JP2003511120A - 細胞移植片を生成するための３ｄマトリックス - Google Patents
細胞移植片を生成するための３ｄマトリックスInfo
- Publication number
- JP2003511120A JP2003511120A JP2001528483A JP2001528483A JP2003511120A JP 2003511120 A JP2003511120 A JP 2003511120A JP 2001528483 A JP2001528483 A JP 2001528483A JP 2001528483 A JP2001528483 A JP 2001528483A JP 2003511120 A JP2003511120 A JP 2003511120A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- matrix
- chitosan
- acid
- dimensional matrix
- aqueous solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
- A61L27/3843—Connective tissue
- A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/20—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/72—Chitin, chitosan
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
この発明は、生体適合性マトリックスを生成するための方法と、その方法を用いて得ることができるマトリックスと、その使用とに関する。インプラントも説明される。この発明のマトリックスは、酸性状態下で水にキトサンを溶解し、溶液を凍結し次に凍結乾燥することによって得られる。過剰な酸は塩基を用いての中和によって凍結乾燥の前またはその後に除去され得る。この発明のマトリックスは寸法的に安定性し、弾性である。それはインプラントの際にはごく僅かな免疫反応しかもたらさない。
Description
【０００１】
この発明は、生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法に関し、こ
の発明の方法によって得ることのできるマトリックスおよびその使用に関する。
の発明の方法によって得ることのできるマトリックスおよびその使用に関する。
【０００２】
近年、移植医療の分野で大きな成功が収められてきた。しかし、ドナーの臓器
の不足のために、移植を必要とする患者が非常に長い期間移植を待たなければな
らないという問題が生じている。さらなる問題は、ＡＩＤＳに罹患しているドナ
ーの場合に少なくとも時折見られたように、ドナーの臓器とともに病原体が伝播
され得ることである。さらに、移植された臓器は受容者の免疫系によって異物と
してみなされる。したがって移植後、拒絶反応を抑制するために患者は免疫抑制
剤に頼っている。近年、細胞培養から人工の臓器を培養する試みがなされ、いく
つかの分野において大きな成功が収められてきた。ここでは、必要なものに関し
て適切な形状にされ得る３次元マトリックス（たとえば耳の形等）上で細胞を培
養する。次に、この人工の臓器または身体の一部が移植され得る。内因性細胞を
用いると、それらが受容者の免疫系によって異物としてみなされることはなく、
つまり、拒絶反応が起こるおそれがなくなる。
の不足のために、移植を必要とする患者が非常に長い期間移植を待たなければな
らないという問題が生じている。さらなる問題は、ＡＩＤＳに罹患しているドナ
ーの場合に少なくとも時折見られたように、ドナーの臓器とともに病原体が伝播
され得ることである。さらに、移植された臓器は受容者の免疫系によって異物と
してみなされる。したがって移植後、拒絶反応を抑制するために患者は免疫抑制
剤に頼っている。近年、細胞培養から人工の臓器を培養する試みがなされ、いく
つかの分野において大きな成功が収められてきた。ここでは、必要なものに関し
て適切な形状にされ得る３次元マトリックス（たとえば耳の形等）上で細胞を培
養する。次に、この人工の臓器または身体の一部が移植され得る。内因性細胞を
用いると、それらが受容者の免疫系によって異物としてみなされることはなく、
つまり、拒絶反応が起こるおそれがなくなる。
【０００３】
マトリックスのための公知の材料の例は、キトサンと混合されたコラーゲンま
たはアルギナートである。しかし、特にコラーゲンは人間の患者用のインプラン
トを生成するために好まれて用いられてはいない。なぜならば、それはウシ軟骨
から生成されるためにＢＳＥのリスクを伴うからである。
たはアルギナートである。しかし、特にコラーゲンは人間の患者用のインプラン
トを生成するために好まれて用いられてはいない。なぜならば、それはウシ軟骨
から生成されるためにＢＳＥのリスクを伴うからである。
【０００４】
有望なマトリックス材料としてキトサンが注目されてきた。キトサンは部分的
に脱アセチル化されたキチンであり、節足動物の外骨格から得られる。それは、
医療分野でたとえば縫合材料としてまたはカプセル薬のために用いられるアミノ
多糖類（ポリ−１−４−グルコサミン）である。その利点は身体がそれを完全に
吸収できることである。キトサンは、遊離アミノ基のプロトン化によってわずか
に酸性の状態下で（ｐＨ＜６）水に溶解され得る。キトサンはアルカリ状態下で
（ｐＨ＞７）水溶液から再沈殿する。このｐＨ依存性メカニズムは、キトサンが
マイルドな条件で精製されて処理され得ることを意味する。
に脱アセチル化されたキチンであり、節足動物の外骨格から得られる。それは、
医療分野でたとえば縫合材料としてまたはカプセル薬のために用いられるアミノ
多糖類（ポリ−１−４−グルコサミン）である。その利点は身体がそれを完全に
吸収できることである。キトサンは、遊離アミノ基のプロトン化によってわずか
に酸性の状態下で（ｐＨ＜６）水に溶解され得る。キトサンはアルカリ状態下で
（ｐＨ＞７）水溶液から再沈殿する。このｐＨ依存性メカニズムは、キトサンが
マイルドな条件で精製されて処理され得ることを意味する。
【０００５】
米国特許第５，８７１，９８５号は、その中へと細胞が成長したマトリックス
からなる、患者への移植のためのビヒクルを提案している。この目的のためにま
ず、生細胞を含むキトサン溶液を生成する。次に、この溶液を半透性の膜に入れ
れてビヒクルを形成する。キトサンは沈殿し、細胞がそこに分配される非架橋マ
トリックスを形成する。
からなる、患者への移植のためのビヒクルを提案している。この目的のためにま
ず、生細胞を含むキトサン溶液を生成する。次に、この溶液を半透性の膜に入れ
れてビヒクルを形成する。キトサンは沈殿し、細胞がそこに分配される非架橋マ
トリックスを形成する。
【０００６】
マディハリー他（Madihally et al.）（生体材料（Biomaterials）１９９９：
２０（１２）、第１１３３頁から第１１４２頁）は、組織再生のためのマトリッ
クスを記載している。この目的のために、８５−９０％脱アセチル化されたキト
サンを０．２Ｍ酢酸中に溶解し、結果として１重量％から３重量％のキトサン含
有溶液を得る。その溶液を凍結(freeze)し、凍結乾燥(lyophilization)によって
水と過剰な酢酸とを除去する。形成される孔の形状はこの場合には凍結乾燥条件
によって影響され得る。結果として得られるマトリックス内の孔の平均的な直径
は４０から２５０μｍの範囲内にある。凍結乾燥されたばかりのマトリックスは
堅く非弾性であると記載されている。中性水性媒質中での水和時に、キトサンは
急速に膨潤し、最終的に溶解する。キトサン構造がさらに溶解することは、希Ｎ
ａＯＨ中での平衡によって、またはたとえば１００、７０、５０、０％のエタノ
ール系で洗浄することによって、回避され得る。この目的のために、凍結乾燥さ
れたマトリックスは０．０５Ｍ ＮａＯＨ中で約１０分間平衡化され、水および
ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）によって洗浄される。しかし、希ＮａＯＨ中
での平衡時にマトリックスは縮み、ｐＨを７にまで減じた時に部分的にのみ可逆
性の構造上の変化を生じる。加えて、マトリックスには多くの空気が含まれる。
より良い結果はエタノール系を用いての平衡によって得られる。空気を除去する
ためにまず、無水アルコールでの洗浄時に短時間だけ真空(vacuum)を適用する。
言及されているさらなる利点は、アルコールでの処理による平衡の間にマトリッ
クスの滅菌がなされることである。しかし、その方法は比較的複雑である。たと
えエタノール系によって膜を安定化させても、孔構造上の変化は起こる。なぜな
らば、キトサンが局部的に水によって溶解することもあり、したがって孔構造が
部分的に破壊されるためである。水和されたマトリックスは柔らかく可撓性があ
るとして記載されているが、それは低い強度を示すのみである。これによってマ
トリックスの処理が著しく妨害される。たとえば軟骨細胞(cartilage cells)を
培養して軟骨を形成するために、適切な形状になるようにマトリックスを切断す
ると、それは非常にたやすく破壊される。同様に、取扱いのために、たとえば出
来たての培養培地へと移される時にマトリックスがたやすく複数の切片へと破壊
されるので、細胞の培養が困難になる。このことは、規定された構造を備えるイ
ンプラントは公知のキトサンマトリックスによって生成可能ではあるがそれには
大きな困難が伴うことを意味する。加えて、マディハリー他はミクロキャリアの
生成を記載している。この目的のために、たとえば液体窒素中で数滴のキトサン
水溶液を直接凍結させるか、または凍結の前に、ＮａＯＨを用いたアルカリ状態
下でそれをゲルとして沈殿させる。より大きな構造は記載されていない。
