DE20215659U1 - Reagenzienkit zur Kultivierung von Zellen - Google Patents

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Abstract

Reagenzienkit zur Kultivierung von Zellen, umfassend
(a) ein biokompatibles Material auf Basis von Chitosan und einer Säure,
(b) mindestens ein Zellkulturgefäß und
(c) gegebenenfalls Mittel zur Manipulation oder/und zur Fixierung des biokompatiblen Materials oder/und Mittel zur Manipulation von Zellen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Reagenzienkit zur Kultivierung von Zellen, umfassend ein biokompatibles Material auf Basis von Chitosan und einer Säure, z.B. als flexible Folie oder/und poröse Matrix, sowie das biokompatible Material in gestützter Form.
  • Die Deutsche Patentanmeldung 199 48 120.2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer biokompatiblen dreidimensionalen Matrix, wobei eine wässrige Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, eingefroren wird und das Wasser bei vermindertem Druck absublimiert wird, wobei die überschüssige Säure vor dem Einfrieren oder nach dem Absublimieren des Wassers entfernt, insbesondere neutralisiert wird. Weiterhin wird eine durch das Verfahren erhältliche Matrix offenbart, die zur Herstellung von Implantaten verwendet werden kann.
  • Die Deutsche Patentanmeldung 101 17 234.6 offenbart biokompatible nichtporöse Materialien auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure. Diese Materialien können beispielsweise in Form einer Folie vorliegen.
  • Die Deutsche Patentanmeldung 101 53 470.1 offenbart die Verwendung der o.g. biokompatiblen Materialien auf Basis von Chitosan und einer Säure als Mittel auf dem Gebiet der Neurochirurgie, insbesondere als Nervenschiene, sowie zur Reparatur von Sehnen und Bändern.
  • Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, neue Anwendungen für Materialien auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, bereitzustellen.
  • Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher einen Reagenzienkit zur Kultivierung von Zellen, umfassend:
    • (a) ein biokompatibles Material auf Basis von Chitosan und einer Säure,
    • (b) mindestens ein Zellkulturgefäß und
    • (c) gegebenenfalls Mittel zur Manipulation oder/und zur Fixierung des biokompatiblen Materials oder/und Mittel zur Manipulation von Zellen.
  • Das biokompatible Material liegt vorzugsweise in steriler Form vor, so dass es unmittelbar zum Kultivieren von Zellen eingesetzt werden kann. Das Material liegt zweckmäßigerweise in vorgefertigtem Format, entsprechend dem jeweils verwendeten Zellkulturgefäß, vor. Weiterhin kann das Material in trockener Form oder in feuchter Form, z.B. vorgequollen in einer wässrigen Pufferlösung, bereitgestellt werden. Je nach Anwendung kann das biokompatible Material in Form einer porösen dreidimensionalen Matrix oder/und in Form einer nichtporösen flexiblen Folie vorliegen.
  • Neben dem biokompatiblen Material enthält der Reagenzienkit ein oder mehrere Zellkulturgefäße, beispielsweise Kunststoff- oder Glaszellkulturgefäße. In einer bevorzugten Ausführungsform (siehe 1), verwendet man als Zellkulturgefäß eine Platte mit mehreren ggf. herausnehmbaren Vertiefungen, z.B. eine Transwellplatte. Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform enthält die Platte insgesamt 3 Vertiefungen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, die in 2 gezeigt ist, ist das Zellkulturgefäß eine Flasche. Daneben sind selbstverständlich weitere, auf dem betreffenden Gebiet bekannte Zellkulturgefäße geeignet, wie etwa Petrischalen, Mikrotiterplatten mit 3, 6, 12, 48, 96 oder mehr Vertiefungen, Flachboden-Kulturflaschen etc.
  • In einer ersten Ausführungsform ist das Material in Form einer flexiblen, insbesondere nichtporösen Folie gemäß der Deutschen Anmeldung 101 17 234.6. Die Folie hat eine Dicke von vorzugsweise 1 μm-200 μm, besonders bevorzugt von 10 μm-50 μm und ist erhältlich durch:
    • – Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
    • – Trocknen der Lösung ohne Einfrieren und
    • – Entfernen von überschüssigen Säuren vor oder/und nach dem Trocknen, vorzugsweise durch Neutralisation.
  • Die Folie kann in vorgefertigten Stücken, z.B. Streifen oder runden Stücken, in geeigneten Dimenisonen entsprechend dem verwendeten Zellkulturgefäß hergestellt werden. Besonders bevorzugt enthält der Kit ein oder mehrere Stücke der nichtporösen Folie vorgefertigt in trockener Form, z.B. direkt eingepasst in das Zellkulturgefäß. Dabei können gegebenenfalls Fixiermittel zur Befestigung der Folien in den Zellkulturgefäßen, z.B. Dichtungsringe, vorhanden sein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das biokompatible Material auf Basis von Chitosan und einer Säure eine poröse Matrix. Besonders bevorzugt wird eine biokompatible poröse Matrix gemäß der deutschen Anmeldung 199 48 120.2 verwendet, die erhältlich ist durch:
    • – Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
    • – Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimieren bei verringertem Druck und
    • – Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren, insbesondere durch Neutralisation mit einer geeigneten Base, z.B. NaOH.
