JP3471781B2 - 細胞移植片を生成するための３ｄマトリックス - Google Patents
細胞移植片を生成するための３ｄマトリックスInfo
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Description
【０００１】
【発明の分野】この発明は、生体適合性３次元マトリッ
クスを生成するための方法に関し、この発明の方法によ
って得ることのできるマトリックスおよびその使用に関
する。
クスを生成するための方法に関し、この発明の方法によ
って得ることのできるマトリックスおよびその使用に関
する。
【０００２】近年、移植医療の分野で大きな成功が収め
られてきた。しかし、ドナーの臓器の不足のために、移
植を必要とする患者が非常に長い期間移植を待たなけれ
ばならないという問題が生じている。さらなる問題は、
ＡＩＤＳに罹患しているドナーの場合に少なくとも時折
見られたように、ドナーの臓器とともに病原体が伝播さ
れ得ることである。さらに、移植された臓器は受容者の
免疫系によって異物としてみなされる。したがって移植
後、拒絶反応を抑制するために患者は免疫抑制剤に頼っ
ている。近年、細胞培養から人工の臓器を培養する試み
がなされ、いくつかの分野において大きな成功が収めら
れてきた。ここでは、必要なものに関して適切な形状に
され得る３次元マトリックス（たとえば耳の形等）上で
細胞を培養する。次に、この人工の臓器または身体の一
部が移植され得る。内因性細胞を用いると、それらが受
容者の免疫系によって異物としてみなされることはな
く、つまり、拒絶反応が起こるおそれがなくなる。
られてきた。しかし、ドナーの臓器の不足のために、移
植を必要とする患者が非常に長い期間移植を待たなけれ
ばならないという問題が生じている。さらなる問題は、
ＡＩＤＳに罹患しているドナーの場合に少なくとも時折
見られたように、ドナーの臓器とともに病原体が伝播さ
れ得ることである。さらに、移植された臓器は受容者の
免疫系によって異物としてみなされる。したがって移植
後、拒絶反応を抑制するために患者は免疫抑制剤に頼っ
ている。近年、細胞培養から人工の臓器を培養する試み
がなされ、いくつかの分野において大きな成功が収めら
れてきた。ここでは、必要なものに関して適切な形状に
され得る３次元マトリックス（たとえば耳の形等）上で
細胞を培養する。次に、この人工の臓器または身体の一
部が移植され得る。内因性細胞を用いると、それらが受
容者の免疫系によって異物としてみなされることはな
く、つまり、拒絶反応が起こるおそれがなくなる。
【０００３】マトリックスのための公知の材料の例は、
キトサンと混合されたコラーゲンまたはアルギナートで
ある。しかし、特にコラーゲンは人間の患者用のインプ
ラントを生成するために好まれて用いられてはいない。
なぜならば、それはウシ軟骨から生成されるためにＢＳ
Ｅのリスクを伴うからである。
キトサンと混合されたコラーゲンまたはアルギナートで
ある。しかし、特にコラーゲンは人間の患者用のインプ
ラントを生成するために好まれて用いられてはいない。
なぜならば、それはウシ軟骨から生成されるためにＢＳ
Ｅのリスクを伴うからである。
【０００４】有望なマトリックス材料としてキトサンが
注目されてきた。キトサンは部分的に脱アセチル化され
たキチンであり、節足動物の外骨格から得られる。それ
は、医療分野でたとえば縫合材料としてまたはカプセル
薬のために用いられるアミノ多糖類（ポリ−１−４−グ
ルコサミン）である。その利点は身体がそれを完全に吸
収できることである。キトサンは、遊離アミノ基のプロ
トン化によってわずかに酸性の状態下で（ｐＨ＜６）水
に溶解され得る。キトサンはアルカリ状態下で（ｐＨ＞
７）水溶液から再沈殿する。このｐＨ依存性メカニズム
は、キトサンがマイルドな条件で精製されて処理され得
ることを意味する。
注目されてきた。キトサンは部分的に脱アセチル化され
たキチンであり、節足動物の外骨格から得られる。それ
は、医療分野でたとえば縫合材料としてまたはカプセル
薬のために用いられるアミノ多糖類（ポリ−１−４−グ
ルコサミン）である。その利点は身体がそれを完全に吸
収できることである。キトサンは、遊離アミノ基のプロ
トン化によってわずかに酸性の状態下で（ｐＨ＜６）水
に溶解され得る。キトサンはアルカリ状態下で（ｐＨ＞
７）水溶液から再沈殿する。このｐＨ依存性メカニズム
は、キトサンがマイルドな条件で精製されて処理され得
ることを意味する。
【０００５】米国特許第５，８７１，９８５号は、その
中へと細胞が成長したマトリックスからなる、患者への
移植のためのビヒクルを提案している。この目的のため
にまず、生細胞を含むキトサン溶液を生成する。次に、
この溶液を半透性の膜に入れれてビヒクルを形成する。
キトサンは沈殿し、細胞がそこに分配される非架橋マト
リックスを形成する。
中へと細胞が成長したマトリックスからなる、患者への
移植のためのビヒクルを提案している。この目的のため
にまず、生細胞を含むキトサン溶液を生成する。次に、
この溶液を半透性の膜に入れれてビヒクルを形成する。
キトサンは沈殿し、細胞がそこに分配される非架橋マト
リックスを形成する。
【０００６】マディハリー他（Madihally et al.）（生
体材料（Biomaterials）１９９９：２０（１２）、第１
１３３頁から第１１４２頁）は、組織再生のためのマト
リックスを記載している。この目的のために、８５−９
０％脱アセチル化されたキトサンを０．２Ｍ酢酸中に溶
解し、結果として１重量％から３重量％のキトサン含有
溶液を得る。その溶液を凍結(freeze)し、凍結乾燥(lyo
philization)によって水と過剰な酢酸とを除去する。形
成される孔の形状はこの場合には凍結乾燥条件によって
影響され得る。結果として得られるマトリックス内の孔
の平均的な直径は４０から２５０μｍの範囲内にある。
凍結乾燥されたばかりのマトリックスは堅く非弾性であ
ると記載されている。中性水性媒質中での水和時に、キ
トサンは急速に膨潤し、最終的に溶解する。キトサン構
造がさらに溶解することは、希ＮａＯＨ中での平衡によ
って、またはたとえば１００、７０、５０、０％のエタ
ノール系で洗浄することによって、回避され得る。この
目的のために、凍結乾燥されたマトリックスは０．０５
Ｍ ＮａＯＨ中で約１０分間平衡化され、水およびＰＢ
Ｓ（リン酸緩衝化生理食塩水）によって洗浄される。し
かし、希ＮａＯＨ中での平衡時にマトリックスは縮み、
ｐＨを７にまで減じた時に部分的にのみ可逆性の構造上
の変化を生じる。加えて、マトリックスには多くの空気
が含まれる。より良い結果はエタノール系を用いての平
衡によって得られる。空気を除去するためにまず、無水
アルコールでの洗浄時に短時間だけ真空(vacuum)を適用
する。言及されているさらなる利点は、アルコールでの
処理による平衡の間にマトリックスの滅菌がなされるこ
とである。しかし、その方法は比較的複雑である。たと
えエタノール系によって膜を安定化させても、孔構造上
の変化は起こる。なぜならば、キトサンが局部的に水に
よって溶解することもあり、したがって孔構造が部分的
に破壊されるためである。水和されたマトリックスは柔
らかく可撓性があるとして記載されているが、それは低
い強度を示すのみである。これによってマトリックスの
処理が著しく妨害される。たとえば軟骨細胞(cartilage
cells)を培養して軟骨を形成するために、適切な形状
になるようにマトリックスを切断すると、それは非常に
たやすく破壊される。同様に、取扱いのために、たとえ
ば出来たての培養培地へと移される時にマトリックスが
たやすく複数の切片へと破壊されるので、細胞の培養が
困難になる。このことは、規定された構造を備えるイン
プラントは公知のキトサンマトリックスによって生成可
能ではあるがそれには大きな困難が伴うことを意味す
る。加えて、マディハリー他はミクロキャリアの生成を
記載している。この目的のために、たとえば液体窒素中
で数滴のキトサン水溶液を直接凍結させるか、または凍
結の前に、ＮａＯＨを用いたアルカリ状態下でそれをゲ
ルとして沈殿させる。より大きな構造は記載されていな
い。
体材料（Biomaterials）１９９９：２０（１２）、第１
１３３頁から第１１４２頁）は、組織再生のためのマト
リックスを記載している。この目的のために、８５−９
０％脱アセチル化されたキトサンを０．２Ｍ酢酸中に溶
解し、結果として１重量％から３重量％のキトサン含有
溶液を得る。その溶液を凍結(freeze)し、凍結乾燥(lyo
philization)によって水と過剰な酢酸とを除去する。形
成される孔の形状はこの場合には凍結乾燥条件によって
影響され得る。結果として得られるマトリックス内の孔
の平均的な直径は４０から２５０μｍの範囲内にある。
凍結乾燥されたばかりのマトリックスは堅く非弾性であ