２０（１２）、第１１３３頁から第１１４２頁）は、組織再生のためのマトリッ
クスを記載している。この目的のために、８５−９０％脱アセチル化されたキト
サンを０．２Ｍ酢酸中に溶解し、結果として１重量％から３重量％のキトサン含
有溶液を得る。その溶液を凍結(freeze)し、凍結乾燥(lyophilization)によって
水と過剰な酢酸とを除去する。形成される孔の形状はこの場合には凍結乾燥条件
によって影響され得る。結果として得られるマトリックス内の孔の平均的な直径
は４０から２５０μｍの範囲内にある。凍結乾燥されたばかりのマトリックスは
堅く非弾性であると記載されている。中性水性媒質中での水和時に、キトサンは
急速に膨潤し、最終的に溶解する。キトサン構造がさらに溶解することは、希Ｎ
ａＯＨ中での平衡によって、またはたとえば１００、７０、５０、０％のエタノ
ール系で洗浄することによって、回避され得る。この目的のために、凍結乾燥さ
れたマトリックスは０．０５Ｍ ＮａＯＨ中で約１０分間平衡化され、水および
ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）によって洗浄される。しかし、希ＮａＯＨ中
での平衡時にマトリックスは縮み、ｐＨを７にまで減じた時に部分的にのみ可逆
性の構造上の変化を生じる。加えて、マトリックスには多くの空気が含まれる。
より良い結果はエタノール系を用いての平衡によって得られる。空気を除去する
ためにまず、無水アルコールでの洗浄時に短時間だけ真空(vacuum)を適用する。
言及されているさらなる利点は、アルコールでの処理による平衡の間にマトリッ
クスの滅菌がなされることである。しかし、その方法は比較的複雑である。たと
えエタノール系によって膜を安定化させても、孔構造上の変化は起こる。なぜな
らば、キトサンが局部的に水によって溶解することもあり、したがって孔構造が
部分的に破壊されるためである。水和されたマトリックスは柔らかく可撓性があ
るとして記載されているが、それは低い強度を示すのみである。これによってマ
トリックスの処理が著しく妨害される。たとえば軟骨細胞(cartilage cells)を
培養して軟骨を形成するために、適切な形状になるようにマトリックスを切断す
ると、それは非常にたやすく破壊される。同様に、取扱いのために、たとえば出
来たての培養培地へと移される時にマトリックスがたやすく複数の切片へと破壊
されるので、細胞の培養が困難になる。このことは、規定された構造を備えるイ
ンプラントは公知のキトサンマトリックスによって生成可能ではあるがそれには
大きな困難が伴うことを意味する。加えて、マディハリー他はミクロキャリアの
生成を記載している。この目的のために、たとえば液体窒素中で数滴のキトサン
水溶液を直接凍結させるか、または凍結の前に、ＮａＯＨを用いたアルカリ状態
下でそれをゲルとして沈殿させる。より大きな構造は記載されていない。
【０００７】
この発明の目的は、必要とされる労力がより少なく安定した柔らかいマトリッ
クスをもたらす、生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法を提供す
ることである。
クスをもたらす、生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法を提供す
ることである。
【０００８】
この目的は、キトサンと過剰な酸とから水溶液を調製し、その水溶液を中和し
、その中和された水溶液を凍結し、減圧下での昇華によって水を除去する、生体
適合性３次元マトリックスを生成するための方法を用いたこの発明の第１の実施
例に従って達成される。
、その中和された水溶液を凍結し、減圧下での昇華によって水を除去する、生体
適合性３次元マトリックスを生成するための方法を用いたこの発明の第１の実施
例に従って達成される。
【０００９】
同等の特性を備える３次元のマトリックスは、キトサンと、アルキルヒドロキ
シカルボン酸およびアリールヒドロキシカルボン酸からなる群より選択される過
剰な酸とから水溶液を調製し、その水溶液を凍結し、減圧下での昇華によって水
を除去し、昇華による除去の前またはその後に過剰な酸を除去する、生体適合性
３次元マトリックスを生成するための方法を用いたこの発明の第２の実施例に従
って得られる。
シカルボン酸およびアリールヒドロキシカルボン酸からなる群より選択される過
剰な酸とから水溶液を調製し、その水溶液を凍結し、減圧下での昇華によって水
を除去し、昇華による除去の前またはその後に過剰な酸を除去する、生体適合性
３次元マトリックスを生成するための方法を用いたこの発明の第２の実施例に従
って得られる。
【００１０】
この発明の方法においてまず、部分的に脱アセチル化されたキトサンと過剰に
存在する酸とから水溶液を調製する。過剰とは、ここでは水溶液のｐＨが酸性の
範囲にあることを意味し、好ましくはｐＨ４より低いことを意味する。これは、
キトサン中の遊離アミノ基が少なくとも部分的にプロトン化され、これによって
水中での溶解度が増すことを意味する。酸の量は重要ではない。それはキトサン
が溶解するように選ばれさえすればよい。酸を過剰に加えることは可能であれば
避けられる。なぜならば、過剰な酸は再び除去しなければならず、したがって酸
の量が多ければ作業が困難になるためである。結果として０．０５から１Ｎ、好
ましくは０．１から０．５Ｎ、特に０．１から０．３Ｎになる酸の量が好ましい
。
存在する酸とから水溶液を調製する。過剰とは、ここでは水溶液のｐＨが酸性の
範囲にあることを意味し、好ましくはｐＨ４より低いことを意味する。これは、
キトサン中の遊離アミノ基が少なくとも部分的にプロトン化され、これによって
水中での溶解度が増すことを意味する。酸の量は重要ではない。それはキトサン
が溶解するように選ばれさえすればよい。酸を過剰に加えることは可能であれば
避けられる。なぜならば、過剰な酸は再び除去しなければならず、したがって酸
の量が多ければ作業が困難になるためである。結果として０．０５から１Ｎ、好
ましくは０．１から０．５Ｎ、特に０．１から０．３Ｎになる酸の量が好ましい
。
【００１１】
特に好適な酸は乳酸である。したがって完成したマトリックスはキトサンの対
イオンとして乳酸イオンを含む。この場合、マトリックスは特に柔らかく弾性で
ある。
イオンとして乳酸イオンを含む。この場合、マトリックスは特に柔らかく弾性で
ある。
【００１２】
キトサンの量は好ましくは、結果として０．０１から５重量％の濃度に、好ま
しくは０．５から１重量％の濃度になるように選ばれる。キトサン溶液の濃度に
よって、マトリックスの構造、特にその孔サイズに影響がもたらされ得る。この
方法で、マトリックスをコロニー化する予定の、特定の細胞型にマトリックスの
孔サイズを適応させることができる。
しくは０．５から１重量％の濃度になるように選ばれる。キトサン溶液の濃度に
よって、マトリックスの構造、特にその孔サイズに影響がもたらされ得る。この
方法で、マトリックスをコロニー化する予定の、特定の細胞型にマトリックスの
孔サイズを適応させることができる。
【００１３】
キトサンは天然資源から生成されるため、均一な分子量を有さない。分子量は
、供給元および製法に依存して２０ｋＤａから１０００ｋＤａを超えるものであ
り得る。３次元マトリックスを生成するためのキトサンはその分子量に関してい
かなる制約も受けない。
、供給元および製法に依存して２０ｋＤａから１０００ｋＤａを超えるものであ
り得る。３次元マトリックスを生成するためのキトサンはその分子量に関してい
かなる制約も受けない。
【００１４】
凍結後、減圧下での昇華によって水を除去する。好適な圧力範囲は０．００１
から３ｈＰａである。精密な条件は水溶液の組成に影響される。揮発性酸を用い
た場合には、それは凍結乾燥の間に少なくとも部分的に共蒸発する場合もある。
から３ｈＰａである。精密な条件は水溶液の組成に影響される。揮発性酸を用い
た場合には、それは凍結乾燥の間に少なくとも部分的に共蒸発する場合もある。
【００１５】
塩基を加えて水溶液のｐＨを５．０から７．５、好ましくは５．５から７．０
、特に６．０から７．０に調整することによって、凍結の前に過剰の酸を除去す
ることが好まれる。その寸法安定性に関して非常に優れた特性を備えるマトリッ
クスが得られる。マトリックスは再水和時に縮まず、いかなる構造的な変化も示
さない。この安定した挙動は、水溶液のｐＨが凍結の前に６．０から７．０であ
る場合に特に顕著である。キトサンはこの範囲内で沈殿し始める。中性状態下で
ゲルまたは微細な懸濁液が形成され、これは凍結乾燥されたマトリックスの構造
に有益な効果をもたらすと考えられる。中和されたキトサン水溶液はこのように
して懸濁液を形成する。したがって、水溶液はキトサン濃度に依存して中和時に
濁る場合もある。
、特に６．０から７．０に調整することによって、凍結の前に過剰の酸を除去す
ることが好まれる。その寸法安定性に関して非常に優れた特性を備えるマトリッ
クスが得られる。マトリックスは再水和時に縮まず、いかなる構造的な変化も示
さない。この安定した挙動は、水溶液のｐＨが凍結の前に６．０から７．０であ
る場合に特に顕著である。キトサンはこの範囲内で沈殿し始める。中性状態下で
ゲルまたは微細な懸濁液が形成され、これは凍結乾燥されたマトリックスの構造
に有益な効果をもたらすと考えられる。中和されたキトサン水溶液はこのように
して懸濁液を形成する。したがって、水溶液はキトサン濃度に依存して中和時に
濁る場合もある。
【００１６】
マディハリー他が提案するような方法では、マトリックスは、ＮａＯＨ水溶液
を用いての平衡による過剰な酢酸の中和時に構造上の大きな変化を経験する。推
定されるところによると、この水溶液を加えることによってキトサンの局所的な
溶解がもたらされ、ＮａＯＨによってそれが再沈殿する。このようにしてマトリ
ックスの孔構造が変化する。
を用いての平衡による過剰な酢酸の中和時に構造上の大きな変化を経験する。推
