. 2000) ersetzt wurde, wobei modifizierte Urokinasen mit Urokinase-Aktivitäten von 9800, 10 000 und 6500 IE/ml, wie durch das Fibrin-Platten-Verfahren bestimmt, erhalten wurden. ^*

BAD ORIGINAL

«β-

Beispiel 10

Monomethylätherpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierte, niedermolekulargewichtige Urokinase

(FEG-DCT-L-UK)

Ein 0,1 M Phosphatpuffer von pH 7,0 (4,7 ml) wurde unter Eiskühlung zu 0,2 ml einer niedermolekulargewichtigen Urokinaselösung (Molekulargewicht = 33 000; 567 828 IE/ ml) gegeben. Anschließend wurde Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1 ,3>5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 5000) in solcher Menge zugesetzt, daß die Konzentration des Triazinderivats auf 4 mM eingestellt wurde. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und überschüssiges Triazinderivat durch Dialyse entfernt. Die Dialyse \nirde 3 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) und. dann eine weitere Stunde gegenüber physiologischer Salzlösung durchgeführt. Nach der Dialyse wurde der Inhalt auf 8 ml aufgefüllt und in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so erhaltenen, Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,5-dichlor-1,3,5- · triazin-modifizierten, niedermolekulargewichtigen Urokinase (PEG-DCT-L-UK) wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 10 300 IE/ml bestimmt. Somit betrug die Gesamtaktivität 82 400 IE. Da die Aktivität der Ausgangs-Urokinase 113 566 IE betrug, war ein Aktivitätsverlust von 27,4?ä festzustellen.

Beispiel 11

Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-i,3,5-

triazin-iaodifizierte Urokinase '

Das Verfahren des Beispiels 9 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die Konzentration des jeweiligen Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazins zu 0,4 mM geändert wurde. Man erhielt (mit Modifizie-

-a*

rungsgraden, die sich von den in Beispiel 9 erhaltenen unterschieden) Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 550, 700, 2000 bzw. 5000). Die Urokinase-Aktivitäten betrugen 8670, 8900, 6770 und 8670 IE/ml, bestimmt mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens.

Beispiel 12

Monomethyläther-polyäthylenglykol-carbomethylazidmpdifizierte Urokinase

(1) Zu 200 mg des in Beispiel 8 hergestellten Mono-"" methyläther-polyäthylenglykol-methoxycarbohydrazids (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils - 5000) gab man unter Eiskühlung 2 ml 1N Salzsäure und dann 1 ml einer 0,008N wäßrigen Natriumnitritlösung. Das resultierende Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt, und dann gab man weiterhin 2 ml einer 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung zur Neutralisation der Mischung zu. Die resultierende Lösung des Monomethylätherpolyäth;
lagert.

polyäthylenglykol-carboxymethylazids wurde bei O⁰C ge-

(2) Ein 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 8,0 (3,656 ml) wurde zu 1 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht = 33 000; 45 600 ΙΕ/ml) gegeben. Anschließend wurden 0,435 ml der gemäß dem obigen Verfahren (1) hergestellten Monomethyläther-polyäthylenglykol-carbomethylazid-Lösung unter schwachem Rühren zugesetzt. Die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die resultierende Reaktionslösung wurde dann in eine Dialyseröhre überführt und 4 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert. Der Inhalt wurde auf 8 ml aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80⁰C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so erhaltenen, Monomethyläther-polyäthylenglykol-carbo-

32401J4

.34 7

metiwlazid-modifizierten Urokinase wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 7300 IE/ml "bestimmt. Verglichen mit nichtmodifizlerter Urokinase wurde eine Aktivitätszunahme von 28% festgestellt. 5

B e i s ρ i e 1 13
Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-tri-

azin-modifizierte Urokinase

Zu 0,61 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht = 54 000; 101 167 ΙΕ/ml) gab man unter Eiskühlung 0,1 M Phosphatpuffer von pH 7,0 (2,0 ml) und dann unter schwachem Rühren Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6~dichlor-1>3,5~triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 10 000). Das Triazinderivat wurde in solcher Menge zugesetzt, daß die Konzentration auf 0,1 Λ eingestellt wurde. Die Mischung wurde 3 h un-■ter Eiskühlung umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und überschüssiges Triazinderivat durch Dialyse entfernt. Die Dialyse wurde 3 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphorsäure-Puffer, versetzt mit 0,035$ (Vol/Vol) Äthylamin (pH 8,0), und dann weitere 2 h gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit 3% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (o,1 ml) versetzt und dann mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) auf 4,0 ml aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80⁰C gelagert. Die Aktivität der so erhaltenen, Monomethyläther-Polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierten Urokinase wurde gemäß dem Fibrin-Platten-Verfahren mit 10 028 IE/ ml bestimmt. Somit betrug die Gesamtaktivität 40 112 IE

und der Aktivitätsverlust 35/6. Ähnliche, modifizierte Urokinasen wurden durch Änderung der* Konzentration an Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triaziu (Durchschnittomolekulargewicht des Polyäthylengl3rIc0l-Ante.ils - 10 000) auf 0,4 hr.w. 1,0 rnM erhalten.