ると記載されている。中性水性媒質中での水和時に、キ
トサンは急速に膨潤し、最終的に溶解する。キトサン構
造がさらに溶解することは、希ＮａＯＨ中での平衡によ
って、またはたとえば１００、７０、５０、０％のエタ
ノール系で洗浄することによって、回避され得る。この
目的のために、凍結乾燥されたマトリックスは０．０５
Ｍ ＮａＯＨ中で約１０分間平衡化され、水およびＰＢ
Ｓ（リン酸緩衝化生理食塩水）によって洗浄される。し
かし、希ＮａＯＨ中での平衡時にマトリックスは縮み、
ｐＨを７にまで減じた時に部分的にのみ可逆性の構造上
の変化を生じる。加えて、マトリックスには多くの空気
が含まれる。より良い結果はエタノール系を用いての平
衡によって得られる。空気を除去するためにまず、無水
アルコールでの洗浄時に短時間だけ真空(vacuum)を適用
する。言及されているさらなる利点は、アルコールでの
処理による平衡の間にマトリックスの滅菌がなされるこ
とである。しかし、その方法は比較的複雑である。たと
えエタノール系によって膜を安定化させても、孔構造上
の変化は起こる。なぜならば、キトサンが局部的に水に
よって溶解することもあり、したがって孔構造が部分的
に破壊されるためである。水和されたマトリックスは柔
らかく可撓性があるとして記載されているが、それは低
い強度を示すのみである。これによってマトリックスの
処理が著しく妨害される。たとえば軟骨細胞(cartilage
cells)を培養して軟骨を形成するために、適切な形状
になるようにマトリックスを切断すると、それは非常に
たやすく破壊される。同様に、取扱いのために、たとえ
ば出来たての培養培地へと移される時にマトリックスが
たやすく複数の切片へと破壊されるので、細胞の培養が
困難になる。このことは、規定された構造を備えるイン
プラントは公知のキトサンマトリックスによって生成可
能ではあるがそれには大きな困難が伴うことを意味す
る。加えて、マディハリー他はミクロキャリアの生成を
記載している。この目的のために、たとえば液体窒素中
で数滴のキトサン水溶液を直接凍結させるか、または凍
結の前に、ＮａＯＨを用いたアルカリ状態下でそれをゲ
ルとして沈殿させる。より大きな構造は記載されていな
い。
【０００７】
【発明の概要】この発明の目的は、必要とされる労力が
より少なく安定した柔らかいマトリックスをもたらす、
生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法を
提供することである。
より少なく安定した柔らかいマトリックスをもたらす、
生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法を
提供することである。
【０００８】この目的は、キトサンと過剰な酸とから水
溶液を調製し、その水溶液を中和し、その中和された水
溶液を凍結し、減圧下での昇華によって水を除去する、
生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法を
用いたこの発明の第１の実施例に従って達成される。
溶液を調製し、その水溶液を中和し、その中和された水
溶液を凍結し、減圧下での昇華によって水を除去する、
生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法を
用いたこの発明の第１の実施例に従って達成される。
【０００９】同等の特性を備える３次元のマトリックス
は、キトサンと、アルキルヒドロキシカルボン酸および
アリールヒドロキシカルボン酸からなる群より選択され
る過剰な酸とから水溶液を調製し、その水溶液を凍結
し、減圧下での昇華によって水を除去し、昇華による除
去の前またはその後に過剰な酸を除去する、生体適合性
３次元マトリックスを生成するための方法を用いたこの
発明の第２の実施例に従って得られる。
は、キトサンと、アルキルヒドロキシカルボン酸および
アリールヒドロキシカルボン酸からなる群より選択され
る過剰な酸とから水溶液を調製し、その水溶液を凍結
し、減圧下での昇華によって水を除去し、昇華による除
去の前またはその後に過剰な酸を除去する、生体適合性
３次元マトリックスを生成するための方法を用いたこの
発明の第２の実施例に従って得られる。
【００１０】この発明の方法においてまず、部分的に脱
アセチル化されたキトサンと過剰に存在する酸とから水
溶液を調製する。過剰とは、ここでは水溶液のｐＨが酸
性の範囲にあることを意味し、好ましくはｐＨ４より低
いことを意味する。これは、キトサン中の遊離アミノ基
が少なくとも部分的にプロトン化され、これによって水
中での溶解度が増すことを意味する。酸の量は重要では
ない。それはキトサンが溶解するように選ばれさえすれ
ばよい。酸を過剰に加えることは可能であれば避けられ
る。なぜならば、過剰な酸は再び除去しなければなら
ず、したがって酸の量が多ければ作業が困難になるため
である。結果として０．０５から１Ｎ、好ましくは０．
１から０．５Ｎ、特に０．１から０．３Ｎになる酸の量
が好ましい。
アセチル化されたキトサンと過剰に存在する酸とから水
溶液を調製する。過剰とは、ここでは水溶液のｐＨが酸
性の範囲にあることを意味し、好ましくはｐＨ４より低
いことを意味する。これは、キトサン中の遊離アミノ基
が少なくとも部分的にプロトン化され、これによって水
中での溶解度が増すことを意味する。酸の量は重要では
ない。それはキトサンが溶解するように選ばれさえすれ
ばよい。酸を過剰に加えることは可能であれば避けられ
る。なぜならば、過剰な酸は再び除去しなければなら
ず、したがって酸の量が多ければ作業が困難になるため
である。結果として０．０５から１Ｎ、好ましくは０．
１から０．５Ｎ、特に０．１から０．３Ｎになる酸の量
が好ましい。
【００１１】特に好適な酸は乳酸である。したがって完
成したマトリックスはキトサンの対イオンとして乳酸イ
オンを含む。この場合、マトリックスは特に柔らかく弾
性である。
成したマトリックスはキトサンの対イオンとして乳酸イ
オンを含む。この場合、マトリックスは特に柔らかく弾
性である。
【００１２】キトサンの量は好ましくは、結果として
０．０１から５重量％の濃度に、好ましくは０．５から
１重量％の濃度になるように選ばれる。キトサン溶液の
濃度によって、マトリックスの構造、特にその孔サイズ
に影響がもたらされ得る。この方法で、マトリックスを
コロニー化する予定の、特定の細胞型にマトリックスの
孔サイズを適応させることができる。
０．０１から５重量％の濃度に、好ましくは０．５から
１重量％の濃度になるように選ばれる。キトサン溶液の
濃度によって、マトリックスの構造、特にその孔サイズ
に影響がもたらされ得る。この方法で、マトリックスを
コロニー化する予定の、特定の細胞型にマトリックスの
孔サイズを適応させることができる。
【００１３】キトサンは天然資源から生成されるため、
均一な分子量を有さない。分子量は、供給元および製法
に依存して２０ｋＤａから１０００ｋＤａを超えるもの
であり得る。３次元マトリックスを生成するためのキト
サンはその分子量に関していかなる制約も受けない。
均一な分子量を有さない。分子量は、供給元および製法
に依存して２０ｋＤａから１０００ｋＤａを超えるもの
であり得る。３次元マトリックスを生成するためのキト
サンはその分子量に関していかなる制約も受けない。
【００１４】凍結後、減圧下での昇華によって水を除去
する。好適な圧力範囲は０．００１から３ｈＰａであ
る。精密な条件は水溶液の組成に影響される。揮発性酸
を用いた場合には、それは凍結乾燥の間に少なくとも部
分的に共蒸発する場合もある。
する。好適な圧力範囲は０．００１から３ｈＰａであ
る。精密な条件は水溶液の組成に影響される。揮発性酸
を用いた場合には、それは凍結乾燥の間に少なくとも部
分的に共蒸発する場合もある。
【００１５】塩基を加えて水溶液のｐＨを５．０から
７．５、好ましくは５．５から７．０、特に６．０から
７．０に調整することによって、凍結の前に過剰の酸を
除去することが好まれる。その寸法安定性に関して非常
に優れた特性を備えるマトリックスが得られる。マトリ
ックスは再水和時に縮まず、いかなる構造的な変化も示
さない。この安定した挙動は、水溶液のｐＨが凍結の前
に６．０から７．０である場合に特に顕著である。キト
サンはこの範囲内で沈殿し始める。中性状態下でゲルま
たは微細な懸濁液が形成され、これは凍結乾燥されたマ
トリックスの構造に有益な効果をもたらすと考えられ
る。中和されたキトサン水溶液はこのようにして懸濁液
を形成する。したがって、水溶液はキトサン濃度に依存
して中和時に濁る場合もある。
７．５、好ましくは５．５から７．０、特に６．０から
７．０に調整することによって、凍結の前に過剰の酸を
除去することが好まれる。その寸法安定性に関して非常
に優れた特性を備えるマトリックスが得られる。マトリ
