DE10317578A1

DE10317578A1 - Chitosanfolie als Periost-Ersatz

Info

Publication number: DE10317578A1
Application number: DE10317578A
Authority: DE
Inventors: Andrea Dipl.-Biol. Dr. Pahmeier; Birger Dipl.-Biol. Dr. Hahnemann; Thomas Prof. Dipl.-Lebensmittelchem. Dr. Lötzbeyer; Philipp Sperling
Original assignee: ALVITO BIOTECHNOLOGIE GmbH
Current assignee: TICOCHE LTD., 15806 ZOSSEN, DE
Priority date: 2003-04-16
Filing date: 2003-04-16
Publication date: 2004-10-28
Also published as: WO2004091678A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure, z. B. als flexible Folie oder/und poröse Matrix, als Mittel auf dem Gebiet der Orthopädie, insbesondere als Periost-Ersatz.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure, z.B. als flexible Folie oder/und poröse Matrix, als Mittel auf dem Gebiet der Orthopädie, insbesondere als Periost-Ersatz.

Die Deutsche Patentanmeldung 199 48 120.2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer biokompatiblen dreidimensionalen Matrix, wobei eine wässrige Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, eingefroren wird und das Wasser bei vermindertem Druck absublimiert wird, wobei die überschüssige Säure vor dem Einfrieren oder nach dem Absublimieren des Wassers entfernt, insbesondere neutralisiert wird. Weiterhin wird eine durch das Verfahren erhältliche Matrix offenbart, die zur Herstellung von Implantaten verwendet werden kann.

Die Deutsche Patentanmeldung 101 17 234.6 offenbart biokompatible nichtporöse Materialien auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure. Diese Materialien können beispielsweise in Form einer Folie vorliegen.

Ausgehend von dieser Erkenntnis war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Anwendungen für Materialien auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, bereitzustellen.

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, als Mittel auf dem Gebiet der Orthopädie, beispielsweise als Ersatz des Periosts.

In einer ersten Ausführungsform liegt das Material in Form einer flexiblen, insbesondere nichtporösen Folie vor. Die Folie hat eine Dicke von kleiner oder gleich etwa 5 mm, beispielsweise zwischen 0,1 μm und 1 mm, vorzugsweise 1 μm bis 200 μm, besonders bevorzugt etwa 50 μm bis 100 μm und ist erhältlich durch:

– Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
– Trocknen der Lösung ohne Einfrieren und
– Entfernen von überschüssigen Säuren vor oder/und nach dem Trocknen, vorzugsweise durch Neutralisation.

Die Folie kann in vorgefertigten Streifen mit einer Breite von z.B. 1 mm – 10 mm hergestellt werden. Alternativ können die benötigten Folienstücke auch nach Bedarf, d.h. jeweils nach dem Ausmaß des Schadens bzw. der Größe der Läsion, z.B. während einer Operation, angefertigt werden. Hierzu kann die Folie passend oder etwas größer als benötigt zugeschnitten und durch Verkleben oder Vernähen an der Schadensstelle befestigt werden.

Die Folien kann eine glatte Oberfläche aufweisen. Alternativ kann auch eine Folie mit einer ein- der beidseitig strukturierten Oberfläche eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Folie eine oder mehrere Noppen, die einen Durchmesser von beispielsweise 0,1 cm bis 2 cm, insbesondere 0,5 cm bis 1,5 cm und besonders bevorzugt etwa 1 cm und eine Höhe von beispielsweise 0,1 mm bis 5 mm, vorzugsweise 0,2 mm bis 2 mm aufweisen. Eine Folie mit strukturierter Oberfläche kann durch Gießen des Materials in eine entsprechende Form hergestellt werden.

Ein Anwendungsgebiet der Folie ist die Verwendung als Periost-Ersatz, beispielsweise bei operativen Eingriffen an Gelenken, insbesondere bei Knieoperationen. Es wurde auch gefunden, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Folie bei Knorpeldefekten den Heilungsprozess sowie die Knorpelbildung fördert. Die Folie kann sich an die jeweiligen gegebenen Bedingungen anpassen und ist zudem vernähbar. Unter diesen Bedingungen zeigen Chondrozyten, z.B. auch humane Chondrozyten, eine deutlich bessere Vermehrung als in anderen Matrices.

Die Folie kann als Träger für eine poröse dreidimensionale Matrix verwendet werden. Somit können biokompatible Verbundmaterialien bereitgestellt werden, die mindestens eine biokompatible Folie, wie zuvor beschrieben, und mindestens eine biokompatible poröse Matrix umfassen. Die biokompatible poröse Matrix ist vorzugsweise auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure aufgebaut. Es können jedoch auch andere poröse biokompatible Matrices verwendet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das biokompatible Material auf Basis von Chitosan und einer Säure eine poröse Matrix. Besonders bevorzugt wird eine biokompatible poröse Matrix gemäß der deutschen Anmeldung 199 48 120.2 verwendet, die erhältlich ist durch:

– Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
– Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimieren bei verringertem Druck und
– Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren, insbesondere durch Neutralisation mit einer geeigneten Base, z.B. NaOH.

Die poröse Matrix kann beispielsweise als Matrix für Zellen in medizinischen oder veterinärmedizinischen Anwendungen eingesetzt werden. Es wurde gefunden, dass die poröse Matrix besonders gut zum Einwachsen von Chondrozyten geeignet ist. Die Chondrozyten können beispielsweise auch auf der Matrix vermehrt werden. Eine solche Vermehrung kann über einen Zeitraum von wenigen Tagen bis zu mehreren Wochen erfolgen.

Die poröse Matrix kann in vorgefertigten Stücken mit einem Volumen von z.B. 1-10 mm³ hergestellt werden. Alternativ können die benötigten Stücke nach Bedarf, z.B. während einer Operation, angefertigt werden. Hierzu kann die Matrix passend zugeschnitten und durch Verkleben oder Vernähen an der Schadensstelle befestigt werden.

In einer weiteren Ausführungsform kann das Material als Kombination einer flexiblen Folie und einer porösen Matrix vorliegen. Die Folie und die Matrix können dabei als separate Komponenten eingesetzt werden, beispielsweise zur Rekonstruktion von Knorpelgewebe. Ein Beispiel für eine derartige Kombination von Materialien, bei der Folie und Matrix als separate Komponenten eingesetzt werden, ist in 1 gezeigt. Gemäß 1 wird an den Ort der Knorpelläsion (1, 2) eine poröse Matrix (3) eingefügt, welche gegebenenfalls mit Chondrozyten besiedelt ist. Als Abdeckung wird eine Folie (4) verwendet. Die Folie (4) kann mit einem geeigneten Klebstoff, z.B. einem Fibrinkleber oder einem Gewebekleber, fixiert werden oder vernäht werden.

Auf analoge Weise wie in 1 gezeigt, kann eine arthrotonische oder arthroskopische Operation am Knie zur Behandlung von Knorpeldefekten, beispielsweise eine autologe Chondrozytenimplantation, erfolgen. Hierzu wird der Defekt kürettiert und gegebenenfalls eine poröse Matrix, die mit Chondrozyten besiedelt ist, präzise eingepasst. Anstelle einer Matrix können auch mit Chondrozyten besiedelte Schwämmchen aus einem anderen geeigneten Material verwendet werden. Weiterhin ist es möglich, in ein Säckchen eingenähte Zellen einzupflanzen, wobei das Säckchen bevorzugt aus der erfindungsgemäßen Matrix oder Folie besteht. Alternativ können auch Sphäroide unter die Matrix gespritzt werden. Die Fixierung des Transplantats erfolgt entweder durch Verkleben oder durch Vernähen. Anschließend erfolgt eine Abdeckung mit der erfindungsgemäßen Folie.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Folien anstelle von Periostgewebe bietet viele Vorteile. Zunächst kann auf eine Zweitinzision am Patienten, welche zur Entnahme des Periostgewebes erforderlich ist, ebenso wie auf die zeitintensive und aufwändige Präparation des Periosts verzichtet werden. Zudem kann die erfindungsgemäße Folie in gleichbleibender Qualität und in der benötigten Größe einfach bereitgestellt werden. Die Abdeckung mit der Folie bewirkt eine stabile Verankerung der transplantierten Zellen am Ort der Läsion und fördert zudem den Heilungsprozess.

Noch eine weitere bevorzugte Anwendung der Folie betrifft eine Verwendung als biohybrides Implantat, z.B. als Kapsel- oder Röhrenstruktur gegebenenfalls in Kombination mit der porösen Matrix zur Verkapselung von Zellen, insbesondere Chondrozyten. In einer Ausführungsform wird eine Hülle bestehend aus der Folie, z.B. in Form eines Sacks oder einer röhrenartigen Struktur, bereitgestellt, in die Chondrozyten eingefüllt werden. Die Hülle wird an den Ort der Gelenkläsion implantiert und kann beispielsweise Förderung der Knorpelbildung bewirken.

Weiterhin kann das Material auf Chitosanbasis, insbesondere die Folie als Abdeckung von Gewebe, z.B. Knorpelgewebe oder Periostgewebe, nach Verletzungen und/oder während chirurgischer Eingriffe dienen.

Die erfindungsgemäße nichtporöse Folie, die poröse Matrix oder ein darauf basierendes Verbundsystem kann auch zur in vitro Kultivierung von Chondrozyten verwendet werden. Dabei können die Materialien zusätzliche Faktoren zum Zellwachstum, z.B. Zytokine, enthalten.

Die poröse Matrix kann gegebenenfalls anisotrope Strukturen, beispielsweise parallel ausgerichtete Faser oder/und Kammern aufweisen. Die anisotrope Matrix ist erhältlich durch:

– Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
– anisotropes Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimation bei verringertem Druck und
– Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren.

Das anisotrope Einfrieren umfasst vorzugsweise ein Einfrieren unter Verwendung von strukturierten Kälteelementen, z.B. Rohren in direktem oder indirektem Kontakt mit der Matrix während des Einfrierprozesses. Die Kältelemente können langgestreckt sein, um beispielsweise parallel ausgerichtete Fasern oder Kammern in der Matrix zu erhalten. Es können jedoch auch gekrümmte Strukturen, z.B. Nachbildungen des zu formenden Organs, als Kälteelemente verwendet werden.

Die anisotrope poröse Matrix kann in einem biokompatiblen Verbundmaterialsystem zusammen mit einem anderen Material, beispielsweise mit einer biokompatiblen nichtporösen Folie eingesetzt werden. Die anisotrope Matrix bzw. das darauf basierende Verbundmaterialsystem kann zur in vitro Kultivierung von Zellen, beispielsweise Chondrozyten, oder als Implantat ohne vorherige Zellbesiedlung, entsprechend den zuvor genannten Anwendungen, eingesetzt werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Matrices und Folien auf Basis von Chitosan und Säuren erfolgt im Wesentlichen nach dem in den Deutschen Anmeldungen 199 48 120.2 und 101 17 234.6 angegebenen Verfahren, sofern nichts anderes angegeben ist. Vorzugsweise wird zunächst eine wässrige Lösung eines teilweise deacetylierten Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure hergestellt. Unter Überschuss wird dabei verstanden, dass der pH der wässrigen Lösung im Sauren liegt, vorzugsweise unterhalb von pH ≤ 4. Dadurch sind die freien Aminogruppen des Chitosans zumindest teilweise protoniert, wodurch die Löslichkeit in Wasser gesteigert wird. Die Säuremenge ist nicht kritisch. Sie muss lediglich so gewählt sein, dass das Chitosan in Lösung geht. Eine übermäßige Säurezugabe wird nach Möglichkeit vermieden, da überschüssige Säure wieder entfernt werden muss, und dadurch die Aufarbeitung bei großen Säuremengen erschwert wird. Günstig sind Säuremengen, die eine 0,05 bis 1 N, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 N, insbesondere 0,1 bis 0,3 N Lösung ergeben. Die Chitosanmenge wird vorzugsweise so gewählt, dass sich eine 0,01 bis 0,5 M, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 M Lösung ergibt. Durch die Konzentration der Chitosanlösung kann Einfluss auf die Struktur der Matrix, insbesondere deren Porengröße genommen werden. Auf diese Weise lässt sich die Porengröße der Matrix auf den jeweiligen Zelltypus abstimmen, mit dem die Matrix besiedelt werden soll.

Chitosan hat wegen seiner Herstellung aus natürlichen Quellen kein einheitliches Molekulargewicht. Je nach Quelle und Aufbereitungsverfahren kann das Molekulargewicht zwischen 20 kDa bis über 1000 kDa betragen.

Für die Herstellung der dreidimensionalen Matrix ist das Chitosan hinsichtlich seines Molekulargewichts keinen Beschränkungen unterworfen. Für die Herstellung der wässrigen Chitosanlösung wird eine Säure verwendet, bei der es sich um eine anorganische Säure oder vorzugsweise um eine organische Säure, besonders bevorzugt um eine Alkyl- oder Aryl- Hydroxycarbonsäure handelt. Geeignet sind insbesondere Hydroxycarbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei eine oder mehrere Hydroxylgruppen sowie eine oder mehrere Carboxylgruppen im Molekül vorhanden sein können. Spezifische Beispiele sind Glycolsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure und Mandelsäure. Besonders bevorzugt ist Milchsäure.

Bei Herstellung einer porösen Matrix wird die Lösung aus Chitosan und Säure zunächst durch Zugabe von Base zumindest teilweise neutralisiert und dann eingefroren oder ohne vorherige Neutralisation direkt eingefroren. Die Neutralisation vor dem Einfrieren ist bevorzugt. Der pH-Wert nach der Neutralisation beträgt im Allgemeinen 5,0 bis 7,5, vorzugsweise 5,5 bis 7,0 und insbesondere 6,0 bis 7,0.

Nach dem Einfrieren wird das Wasser unter vermindertem Druck absublimiert, beispielsweise im Druckbereich von 0,001 bis 3 hPa.

Zur Herstellung einer nichtporösen Folie wird die Lösung nicht gefroren und absublimiert, sondern ohne Einfrieren bei gegebenenfalls erhöhter Temperatur oder/und verringertem Druck getrocknet und vorzugsweise nach Trocknung neutralisiert. Die entstehende nichtporöse Matrix ist in feuchtem Zustand stark belastbar und dehnbar.

Durch die große Anzahl von Amino- und Hydroxygruppen ist das Material beliebig modifizierbar. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind Liganden kovalent oder nicht kovalent an das Chitosan gebunden, vorzugsweise an die freien Aminogruppen des Chitosans. Als Liganden können z.B. Wachstumsstoffe, Proteine, Hormone, Heparin, Heparansulfate, Chondroitsulfate, Dextransulfate oder eine Mischung dieser Substanzen verwendet werden. Die Liganden dienen vorzugsweise zur Kontrolle und Verbesserung der Zellproliferation.

Das Zellwachstum auf der Matrix bzw. der Folie wird weiter verbessert, wenn die Matrix mit autologem Fibrin beschichtet ist.

Die dreidimensionale Matrix kann mit eukaryontischen Zellen, z.B. mit humanen oder mit animalischen Zellen (beispielsweise vom Pferd, Hund oder Hai) besiedelt werden. Besonders geeignet sind Haizellen, da diese beim Empfänger keine wesentliche immunologische Antwort auslösen.

Die Materialien, wie zuvor beschrieben, können im humanmedizinischen und im tiermedizinischen Bereich eingesetzt werden, insbesondere bei orthopädischen Eingriffen an Knochen und Gelenken.

Die Materialien werden vor Einsatz in der Zellkultur sterilisiert, um Keimfreiheit zu garantieren. Die Sterilisation kann durch Temperaturbehandlung, z.B. durch Autoklavieren, Dampfbehandlung etc. oder/und durch Bestrahlung, z.B. Gammastrahlenbehandlung, erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Sterilisation in einer physiologisch verträglichen gepufferten Lösung, z.B. in PBS, um eine vollständige Benetzung der Matrix bzw. der Folie mit Flüssigkeit und die Abwesenheit größerer Lufteinschlüsse sicherzustellen.

Bei Kultivierung der Zellen wird das Material in einem Zeitraum von ca. 5-8 Wochen oder länger abgebaut. Die Abbauzeiten können über den Deacetylierungsgrad des Chitosans und die Konzentration des Materials eingestellt werden.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele erläutert werden.
Erläuterung der Abbildungen:
1 zeigt eine Kombination von Materialien, bei denen Folie und Matrix als separate Kombinationen eingesetzt werden.
Die 2 bis 8 zeigen die erfindungsgemäße Anwendung einer Folie bei einer Knieoperation. In 2 ist ein tiefer Knorpeldefekt in einem Rinderknie zu erkennen. 3 zeigt die Auflage einer erfindungsgemäßen Folie mit Dicke von 70 μm als Periostersatz. In den 4 bis 6 ist der Prozess des Vernähens der Folie dargestellt. 7 zeigt die vollständig vernähte Folie. In 8 ist das Befüllen des Defekts, beispielsweise mit Sphäroiden, mittels Injektion unter die Folie zu erkennen.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung einer nichtporösen Folie
Nach dem in Beispiel 3 von DE 199 48 120.2 beschriebenen Verfahren wird eine Mischung aus Chitosan und Milchsäure hergestellt. Die Lösung wird in eine Petrischale gegossen, bei 50 °C getrocknet und nach Entstehen eines glasklaren Filmes mit 1 M Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert. Die entstehende Folie ist im feuchten Zustand stark belastbar und dehnbar.
Durch gezielte Zugabe der Natronlauge von einer Seite her kann eine Folie mit "Memory-Effekt" erzeugt werden.
Beispiel 2: In vitro Kultivierung von Chondrozyten
Es wurden Chondrozyten auf die Folie bzw. auf die Matrix aufgebracht und in vitro angezüchtet. Die Anzüchung von Chondrozyten gelingt in der Matrix insbesondere bei Porendurchmessern von etwa 20 μm bis 100 μm.

Claims

Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure als Mittel auf dem Gebiet der Orthopädie.
Verwendung nach Anspruch 1 als Periostersatz.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Material in Form einer flexiblen, insbesondere nichtporösen, Folie vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Folie Noppen aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Material in Form einer porösen Matrix vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Material als Kombination einer flexiblen Folie und einer porösen Matrix vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Folie und Matrix als separate Komponenten eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Folie und Matrix als Verbundkomponente eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Aufwachsen von Chondrozyten.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Material eine Dicke im Bereich von 0,1 μm bis 5 mm aufweist.
Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure als Mittel zur Reparatur von Knorpelgewebe.
Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure als Schwämmchen zur Besiedlung mit Chondrozyten.
Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure als Säckchen, in das Zellen eingenäht werden können.
Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure zur Abdeckung von Knochen und Gelenken nach Verletzungen und/oder während chirurgischer Eingriffe.