定されるところによると、この水溶液を加えることによってキトサンの局所的な
溶解がもたらされ、ＮａＯＨによってそれが再沈殿する。このようにしてマトリ
ックスの孔構造が変化する。
【００１７】
この発明の発明者が発見した方法を用いると、凍結乾燥による水の除去の後の
マトリックスのさらなる処理の時に構造的変化が全く起こらないかまたはずっと
小さな構造的変化しか起こらないように、マトリックスを安定化させることがで
きる。
マトリックスのさらなる処理の時に構造的変化が全く起こらないかまたはずっと
小さな構造的変化しか起こらないように、マトリックスを安定化させることがで
きる。
【００１８】
この発明の方法の第１の実施例では、キトサン溶液はたとえ凍結および凍結乾
燥の前でも中性のｐＨを有する。「中性ｐＨ」とはこの場合、上述の範囲内にあ
るｐＨを意味する。したがって、凍結乾燥後に塩基を用いてマトリックスを平衡
化する必要はもはやない。極めて重要なポイントは、キトサン溶液が適切に中和
されてキトサンがゲルとして沈殿することである。中和が慎重に行なわれない場
合には、結果として得られるマトリックスは再水和時に再び溶解する。この発明
の方法の第１の実施例では、酸は第１の例においてはいかなる特定の制約にも影
響されない。
燥の前でも中性のｐＨを有する。「中性ｐＨ」とはこの場合、上述の範囲内にあ
るｐＨを意味する。したがって、凍結乾燥後に塩基を用いてマトリックスを平衡
化する必要はもはやない。極めて重要なポイントは、キトサン溶液が適切に中和
されてキトサンがゲルとして沈殿することである。中和が慎重に行なわれない場
合には、結果として得られるマトリックスは再水和時に再び溶解する。この発明
の方法の第１の実施例では、酸は第１の例においてはいかなる特定の制約にも影
響されない。
【００１９】
キトサン水溶液を調製するために、無機酸および有機酸、好ましくはアルキル
カルボン酸およびアリールカルボン酸、特にヒドロキシカルボン酸からなる群よ
り選択される酸を用いることができる。乳酸が特に好まれる。
カルボン酸およびアリールカルボン酸、特にヒドロキシカルボン酸からなる群よ
り選択される酸を用いることができる。乳酸が特に好まれる。
【００２０】
無機酸の例は、塩酸、リン酸、および酸性のリン酸塩である。有機酸の例は、
１から１２の炭素原子を有するアルキルカルボン酸であり、アルキル鎖は直鎖ま
たは分枝鎖であり得る。例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸
、ヘキサン酸、ペプタン酸、およびより高級の直鎖カルボン酸である。他に好適
なものは、シュウ酸、コハク酸、またはアジピン酸等の、２から８の炭素原子を
有するジカルボン酸である。さらに他に好適なものは、安息香酸またはナフトエ
酸等の芳香族カルボン酸である。さらに、グルタミン酸またはアスパラギン酸等
のアミノ酸も好適である。
１から１２の炭素原子を有するアルキルカルボン酸であり、アルキル鎖は直鎖ま
たは分枝鎖であり得る。例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸
、ヘキサン酸、ペプタン酸、およびより高級の直鎖カルボン酸である。他に好適
なものは、シュウ酸、コハク酸、またはアジピン酸等の、２から８の炭素原子を
有するジカルボン酸である。さらに他に好適なものは、安息香酸またはナフトエ
酸等の芳香族カルボン酸である。さらに、グルタミン酸またはアスパラギン酸等
のアミノ酸も好適である。
【００２１】
しかし、ヒドロキシカルボン酸を用いると特に優れた結果が得られる。特に好
適なものは２から１２の炭素原子を有するヒドロキシカルボン酸である。分子内
に１つ以上のヒドロキシル基と１つ以上のカルボキシル基とが存在し得る。例と
しては、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびクエン酸である。たと
えばマンデル酸等の芳香族ヒドロキシカルボン酸を用いることも可能である。
適なものは２から１２の炭素原子を有するヒドロキシカルボン酸である。分子内
に１つ以上のヒドロキシル基と１つ以上のカルボキシル基とが存在し得る。例と
しては、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびクエン酸である。たと
えばマンデル酸等の芳香族ヒドロキシカルボン酸を用いることも可能である。
【００２２】
用いられ得る塩基は、たとえば、ＮａＯＨ等のアルカリ金属水酸化物などの従
来の塩基である。塩基は、中性のｐＨが無理なく調整され得るように選ばれるべ
きである。
来の塩基である。塩基は、中性のｐＨが無理なく調整され得るように選ばれるべ
きである。
【００２３】
改善された構造を備えるマトリックスを得るためにさらに、水中でキトサンを
溶解するために用いられる酸でマトリックスを安定化させる。
溶解するために用いられる酸でマトリックスを安定化させる。
【００２４】
意外なことには、キトサンマトリックスの特性は対イオンの選択によって影響
され得ることが明らかになった。これはこの発明の方法の第２の実施例で利用さ
れる。この場合に用いられる酸はヒドロキシカルボン酸である。キトサンのプロ
トン化されたアミノ基に対する対イオンが乳酸アニオンとそれとによって形成さ
れるような乳酸を用いたときに特に、非常に優れた特性が得られる。マトリック
スは高い温度耐性を示し、無理なくたとえばオートクレーブ処理され得る。この
間にマトリックスの変色、またはマトリックスの分解という他の兆候が現われる
ことはない。マトリックスはまた高い弾性および機械的強度を示す。したがって
、ペトリ皿に水性キトサン／乳酸溶液を注ぎ次に凍結させて凍結乾燥することに
よって得られるシート様マトリックスを、無理なく、マトリックスを破損させず
に巻くことができる。
され得ることが明らかになった。これはこの発明の方法の第２の実施例で利用さ
れる。この場合に用いられる酸はヒドロキシカルボン酸である。キトサンのプロ
トン化されたアミノ基に対する対イオンが乳酸アニオンとそれとによって形成さ
れるような乳酸を用いたときに特に、非常に優れた特性が得られる。マトリック
スは高い温度耐性を示し、無理なくたとえばオートクレーブ処理され得る。この
間にマトリックスの変色、またはマトリックスの分解という他の兆候が現われる
ことはない。マトリックスはまた高い弾性および機械的強度を示す。したがって
、ペトリ皿に水性キトサン／乳酸溶液を注ぎ次に凍結させて凍結乾燥することに
よって得られるシート様マトリックスを、無理なく、マトリックスを破損させず
に巻くことができる。
【００２５】
この発明の方法の第２の実施例では、たとえキトサン溶液が凍結の前に中和さ
れなくても、ヒドロキシアルキルカルボン酸またはヒドロキシアリールカルボン
酸の安定効果が現れる。凍結乾燥後、たとえば０．０５Ｎ ＮａＯＨ等の塩基を
用いての平衡によって、依然として存在する過剰な酸の残留物を除去する。次に
、リン酸緩衝液（０．１Ｎ、約７のｐＨ）を含み得る水でマトリックスを洗浄す
る。この場合、マトリックスの構造的変化はマディハリーが記載しているマトリ
ックスでの場合よりもかなり少ない。この発明の方法の第２の実施例において凍
結の前にキトサン溶液を中和することが特に有利である。アルカリ状態下での平
衡はもはや必要ではなくなる。直接マトリックスをさらに処理することができる
。たとえば、それを細胞によってコロニー化することができる。
れなくても、ヒドロキシアルキルカルボン酸またはヒドロキシアリールカルボン
酸の安定効果が現れる。凍結乾燥後、たとえば０．０５Ｎ ＮａＯＨ等の塩基を
用いての平衡によって、依然として存在する過剰な酸の残留物を除去する。次に
、リン酸緩衝液（０．１Ｎ、約７のｐＨ）を含み得る水でマトリックスを洗浄す
る。この場合、マトリックスの構造的変化はマディハリーが記載しているマトリ
ックスでの場合よりもかなり少ない。この発明の方法の第２の実施例において凍
結の前にキトサン溶液を中和することが特に有利である。アルカリ状態下での平
衡はもはや必要ではなくなる。直接マトリックスをさらに処理することができる
。たとえば、それを細胞によってコロニー化することができる。
【００２６】
この発明の方法の両方の実施例の結果として、柔らかく曲げやすい、均一な孔
構造を備えるマトリックスが得られる。たとえばマトリックスが指からの圧力に
よって圧縮されると、圧力がなくなった後それは再び弾性的に元の形状を取り戻
す。破壊または砕くことなしにマトリックスを成形すること、たとえばそれを巻
くことができる。
構造を備えるマトリックスが得られる。たとえばマトリックスが指からの圧力に
よって圧縮されると、圧力がなくなった後それは再び弾性的に元の形状を取り戻
す。破壊または砕くことなしにマトリックスを成形すること、たとえばそれを巻
くことができる。
【００２７】
細胞の合着アセンブリを形成するためには、細胞によるコロニー化の間にマト
リックスが十分な強度を有し、非常に長い時間をかけないと崩壊(breakdown)し
ないようにすることが必要である。崩壊の速度は、キトサンの脱アセチル化の程
度によって制御され得る。非常に高い程度でアセチル化されたキトサンを用いる
と、１ヶ月よりも長い崩壊の期間を達成することができる。
リックスが十分な強度を有し、非常に長い時間をかけないと崩壊(breakdown)し
ないようにすることが必要である。崩壊の速度は、キトサンの脱アセチル化の程
度によって制御され得る。非常に高い程度でアセチル化されたキトサンを用いる
と、１ヶ月よりも長い崩壊の期間を達成することができる。
【００２８】
キトサンの脱アセチル化の程度が≦８０％である場合、マトリックスは特に高
い吸収性を有するということが確認される。脱アセチル化の程度はキトサンのＮ
アセチル基に関係する。脱アセチル化の程度とは、存在する全アミノ基（遊離ア
ミノ基とアセチル化されたアミノ基とのトータル）に対するアセチル化されてい
ないアミノ基の比率を意味する。≦８０％の脱アセチル化の程度ではアモルファ