ックスは再水和時に縮まず、いかなる構造的な変化も示
さない。この安定した挙動は、水溶液のｐＨが凍結の前
に６．０から７．０である場合に特に顕著である。キト
サンはこの範囲内で沈殿し始める。中性状態下でゲルま
たは微細な懸濁液が形成され、これは凍結乾燥されたマ
トリックスの構造に有益な効果をもたらすと考えられ
る。中和されたキトサン水溶液はこのようにして懸濁液
を形成する。したがって、水溶液はキトサン濃度に依存
して中和時に濁る場合もある。
【００１６】マディハリー他が提案するような方法で
は、マトリックスは、ＮａＯＨ水溶液を用いての平衡に
よる過剰な酢酸の中和時に構造上の大きな変化を経験す
る。推定されるところによると、この水溶液を加えるこ
とによってキトサンの局所的な溶解がもたらされ、Ｎａ
ＯＨによってそれが再沈殿する。このようにしてマトリ
ックスの孔構造が変化する。
は、マトリックスは、ＮａＯＨ水溶液を用いての平衡に
よる過剰な酢酸の中和時に構造上の大きな変化を経験す
る。推定されるところによると、この水溶液を加えるこ
とによってキトサンの局所的な溶解がもたらされ、Ｎａ
ＯＨによってそれが再沈殿する。このようにしてマトリ
ックスの孔構造が変化する。
【００１７】この発明の発明者が発見した方法を用いる
と、凍結乾燥による水の除去の後のマトリックスのさら
なる処理の時に構造的変化が全く起こらないかまたはず
っと小さな構造的変化しか起こらないように、マトリッ
クスを安定化させることができる。
と、凍結乾燥による水の除去の後のマトリックスのさら
なる処理の時に構造的変化が全く起こらないかまたはず
っと小さな構造的変化しか起こらないように、マトリッ
クスを安定化させることができる。
【００１８】この発明の方法の第１の実施例では、キト
サン溶液はたとえ凍結および凍結乾燥の前でも中性のｐ
Ｈを有する。「中性ｐＨ」とはこの場合、上述の範囲内
にあるｐＨを意味する。したがって、凍結乾燥後に塩基
を用いてマトリックスを平衡化する必要はもはやない。
極めて重要なポイントは、キトサン溶液が適切に中和さ
れてキトサンがゲルとして沈殿することである。中和が
慎重に行なわれない場合には、結果として得られるマト
リックスは再水和時に再び溶解する。この発明の方法の
第１の実施例では、酸は第１の例においてはいかなる特
定の制約にも影響されない。
サン溶液はたとえ凍結および凍結乾燥の前でも中性のｐ
Ｈを有する。「中性ｐＨ」とはこの場合、上述の範囲内
にあるｐＨを意味する。したがって、凍結乾燥後に塩基
を用いてマトリックスを平衡化する必要はもはやない。
極めて重要なポイントは、キトサン溶液が適切に中和さ
れてキトサンがゲルとして沈殿することである。中和が
慎重に行なわれない場合には、結果として得られるマト
リックスは再水和時に再び溶解する。この発明の方法の
第１の実施例では、酸は第１の例においてはいかなる特
定の制約にも影響されない。
【００１９】キトサン水溶液を調製するために、無機酸
および有機酸、好ましくはアルキルカルボン酸およびア
リールカルボン酸、特にヒドロキシカルボン酸からなる
群より選択される酸を用いることができる。乳酸が特に
好まれる。
および有機酸、好ましくはアルキルカルボン酸およびア
リールカルボン酸、特にヒドロキシカルボン酸からなる
群より選択される酸を用いることができる。乳酸が特に
好まれる。
【００２０】無機酸の例は、塩酸、リン酸、および酸性
のリン酸塩である。有機酸の例は、１から１２の炭素原
子を有するアルキルカルボン酸であり、アルキル鎖は直
鎖または分枝鎖であり得る。例としては、ギ酸、酢酸、
プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ペプタン
酸、およびより高級の直鎖カルボン酸である。他に好適
なものは、シュウ酸、コハク酸、またはアジピン酸等
の、２から８の炭素原子を有するジカルボン酸である。
さらに他に好適なものは、安息香酸またはナフトエ酸等
の芳香族カルボン酸である。さらに、グルタミン酸また
はアスパラギン酸等のアミノ酸も好適である。
のリン酸塩である。有機酸の例は、１から１２の炭素原
子を有するアルキルカルボン酸であり、アルキル鎖は直
鎖または分枝鎖であり得る。例としては、ギ酸、酢酸、
プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ペプタン
酸、およびより高級の直鎖カルボン酸である。他に好適
なものは、シュウ酸、コハク酸、またはアジピン酸等
の、２から８の炭素原子を有するジカルボン酸である。
さらに他に好適なものは、安息香酸またはナフトエ酸等
の芳香族カルボン酸である。さらに、グルタミン酸また
はアスパラギン酸等のアミノ酸も好適である。
【００２１】しかし、ヒドロキシカルボン酸を用いると
特に優れた結果が得られる。特に好適なものは２から１
２の炭素原子を有するヒドロキシカルボン酸である。分
子内に１つ以上のヒドロキシル基と１つ以上のカルボキ
シル基とが存在し得る。例としては、グリコール酸、乳
酸、リンゴ酸、酒石酸、およびクエン酸である。たとえ
ばマンデル酸等の芳香族ヒドロキシカルボン酸を用いる
ことも可能である。
特に優れた結果が得られる。特に好適なものは２から１
２の炭素原子を有するヒドロキシカルボン酸である。分
子内に１つ以上のヒドロキシル基と１つ以上のカルボキ
シル基とが存在し得る。例としては、グリコール酸、乳
酸、リンゴ酸、酒石酸、およびクエン酸である。たとえ
ばマンデル酸等の芳香族ヒドロキシカルボン酸を用いる
ことも可能である。
【００２２】用いられ得る塩基は、たとえば、ＮａＯＨ
等のアルカリ金属水酸化物などの従来の塩基である。塩
基は、中性のｐＨが無理なく調整され得るように選ばれ
るべきである。
等のアルカリ金属水酸化物などの従来の塩基である。塩
基は、中性のｐＨが無理なく調整され得るように選ばれ
るべきである。
【００２３】改善された構造を備えるマトリックスを得
るためにさらに、水中でキトサンを溶解するために用い
られる酸でマトリックスを安定化させる。
るためにさらに、水中でキトサンを溶解するために用い
られる酸でマトリックスを安定化させる。
【００２４】意外なことには、キトサンマトリックスの
特性は対イオンの選択によって影響され得ることが明ら
かになった。これはこの発明の方法の第２の実施例で利
用される。この場合に用いられる酸はヒドロキシカルボ
ン酸である。キトサンのプロトン化されたアミノ基に対
する対イオンが乳酸アニオンとそれとによって形成され
るような乳酸を用いたときに特に、非常に優れた特性が
得られる。マトリックスは高い温度耐性を示し、無理な
くたとえばオートクレーブ処理され得る。この間にマト
リックスの変色、またはマトリックスの分解という他の
兆候が現われることはない。マトリックスはまた高い弾
性および機械的強度を示す。したがって、ペトリ皿に水
性キトサン／乳酸溶液を注ぎ次に凍結させて凍結乾燥す
ることによって得られるシート様マトリックスを、無理
なく、マトリックスを破損させずに巻くことができる。
特性は対イオンの選択によって影響され得ることが明ら
かになった。これはこの発明の方法の第２の実施例で利
用される。この場合に用いられる酸はヒドロキシカルボ
ン酸である。キトサンのプロトン化されたアミノ基に対
する対イオンが乳酸アニオンとそれとによって形成され
るような乳酸を用いたときに特に、非常に優れた特性が
得られる。マトリックスは高い温度耐性を示し、無理な
くたとえばオートクレーブ処理され得る。この間にマト
リックスの変色、またはマトリックスの分解という他の
兆候が現われることはない。マトリックスはまた高い弾
性および機械的強度を示す。したがって、ペトリ皿に水
性キトサン／乳酸溶液を注ぎ次に凍結させて凍結乾燥す
ることによって得られるシート様マトリックスを、無理
なく、マトリックスを破損させずに巻くことができる。
【００２５】この発明の方法の第２の実施例では、たと
えキトサン溶液が凍結の前に中和されなくても、ヒドロ
キシアルキルカルボン酸またはヒドロキシアリールカル
ボン酸の安定効果が現れる。凍結乾燥後、たとえば０．
０５Ｎ ＮａＯＨ等の塩基を用いての平衡によって、依
然として存在する過剰な酸の残留物を除去する。次に、
リン酸緩衝液（０．１Ｎ、約７のｐＨ）を含み得る水で
マトリックスを洗浄する。この場合、マトリックスの構
造的変化はマディハリーが記載しているマトリックスで
の場合よりもかなり少ない。この発明の方法の第２の実
施例において凍結の前にキトサン溶液を中和することが
特に有利である。アルカリ状態下での平衡はもはや必要
ではなくなる。直接マトリックスをさらに処理すること
ができる。たとえば、それを細胞によってコロニー化す
ることができる。
えキトサン溶液が凍結の前に中和されなくても、ヒドロ
キシアルキルカルボン酸またはヒドロキシアリールカル