BAD ORIGINAL

32-A0174

ι Deren Urokinaee-Aktivitäton betrugen 8794 und 6634 IE/ml.

Außerdem wurden Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3 >5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 15 000) und Urokinase auf ähnliche Weise umgesetzt, wobei Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 15 000) erhalten wurde. Die Aktivitäten der modifizierten, durch Änderung der Konzentrationen der Triazinderivate zu 0,1, 0,4 und 1,0 mM erhaltenen Urokinasen betrugen 11 300, 0380 bzw. 7176 IK/ml.

Beispiel _i _n 14

Monostearyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1, 3>5-

triazin-modifizierte Urokinase

Zu 0,2 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht = 54 000; 101 167 IE/ml) gab man unter Eiskühlung 0,66 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0) und danach Monostearyl-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 3200). Das Triazinderivat wurde in solcher Menge zugesetzt, daß die Konzentration auf 2 mM eingestellt wurde. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und der Dialyse zur Entfernung überschüssigen Triazinderivats unterzogen. Die Dialyse wurde 4 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit 0,1 ml einer 3»Obigen wäßrigen Lösung von Rinderserumalbumin versetzt und dann mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) auf 4,0 ml eingestellt. Die resultierende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80 C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so hergestellten, Monostearyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3»5-

B& π

■19- ' triazin - modifizierten Urokinase (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 3200) wurde mittels dec Fibrin-Platten-Verfahrens mit 2826 IE/ml bestimmt. Da die Gesamtaktivität 11 304 IE betrug, lag die Aktivität bei 55,9% , verglichen mit der der Ausgangs-Urokinase. Die Aktivitäten der modifizierten Urokinasen, die durch Änderung der Konzentration an Monostearyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin zu 4, 6 bzw. 8 mM erhalten wurden, betrugen 2351, 1430 und 1059 IE/ml.

Beispiel 15

Polyäthylenglykol~4-chlor-6-hydroxy-1,3»5-triazin-modifizierte Urokinase

Zu 1 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht = 54 000; 45 600 IE/ml) gab man unter Eiskühlung 4,0 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 9*2) und anschließend 2,34 mg Polyäthylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin. Das durchschnittliche Molekulargewicht des PoIyäthylenglykol-Anteils des Triazinderivats lag bei 6000. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und überschüssiges Triazinderivat durch Dialyse entfernt. Die Dialyse wurde 1 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 9,2) und dann weitere 3 h gegenüber einem 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit. einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) auf 8,0 ml aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80⁰C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so erhaltenen, mit Polyäthylenglykol^-chlor-ö-hydroxy-1,3,5-triazin modifizierten Urokinase (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 6000) wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 460 IE/ ml bestimmt.

BAD ORIGINAL

Wt *· *

Auf ähnliche Weise vmrden andere Polyäthylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-i, 3,5-tr.i.a^.in-modif i/..i ox* bo Urokinasen (Durchschnittsmolekulargewichte der Polyäthylenglykol-Anteile = 4000 bzw. 1000) erhalten. 5

Beispiel 16

Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin-

modifizierte Urokinase '

Zu 0,5 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht = 54 000; 101 167 ΙΕ/ml) gab man unter Eiskühlung 1,5 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0) und dann 0,05 ml einer Dioxanlösung von Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor~1,3,5-triazin (270 mg/ml) (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils = 2700). Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und zur Entfernung überschüssigen Triazinderivats der Dialyse unterzogen. Die Dialyse wurde 4 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit einem Phosphatpuffer auf 5 ml aufgefüllt. Die resultierende
lagert

rende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80°C ge

Als Ergebnis der Urokinase-Aktivitätsbestimmung mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens wurde festgestellt, daß die so erhaltene Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modif.i.zierte Urokinase eine Aktivität von 106% im Vergleich ;iu der der Aus gangs-Urokinase hatte.

Andere Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifiziarte Urokinasen mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden wurden durch Umsetzung mit Urokinase unter Verxyendung einer Dioxanlösung von Stearoylpolyäthy- lenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (270 mg/ml) in Mengen von 0,1 bzw. 0,2 ml erhalten. Das Durchschnitts-

^SÄö ORIGINAL

«β- -34-

molekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils des Triazinderivats betrug 2700. Die so hergestellten, modifizierten Urokinasen besaßen Aktivitäten von 106 und 101% im Vergleich zu derjenigen der Ausgangs-Urokinase. 5

Beispiel 17
Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin-

modifizierte Urokinase

Zu 0,5 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht = 54 000; 101 167 IE/ml) gab man unter Eiskühlung 1,5 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0) und anschließend 0,05 ml einer Dioxanlö'sung des Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3»5-triazins (100 mg/ml), erhalten in Beispiel 6. Das Durchschnittsmolekulargewicht des PoIypropylenglykol-Anteils des Triazinderivats betrug 1000. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und zur Entfernung überschüssigen Triazinderivats der Dialyse unterzogen. Die Dialyse wurde 4 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit einem Phosphatpuffer auf 5 ml aufgefüllt und dann in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert. Es wurde festgestellt, daß die so erhaltene, Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase eine Aktivität von 96,4% gegenüber derjenigen der Ausgangs-Urokinase (bestimmt nach dem Fibrin-Platten-Verfahren) beibehalten hatte.

Andere Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazinmodifizierte Urokinasen mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden wurden aus ähnliche Weise unter Verwendung einer Dioxanlösung von Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin (100 mg/ml) in Mengen von 0,1 bzw. 0,2 ml erhalten. Das Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol-Anteils des Triazinderivats betrug

BAD ORIGlMAL

·3Ζ'

1000. Die modifizierten Urokinasen zeigten Aktivitäten von 99,3 und 106,8% im Vergleich zu derjenigen der unrnodif izierten Aus gangs-Urokinase.

Beispiel 18

Pol3Tpropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazinmodifizierte Urokinase

Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinasen mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden wurden in genau der gleichen Weise wie in Beispiel 3 unter Verwendung einer Dioxanlösung, enthaltend 400 mg/ml des in Beispiel 7 erhaltenen Polypropylen- <~ glykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazins, in Mengen von 0,05, 0,1 bzw. 0,2 ml erhalten. Das Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils des Triazinderivats betrug 4000. Mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens wurde festgestellt, daß ihre Urokinase-Aktivitäten 89,7» 100,0 und 98,9% im Vergleich mit derjenigen der Ausgangs-

Urokinase betrugen.
20

Beispiel 19

Optimaler pH für modifizierte Urokinase, gemessen als

Amidase-Aktivität

Gemäß Beispiel 9 erhaltene PEG-DCT-UK und unmodifizierte Urokinase wurden jeweils mit physiologischer Salzlösung, enthaltend 0,1% menschliches Albumin, verdünnt, um zwei Lösungen von 167 ΙΕ/ml zu erhalten. Jede der Lösungen wurde in Portionen von 0,3 ml geteilt, welche dann mit 50 ml'I Tris-HCl-Puffern verschiedener pH-Werte (jeweils 1,0 ml) und dann mit einem synthetischen Substrat S-2444 (pyrGlu-Gly-Arg-p-nitroanilid, hergestellt von ICabi Corporation) versetzt v/urdan. Die resultierenden Mischungen wurden 10 min bei 37⁰C inkubiert. Die Reaktionen wurden dann durch Zugabe von 30%iger Essigsäure gestoppt. Deren Extinktion wurde bei 405 nm gemessen. Daraus resultierte, daß die optimalen pH-Werte für PEG-

BAD

CDT-UK iond unmodifizierte Urokinase 8,2 bzw. 8,5 betrugen, gemessen als Amidase-Aktivität, bei Verwendung des synthetischen Substrats S-2444. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt,

Die optimalen pH-Werte für PEG-DCT-L-UK, erhalten gemäß Beispiel 4, und für unmodifizierte, niedermolekulargewichtige Urokinase wurden in ähnlicher Weise als Amidase-Aktivität bestimmt und betrugen 8,2 bzw. 8,4. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 20 Stabilität von modifizierter Urokinase bei Raumtemperatur

Gemäß Beispiel 9 erhaltene PEG-DCT-UK wurde entweder mit einer Ringer-Lösung oder einer physiologischen Salzlösung auf eine Konzentration von 105,3 IE/ml vordünnb. Zum Vergleich wurde ebenfalls unmodifizierte Urokinase-entweder mit einer Ringer-Lösung oder einer physiologischen Salzlösung a\.i£ eine Konzentration von 76,1 IE/ml verdünnt. 3,5 ml jeder der so verdünnten Lösungen wurden 6 h bei Raumtemperatur (27°C) stehengelassen. Die Rest-Urokinaseaktivität wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens periodisch gemessen, bis eine Zeit von 6 h verstrichen war. Das Ausmaß des AktivitätsVerlustes der erfindungsgemäßen, modifizierten Urokinase war weitaus geringer als bei unmodifizierter Urokinase. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 21

Stabilität von modifizierter Urokinase gegenüber Ein-

frier- und Auftaubehandlung

Gemäß Beispiel 10 erhaltene PEG-DCT-L-UK wurde mit physiologischer Salzlösung auf eine Konzentration von 200 IE/ml verdünnt. Zum Vergleich wurde unmodifizierte, niedermolekulargewichtige Urokinase mit physiologischer Salzlösung auf eine Konzentration von 200 IE/ml verdünnt.

BAD ORIGINAL

Jede der so verdünnton Lösungen wurde bei -8O⁰C eingefroren und anschließend bei Rauirrtemperatur aufgetaut. Die Einfrier- und Auftaubehandlungen wurden O, 2, 4 und 6 Mal wiederholt. Die Rest-Urokinaseaktivität wurde unter Verwendung eines synthetischen Substrats S-2444 (hergestellt von Kabi Corporation) gemessen. Das Ausmaß des Aktivitätsverlustes der erfindungsgemäßen, modifizierten Urokinase war extrem niedrig, verglichen mit unmodifizierter, niedermolekulargewichtiger Urokinase. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 22

Acht gesunde, männliche Kaninchen (weiße Japaner) mit einem jeweiligen Körpergewicht von 2,6 bis 3,1 kg wurden in zwei Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde mit 8000 IE/ kg PEG-DCT-UK und die andere mit 8000 IE/kg unmodifizierter Urokinase dosiert, jeweils über die Gehörvenen. Aus den Gehörvenen wurden vor der Dosierung und bei einer Zeit von 1, 2 und 4 h nach der Dosierung Blut gesammelt.

Die Blutproben wurden mit einer Natriumeitratlösung versetzt, um Plasma abzutrennen. Nach Auswaschen der modifizierten und unmodifizierten Urokinasen über 18 Tage wurden die zwei Gruppen miteinander gekreuzt und ähnliche Versuche ausgeführt, um Plasmaproben zu entnehmen. Ein Teil der jeweiligen, so erhaltenen Plasmaproben wurde abgetrennt und der Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung von Lysin-Sepharose 4B unterzogen, wobei eine Plasmin-Inhibitorfraktion (Fraktion F.) und eine Plasmin- und Plasminogen-Fraktion (Fraktion F₇) erhalten wurden.

Änderungen in der Menge an Plasmin-Inhibitor in der Fraktion F₁ im Verlauf der Zeit wurden bestimmt durch Zugabe von Plasmin zur Fraktion F^ und'Messen der Menge an restlichem Plasmin, welches durch den Inhibitor nicht nachteilig beeinflußt wurde, mit einem synthetischen Substrat S-2251 (hergestellt von Kabi Corporation). Der Plasmin-Inhibitor aus der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe zeigte

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scheinbare Abnahme und langsamere Regenerierung. In der unmodifizierte Urokinase-verabreichten Gruppe war die Abnahme deo Plasmin-Inhibitors eher gering und seine Änderungen im Verlauf der Zeit kamen nicht deutlich heraus. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.

Andererseits wurde die Menge an Plasminogen in der Fraktion F-* bestimmt durch Zugabe von Urokinase zur Fraktion F,, um Plasmin zu erzeugen, und Messen der Menge des so erzeugten Plasmins mittels eines synthetischen Substrats S-2251. In der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe verringerte sich das Plasminogen nach 2 h auf etwa 50% und regenerierte sich danach stufenweise. In der unmodifizierte Urokinase-verabreichten Gruppe verringerte sich das Plasminogen jedoch bis zu etwa 65% nach 1 h, nahm jedoch nicht weiter ab. Es war eine Tendenz der Regenerierung von Plasminogen selbst 2 h nach der Dosierung zu beobachten. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt.

Weiterhin wurde ein Teil jedes Plasmas als Probe genommen und mit einer Säure auf pH 5>2 behandelt, um so den darin enthaltenen Inhibitor zu desaktivieren. Dann wurde neutralisiert und die in dem säurebehandelten Plasma vorhandene Menge an Plasminogen gemessen durch Zugabe von Urokinase zu dem säurebehandelten Plasma, um Plasmin zu erzeugen, und durch Messen der Menge des so erzeugten Plasmins unter Verwendung eines synthetischen Substrats S-2251♦ In der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe verringerte sich das Plasminogen auf etwa 70% nach 2 h, zeigte jedoch seine stufenweise Regenerierung danach. In der unmodifizierte Urokinase-verabreichten Gruppe verringerte sich jedoch die Menge an Plasminogen, auf etwa 3h% nach 1 h, nahm jedoch nicht weiter ab. Danach nahm die Menge an Plasminogen stufenweise zu. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Fig. 7 gezeigt. Nebenbei sei bemerkt, daß von der Fraktion F_v keine P'Jasminaktivität festgestellt wurde,

BAD ORIQISSiAL

324017A

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Lyophilisiertes Produkt, das für die Herstellung inji-

zierbarer Formulierungen geeignet ist

Die gemäß Beispiel 9 erhaltene PEG-DCT-UK-Lösung wurde mittels olnen Membranfilters (Amicon Gel, Handelsbezeichnung) konzentriert und dann mit physiologischer Salzlösung und einem 0,05 M Phosphatpuffer versetzt. Die resultierende Mischung wurde unter Verwendung eines Membranfilters keimfrei filtriert. Das Filtrat wurde portionsweise in sterilisierte Ampullen gegossen und dann lyophilisiert. Die fibrinolytische Aktivität des lyophilisierten Produktes aus PEG-DCT-UK für die Herstellung injizierbarer Formulierungen wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 57 000 IE/Ampulle bestimmt.

Beispiel 24

Lyophilisiertes Produkt, das sich zur Herstellung injizierbarer Formulierungen eignet '

Die gemäß Beispiel 9 erhaltene PEG-DCT-UK-Lösung wurde mittels eines Membranfilters (Amicon Gel, Handelsbezeichnung) konzentriert und dann mit physiologischer Salzlösung versetzt. Die resultierende Mischung wurde unter Verwendung eines Membranfilters keimfrei filtriert. Das Filtrat wurde portionsweise in sterilisierte Ampullen gegössen und dann lyophilisiert. Die fibrinolytische Aktivität des so erhaltenen, lyophilisierten Produktes von PEG-DCT-UK, das für die Herstellung injizierbarer Formulierungen geeignet ist, wurde mittels des Fibrin-Platten-

Verfahrens mit 67 000 IE/Ampulle bestimmt. 30

Claims

Patentansprüche

1. Derivat eines vom Menschen stammenden, nichtimmunisierenden Plasminogen-Aktivators, dadurch gekenn-

25 zeichnet, daß es mindestens ein Polyalkylenglykol, das mit mindestens einem Kupplungsmittel an Aminosäure-Seitenketten des Plasminogen-Aktivators gebunden ist, umfaßt, wobei das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20 000 besitzt und wahlweise eine

30 oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituentengruppen enthält»

2. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen™Aktivator Urokinase ist.

3. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenglykol gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Polyäthylen- und Polypropylenglykol, welche wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituentengruppen enthalten können.

4. Derivat nach Anspruch 1 oder 3> dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenglykol ein Polyäthylenglykol-monoalkylather ist.

5. Derivat nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenglykol ein Polypropylenglykol ist.

6. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 10 000 besitzt.

7. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsmittel ein Cyanurhalogenid ist.

8. Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-

1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase, deren Polyäthylenglykol-Anteil ein mittleres Molekulargewicht von 5000 besitzt.

9. Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase, deren Polypropylenglykol-Anteil ein mittleres Molekulargewicht von 4000 besitzt.

10. Verfahren zur Herstellung eines Derivats eines von Menschen stammenden, nicht-immunisierenden Plasminogen- Aktivators , dadurch gekennzeichnet, daß man ein gekuppeltes Produkt aus mindestens einem Polyalkylenglykol und mindestens einem Kupplungsmittel mit einem Plasminogen-Aktivator umsetzt, wobei das Polyalkylenglykol ein

BAD ORIGINAL

Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20 000 besitzt und wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Sübstituentengruppen enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator Urokinase ist,

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das gekuppelt© Produkt und der Plasminogen-Aktivator unter solchen Bedingungen umgesetzt werden, daß der Aktivator nicht seine physiologische Aktivität verliert.

13» Thrombolytisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Derivat eines vom Menschen stammenden, nichtimmunisierenden Plasminogen-Aktivators nach Anspruch 1 umfaßt»