ス構造がマトリックスの広範囲で形成されると仮定される。これらのアモルファ
ス区域は推定されるところによると酵素によってさらに攻撃され得る。したがっ
て、マトリックスが体内に吸収されかつ特定のニーズに関して調整される速度に
影響を及ぼすことが可能である。
い吸収性を有するということが確認される。脱アセチル化の程度はキトサンのＮ
アセチル基に関係する。脱アセチル化の程度とは、存在する全アミノ基（遊離ア
ミノ基とアセチル化されたアミノ基とのトータル）に対するアセチル化されてい
ないアミノ基の比率を意味する。≦８０％の脱アセチル化の程度ではアモルファ
ス構造がマトリックスの広範囲で形成されると仮定される。これらのアモルファ
ス区域は推定されるところによると酵素によってさらに攻撃され得る。したがっ
て、マトリックスが体内に吸収されかつ特定のニーズに関して調整される速度に
影響を及ぼすことが可能である。
【００２９】
マトリックスの孔サイズはさらに、キトサン水溶液が凍結される速度によって
影響を及ぼされ得る。この点について、たとえば液体窒素中での急速凍結の結果
として小さな孔直径が得られ、一方で、たとえば−３０から−１５℃の範囲での
緩慢凍結の結果としてより大きな孔が得られる。キトサン溶液を凍結するための
温度は−２００℃から−０℃、好ましくは−９０℃から−１０℃、特に好ましく
は−４０℃から−１５℃の範囲で、好ましくは選ばれる。
影響を及ぼされ得る。この点について、たとえば液体窒素中での急速凍結の結果
として小さな孔直径が得られ、一方で、たとえば−３０から−１５℃の範囲での
緩慢凍結の結果としてより大きな孔が得られる。キトサン溶液を凍結するための
温度は−２００℃から−０℃、好ましくは−９０℃から−１０℃、特に好ましく
は−４０℃から−１５℃の範囲で、好ましくは選ばれる。
【００３０】
上述の方法を用いて得ることのできるマトリックスは、先行技術で公知のマト
リックスと比較して非常に優れた特性を有する。したがって、この発明は上述の
方法を用いて得られるようなマトリックスにも関する。マトリックスは寸法的に
安定していて、柔らかく、かつ可撓性があるため、容易に処理され得る。それは
たとえば容易に所望の形状に切断され得る。分解反応を起こすことなしにそれを
オートクレーブ処理することができ、したがって容易に滅菌することができる。
マトリックスを安定化させるために、コラーゲンまたはアルギナートのさらなる
物質が必要とされることはない。アセチル化の程度、したがってたとえばマトリ
ックスの吸収性を制約なしに選ぶことができ、したがってそれを特定の要件に調
整することができる。マトリックスの構造、特に孔サイズは、キトサン水溶液の
濃度と凍結条件とによって影響され得る。
リックスと比較して非常に優れた特性を有する。したがって、この発明は上述の
方法を用いて得られるようなマトリックスにも関する。マトリックスは寸法的に
安定していて、柔らかく、かつ可撓性があるため、容易に処理され得る。それは
たとえば容易に所望の形状に切断され得る。分解反応を起こすことなしにそれを
オートクレーブ処理することができ、したがって容易に滅菌することができる。
マトリックスを安定化させるために、コラーゲンまたはアルギナートのさらなる
物質が必要とされることはない。アセチル化の程度、したがってたとえばマトリ
ックスの吸収性を制約なしに選ぶことができ、したがってそれを特定の要件に調
整することができる。マトリックスの構造、特に孔サイズは、キトサン水溶液の
濃度と凍結条件とによって影響され得る。
【００３１】
マトリックスが対イオンとして乳酸アニオンを有する場合には、寸法的に非常
に安定した可撓性のあるマトリックスが得られる。
に安定した可撓性のあるマトリックスが得られる。
【００３２】
マトリックスは所望であれば多数のアミノ基によって修飾され得る。３次元マ
トリックスの好ましい実施例では、リガンドがキトサンマトリックス、好ましく
はキトサンの遊離アミノ基に共有結合または非共有結合される。用いられ得るリ
ガンドはたとえば、増殖プロモータ、タンパク質、ホルモン、ヘパリン、硫酸ヘ
パリン、コンドロイチン硫酸、硫酸デキストラン、またはこれらの物質の混合で
ある。リガンドは好ましくは細胞増殖を制御し改善させるように働く。
トリックスの好ましい実施例では、リガンドがキトサンマトリックス、好ましく
はキトサンの遊離アミノ基に共有結合または非共有結合される。用いられ得るリ
ガンドはたとえば、増殖プロモータ、タンパク質、ホルモン、ヘパリン、硫酸ヘ
パリン、コンドロイチン硫酸、硫酸デキストラン、またはこれらの物質の混合で
ある。リガンドは好ましくは細胞増殖を制御し改善させるように働く。
【００３３】
マトリックス上の細胞増殖はさらに、マトリックスが自己フィブリンによって
コーティングされると改善される。
コーティングされると改善される。
【００３４】
この発明の３次元マトリックスは培養リアクタ（細胞ファクトリー）内の固相
として用いられ得る。マトリックスは培養培地内で非常に高い強度を示す。マト
リックスは細胞増殖を促進することも明らかになった。
として用いられ得る。マトリックスは培養培地内で非常に高い強度を示す。マト
リックスは細胞増殖を促進することも明らかになった。
【００３５】
マトリックスは細胞増殖を促す。したがってそれは直接、つまり前段階の細胞
によるコロニー化なしに、インプラントされ得る。インプラント後、内因性細胞
が増殖し、マトリックスは漸進的に溶解する。
によるコロニー化なしに、インプラントされ得る。インプラント後、内因性細胞
が増殖し、マトリックスは漸進的に溶解する。
【００３６】
マトリックスはまた細胞インプラントとしての用途に好適であり、特に軟骨(c
artilage)形成細胞のために好適である。この点に関して、遺伝子的に変更され
た細胞のいずれも用いないことが好まれる。好ましくは、生検によって患者から
細胞を採取してそれを細胞マトリックス上で培養し、次に細胞インプラントを患
者にインプラントする。移植による拒絶反応は以下のもののために実質的に防が
れる。すなわち、周辺組織のそれぞれの増殖因子に促されて移植部位のみで分化
する内因性幹細胞（代用骨）による、３次元マトリックスのコロニー化と、ヒア
リン軟骨のさらなる形成のための、軟骨細胞(cartilage cells)によるコロニー
化とのために、拒絶反応が防がれる。これは種々のプラスチックまたはセラミッ
クから作られる以前のマトリックスと比較して非常に大きな利点である。これら
の材料は体内に残り、数年後でさえも異物としてみなされて拒絶されるおそれが
ある。３次元マトリックスは、人間の細胞と動物の細胞（たとえばウマ、イヌ、
またはサメ由来の細胞）との両者によってコロニー化され得る。サメの細胞が特
に好適である。なぜならば、それらは受容者の中で無視できるほどの免疫学的応
答しか誘導しないためである。サメの細胞は既に臓器の代わりに、たとえば目の
水晶体のために用いられている。
artilage)形成細胞のために好適である。この点に関して、遺伝子的に変更され
た細胞のいずれも用いないことが好まれる。好ましくは、生検によって患者から
細胞を採取してそれを細胞マトリックス上で培養し、次に細胞インプラントを患
者にインプラントする。移植による拒絶反応は以下のもののために実質的に防が
れる。すなわち、周辺組織のそれぞれの増殖因子に促されて移植部位のみで分化
する内因性幹細胞（代用骨）による、３次元マトリックスのコロニー化と、ヒア
リン軟骨のさらなる形成のための、軟骨細胞(cartilage cells)によるコロニー
化とのために、拒絶反応が防がれる。これは種々のプラスチックまたはセラミッ
クから作られる以前のマトリックスと比較して非常に大きな利点である。これら
の材料は体内に残り、数年後でさえも異物としてみなされて拒絶されるおそれが
ある。３次元マトリックスは、人間の細胞と動物の細胞（たとえばウマ、イヌ、
またはサメ由来の細胞）との両者によってコロニー化され得る。サメの細胞が特
に好適である。なぜならば、それらは受容者の中で無視できるほどの免疫学的応
答しか誘導しないためである。サメの細胞は既に臓器の代わりに、たとえば目の
水晶体のために用いられている。
【００３７】
免疫応答を僅かに刺激するのみかまたは全く刺激しないこの発明のインプラン
トは有利なことには、好ましくは内因性細胞によってコロニー化される上述の３
次元マトリックスから構成される。したがって、たとえば、無菌状態下で好適な
培養培地内において角膜実質細胞によってコロニー化された薄いシートのような
マトリックスは、皮膚移植片として役に立つことができる。コロニー化されたマ
トリックスは、手術室において無菌状態下の培養培地から取除かれて清潔な創傷
面上に置かれ得る。次に内因性細胞がマトリックスに移動して組織を形成するこ
とができる。
トは有利なことには、好ましくは内因性細胞によってコロニー化される上述の３
次元マトリックスから構成される。したがって、たとえば、無菌状態下で好適な
培養培地内において角膜実質細胞によってコロニー化された薄いシートのような
マトリックスは、皮膚移植片として役に立つことができる。コロニー化されたマ
トリックスは、手術室において無菌状態下の培養培地から取除かれて清潔な創傷
面上に置かれ得る。次に内因性細胞がマトリックスに移動して組織を形成するこ
とができる。
【００３８】
人工肝臓としての実施例も可能である。この場合のマトリックスは好適な培養
培地内で肝細胞によってコロニー化される。マトリックスによってまた安定化さ
れ得る細胞アセンブリが患者の体内にインプラントされ、そこでたとえば損傷し
た肝臓の機能を手助けすることができる。
培地内で肝細胞によってコロニー化される。マトリックスによってまた安定化さ
れ得る細胞アセンブリが患者の体内にインプラントされ、そこでたとえば損傷し
た肝臓の機能を手助けすることができる。
【００３９】
自己軟骨細胞（chondrocytes）によって３次元マトリックスをコロニー化する