ボン酸の安定効果が現れる。凍結乾燥後、たとえば０．
０５Ｎ ＮａＯＨ等の塩基を用いての平衡によって、依
然として存在する過剰な酸の残留物を除去する。次に、
リン酸緩衝液（０．１Ｎ、約７のｐＨ）を含み得る水で
マトリックスを洗浄する。この場合、マトリックスの構
造的変化はマディハリーが記載しているマトリックスで
の場合よりもかなり少ない。この発明の方法の第２の実
施例において凍結の前にキトサン溶液を中和することが
特に有利である。アルカリ状態下での平衡はもはや必要
ではなくなる。直接マトリックスをさらに処理すること
ができる。たとえば、それを細胞によってコロニー化す
ることができる。
【００２６】この発明の方法の両方の実施例の結果とし
て、柔らかく曲げやすい、均一な孔構造を備えるマトリ
ックスが得られる。たとえばマトリックスが指からの圧
力によって圧縮されると、圧力がなくなった後それは再
び弾性的に元の形状を取り戻す。破壊または砕くことな
しにマトリックスを成形すること、たとえばそれを巻く
ことができる。
て、柔らかく曲げやすい、均一な孔構造を備えるマトリ
ックスが得られる。たとえばマトリックスが指からの圧
力によって圧縮されると、圧力がなくなった後それは再
び弾性的に元の形状を取り戻す。破壊または砕くことな
しにマトリックスを成形すること、たとえばそれを巻く
ことができる。
【００２７】細胞の合着アセンブリを形成するために
は、細胞によるコロニー化の間にマトリックスが十分な
強度を有し、非常に長い時間をかけないと崩壊(breakdo
wn)しないようにすることが必要である。崩壊の速度
は、キトサンの脱アセチル化の程度によって制御され得
る。非常に高い程度でアセチル化されたキトサンを用い
ると、１ヶ月よりも長い崩壊の期間を達成することがで
きる。
は、細胞によるコロニー化の間にマトリックスが十分な
強度を有し、非常に長い時間をかけないと崩壊(breakdo
wn)しないようにすることが必要である。崩壊の速度
は、キトサンの脱アセチル化の程度によって制御され得
る。非常に高い程度でアセチル化されたキトサンを用い
ると、１ヶ月よりも長い崩壊の期間を達成することがで
きる。
【００２８】キトサンの脱アセチル化の程度が≦８０％
である場合、マトリックスは特に高い吸収性を有すると
いうことが確認される。脱アセチル化の程度はキトサン
のＮアセチル基に関係する。脱アセチル化の程度とは、
存在する全アミノ基（遊離アミノ基とアセチル化された
アミノ基とのトータル）に対するアセチル化されていな
いアミノ基の比率を意味する。≦８０％の脱アセチル化
の程度ではアモルファス構造がマトリックスの広範囲で
形成されると仮定される。これらのアモルファス区域は
推定されるところによると酵素によってさらに攻撃され
得る。したがって、マトリックスが体内に吸収されかつ
特定のニーズに関して調整される速度に影響を及ぼすこ
とが可能である。
である場合、マトリックスは特に高い吸収性を有すると
いうことが確認される。脱アセチル化の程度はキトサン
のＮアセチル基に関係する。脱アセチル化の程度とは、
存在する全アミノ基（遊離アミノ基とアセチル化された
アミノ基とのトータル）に対するアセチル化されていな
いアミノ基の比率を意味する。≦８０％の脱アセチル化
の程度ではアモルファス構造がマトリックスの広範囲で
形成されると仮定される。これらのアモルファス区域は
推定されるところによると酵素によってさらに攻撃され
得る。したがって、マトリックスが体内に吸収されかつ
特定のニーズに関して調整される速度に影響を及ぼすこ
とが可能である。
【００２９】マトリックスの孔サイズはさらに、キトサ
ン水溶液が凍結される速度によって影響を及ぼされ得
る。この点について、たとえば液体窒素中での急速凍結
の結果として小さな孔直径が得られ、一方で、たとえば
−３０から−１５℃の範囲での緩慢凍結の結果としてよ
り大きな孔が得られる。キトサン溶液を凍結するための
温度は−２００℃から−０℃、好ましくは−９０℃から
−１０℃、特に好ましくは−４０℃から−１５℃の範囲
で、好ましくは選ばれる。
ン水溶液が凍結される速度によって影響を及ぼされ得
る。この点について、たとえば液体窒素中での急速凍結
の結果として小さな孔直径が得られ、一方で、たとえば
−３０から−１５℃の範囲での緩慢凍結の結果としてよ
り大きな孔が得られる。キトサン溶液を凍結するための
温度は−２００℃から−０℃、好ましくは−９０℃から
−１０℃、特に好ましくは−４０℃から−１５℃の範囲
で、好ましくは選ばれる。
【００３０】上述の方法を用いて得ることのできるマト
リックスは、先行技術で公知のマトリックスと比較して
非常に優れた特性を有する。したがって、この発明は上
述の方法を用いて得られるようなマトリックスにも関す
る。マトリックスは寸法的に安定していて、柔らかく、
かつ可撓性があるため、容易に処理され得る。それはた
とえば容易に所望の形状に切断され得る。分解反応を起
こすことなしにそれをオートクレーブ処理することがで
き、したがって容易に滅菌することができる。マトリッ
クスを安定化させるために、コラーゲンまたはアルギナ
ートのさらなる物質が必要とされることはない。アセチ
ル化の程度、したがってたとえばマトリックスの吸収性
を制約なしに選ぶことができ、したがってそれを特定の
要件に調整することができる。マトリックスの構造、特
に孔サイズは、キトサン水溶液の濃度と凍結条件とによ
って影響され得る。
リックスは、先行技術で公知のマトリックスと比較して
非常に優れた特性を有する。したがって、この発明は上
述の方法を用いて得られるようなマトリックスにも関す
る。マトリックスは寸法的に安定していて、柔らかく、
かつ可撓性があるため、容易に処理され得る。それはた
とえば容易に所望の形状に切断され得る。分解反応を起
こすことなしにそれをオートクレーブ処理することがで
き、したがって容易に滅菌することができる。マトリッ
クスを安定化させるために、コラーゲンまたはアルギナ
ートのさらなる物質が必要とされることはない。アセチ
ル化の程度、したがってたとえばマトリックスの吸収性
を制約なしに選ぶことができ、したがってそれを特定の
要件に調整することができる。マトリックスの構造、特
に孔サイズは、キトサン水溶液の濃度と凍結条件とによ
って影響され得る。
【００３１】マトリックスが対イオンとして乳酸アニオ
ンを有する場合には、寸法的に非常に安定した可撓性の
あるマトリックスが得られる。
ンを有する場合には、寸法的に非常に安定した可撓性の
あるマトリックスが得られる。
【００３２】マトリックスは所望であれば多数のアミノ
基によって修飾され得る。３次元マトリックスの好まし
い実施例では、リガンドがキトサンマトリックス、好ま
しくはキトサンの遊離アミノ基に共有結合または非共有
結合される。用いられ得るリガンドはたとえば、増殖プ
ロモータ、タンパク質、ホルモン、ヘパリン、硫酸ヘパ
リン、コンドロイチン硫酸、硫酸デキストラン、または
これらの物質の混合である。リガンドは好ましくは細胞
増殖を制御し改善させるように働く。
基によって修飾され得る。３次元マトリックスの好まし
い実施例では、リガンドがキトサンマトリックス、好ま
しくはキトサンの遊離アミノ基に共有結合または非共有
結合される。用いられ得るリガンドはたとえば、増殖プ
ロモータ、タンパク質、ホルモン、ヘパリン、硫酸ヘパ
リン、コンドロイチン硫酸、硫酸デキストラン、または
これらの物質の混合である。リガンドは好ましくは細胞
増殖を制御し改善させるように働く。
【００３３】マトリックス上の細胞増殖はさらに、マト
リックスが自己フィブリンによってコーティングされる
と改善される。
リックスが自己フィブリンによってコーティングされる
と改善される。
【００３４】この発明の３次元マトリックスは培養リア
クタ（細胞ファクトリー）内の固相として用いられ得
る。マトリックスは培養培地内で非常に高い強度を示
す。マトリックスは細胞増殖を促進することも明らかに
なった。
クタ（細胞ファクトリー）内の固相として用いられ得
る。マトリックスは培養培地内で非常に高い強度を示
す。マトリックスは細胞増殖を促進することも明らかに
なった。
【００３５】マトリックスは細胞増殖を促す。したがっ
てそれは直接、つまり前段階の細胞によるコロニー化な
しに、インプラントされ得る。インプラント後、内因性
細胞が増殖し、マトリックスは漸進的に溶解する。
てそれは直接、つまり前段階の細胞によるコロニー化な
しに、インプラントされ得る。インプラント後、内因性
細胞が増殖し、マトリックスは漸進的に溶解する。
【００３６】マトリックスはまた細胞インプラントとし
ての用途に好適であり、特に軟骨(cartilage)形成細胞
のために好適である。この点に関して、遺伝子的に変更
された細胞のいずれも用いないことが好まれる。好まし
くは、生検によって患者から細胞を採取してそれを細胞
マトリックス上で培養し、次に細胞インプラントを患者
にインプラントする。移植による拒絶反応は以下のもの
のために実質的に防がれる。すなわち、周辺組織のそれ
ぞれの増殖因子に促されて移植部位のみで分化する内因
性幹細胞（代用骨）による、３次元マトリックスのコロ
ニー化と、ヒアリン軟骨のさらなる形成のための、軟骨
細胞(cartilage cells)によるコロニー化とのために、
拒絶反応が防がれる。これは種々のプラスチックまたは
セラミックから作られる以前のマトリックスと比較して
非常に大きな利点である。これらの材料は体内に残り、
数年後でさえも異物としてみなされて拒絶されるおそれ
がある。３次元マトリックスは、人間の細胞と動物の細
胞（たとえばウマ、イヌ、またはサメ由来の細胞）との
両者によってコロニー化され得る。サメの細胞が特に好
適である。なぜならば、それらは受容者の中で無視でき
るほどの免疫学的応答しか誘導しないためである。サメ
の細胞は既に臓器の代わりに、たとえば目の水晶体のた
めに用いられている。
ての用途に好適であり、特に軟骨(cartilage)形成細胞
のために好適である。この点に関して、遺伝子的に変更
された細胞のいずれも用いないことが好まれる。好まし
くは、生検によって患者から細胞を採取してそれを細胞
マトリックス上で培養し、次に細胞インプラントを患者
にインプラントする。移植による拒絶反応は以下のもの
のために実質的に防がれる。すなわち、周辺組織のそれ
ぞれの増殖因子に促されて移植部位のみで分化する内因
性幹細胞（代用骨）による、３次元マトリックスのコロ
ニー化と、ヒアリン軟骨のさらなる形成のための、軟骨
細胞(cartilage cells)によるコロニー化とのために、
拒絶反応が防がれる。これは種々のプラスチックまたは
セラミックから作られる以前のマトリックスと比較して
非常に大きな利点である。これらの材料は体内に残り、
数年後でさえも異物としてみなされて拒絶されるおそれ
がある。３次元マトリックスは、人間の細胞と動物の細
胞（たとえばウマ、イヌ、またはサメ由来の細胞）との
両者によってコロニー化され得る。サメの細胞が特に好
適である。なぜならば、それらは受容者の中で無視でき
るほどの免疫学的応答しか誘導しないためである。サメ
の細胞は既に臓器の代わりに、たとえば目の水晶体のた
めに用いられている。
【００３７】免疫応答を僅かに刺激するのみかまたは全
く刺激しないこの発明のインプラントは有利なことに
は、好ましくは内因性細胞によってコロニー化される上
述の３次元マトリックスから構成される。したがって、
たとえば、無菌状態下で好適な培養培地内において角膜
実質細胞によってコロニー化された薄いシートのような
マトリックスは、皮膚移植片として役に立つことができ
る。コロニー化されたマトリックスは、手術室において
無菌状態下の培養培地から取除かれて清潔な創傷面上に
置かれ得る。次に内因性細胞がマトリックスに移動して
組織を形成することができる。
く刺激しないこの発明のインプラントは有利なことに
は、好ましくは内因性細胞によってコロニー化される上
述の３次元マトリックスから構成される。したがって、
たとえば、無菌状態下で好適な培養培地内において角膜
実質細胞によってコロニー化された薄いシートのような
マトリックスは、皮膚移植片として役に立つことができ
る。コロニー化されたマトリックスは、手術室において
無菌状態下の培養培地から取除かれて清潔な創傷面上に
置かれ得る。次に内因性細胞がマトリックスに移動して
組織を形成することができる。
【００３８】人工肝臓としての実施例も可能である。こ
の場合のマトリックスは好適な培養培地内で肝細胞によ
ってコロニー化される。マトリックスによってまた安定
化され得る細胞アセンブリが患者の体内にインプラント
され、そこでたとえば損傷した肝臓の機能を手助けする
ことができる。
の場合のマトリックスは好適な培養培地内で肝細胞によ
ってコロニー化される。マトリックスによってまた安定
化され得る細胞アセンブリが患者の体内にインプラント
され、そこでたとえば損傷した肝臓の機能を手助けする
ことができる。
【００３９】自己軟骨細胞（chondrocytes）によって３
次元マトリックスをコロニー化する場合に、良い結果が
達成された。次にマトリックスは、新しい軟骨物質がそ
こで発達し得る軟骨上の適切な場所に移植され得る。こ
れにより、現在用いられている、支持マトリックスなし
での軟骨細胞(cartilage cells)の移植方法と比較して
優れた利点が提供される。この方法に高い確率で存在す
る、骨膜が損傷され次に骨細胞(bone cells)が新しい軟
骨層へと増殖し新しい軟骨の退化がそれに続くという現
象がこの発明のインプラントによって避けられる。
次元マトリックスをコロニー化する場合に、良い結果が
達成された。次にマトリックスは、新しい軟骨物質がそ
こで発達し得る軟骨上の適切な場所に移植され得る。こ
れにより、現在用いられている、支持マトリックスなし
での軟骨細胞(cartilage cells)の移植方法と比較して
優れた利点が提供される。この方法に高い確率で存在す
る、骨膜が損傷され次に骨細胞(bone cells)が新しい軟
骨層へと増殖し新しい軟骨の退化がそれに続くという現
象がこの発明のインプラントによって避けられる。
【００４０】マトリックスをコロニー化するために好適
な他の細胞の例は、骨細胞(osteocytes)、ケラチノサイ
ト、肝細胞(hepatocytes)、骨髄幹細胞、またはニュー
ロン細胞である。
な他の細胞の例は、骨細胞(osteocytes)、ケラチノサイ
ト、肝細胞(hepatocytes)、骨髄幹細胞、またはニュー
ロン細胞である。
【００４１】この発明は、いくつかの図の参照と例とに
よって以下でより詳細に説明される。
よって以下でより詳細に説明される。
【００４２】
【詳細な説明】例１：３次元マトリックスを生成するた
めの一般的な方法（第１の実施例） ｐＨ３から６の間での希酸水溶液中で攪拌することによ
って、キトサンを溶解する。次に、希ＮａＯＨを用いて
所望のｐＨを調整する。溶液を好適な形状の容器に移
し、−３０から−１５℃で凍結する。凍結された溶液が
入った容器を凍結乾燥器に移し、減圧下（０．０１から
０．５ｈＰａ）での昇華によって水を除去する。さらな
る精製をせずに細胞によるコロニー化のために海綿状の
残留物を用いることができる。
めの一般的な方法（第１の実施例） ｐＨ３から６の間での希酸水溶液中で攪拌することによ
って、キトサンを溶解する。次に、希ＮａＯＨを用いて
所望のｐＨを調整する。溶液を好適な形状の容器に移
し、−３０から−１５℃で凍結する。凍結された溶液が
入った容器を凍結乾燥器に移し、減圧下（０．０１から
０．５ｈＰａ）での昇華によって水を除去する。さらな
る精製をせずに細胞によるコロニー化のために海綿状の
残留物を用いることができる。
【００４３】例２：３次元マトリックスを生成するため
の一般的な方法（第２の実施例） ｐＨ３から６の間での希ヒドロキシカルボン酸水溶液中
で攪拌することによって、キトサンを溶解する。透明な
溶液を好適な形状の容器内で−３０から−１５℃の温度
で凍結する。凍結された溶液が入った容器を凍結乾燥器
に移し、減圧下（０．０１から０．５ｈＰａ）での昇華
によって水を除去する。昇華による水の除去の後に残る
海綿状の残留物を水酸化ナトリウム溶液（５重量％）中
で２４時間塩基性化する。次に細胞に対する許容ｐＨが
得られるまで脱イオン水で海綿状のマトリックスを洗浄
する。
の一般的な方法（第２の実施例） ｐＨ３から６の間での希ヒドロキシカルボン酸水溶液中
で攪拌することによって、キトサンを溶解する。透明な
溶液を好適な形状の容器内で−３０から−１５℃の温度
で凍結する。凍結された溶液が入った容器を凍結乾燥器
に移し、減圧下（０．０１から０．５ｈＰａ）での昇華
によって水を除去する。昇華による水の除去の後に残る
海綿状の残留物を水酸化ナトリウム溶液（５重量％）中
で２４時間塩基性化する。次に細胞に対する許容ｐＨが
得られるまで脱イオン水で海綿状のマトリックスを洗浄
する。
【００４４】例３：多孔質キトサンマトリックスの生成
（対イオン：乳酸塩） ９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、
０．１ｇのキトサンおよび０．１１１３ｇの乳酸（９０
％水中、ダルムシュタット(Darmstadt)のメルクＫＧａ
Ａ（Merck ＫＧａＡ）から購入）を溶解し、１Ｍ水酸化
ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。まず
透明な溶液を−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰａの
圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
（対イオン：乳酸塩） ９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、
０．１ｇのキトサンおよび０．１１１３ｇの乳酸（９０
％水中、ダルムシュタット(Darmstadt)のメルクＫＧａ
Ａ（Merck ＫＧａＡ）から購入）を溶解し、１Ｍ水酸化
ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。まず
透明な溶液を−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰａの
圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
【００４５】海綿状の弾性を有する白色で微細孔の発泡
体が得られた。さらなる精製をせずに、細胞によるコロ
ニー化のために発泡体を用いた。マトリックスは図１で
示される。それは均一で、微細な構造の表面を有する。
歪みは検出され得ず、そのマトリックスは全体にわたっ
て均一な微細孔の構造を示す。
体が得られた。さらなる精製をせずに、細胞によるコロ
ニー化のために発泡体を用いた。マトリックスは図１で
示される。それは均一で、微細な構造の表面を有する。
歪みは検出され得ず、そのマトリックスは全体にわたっ
て均一な微細孔の構造を示す。
【００４６】例４：多孔質キトサンマトリックスの生成
（対イオン：酢酸塩）（第１の実施例） ９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、
０．１ｇのキトサンおよび０．１ｇの酢酸（１００％）
を溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７
にまで調整した。まず透明な溶液を−２４℃で凍結し、
次に０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除
去した。
（対イオン：酢酸塩）（第１の実施例） ９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、
０．１ｇのキトサンおよび０．１ｇの酢酸（１００％）
を溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７
にまで調整した。まず透明な溶液を−２４℃で凍結し、
次に０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除
去した。
【００４７】白色の、微細孔の発泡体が得られた。
例５：多孔質キトサンマトリックスの生成（対イオン：
リン酸塩） ７．００ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、
０．１ｇのキトサンおよび０．０３７ｍｌのオルトリン
酸（８５％ シグマ Ｐ ６５６０）を溶解し、１Ｍ水
酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。
まず透明な溶液を−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰ
ａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
リン酸塩） ７．００ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、
０．１ｇのキトサンおよび０．０３７ｍｌのオルトリン
酸（８５％ シグマ Ｐ ６５６０）を溶解し、１Ｍ水
酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。
まず透明な溶液を−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰ
ａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
【００４８】海綿状の弾性を有する白色で微細孔の発泡
体が得られた。さらなる精製をせずに、細胞によるコロ
ニー化のために発泡体を用いた。
体が得られた。さらなる精製をせずに、細胞によるコロ
ニー化のために発泡体を用いた。
【００４９】例６：多孔質キトサンマトリックスの生成
（対イオン：グルタミン酸塩） １０．００ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、
０．１ｇのキトサンおよび０．１ｇのグルタミン酸（シ
グマ Ｇ ６９０４）を溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム
溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。まず透明な溶液
を−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰａの圧力下での
昇華によって溶媒を除去した。
（対イオン：グルタミン酸塩） １０．００ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、
０．１ｇのキトサンおよび０．１ｇのグルタミン酸（シ
グマ Ｇ ６９０４）を溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム
溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。まず透明な溶液
を−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰａの圧力下での
昇華によって溶媒を除去した。
【００５０】海綿状の弾性を有する白色の、微細孔発泡
体が得られた。 例７：９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによっ
て、０．１ｇのキトサンおよび０．１１１３ｇの乳酸を
溶解し、透明な溶液をまず−２４℃で凍結した。０．０
５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。海
綿状の残留物を水酸化ナトリウム溶液（５重量％）中で
２４時間塩基性化し、次に、中性になるまで脱イオン水
で洗浄した。乾燥させた結果として弾性の白い発泡体が
得られた。そのマトリックスは図２ａで示される。
体が得られた。 例７：９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによっ
て、０．１ｇのキトサンおよび０．１１１３ｇの乳酸を
溶解し、透明な溶液をまず−２４℃で凍結した。０．０
５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。海
綿状の残留物を水酸化ナトリウム溶液（５重量％）中で
２４時間塩基性化し、次に、中性になるまで脱イオン水
で洗浄した。乾燥させた結果として弾性の白い発泡体が
得られた。そのマトリックスは図２ａで示される。
【００５１】比較例１：７．００ｇの脱イオン水中で攪
拌することによって、０．１ｇのキトサンおよび０．０
３７ｍｌのオルトリン酸を溶解し、透明な溶液をまず−
２４℃で凍結した。０．０５ｈＰａの圧力下での昇華に
よって溶媒を除去した。海綿状の残留物を水酸化ナトリ
ウム溶液中で２４時間塩基性化し、次に、中性になるま
で脱イオン水で洗浄した。乾燥させた結果として脆性の
白い発泡体が得られた。そのマトリックスは図２ｂで示
される。
拌することによって、０．１ｇのキトサンおよび０．０
３７ｍｌのオルトリン酸を溶解し、透明な溶液をまず−
２４℃で凍結した。０．０５ｈＰａの圧力下での昇華に
よって溶媒を除去した。海綿状の残留物を水酸化ナトリ
ウム溶液中で２４時間塩基性化し、次に、中性になるま
で脱イオン水で洗浄した。乾燥させた結果として脆性の
白い発泡体が得られた。そのマトリックスは図２ｂで示
される。
【００５２】例８：アニオン特性（Ｌグルタミン酸の固
定）を用いての多孔質キトサンマトリックスの生成 ０．１ｇのキトサンを１０ｍｌの水に入れ、１Ｍ塩酸を
用いてｐＨを４にまで調整し、その混合物を２４時間攪
拌した。１Ｎ ＮａＯＨを加えることによってｐＨを
５．８にまで調整し、攪拌している間、０．０５ｇのグ
ルタミン酸と０．０５ｇの１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）とを
加えて溶解した。室温でさらに３時間攪拌した後、１Ｍ
ＮａＯＨを用いてｐＨを７にまで調整し、沈殿物を濾
過し、それを２ｌの脱イオン水で洗浄した。洗浄された
沈殿物を、０．１１１３ｇの乳酸（９０％水中、ダルム
シュタットのメルクＫＧａＡから購入）を用いて９．７
９ｇの水中で攪拌することによって溶解した。１Ｎ水酸
化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整し、溶液
を−２４℃で凍結した。次に０．０５ｈＰａの圧力下で
の昇華によって水を除去した。
定）を用いての多孔質キトサンマトリックスの生成 ０．１ｇのキトサンを１０ｍｌの水に入れ、１Ｍ塩酸を
用いてｐＨを４にまで調整し、その混合物を２４時間攪
拌した。１Ｎ ＮａＯＨを加えることによってｐＨを
５．８にまで調整し、攪拌している間、０．０５ｇのグ
ルタミン酸と０．０５ｇの１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）とを
加えて溶解した。室温でさらに３時間攪拌した後、１Ｍ
ＮａＯＨを用いてｐＨを７にまで調整し、沈殿物を濾
過し、それを２ｌの脱イオン水で洗浄した。洗浄された
沈殿物を、０．１１１３ｇの乳酸（９０％水中、ダルム
シュタットのメルクＫＧａＡから購入）を用いて９．７
９ｇの水中で攪拌することによって溶解した。１Ｎ水酸
化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整し、溶液
を−２４℃で凍結した。次に０．０５ｈＰａの圧力下で
の昇華によって水を除去した。
【００５３】白色で海綿状の残留物が得られた。海綿は
さらなる精製なしに用いられ得る。 例９：固定された細胞接着因子Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｇｌｙ
−Ｌ−Ａｓｐを用いての３次元マトリックスの生成 ０．１ｇのキトサンを１０ｍｌの水に入れ、１Ｍ塩酸を
用いてｐＨを４にまで調整した。室温で２４時間攪拌し
た後、透明の溶液を１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．８
にまで調整し、次に、０．０１ｇのＬ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｌ−Ａｓｐと０．０５ｇの１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡ
Ｃ）とを続けて加え、攪拌することによって溶解した。
室温でさらに３時間攪拌した後、１Ｎ ＮａＯＨを用い
てｐＨを７にまで調整した。沈殿物を濾過し、それを２
ｌの水で洗浄した。次に沈殿物を、０．１１１３ｇの乳
酸（９０％水中、ダルムシュタットのメルクＫＧａＡか
ら購入）を用いて９．７９ｇの水中で攪拌することによ
って溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを
７にまで調整し、溶液を−２４℃で凍結した。最後に、
０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって水を除去し
た。
さらなる精製なしに用いられ得る。 例９：固定された細胞接着因子Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｇｌｙ
−Ｌ−Ａｓｐを用いての３次元マトリックスの生成 ０．１ｇのキトサンを１０ｍｌの水に入れ、１Ｍ塩酸を
用いてｐＨを４にまで調整した。室温で２４時間攪拌し
た後、透明の溶液を１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．８
にまで調整し、次に、０．０１ｇのＬ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｌ−Ａｓｐと０．０５ｇの１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡ
Ｃ）とを続けて加え、攪拌することによって溶解した。
室温でさらに３時間攪拌した後、１Ｎ ＮａＯＨを用い
てｐＨを７にまで調整した。沈殿物を濾過し、それを２
ｌの水で洗浄した。次に沈殿物を、０．１１１３ｇの乳
酸（９０％水中、ダルムシュタットのメルクＫＧａＡか
ら購入）を用いて９．７９ｇの水中で攪拌することによ
って溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを
７にまで調整し、溶液を−２４℃で凍結した。最後に、
０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって水を除去し
た。
【００５４】白色で海綿状の残留物が得られた。海綿は
さらなる精製なしに用いられ得る。 例１０：３次元マトリックス上に細胞を播種してインキ
ュベートするための一般的な手順 例１から６で得られた３次元マトリックスをＰＢＳ中で
１２１℃で２０分間オートクレーブ処理する。このとき
マトリックスは無菌であり、液体で完全に湿らされてい
る。次に、必要物のために適切に切断されたマトリック
ス上に好適な培養培地で培養された細胞を直接置き、好
適な温度でインキュベートする。増殖を伴うマトリック
スは無菌状態下で取除かれて、たとえばインプラントさ
れ得る。
さらなる精製なしに用いられ得る。 例１０：３次元マトリックス上に細胞を播種してインキ
ュベートするための一般的な手順 例１から６で得られた３次元マトリックスをＰＢＳ中で
１２１℃で２０分間オートクレーブ処理する。このとき
マトリックスは無菌であり、液体で完全に湿らされてい
る。次に、必要物のために適切に切断されたマトリック
ス上に好適な培養培地で培養された細胞を直接置き、好
適な温度でインキュベートする。増殖を伴うマトリック
スは無菌状態下で取除かれて、たとえばインプラントさ
れ得る。
【００５５】例１１：３次元マトリックス上での軟骨細
胞（chondrocytes）の培養 生検によって得られる自己軟骨細胞（chondrocytes）を
軟骨細胞（chondrocytes）増殖培地上で培養した（米
国、セルアプリケーションズ社（Cell Applications In
c.））。
胞（chondrocytes）の培養 生検によって得られる自己軟骨細胞（chondrocytes）を
軟骨細胞（chondrocytes）増殖培地上で培養した（米
国、セルアプリケーションズ社（Cell Applications In
c.））。
【００５６】まず、例３のとおりに生成した３次元マト
リックスを１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し
た。完全に湿らされたマトリックスを無菌状態下で適切
に切断し、培養器に入れた。次に、培養培地で培養した
軟骨細胞（chondrocytes）を３次元マトリックス上に置
き、３７℃で１４日から２１日間インキュベートした。
この間、細胞は３次元マトリックスへと増殖した。増殖
を伴うマトリックスを無菌状態下で取り除いた。次にそ
れはインプラントされ得る。
リックスを１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し
た。完全に湿らされたマトリックスを無菌状態下で適切
に切断し、培養器に入れた。次に、培養培地で培養した
軟骨細胞（chondrocytes）を３次元マトリックス上に置
き、３７℃で１４日から２１日間インキュベートした。
この間、細胞は３次元マトリックスへと増殖した。増殖
を伴うマトリックスを無菌状態下で取り除いた。次にそ
れはインプラントされ得る。
【００５７】図３は、顕微鏡で拡大されたイメージとし
てのコロニー化されたキトサンマトリックスを示す。矢
印で示され球状の凝集物から成るより黒い領域は、培養
中にマトリックス上で発達した細胞の凝集物である。細
胞はマトリックスの孔へと増殖し、そこで３次元の細胞
凝集物を形成する。
てのコロニー化されたキトサンマトリックスを示す。矢
印で示され球状の凝集物から成るより黒い領域は、培養
中にマトリックス上で発達した細胞の凝集物である。細
胞はマトリックスの孔へと増殖し、そこで３次元の細胞
凝集物を形成する。
【００５８】キトサンマトリックスの特性は、生成方法
と用いられる対イオンとによって強く影響を受ける。対
イオンの効果が図２ａ（例７）と図２ｂ（比較例１）と
の比較から明らかである。両方のマトリックスが、キト
サンと適切な酸とを水中で溶解し、溶液を凍結し、昇華
によって溶媒を除去することによって生成された。次
に、発泡体のような残留物がＮａＯＨ水溶液中で平衡化
された。対イオンとして乳酸塩を用いると（図２ａ）、
ＮａＯＨを用いての平衡時のマトリックスの構造的変化
はリン酸塩を用いるとき（図２ｂ）よりも明らかにより
少ない。そのマトリックスの表面はより平滑であり、は
っきりとした構造化はあまり見られない。例７で得られ
るマトリックスは比較例１からのマトリックスよりも明
らかにより弾性であり、より安定している。それを圧縮
することができ、圧力がなくなった後それは再び弾性的
に元の形状を取り戻す。同様に、破壊することなしにそ
れを弾性的に曲げることもできる。
と用いられる対イオンとによって強く影響を受ける。対
イオンの効果が図２ａ（例７）と図２ｂ（比較例１）と
の比較から明らかである。両方のマトリックスが、キト
サンと適切な酸とを水中で溶解し、溶液を凍結し、昇華
によって溶媒を除去することによって生成された。次
に、発泡体のような残留物がＮａＯＨ水溶液中で平衡化
された。対イオンとして乳酸塩を用いると（図２ａ）、
ＮａＯＨを用いての平衡時のマトリックスの構造的変化
はリン酸塩を用いるとき（図２ｂ）よりも明らかにより
少ない。そのマトリックスの表面はより平滑であり、は
っきりとした構造化はあまり見られない。例７で得られ
るマトリックスは比較例１からのマトリックスよりも明
らかにより弾性であり、より安定している。それを圧縮
することができ、圧力がなくなった後それは再び弾性的
に元の形状を取り戻す。同様に、破壊することなしにそ
れを弾性的に曲げることもできる。
【００５９】生成方法の効果は、図１と図２ａとを比較
すると明らかである。図１（例３）の場合には凍結乾燥
の前に乳酸を中和し、一方で、図２ａのマトリックスの
場合には凍結乾燥の後にＮａＯＨ水溶液を用いての塩基
性化によって乳酸を除去した。マトリックス表面の均一
な構造が図１ではっきりと見られ、それには事実上主な
小窩は存在しない。図１で示されるマトリックスは図２
ａのマトリックスよりもずっと柔らかく弾性である。
すると明らかである。図１（例３）の場合には凍結乾燥
の前に乳酸を中和し、一方で、図２ａのマトリックスの
場合には凍結乾燥の後にＮａＯＨ水溶液を用いての塩基
性化によって乳酸を除去した。マトリックス表面の均一
な構造が図１ではっきりと見られ、それには事実上主な
小窩は存在しない。図１で示されるマトリックスは図２
ａのマトリックスよりもずっと柔らかく弾性である。
【００６０】マトリックスの特性が表１の定性比較にお
いてまとめられている。
いてまとめられている。
【００６１】
【表１】
［図面の簡単な説明］
【図１】 マトリックスの生成において凍結の前にキト
サン水溶液が中和され、対イオンとして乳酸塩を備え
る、マトリックスの図である。
サン水溶液が中和され、対イオンとして乳酸塩を備え
る、マトリックスの図である。
【図２ａ】 マトリックスの生成において凍結乾燥の後
ＮａＯＨ（５重量％）を用いてマトリックスが平衡化さ
れ、対イオンが乳酸塩によって形成される、マトリック
スの図である。
ＮａＯＨ（５重量％）を用いてマトリックスが平衡化さ
れ、対イオンが乳酸塩によって形成される、マトリック
スの図である。
【図２ｂ】 マトリックスの生成において凍結乾燥の後
ＮａＯＨ（５重量％）を用いてマトリックスが平衡化さ
れ、対イオンがリン酸塩によって形成される、マトリッ
クスの図である。
ＮａＯＨ（５重量％）を用いてマトリックスが平衡化さ
れ、対イオンがリン酸塩によって形成される、マトリッ
クスの図である。
【図３】 軟骨細胞（chondrocytes）によってコロニー
化されたマトリックスの顕微鏡写真の図である。
化されたマトリックスの顕微鏡写真の図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 パーマイヤー，アンドレーア
ドイツ、15806 ツォッセン、アイヒホ
ルンシュトラーセ、32
(72)発明者 レッツバイヤー，トーマス
ドイツ、27574 ブレーマーハーフェン、
ジーメンスシュトラーセ、８
(56)参考文献 特開 平７−33902（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−261838（ＪＰ，Ａ)
特開 平10−211270（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−207785（ＪＰ，Ａ)
特開 平10−226732（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−268766（ＪＰ，Ａ)
特開 昭62−51982（ＪＰ，Ａ)
特開 昭58−57401（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C08J 9/26 101
A61L 27/00 - 27/60
C08B 37/08
C12N 11/10
Claims (10)
- 【請求項１】 生体適合性３次元マトリックスを生成す
るための方法であって、 キトサンと過剰な酸とから水溶液を調製し、該水溶液を
中和し、該中和された水溶液を凍結し、減圧下での昇華
によって水を除去する、方法。 - 【請求項２】 生体適合性３次元マトリックスを生成す
るための方法であって、 キトサンと、アルキルヒドロキシカルボン酸およびアリ
ールヒドロキシカルボン酸からなる群より選択される過
剰な酸とから水溶液を調製し、該水溶液を凍結し、減圧
下での昇華によって水を除去し、前記凍結の前に前記水
溶液を中和する、方法。 - 【請求項３】 酸は乳酸である、請求項１または２に記
載の方法。 - 【請求項４】 塩基を加えて水溶液のｐＨを５．０から
７．５に調整することによって、酸を除去または中和す
る、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 請求項１から４のいずれかに記載の方法
によって得ることのできる３次元マトリックス。 - 【請求項６】 接着因子、ホルモンおよび／または増殖
因子がキトサンフレームワークに結合される、請求項５
に記載の３次元マトリックス。 - 【請求項７】 マトリックスは自己フィブリンによって
コーティングされる、請求項５に記載の３次元マトリッ
クス。 - 【請求項８】 培養リアクタ内での固相としての請求項
５から７のいずれかに記載の３次元マトリックスの使
用。 - 【請求項９】 インプラントのためのマトリックスとし
ての請求項５から７のいずれかに記載の３次元マトリッ
クスの使用。 - 【請求項１０】 請求項５から７のいずれかに記載の３
次元マトリックスを含むインプラント。
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|---|---|---|---|
| DE19948120A DE19948120C2 (de) | 1999-10-06 | 1999-10-06 | 3D-Matrix zur Herstellung von Zelltransplantaten |
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| PCT/EP2000/009809 WO2001025321A1 (de) | 1999-10-06 | 2000-10-06 | 3d-matrix zur herstellung von zelltransplantaten |
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|---|---|
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| DE10317578A1 (de) * | 2003-04-16 | 2004-10-28 | Alvito Biotechnologie Gmbh | Chitosanfolie als Periost-Ersatz |
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| US9662400B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-05-30 | The University Of Memphis Research Foundation | Methods for producing a biodegradable chitosan composition and uses thereof |
| EP3107589A4 (en) * | 2014-02-20 | 2017-08-09 | Ortho Regenerative Technologies Inc. | Lyophilized polymer scaffold compositions, processes for preparation and use in anabolic wound repair |
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| JPH02261838A (ja) * | 1989-04-03 | 1990-10-24 | Sumitomo Cement Co Ltd | 多孔質キトサン材料の製造方法 |
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