  • Auch die poröse Matrix wird vorzugsweise in Form von vorgefertigten Stücken mit einem dem jeweils verwendeten Zellkulturgefäß angepassten Volumen bereitgestellt. Um eine bessere Benetzung der Matrix während der Zellkultur zu gewährleisten, wird sie vorzugsweise in feuchter Form in einer wässrigen Lösung in einem oder mehreren Aufbewahrungsgefäßen eingesetzt. Ein Aufbewahrungsgefäß kann dabei mehrere Matrixstücke enthalten, die mit geeigneten Manipulationsmitteln, z.B. Zangen oder Löffeln, in die Zellkulturgefäße überführt werden können.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Reagenzienkit das biokompatible Material in Form einer gestützten porösen dreidimensionalen Matrix oder/und einer gestützten nichtporösen flexiblen Folie. Dabei ist das biokompatible Material auf einem inerten Träger aufgebracht, z.B. einem Träger aus Kunststoffen, Metallen, Metalloxiden, Keramiken, Gläsern, Mineralien und Kombinationen davon. Ein weiterer bevorzugter inerter Träger sind auch Partikel, z.B. aus den zuvor genannten Materialien. Für bestimmte Ausführungsformen, z.B. einer Kultivierung in Rollerflaschen, kann der inerte Träger beispielsweise ein Kunststoffnetz, z.B. ein Nylonnetz, sein.
  • Das Aufbringen des biokompatiblen Materials auf den inerten Träger erfolgt beispielsweise dadurch, dass die Verfestigung des Materials während des Herstellungsprozesses in Anwesenheit des Trägermaterials erfolgt.
  • Das biokompatible Material ist hervorragend für die Kultivierung eukaryontischer Zellen, insbesondere Säugerzellen einschließlich humaner Zellen, geeignet. Je nach Art der zu kultivierenden Zellen kann das Material hinsichtlich des Porositätsgrads und der Porengröße variiert werden. So ist beispielsweise die poröse Matrix insbesondere zur Kultivierung von Leberzellen, aber auch anderen Zelltypen, wie etwa primäre und etablierte Zellen bzw. Zelllinien humanen oder tierischen Ursprungs. z.B. CHO-Zellen, 3T3-Zellen, HeLa-Zellen, Hep2-Zellen, Chondrocyten, Fibroblasten, Keratinocyten, Nervenzellen etc. geeignet. Die nichtporöse Folie ist wiederum insbesondere zur Kultivierung von Haut- und Nervenzellen geeignet.
  • Neben den zuvor genannten Bestandteilen kann der Reagenzienkit weiterhin gegebenenfalls Mittel zur Manipulation oder/und zur Fixierung des biokompatiblen Materials, beispielsweise Zangen, Löffel, Halteringe etc., oder/und Mittel zur Manipulation von Zellen, z.B. Spritzen, Spatel etc., enthalten. Auch diese Materialien liegen vorzugsweise in steriler Form vor.
  • Die Herstellung der Matrices und Folien auf Basis von Chitosan und Säuren erfolgt im Wesentlichen nach dem in den Deutschen Anmeldungen 199 48 120.2 und 101 17 234.6 angegebenen Verfahren, sofern nichts anderes angegeben ist. Vorzugsweise wird zunächst eine wässrige Lösung eines teilweise deacetylierten Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure hergestellt. Unter Überschuss wird dabei verstanden, dass der pH der wässrigen Lösung im Sauren liegt, vorzugsweise unterhalb von pH ≤ 4. Dadurch sind die freien Aminogruppen des Chitosans zumindest teilweise protoniert, wodurch die Löslichkeit in Wasser gesteigert wird. Die Säuremenge ist nicht kritisch. Sie muss lediglich so gewählt sein, dass das Chitosan in Lösung geht. Eine übermäßige Säurezugabe wird nach Möglichkeit vermieden, da überschüssige Säure wieder entfernt werden muss, und dadurch die Aufarbeitung bei großen Säuremengen erschwert wird. Günstig sind Säuremengen, die eine 0,05 bis 1 N, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 N, insbesondere 0,1 bis 0,3 N Lösung ergeben. Die Chitosanmenge wird vorzugsweise so gewählt, dass sich eine 0,01 bis 0,5 M, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 M Lösung ergibt. Durch die Konzentration der Chitosanlösung kann Einfluss auf die Struktur der Matrix, insbesondere deren Porengröße genommen werden. Auf diese Weise lässt sich die Porengröße der Matrix auf den jeweiligen Zelltypus abstimmen, mit dem die Matrix besiedelt werden soll.
  • Chitosan hat wegen seiner Herstellung aus natürlichen Quellen kein einheitliches Molekulargewicht. Je nach Quelle und Aufbereitungsverfahren kann das Molekulargewicht zwischen 20 kDa bis über 1000 kDa betragen.
  • Für die Herstellung der dreidimensionalen Matrix ist das Chitosan hinsichtlich seines Molekulargewichts keinen Beschränkungen unterworfen. Für die Herstellung der wässrigen Chitosanlösung wird eine Säure verwendet, bei der es sich um eine anorganische Säure oder vorzugsweise um eine organische Säure, besonders bevorzugt um eine Alkyl- oder Aryl-Hydroxycarbonsäure handelt. Geeignet sind insbesondere Hydroxycarbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei eine oder mehrere Hydroxylgruppen sowie eine oder mehrere Carboxylgruppen im Molekül vorhanden sein können. Spezifische Beispiele sind Glycolsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure und Mandelsäure. Besonders bevorzugt ist Milchsäure.
  • Bei Herstellung einer porösen Matrix wird die Lösung aus Chitosan und Säure zunächst durch Zugabe von Base zumindest teilweise neutralisiert und dann eingefroren oder ohne vorherige Neutralisation direkt eingefroren. Die Neutralisation vor dem Einfrieren ist bevorzugt. Der pH-Wert nach der Neutralisation beträgt im Allgemeinen 5,0 bis 7,5, vorzugsweise 5,5 bis 7,0 und insbesondere 6,0 bis 7,0.
  • Nach dem Einfrieren wird das Wasser unter vermindertem Druck absublimiert, beispielsweise im Druckbereich von 0,001 bis 3 hPa.
  • Zur Herstellung einer nichtporösen Folie wird die Lösung nicht gefroren und absublimiert, sondern ohne Einfrieren bei gegebenenfalls erhöhter Temperatur oder/und verringertem Druck getrocknet und vorzugsweise nach Trocknung neutralisiert. Die entstehende nichtporöse Matrix ist in feuchtem Zustand stark belastbar und dehnbar.
  • Durch die große Anzahl von Amino- und Hydroxygruppen ist das Material beliebig modifizierbar. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind Liganden kovalent oder nicht kovalent an das Chitosan gebunden, vorzugsweise an die freien Aminogruppen des Chitosans. Als Liganden können z.B. Wachstumsstoffe, Proteine, Hormone, Heparin, Heparansulfate, Chondroitsulfate, Dextransulfate oder eine Mischung dieser Substanzen verwendet werden. Die Liganden dienen vorzugsweise zur Kontrolle und Verbesserung der Zellproliferation.
  • Die Materialien werden vor Einsatz in der Zellkultur sterilisiert, um Keimfreiheit zu garantieren. Die Sterilisation kann durch Temperaturbehandlung, z.B. durch Autoklavieren, Dampfbehandlung etc. oder/und durch Bestrahlung, z.B. Gammastrahlenbehandlung, erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Sterilisation in einer physiologisch verträglichen gepufferten Lösung, z.B. in PBS, um eine vollständige Benetzung der Matrix bzw. der Folie mit Flüssigkeit und die Abwesenheit größerer Lufteinschlüsse sicherzustellen.
  • Bei Kultivierung der Zellen wird das Material in einem Zeitraum von ca. 5-8 Wochen oder länger abgebaut. Die Abbauzeiten können über den Deacetylierungsgrad des Chitosans und die Konzentration des Materials eingestellt werden.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein biokompatibles Material auf Basis von Chitosan und einer Säure in gestützter Form, vorzugsweise aufgebracht auf einen inerten Träger, wie zuvor beschrieben. Das Material kann in Form einer gestützten dreidimensionalen porösen Matrix, in Form einer gestützten nichtporösen flexiblen Folie oder/und in einer Kombination davon sein.
  • Das gestützte Material kann einerseits – wie zuvor beschrieben – als Bestandteil von Reagenzienkits zur Kultivierung von Zellen eingesetzt werden. Andererseits kann das Material jedoch auch als Implantat eingesetzt werden. Hierzu ist der inerte Träger vorzugsweise ein biokompatibles Material, z.B. ein Ersatzmaterial für Knochen, Gelenke, Zahnersatz, Sehnen und Bänder, etc., wie etwa eine Metallprothese (z.B. Titan), oder eine Keramik- oder Mineral(z.B. Apatit)prothese. Durch Aufbringen der Matrix oder/und der Folie auf das Implantatmaterial kann die Biokompatibilität bei der Implantation verbessert werden, wodurch sich das Einwachsen der Implantate im Körper erleichtert.
  • Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden:
  • 1 zeigt eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagenzienkits. Der Reagenzienkit umfasst eine Platte (2) mit mehreren Vertiefungen (4a, 4b, 4c), die gegebenenfalls herausnehmbar sein können. Weiterhin enthält der Kit ein Aufbewahrungsgefäß (6) mit Schraubverschluss (8), das mit einer wässrigen Pufferlösung (10) gefüllt ist, in der sich Stücke der porösen Matrix (12) in einer dem Kulturgefäß angepassten Dimension in vorbenetzter Form befinden. Alternativ oder zusätzlich kann der Kit auch eine nichtporöse flexible Folie (14) enthalten, die direkt in den Vertiefungen der Zellkulturplatte, gegebenenfalls mit einem Fixierungsmittel, befestigt sein kann oder auch abgepackt, z.B. in sterilen Plastikverpackungen, vorliegen kann. Darüber hinaus kann der Reagenzienkit Mittel zur Manipulation des biokompatiblen Materials, z.B. eine Zange, oder/und Mittel zur Manipulation von Zellen, z.B. eine Spritze oder ein Spatel, enthalten.
  • Eine weitere Ausführungform eines erfindungsgemäßen Reagenzienkits ist in 2 gezeigt. Dort befindet sich in einer Kulturflasche (16) mit Schraubverschluss (18) oder in einer anderen Kulturflasche, z.B. einer Rollerkulturflasche, das biokompatible Material in gestützter Form (20), z.B. auf einem Nylonnetzträger. Das gestützte biokompatible Material (20) ist dabei vorzugsweise derart angeordnet, dass es am Innenrand der Kulturflasche im wesentlichen über deren gesamten Umfang anliegt. Zur Kultivierung muss nur noch Medium in die Kulturflasche (16) eingefüllt und die Matrix mit Zellen besiedelt werden. Alternativ kann die gestützte Matrix auch in Flachbodenflaschen eingelegt werden, z.B. zur Bedeckung der Kulturfläche, um eine Oberflächenvergrößerung zu erreichen.

Claims (18)

  1. Reagenzienkit zur Kultivierung von Zellen, umfassend (a) ein biokompatibles Material auf Basis von Chitosan und einer Säure, (b) mindestens ein Zellkulturgefäß und (c) gegebenenfalls Mittel zur Manipulation oder/und zur Fixierung des biokompatiblen Materials oder/und Mittel zur Manipulation von Zellen.
  2. Reagenzienkit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er das biokompatible Material in steriler Form enthält.
  3. Reagenzienkit nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er das biokompatible Material in Form einer porösen dreidimensionalen Matrix enthält.
  4. Reagenzienkit nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass er ein oder mehrere Stücke der porösen dreidimensionalen Matrix vorgefertigt in einer wässrigen Lösung in einem oder mehreren Aufbewahrungsgefäßen enthält.
  5. Reagenzienkit nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er das biokompatible Material in Form einer nichtporösen flexiblen Folie enthält.
  6. Reagenzienkit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er ein oder mehrere Stücke der nichtporösen Folie vorgefertigt in trockner Form enthält.
  7. Reagenzienkit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Stücke der nichtporösen Folie in den Zellkulturgefäßen fixiert sind.
  8. Reagenzienkit nach Anspruch 1 oder 2, ' dadurch gekennzeichnet, dass er das biokompatible Material in Form einer gestützten porösen dreidimensionalen Matrix oder/und einer gestützten nichtporösen flexiblen Folie enthält.
  9. Reagenzienkit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das biokompatible Material auf einem inerten Träger aufgebracht ist.
  10. Reagenzienkit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der inerte Träger ausgewählt ist aus Kunststoffen, Metallen, Metalloxiden, Keramiken, Gläsern, Mineralien und Kombinationen davon.
  11. Reagenzienkit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der inerte Träger ein Kunststoffnetz ist.
  12. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Zellkulturgefäß eine Platte mit mehreren gegebenenfalls herausnehmbaren Vertiefungen umfasst.
  13. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Zellkulturgefäß eine Flasche, insbesondere eine Rollerflasche, umfasst.
  14. Biokompatibles Material auf Basis von Chitosan und einer Säure in gestützter Form.
  15. Material nach Anspruch 14, aufgebracht auf einen inerten Träger.
  16. Material nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der inerte Träger ausgewählt ist aus Kunststoffen, Metallen, Metalloxiden, Keramiken, Gläsern, Mineralien und Kombinationen davon.
  17. Material nach einem der Ansprüche 14 bis 16 in Form einer gestützten dreidimensionalen porösen Matrix.
  18. Material nach einem der Ansprüche 14 bis 17 in Form einer gestützten nichtporösen flexiblen Folie.
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