場合に、良い結果が達成された。次にマトリックスは、新しい軟骨物質がそこで
発達し得る軟骨上の適切な場所に移植され得る。これにより、現在用いられてい
る、支持マトリックスなしでの軟骨細胞(cartilage cells)の移植方法と比較し
て優れた利点が提供される。この方法に高い確率で存在する、骨膜が損傷され次
に骨細胞(bone cells)が新しい軟骨層へと増殖し新しい軟骨の退化がそれに続く
という現象がこの発明のインプラントによって避けられる。
場合に、良い結果が達成された。次にマトリックスは、新しい軟骨物質がそこで
発達し得る軟骨上の適切な場所に移植され得る。これにより、現在用いられてい
る、支持マトリックスなしでの軟骨細胞(cartilage cells)の移植方法と比較し
て優れた利点が提供される。この方法に高い確率で存在する、骨膜が損傷され次
に骨細胞(bone cells)が新しい軟骨層へと増殖し新しい軟骨の退化がそれに続く
という現象がこの発明のインプラントによって避けられる。
【００４０】
マトリックスをコロニー化するために好適な他の細胞の例は、骨細胞(osteocy
tes)、ケラチノサイト、肝細胞(hepatocytes)、骨髄幹細胞、またはニューロン
細胞である。
tes)、ケラチノサイト、肝細胞(hepatocytes)、骨髄幹細胞、またはニューロン
細胞である。
【００４１】
この発明は、いくつかの図の参照と例とによって以下でより詳細に説明される
。
。
【００４２】
例１：３次元マトリックスを生成するための一般的な方法（第１の実施例）
ｐＨ３から６の間での希酸水溶液中で攪拌することによって、キトサンを溶解
する。次に、希ＮａＯＨを用いて所望のｐＨを調整する。溶液を好適な形状の容
器に移し、−３０から−１５℃で凍結する。凍結された溶液が入った容器を凍結
乾燥器に移し、減圧下（０．０１から０．５ｈＰａ）での昇華によって水を除去
する。さらなる精製をせずに細胞によるコロニー化のために海綿状の残留物を用
いることができる。
する。次に、希ＮａＯＨを用いて所望のｐＨを調整する。溶液を好適な形状の容
器に移し、−３０から−１５℃で凍結する。凍結された溶液が入った容器を凍結
乾燥器に移し、減圧下（０．０１から０．５ｈＰａ）での昇華によって水を除去
する。さらなる精製をせずに細胞によるコロニー化のために海綿状の残留物を用
いることができる。
【００４３】
例２：３次元マトリックスを生成するための一般的な方法（第２の実施例）
ｐＨ３から６の間での希ヒドロキシカルボン酸水溶液中で攪拌することによっ
て、キトサンを溶解する。透明な溶液を好適な形状の容器内で−３０から−１５
℃の温度で凍結する。凍結された溶液が入った容器を凍結乾燥器に移し、減圧下
（０．０１から０．５ｈＰａ）での昇華によって水を除去する。昇華による水の
除去の後に残る海綿状の残留物を水酸化ナトリウム溶液（５重量％）中で２４時
間塩基性化する。次に細胞に対する許容ｐＨが得られるまで脱イオン水で海綿状
のマトリックスを洗浄する。
て、キトサンを溶解する。透明な溶液を好適な形状の容器内で−３０から−１５
℃の温度で凍結する。凍結された溶液が入った容器を凍結乾燥器に移し、減圧下
（０．０１から０．５ｈＰａ）での昇華によって水を除去する。昇華による水の
除去の後に残る海綿状の残留物を水酸化ナトリウム溶液（５重量％）中で２４時
間塩基性化する。次に細胞に対する許容ｐＨが得られるまで脱イオン水で海綿状
のマトリックスを洗浄する。
【００４４】
例３：多孔質キトサンマトリックスの生成（対イオン：乳酸塩）
９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、０．１ｇのキトサンおよ
び０．１１１３ｇの乳酸（９０％水中、ダルムシュタット(Darmstadt)のメルク
ＫＧａＡ（Merck ＫＧａＡ）から購入）を溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を
用いてｐＨを７にまで調整した。まず透明な溶液を−２４℃で凍結し、次に０．
０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
び０．１１１３ｇの乳酸（９０％水中、ダルムシュタット(Darmstadt)のメルク
ＫＧａＡ（Merck ＫＧａＡ）から購入）を溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を
用いてｐＨを７にまで調整した。まず透明な溶液を−２４℃で凍結し、次に０．
０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
【００４５】
海綿状の弾性を有する白色で微細孔の発泡体が得られた。さらなる精製をせず
に、細胞によるコロニー化のために発泡体を用いた。マトリックスは図１で示さ
れる。それは均一で、微細な構造の表面を有する。歪みは検出され得ず、そのマ
トリックスは全体にわたって均一な微細孔の構造を示す。
に、細胞によるコロニー化のために発泡体を用いた。マトリックスは図１で示さ
れる。それは均一で、微細な構造の表面を有する。歪みは検出され得ず、そのマ
トリックスは全体にわたって均一な微細孔の構造を示す。
【００４６】
例４：多孔質キトサンマトリックスの生成（対イオン：酢酸塩）（第１の実施
例） ９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、０．１ｇのキトサンおよ
び０．１ｇの酢酸（１００％）を溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐ
Ｈを７にまで調整した。まず透明な溶液を−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰ
ａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
例） ９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、０．１ｇのキトサンおよ
び０．１ｇの酢酸（１００％）を溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐ
Ｈを７にまで調整した。まず透明な溶液を−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰ
ａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
【００４７】
白色の、微細孔の発泡体が得られた。
例５：多孔質キトサンマトリックスの生成（対イオン：リン酸塩）
７．００ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、０．１ｇのキトサンおよ
び０．０３７ｍｌのオルトリン酸（８５％ シグマ Ｐ ６５６０）を溶解し、
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。まず透明な溶液を
−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去し
た。
び０．０３７ｍｌのオルトリン酸（８５％ シグマ Ｐ ６５６０）を溶解し、
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。まず透明な溶液を
−２４℃で凍結し、次に０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去し
た。
【００４８】
海綿状の弾性を有する白色で微細孔の発泡体が得られた。さらなる精製をせず
に、細胞によるコロニー化のために発泡体を用いた。
に、細胞によるコロニー化のために発泡体を用いた。
【００４９】
例６：多孔質キトサンマトリックスの生成（対イオン：グルタミン酸塩）
１０．００ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、０．１ｇのキトサンお
よび０．１ｇのグルタミン酸（シグマ Ｇ ６９０４）を溶解し、１Ｍ水酸化ナ
トリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。まず透明な溶液を−２４℃で凍
結し、次に０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
よび０．１ｇのグルタミン酸（シグマ Ｇ ６９０４）を溶解し、１Ｍ水酸化ナ
トリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整した。まず透明な溶液を−２４℃で凍
結し、次に０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。
【００５０】
海綿状の弾性を有する白色の、微細孔発泡体が得られた。
例７：９．７９ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、０．１ｇのキトサ
ンおよび０．１１１３ｇの乳酸を溶解し、透明な溶液をまず−２４℃で凍結した
。０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。海綿状の残留物を
水酸化ナトリウム溶液（５重量％）中で２４時間塩基性化し、次に、中性になる
まで脱イオン水で洗浄した。乾燥させた結果として弾性の白い発泡体が得られた
。そのマトリックスは図２ａで示される。
ンおよび０．１１１３ｇの乳酸を溶解し、透明な溶液をまず−２４℃で凍結した
。０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。海綿状の残留物を
水酸化ナトリウム溶液（５重量％）中で２４時間塩基性化し、次に、中性になる
まで脱イオン水で洗浄した。乾燥させた結果として弾性の白い発泡体が得られた
。そのマトリックスは図２ａで示される。
【００５１】
比較例１：７．００ｇの脱イオン水中で攪拌することによって、０．１ｇのキ
トサンおよび０．０３７ｍｌのオルトリン酸を溶解し、透明な溶液をまず−２４
℃で凍結した。０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。海綿
状の残留物を水酸化ナトリウム溶液中で２４時間塩基性化し、次に、中性になる
まで脱イオン水で洗浄した。乾燥させた結果として脆性の白い発泡体が得られた
。そのマトリックスは図２ｂで示される。
トサンおよび０．０３７ｍｌのオルトリン酸を溶解し、透明な溶液をまず−２４
℃で凍結した。０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって溶媒を除去した。海綿
状の残留物を水酸化ナトリウム溶液中で２４時間塩基性化し、次に、中性になる
まで脱イオン水で洗浄した。乾燥させた結果として脆性の白い発泡体が得られた
。そのマトリックスは図２ｂで示される。
【００５２】
例８：アニオン特性（Ｌグルタミン酸の固定）を用いての多孔質キトサンマト
リックスの生成 ０．１ｇのキトサンを１０ｍｌの水に入れ、１Ｍ塩酸を用いてｐＨを４にまで
調整し、その混合物を２４時間攪拌した。１Ｎ ＮａＯＨを加えることによって
ｐＨを５．８にまで調整し、攪拌している間、０．０５ｇのグルタミン酸と０．
０５ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｅ
ＤＡＣ）とを加えて溶解した。室温でさらに３時間攪拌した後、１Ｍ ＮａＯＨ
を用いてｐＨを７にまで調整し、沈殿物を濾過し、それを２ｌの脱イオン水で洗
浄した。洗浄された沈殿物を、０．１１１３ｇの乳酸（９０％水中、ダルムシュ
タットのメルクＫＧａＡから購入）を用いて９．７９ｇの水中で攪拌することに
よって溶解した。１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整し、溶
液を−２４℃で凍結した。次に０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって水を除
去した。
リックスの生成 ０．１ｇのキトサンを１０ｍｌの水に入れ、１Ｍ塩酸を用いてｐＨを４にまで
調整し、その混合物を２４時間攪拌した。１Ｎ ＮａＯＨを加えることによって
ｐＨを５．８にまで調整し、攪拌している間、０．０５ｇのグルタミン酸と０．
０５ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｅ
ＤＡＣ）とを加えて溶解した。室温でさらに３時間攪拌した後、１Ｍ ＮａＯＨ
を用いてｐＨを７にまで調整し、沈殿物を濾過し、それを２ｌの脱イオン水で洗
浄した。洗浄された沈殿物を、０．１１１３ｇの乳酸（９０％水中、ダルムシュ
タットのメルクＫＧａＡから購入）を用いて９．７９ｇの水中で攪拌することに
よって溶解した。１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７にまで調整し、溶
液を−２４℃で凍結した。次に０．０５ｈＰａの圧力下での昇華によって水を除
去した。
【００５３】
白色で海綿状の残留物が得られた。海綿はさらなる精製なしに用いられ得る。
例９：固定された細胞接着因子Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｓｐを用いて
の３次元マトリックスの生成 ０．１ｇのキトサンを１０ｍｌの水に入れ、１Ｍ塩酸を用いてｐＨを４にまで
調整した。室温で２４時間攪拌した後、透明の溶液を１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐ
Ｈ５．８にまで調整し、次に、０．０１ｇのＬ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｓ
ｐと０．０５ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド（ＥＤＡＣ）とを続けて加え、攪拌することによって溶解した。室温でさら
に３時間攪拌した後、１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを７にまで調整した。沈殿物
を濾過し、それを２ｌの水で洗浄した。次に沈殿物を、０．１１１３ｇの乳酸（
９０％水中、ダルムシュタットのメルクＫＧａＡから購入）を用いて９．７９ｇ
の水中で攪拌することによって溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ
を７にまで調整し、溶液を−２４℃で凍結した。最後に、０．０５ｈＰａの圧力
下での昇華によって水を除去した。
の３次元マトリックスの生成 ０．１ｇのキトサンを１０ｍｌの水に入れ、１Ｍ塩酸を用いてｐＨを４にまで
調整した。室温で２４時間攪拌した後、透明の溶液を１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐ
Ｈ５．８にまで調整し、次に、０．０１ｇのＬ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｓ
ｐと０．０５ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド（ＥＤＡＣ）とを続けて加え、攪拌することによって溶解した。室温でさら
に３時間攪拌した後、１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを７にまで調整した。沈殿物
を濾過し、それを２ｌの水で洗浄した。次に沈殿物を、０．１１１３ｇの乳酸（
９０％水中、ダルムシュタットのメルクＫＧａＡから購入）を用いて９．７９ｇ
の水中で攪拌することによって溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ
を７にまで調整し、溶液を−２４℃で凍結した。最後に、０．０５ｈＰａの圧力
下での昇華によって水を除去した。
【００５４】
白色で海綿状の残留物が得られた。海綿はさらなる精製なしに用いられ得る。
例１０：３次元マトリックス上に細胞を播種してインキュベートするための一
般的な手順 例１から６で得られた３次元マトリックスをＰＢＳ中で１２１℃で２０分間オ
ートクレーブ処理する。このときマトリックスは無菌であり、液体で完全に湿ら
されている。次に、必要物のために適切に切断されたマトリックス上に好適な培
養培地で培養された細胞を直接置き、好適な温度でインキュベートする。増殖を
伴うマトリックスは無菌状態下で取除かれて、たとえばインプラントされ得る。
般的な手順 例１から６で得られた３次元マトリックスをＰＢＳ中で１２１℃で２０分間オ
ートクレーブ処理する。このときマトリックスは無菌であり、液体で完全に湿ら
されている。次に、必要物のために適切に切断されたマトリックス上に好適な培
養培地で培養された細胞を直接置き、好適な温度でインキュベートする。増殖を
伴うマトリックスは無菌状態下で取除かれて、たとえばインプラントされ得る。
【００５５】
例１１：３次元マトリックス上での軟骨細胞（chondrocytes）の培養
生検によって得られる自己軟骨細胞（chondrocytes）を軟骨細胞（chondrocyt
es）増殖培地上で培養した（米国、セルアプリケーションズ社（Cell Applicati
ons Inc.））。
es）増殖培地上で培養した（米国、セルアプリケーションズ社（Cell Applicati
ons Inc.））。
【００５６】
まず、例３のとおりに生成した３次元マトリックスを１２１℃で２０分間オー
トクレーブ処理した。完全に湿らされたマトリックスを無菌状態下で適切に切断
し、培養器に入れた。次に、培養培地で培養した軟骨細胞（chondrocytes）を３
次元マトリックス上に置き、３７℃で１４日から２１日間インキュベートした。
この間、細胞は３次元マトリックスへと増殖した。増殖を伴うマトリックスを無
菌状態下で取り除いた。次にそれはインプラントされ得る。
トクレーブ処理した。完全に湿らされたマトリックスを無菌状態下で適切に切断
し、培養器に入れた。次に、培養培地で培養した軟骨細胞（chondrocytes）を３
次元マトリックス上に置き、３７℃で１４日から２１日間インキュベートした。
この間、細胞は３次元マトリックスへと増殖した。増殖を伴うマトリックスを無
菌状態下で取り除いた。次にそれはインプラントされ得る。
【００５７】
図３は、顕微鏡で拡大されたイメージとしてのコロニー化されたキトサンマト
リックスを示す。矢印で示され球状の凝集物から成るより黒い領域は、培養中に
マトリックス上で発達した細胞の凝集物である。細胞はマトリックスの孔へと増
殖し、そこで３次元の細胞凝集物を形成する。
リックスを示す。矢印で示され球状の凝集物から成るより黒い領域は、培養中に
マトリックス上で発達した細胞の凝集物である。細胞はマトリックスの孔へと増
殖し、そこで３次元の細胞凝集物を形成する。
【００５８】
キトサンマトリックスの特性は、生成方法と用いられる対イオンとによって強
く影響を受ける。対イオンの効果が図２ａ（例７）と図２ｂ（比較例１）との比
較から明らかである。両方のマトリックスが、キトサンと適切な酸とを水中で溶
解し、溶液を凍結し、昇華によって溶媒を除去することによって生成された。次
に、発泡体のような残留物がＮａＯＨ水溶液中で平衡化された。対イオンとして
乳酸塩を用いると（図２ａ）、ＮａＯＨを用いての平衡時のマトリックスの構造
的変化はリン酸塩を用いるとき（図２ｂ）よりも明らかにより少ない。そのマト
リックスの表面はより平滑であり、はっきりとした構造化はあまり見られない。
例７で得られるマトリックスは比較例１からのマトリックスよりも明らかにより
弾性であり、より安定している。それを圧縮することができ、圧力がなくなった
後それは再び弾性的に元の形状を取り戻す。同様に、破壊することなしにそれを
弾性的に曲げることもできる。
く影響を受ける。対イオンの効果が図２ａ（例７）と図２ｂ（比較例１）との比
較から明らかである。両方のマトリックスが、キトサンと適切な酸とを水中で溶
解し、溶液を凍結し、昇華によって溶媒を除去することによって生成された。次
に、発泡体のような残留物がＮａＯＨ水溶液中で平衡化された。対イオンとして
乳酸塩を用いると（図２ａ）、ＮａＯＨを用いての平衡時のマトリックスの構造
的変化はリン酸塩を用いるとき（図２ｂ）よりも明らかにより少ない。そのマト
リックスの表面はより平滑であり、はっきりとした構造化はあまり見られない。
例７で得られるマトリックスは比較例１からのマトリックスよりも明らかにより
弾性であり、より安定している。それを圧縮することができ、圧力がなくなった
後それは再び弾性的に元の形状を取り戻す。同様に、破壊することなしにそれを
弾性的に曲げることもできる。
【００５９】
生成方法の効果は、図１と図２ａとを比較すると明らかである。図１（例３）
の場合には凍結乾燥の前に乳酸を中和し、一方で、図２ａのマトリックスの場合
には凍結乾燥の後にＮａＯＨ水溶液を用いての塩基性化によって乳酸を除去した
。マトリックス表面の均一な構造が図１ではっきりと見られ、それには事実上主
な小窩は存在しない。図１で示されるマトリックスは図２ａのマトリックスより
もずっと柔らかく弾性である。
の場合には凍結乾燥の前に乳酸を中和し、一方で、図２ａのマトリックスの場合
には凍結乾燥の後にＮａＯＨ水溶液を用いての塩基性化によって乳酸を除去した
。マトリックス表面の均一な構造が図１ではっきりと見られ、それには事実上主
な小窩は存在しない。図１で示されるマトリックスは図２ａのマトリックスより
もずっと柔らかく弾性である。
【００６０】
マトリックスの特性が表１の定性比較においてまとめられている。
【００６１】
【表１】
【図１】 マトリックスの生成において凍結の前にキトサン水溶液が中和さ
れ、対イオンとして乳酸塩を備える、マトリックスの図である。
れ、対イオンとして乳酸塩を備える、マトリックスの図である。
【図２ａ】 マトリックスの生成において凍結乾燥の後ＮａＯＨ（５重量％
）を用いてマトリックスが平衡化され、対イオンが乳酸塩によって形成される、
マトリックスの図である。
）を用いてマトリックスが平衡化され、対イオンが乳酸塩によって形成される、
マトリックスの図である。
【図２ｂ】 マトリックスの生成において凍結乾燥の後ＮａＯＨ（５重量％
）を用いてマトリックスが平衡化され、対イオンがリン酸塩によって形成される
、マトリックスの図である。
）を用いてマトリックスが平衡化され、対イオンがリン酸塩によって形成される
、マトリックスの図である。
【図３】 軟骨細胞（chondrocytes）によってコロニー化されたマトリック
スの顕微鏡写真の図である。
スの顕微鏡写真の図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月１７日（２００２．４．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 パーマイヤー，アンドレーア
ドイツ、15806 ツォッセン、アイヒホル
ンシュトラーセ、32
(72)発明者 レッツバイヤー，トーマス
ドイツ、27574 ブレーマーハーフェン、
ジーメンスシュトラーセ、８
Ｆターム(参考） 4C081 AA12 AA14 AB19 AB35 AC03
BA01 BA02 BA12 BA17 CD091
CD34 DA04 DA05 DA06 DB01
DB03 DC14
Claims (10)
- 【請求項１】 生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法であっ
て、 キトサンと過剰な酸とから水溶液を調製し、該水溶液を中和し、該中和された
水溶液を凍結し、減圧下での昇華によって水を除去する、方法。 - 【請求項２】 生体適合性３次元マトリックスを生成するための方法であっ
て、 キトサンと、アルキルヒドロキシカルボン酸およびアリールヒドロキシカルボ
ン酸からなる群より選択される過剰な酸とから水溶液を調製し、該水溶液を凍結
し、減圧下での昇華によって水を除去し、昇華による除去の前またはその後に過
剰な酸を除去する、方法。 - 【請求項３】 酸は乳酸である、請求項１または２に記載の方法。
- 【請求項４】 塩基を加えて水溶液のｐＨを５．０から７．５、好ましくは
５．５から７．０、特に６．０から７．０に調整することによって、酸を除去ま
たは中和する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 請求項１から４のいずれかに記載の方法によって得ることの
できる３次元マトリックス。 - 【請求項６】 接着因子、ホルモンおよび／または増殖因子がキトサンフレ
ームワークに結合される、請求項５に記載の３次元マトリックス。 - 【請求項７】 マトリックスは自己フィブリンによってコーティングされる
、請求項５に記載の３次元マトリックス。 - 【請求項８】 培養リアクタ内での固相としての請求項５から７のいずれか
に記載の３次元マトリックスの使用。 - 【請求項９】 インプラントのためのマトリックスとしての請求項５から７
のいずれかに記載の３次元マトリックスの使用。 - 【請求項１０】 請求項５から７のいずれかに記載の３次元マトリックスを
含むインプラント。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19948120.2 | 1999-10-06 | ||
| DE19948120A DE19948120C2 (de) | 1999-10-06 | 1999-10-06 | 3D-Matrix zur Herstellung von Zelltransplantaten |
| PCT/EP2000/009809 WO2001025321A1 (de) | 1999-10-06 | 2000-10-06 | 3d-matrix zur herstellung von zelltransplantaten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003511120A true JP2003511120A (ja) | 2003-03-25 |
| JP3471781B2 JP3471781B2 (ja) | 2003-12-02 |
Family
ID=7924675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001528483A Expired - Fee Related JP3471781B2 (ja) | 1999-10-06 | 2000-10-06 | 細胞移植片を生成するための３ｄマトリックス |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1232203B1 (ja) |
| JP (1) | JP3471781B2 (ja) |
| AT (1) | ATE271579T1 (ja) |
| AU (1) | AU759066B2 (ja) |
| CA (1) | CA2386586A1 (ja) |
| DE (2) | DE19948120C2 (ja) |
| IL (1) | IL148853A0 (ja) |
| WO (1) | WO2001025321A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012520740A (ja) * | 2009-03-16 | 2012-09-10 | ユニバーシティー オブ メンフィス リサーチ ファウンデーション | 傷に剤を届けるための組成物および方法 |
| US9662400B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-05-30 | The University Of Memphis Research Foundation | Methods for producing a biodegradable chitosan composition and uses thereof |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10117234A1 (de) * | 2001-04-06 | 2002-10-10 | Alvito Biotechnologie Gmbh | Poröse und nichtporöse Matrices auf Basis von Chitosan und Hydroxycarbonsäuren |
| JP4859315B2 (ja) * | 2001-09-26 | 2012-01-25 | 京セラ株式会社 | 関節軟骨欠損修復材およびこれを用いた関節欠損修復部材 |
| EP1506026A2 (de) | 2001-10-30 | 2005-02-16 | Alvito Biotechnologie GmbH | Verwendung von chitosanmaterialien |
| JP2004067547A (ja) | 2002-08-02 | 2004-03-04 | Yoshinori Kuboki | チタン繊維医療材料 |
| DE20215659U1 (de) | 2002-10-11 | 2004-02-19 | Alvito Biotechnologie Gmbh | Reagenzienkit zur Kultivierung von Zellen |
| DE10317578A1 (de) * | 2003-04-16 | 2004-10-28 | Alvito Biotechnologie Gmbh | Chitosanfolie als Periost-Ersatz |
| DE102004047115B9 (de) * | 2004-09-27 | 2007-10-31 | Universität Hamburg | Verfahren zur Herstellung einer Wundauflage |
| FR2994185B1 (fr) * | 2012-08-02 | 2015-07-31 | Sofradim Production | Procede de preparation d’une couche poreuse a base de chitosane |
| AU2015221390B2 (en) | 2014-02-20 | 2019-03-07 | Ortho Regenerative Technologies Inc. | Lyophilized polymer scaffold compositions, processes for preparation and use in anabolic wound repair |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02207785A (ja) * | 1989-02-08 | 1990-08-17 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 細胞培養用多孔担体 |
| JPH02261838A (ja) * | 1989-04-03 | 1990-10-24 | Sumitomo Cement Co Ltd | 多孔質キトサン材料の製造方法 |
| JP2571887B2 (ja) * | 1991-11-27 | 1997-01-16 | リグナイト株式会社 | キトサン多孔質体の製造方法 |
| JP4472804B2 (ja) * | 1999-05-18 | 2010-06-02 | 学校法人松本歯科大学 | 骨補填剤及びその製造方法 |
-
1999
- 1999-10-06 DE DE19948120A patent/DE19948120C2/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-10-06 EP EP00967842A patent/EP1232203B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-06 AT AT00967842T patent/ATE271579T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-10-06 JP JP2001528483A patent/JP3471781B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-06 DE DE50007153T patent/DE50007153D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-06 WO PCT/EP2000/009809 patent/WO2001025321A1/de active IP Right Grant
- 2000-10-06 CA CA002386586A patent/CA2386586A1/en not_active Abandoned
- 2000-10-06 AU AU77861/00A patent/AU759066B2/en not_active Ceased
- 2000-10-06 IL IL14885300A patent/IL148853A0/xx unknown
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012520740A (ja) * | 2009-03-16 | 2012-09-10 | ユニバーシティー オブ メンフィス リサーチ ファウンデーション | 傷に剤を届けるための組成物および方法 |
| US8993540B2 (en) | 2009-03-16 | 2015-03-31 | University Of Memphis Research Foundation | Compositions and methods for delivering an agent to a wound |
| US9642948B2 (en) | 2009-03-16 | 2017-05-09 | The University Of Memphis Research Foundation | Compositions and methods for delivering an agent to a wound |
| US10052388B2 (en) | 2009-03-16 | 2018-08-21 | University Of Memphis Research Foundation | Compositions and methods for delivering an agent to a wound |
| US10799592B2 (en) | 2009-03-16 | 2020-10-13 | University Of Memphis Research Foundation | Compositions and methods for delivering an agent to a wound |
| US11576975B2 (en) | 2009-03-16 | 2023-02-14 | University Of Memphis Research Foundation | Compositions and methods for delivering an agent to a wound |
| US9662400B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-05-30 | The University Of Memphis Research Foundation | Methods for producing a biodegradable chitosan composition and uses thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7786100A (en) | 2001-05-10 |
| CA2386586A1 (en) | 2001-04-12 |
| DE19948120C2 (de) | 2001-11-08 |
| AU759066B2 (en) | 2003-04-03 |
| ATE271579T1 (de) | 2004-08-15 |
| DE19948120A1 (de) | 2001-04-19 |
| JP3471781B2 (ja) | 2003-12-02 |
| IL148853A0 (en) | 2002-09-12 |
| EP1232203B1 (de) | 2004-07-21 |
| WO2001025321A1 (de) | 2001-04-12 |
| DE50007153D1 (de) | 2004-08-26 |
| EP1232203A1 (de) | 2002-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200248144A1 (en) | Cartilage gel for cartilage repair, comprising chitosan and chondrocytes | |
| US9555164B2 (en) | Method for preparing porous scaffold for tissue engineering | |
| US5939323A (en) | Hyaluronan based biodegradable scaffolds for tissue repair | |
| US5830507A (en) | Biotherapeutic cell-coated microspheres | |
| US7807150B2 (en) | Injectable composition containing crosslinkable material and cells for forming animal tissue | |
| US20050129730A1 (en) | Tissue composites and uses thereof | |
| CA2212300A1 (en) | In vitro or in vivo gelfying chitosan and therapeutic uses thereof | |
| JP2000512666A (ja) | 細胞培養および移植用の多糖スポンジ | |
| US20100233267A1 (en) | Composite hydrogel | |
| JP3471781B2 (ja) | 細胞移植片を生成するための３ｄマトリックス | |
| US20030119157A1 (en) | Macroporous chitosan beads and preparation method thereof | |
| US20070148770A1 (en) | Macroporous chitosan beads and preparation method thereof | |
| JP2004533288A (ja) | キトサンおよびヒドロキシカルボン酸をベースとする多孔質および非多孔質マトリクス | |
| US20050191356A1 (en) | Porous and non-porous matrices based on chitosan and hydroxy carboxylic acids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20030805 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |