CN114656653B - 一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法 - Google Patents

一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114656653B
CN114656653B CN202210284267.2A CN202210284267A CN114656653B CN 114656653 B CN114656653 B CN 114656653B CN 202210284267 A CN202210284267 A CN 202210284267A CN 114656653 B CN114656653 B CN 114656653B
Authority
CN
China
Prior art keywords
paramyosin
hydrogel
preparation
solution
metal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210284267.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114656653A (zh
Inventor
张拓
尹术华
赵广华
吕晨艳
臧佳辰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202210284267.2A priority Critical patent/CN114656653B/zh
Publication of CN114656653A publication Critical patent/CN114656653A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114656653B publication Critical patent/CN114656653B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法，属于医药生物材料技术领域。该方法从水产品无脊椎动物中提取纯化出副肌球蛋白，加入金属离子诱导副肌球蛋白之间的相互作用驱动自组装，制备成网状疏松多孔的副肌球蛋白水凝胶，可应用于创伤组织或骨骼修复材料的制备。本发明提供的制备方法得到的蛋白水凝胶不仅机械性能稳定、生物相容性好，且具有响应金属离子可逆调控的特性。本发明提供的方法制备工艺简单，能够大规模的生产副肌球蛋白水凝胶，在生物材料领域有着广泛的应用前景。

Description

一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及到一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法。
背景技术
水产品养殖为人类提供优质蛋白，带来巨大的经济效益，副肌球蛋白广泛存在于无脊椎动物水产品中。比较有代表性的非脊椎动物水产养殖品类包括牡蛎、鲍鱼、虾等，其养殖场广泛地分布在世界各地。肌肉蛋白主要由肌原纤维蛋白、肌浆蛋白和肌基质蛋白组成。副肌球蛋白是无脊椎动物所特有的肌肉蛋白组分，是肌原纤维蛋白粗丝的重要组成部分。在牡蛎闭壳肌、鲍鱼、虾肌肉中副肌球蛋白含量较高。在生理状态下，副肌球蛋白主要由a螺旋组成，分子量约为99kDa，通常以二聚体的形式存在，两条a螺旋相互缠绕构成卷曲螺旋。目前，虽然副肌球蛋白的生物学功能还不是很清楚，但是它被认为与双壳类动物的闭壳过程有关，主要是相互聚集的副肌球蛋白能够在较低的能量消耗下将壳在长时间处于紧闭状态。
水凝胶是一种亲水性的三维网状结构材料，含水量高。蛋白水凝胶是以蛋白质或者蛋白质和其他聚合物为构建单元形成，蛋白质这些大分子许多特性使蛋白质水凝胶具有多种功能。蛋白水凝胶具有的生物相容性、生物可降解性等优点，与天然组织和器官相似的机械性能以及对环境的响应能力，使得蛋白水凝胶在组织修复、药物包埋递送、生物传感器、人工肌肉等生物医学方面有着广泛的应用。
副肌球蛋白卷曲螺旋的蛋白结构使其具备一定的凝胶特性。有文献报道，副肌球蛋白在较高温度时可以形成蛋白凝胶，并且具有较高的凝胶强度，然而在低温状态下，结果却相反。但是通过加热使副肌球蛋白变性而形成凝胶，破坏了天然的蛋白质结构，造成在生物材料以及再生医学应用方面具有一定的而局限性。因此，有必要开发一种基于非变性方法制备可逆调控、可注射的副肌球蛋白水凝胶的方法，对提高其在生物医药领域的实际应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的首要目的是在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种金属离子诱导副肌球蛋水凝胶的制备及解离方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
将提取纯化的副肌球蛋白溶液置于透析袋中，在含有金属离子的缓冲溶液中搅拌透析进行交联，将透析后的溶液置于离心管中离心，去除上清溶液，得到副肌球蛋白水凝胶；将所得水凝胶通过透析或者螯合剂去除金属离子可以实现水凝胶解离。
优选的，副肌球蛋白来源于牡蛎、鲍鱼、虾等水产品养殖非脊椎动物。
优选的，所述蛋白溶液中副肌球蛋白的浓度在1～10mg/mL。
优选的，所述蛋白溶液溶解在含NaCl的缓冲溶液中，缓冲体系为10～20 mMTris、HEPES、PBS或者MOPS溶液，NaCl浓度在150～200mM，蛋白溶液的pH为6.0～9.0。
优选的，所述装有蛋白溶液的透析袋分子量为10～100KD。
优选的，所述的搅拌装置为磁力搅拌器，转速为50-200rpm。
优选的，所述的金属离子为Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Mg2+，金属离子的浓度为20～100μM。
优选的，所述的透析缓冲液为10～50mM的Tris、HEPES、PBS或者MOPS，缓冲液的pH为6.0～9.0。
优选的，所述的交联反应条件为透析时间为4～12h，透析3～4次，透析的温度为4～25℃。
优选的，所述的离心条件为8000～12000rpm离心2～10min。
优选的，所述凝胶解离透析缓冲液为10～50mM的Tris、HEPES、PBS 或者MOPS，缓冲液的pH为6.0～9.0，缓冲液中不含金属离子。
优选的，所述凝胶解离金属螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二羟乙基甘氨酸(DEG) 等，浓度为50μM～100mM。
本发明提供一种副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法，采用上述技术方案中所述的方法实现。
本发明提供一种金属离子副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法，通过在反应液中加入微摩级的金属离子，金属离子可以与副肌球蛋白中所含的组氨酸、谷氨酸金属配位，基于配体-金属配位键的交联点，使副肌球蛋白分子之间相互交联形成蛋白水凝胶，通过去除金属离子可以实现水凝胶解离，所制备水凝胶具有可逆调控的能力，通过水凝胶可逆组装可以实现活性物质的包埋。较目前有关通过加热的方法来制备副肌球蛋白水凝胶，本发明能够保持蛋白在天然活性状态形成水凝胶，制备出具有良好生物相容性和生物可降解性以及可逆可注射的副肌球蛋白凝胶。本发明可降低成本，节约能源，符合社会经济可持续发展的目标。这能扩大副肌球蛋白凝胶的应用潜力，适合于生物医学、组织工程等领域。
附图说明
图1为制备的可逆调控的副肌球蛋白水凝胶的实物图；
图2为制备的金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶冷冻干燥后的扫描电镜结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种牡蛎副肌球蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)取若干只太平洋长牡蛎闭壳肌组织，将闭壳肌切成小块组织，于0.15 M pH6.5磷酸盐缓冲溶液中绞碎，冰上均质，离心弃上清；
2)沉淀用预冷的50mM NaHCO3溶液溶解，低温搅拌,离心弃上清；
3)沉淀用预冷的无菌水溶解，低温搅拌,离心弃上清；
4)沉淀用-20℃预冷的丙酮溶解，室温搅拌，离心弃上清，将沉淀用同样的方法再处理3次，最后将收集的沉淀室温过夜干燥，获得的丙酮粉。
5)在丙酮粉加入20mL Buffer G(2mM Tris，0.2mM CaCl2，0.2mM ATP-Na2，0.5mMβ-巯基乙醇pH 8.0)在冰上搅拌，离心收集上清，用DEAE 离子交换层析纯化出副肌球蛋白。
6)将提取纯化的2mg/mL副肌球蛋白溶液置于透析袋中，在100μM ZnCl2，20mMHEPES pH8.0的缓冲溶液中室温搅拌透析4h，将透析后的溶液置于离心管中离心，去除上清溶液，得到副肌球蛋白水凝胶。
实施例2
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(5)中丙酮粉的溶解溶液为20mMTris pH 8.0，其他均与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(6)中副肌球蛋白为5mg/mL，其他均与实施例 1相同。
实施例4
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(6)中Zn2+的浓度为100μM，其他均与实施例1 相同。
实施例5
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(6)中Cu2+的浓度为50μM，其他均与实施例1 相同。
实施例6
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(6)中Co2+的浓度为100μM，其他均与实施例1 相同。
实施例7
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(6)中Ni2+的浓度为100μM，其他均与实施例1 相同。
实施例8
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(6)中Mg2+的浓度为50μM，其他均与实施例1 相同。
实施例9
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(6)中Fe3+的浓度为100μM，其他均与实施例1 相同。
实施例10
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的制备方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除步骤(6)中搅拌透析的时间为12h，透析的温度为4℃，其他均与实施例1相同。
实施例11
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的解离方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除同实施案例1，所制备水凝胶通过50mM Tris-HCl缓冲液pH8.0透析12h，透析温度为4℃，副肌球蛋白水凝胶解离。
实施案例11
本实施例提供了一种副肌球蛋白水凝胶的解离方法。本实施例副肌球蛋白水凝胶的制备方法除同实施案例1，所制备水凝胶通过加入10mM EDTA， 50mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液，副肌球蛋白水凝胶解离。
对比例1
一种金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶的制备方法，制备方法同实施例 1，不同之处在于：步骤(6)中使用10μM CaCl2，20m M HEPES pH8.0溶液。
对比例2
一种金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶的制备方法，制备方法同实施例 1，不同之处在于：步骤(6)不使用任何金属离子。
表1实施例1～10和对比例1～2副肌球蛋白水凝胶的形成情况

Claims (13)

1.一种金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将副肌球蛋白溶液置于透析袋中，在含有金属离子的缓冲液中搅拌透析，将透析后的溶液置于离心管中离心，去除上清溶液，即得副肌球蛋白水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述副肌球蛋白溶液的浓度为1～10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为150～500mMNaCl溶液或者10～50mM HEPES溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述副肌球蛋白溶液pH为6.0～9.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的透析袋的分子量为10～100KD。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的金属离子为Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2 +、Fe3+与Mg2+中的一种或多种，金属离子的浓度为20～100μM。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的透析缓冲液为10～50mM的HEPES、Tris-HCl、PBS或者MOPS，缓冲液的pH为6.0～9.0。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透析用的透析装置为磁力搅拌器，转速为60～200rpm，所述透析的时间为4～12h，透析3～4次，透析的温度为4～25℃。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的离心条件为8000～12000rpm离心2～10min。
10.权利要求1～9任一项所述制备方法得到的金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶。
11.权利要求1所述制备方法制备的副肌球蛋白水凝胶的凝胶解离方法，其特征在于，去除金属离子实现凝胶解离；去除金属离子条件为所述透析缓冲液为10～50mM的HEPES、Tris-HCl、PBS或者MOPS，缓冲液的pH为6.0～9.0，缓冲液中不含金属离子。
12.根据权利要求11所述的凝胶解离方法，其特征在于，去除金属离子条件为添加金属螯合剂；所述金属螯合剂选自氨基酸类金属螯合剂、羟基羧酸类金属螯合剂与羟氨基羧酸类金属螯合剂中的一种或多种；所述氨基羧酸类金属螯合剂选自乙二胺四乙酸；所述羟基羧酸类类金属螯合剂选自柠檬酸、酒石酸与葡萄糖酸中的一种或多种；所述羟氨基羧酸类金属螯合剂选自羟乙基乙二胺三乙酸和/或二羟乙基甘氨酸；所述金属螯合剂的添加浓度为50μM～100mM。
13.权利要求1～9任意一项制备方法所制备的金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶或权利要求10所述的金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶或11或12所述凝胶结力方法解离的水凝胶在制备药物释放载体和生物活性物质传递载体中的应用。
CN202210284267.2A 2022-03-22 2022-03-22 一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法 Active CN114656653B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210284267.2A CN114656653B (zh) 2022-03-22 2022-03-22 一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210284267.2A CN114656653B (zh) 2022-03-22 2022-03-22 一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114656653A CN114656653A (zh) 2022-06-24
CN114656653B true CN114656653B (zh) 2023-08-04

Family

ID=82030992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210284267.2A Active CN114656653B (zh) 2022-03-22 2022-03-22 一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114656653B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1160151A (en) * 1965-10-08 1969-07-30 Diagnostic Data Inc Therapeutically Active Metal Chelates of Proteins
CN101864178A (zh) * 2010-06-17 2010-10-20 复旦大学 一种可注射的化学交联蛋白质/多肽水凝胶及其制备方法
CN102688525A (zh) * 2012-05-07 2012-09-26 东南大学 一种生物大分子水凝胶及其制备方法
WO2013021836A1 (ja) * 2011-08-05 2013-02-14 公立大学法人大阪市立大学 機能性ハイドロゲル
CN109553675A (zh) * 2018-11-02 2019-04-02 广东海洋大学 一种罗非鱼肌球蛋白热诱导凝胶的制备方法
CN109942692A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 上海海洋大学 一种肌肉蛋白纯化方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1160151A (en) * 1965-10-08 1969-07-30 Diagnostic Data Inc Therapeutically Active Metal Chelates of Proteins
CN101864178A (zh) * 2010-06-17 2010-10-20 复旦大学 一种可注射的化学交联蛋白质/多肽水凝胶及其制备方法
WO2013021836A1 (ja) * 2011-08-05 2013-02-14 公立大学法人大阪市立大学 機能性ハイドロゲル
CN102688525A (zh) * 2012-05-07 2012-09-26 东南大学 一种生物大分子水凝胶及其制备方法
CN109942692A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 上海海洋大学 一种肌肉蛋白纯化方法
CN109553675A (zh) * 2018-11-02 2019-04-02 广东海洋大学 一种罗非鱼肌球蛋白热诱导凝胶的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114656653A (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107952115B (zh) 一种仿生生物矿化人工骨修复材料及其制备方法与应用
CA1073360A (en) Non-antigenic collagen and articles of manufacture
US7781158B2 (en) Method of separating collagen from the various animal tissues for producing collagen solution and product using the same
CN1142833B (zh) 聚-β-1→4-N-乙酰基葡糖胺
US4233360A (en) Non-antigenic collagen and articles of manufacture
US4488911A (en) Non-antigenic collagen and articles of manufacture
WO2005079879A1 (ja) コラーゲンゲルおよびその製造方法
JP2006257013A (ja) 魚鱗由来コラーゲンゲルとその作成方法
Abdel-Fattah et al. Influence of the protocol of fibroin extraction on the antibiotic activities of the constructed composites
US20210015966A1 (en) Antibacterial Cellulose Hydrogels and Preparation Method therefor
CN110152055A (zh) 海藻酸胺化衍生物/细菌纤维素纳米晶复合凝胶构筑的功能性药物缓释医用敷料
JP3412014B2 (ja) ハイドロゲルの製造方法および細胞培養支持体
Miao et al. Engineered bone tissues using biomineralized gelatin methacryloyl/sodium alginate hydrogels
CN114656653B (zh) 一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法
CN101856515B (zh) 以壳聚糖和贝壳粉末为原料制备人工骨的方法
JP2012001859A (ja) コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体及びその製造方法
KR100315381B1 (ko) 키토산 마이크로플레이크와 그 제조방법
JP2007297360A (ja) ハイドロゲル、その製造方法およびその用途
JP3471781B2 (ja) 細胞移植片を生成するための３ｄマトリックス
US9737590B2 (en) Self-assembly of collagen fibers from dermis, fascia and tendon for tissue augmentation and coverage of wounds and burns
JP2955653B2 (ja) 絹蛋白質／コラーゲン複合体およびその製造方法
CN108452366B (zh) 一种鳕鱼皮明胶复合止血敷料及其制备方法
CN103923200A (zh) 一种大分子量丝素蛋白冻干粉
CN113999410B (zh) 一种用于烧烫伤创面修复的双交联抗菌水凝胶的制备方法
JP2015213675A (ja) 溶解性コラーゲン線維多孔体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant