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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konservierung von tierischem Knorpelgewebe, insbesondere von porcinem Knorpelgewebe, ein mit diesem Verfahren erhältliches Transplantat sowie die Verwendung eines solchen Transplantats.
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Gewebetransplantate werden für viele Anwendungen eingesetzt, wie zur Rekonstruktion von Knorpel- und/oder Knochenstrukturen beispielsweise in der Schönheitschirurgie, wie zum Beispiel in der Rhinoplastik. Darüber hinaus werden sie beispielsweise auch bei Operationen an der Wirbelsäule, in der Sportmedizin beispielsweise bei Eingriffen zur Wiederherstellung von Sehnen und Bändern, bei zahnärztlichen Operationen beispielsweise zum Aufbau des Kieferknochens oder zur Weichgeweberegeneration, zum Auffüllen von Knochendefekten im Falle eines Tumors, bei der Korrektur angeborener Defekte, bei der Revision von Hüftprothesen oder bei der Behandlung von Bauchwanddefekten eingesetzt. Dabei können grundsätzlich sowohl Transplantate aus Gewebe natürlichen Ursprungs als auch Transplantate aus synthetischem Material verwendet werden.
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Transplantate aus synthetischem Material zeichnen sich durch eine gute Handhabung und Verarbeitbarkeit aus, verheilen jedoch in der Regel schlechter mit dem nativen Gewebe als Transplantate aus Gewebe natürlichen Ursprungs, weswegen letztere bevorzugt sind. Grundsätzlich werden drei Arten von Gewebetransplantaten natürlichen Ursprungs unterschieden, nämlich autogene Gewebetransplantate, bei denen Spender und Empfänger dieselbe Person sind, wobei das Transplantat üblicherweise an einer anderen Stelle als der Entnahmestelle eingesetzt wird, allogene Gewebetransplantate, bei denen Spender und Empfänger verschiedene Individuen einer Spezies sind, sowie xenogene Gewebetransplantate, bei denen der Spender einer anderen Art, beispielsweise Schwein, angehört als der Empfänger, beispielsweise Mensch. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit allogener und insbesondere autogener Gewebetransplantate sind xenogene Gewebetransplantate von besonderem Interesse. Dabei sind insbesondere Gewebetransplantate aus Schweinen begehrt, weil diese physiologisch besser den Anforderungen an den menschlichen Körper genügen als beispielsweise Gewebetransplantate aus Primaten. Hinzu kommt die nahezu unbegrenzte Verfügbarkeit von porcinen Geweben.
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Ein wesentlicher Aspekt bei der Herstellung von Gewebetransplantaten ist es, dass die native Struktur des Gewebes in dem fertigen Transplantat möglichst beibehalten wird, damit dieses beispielsweise im Hinblick auf die innere Oberfläche, die Handhabbarkeit und die Elastizität zumindest weitgehend die Eigenschaften des Nativgewebes aufweist. Während dies bei bekannten Verfahren für einige Gewebe, wie Knochen oder Hohlgewebe, beispielsweise Blutgefäße, erreicht wird, gelingt dies für Knorpel nicht oder zumindest nicht in einem befriedigenden Ausmaß. Bei Knorpel handelt es sich im Vergleich zu anderen Geweben, wie Knochen oder Hohlgeweben, um ein besonderes Gewebe, das sowohl druck- als auch biegungselastisch ist, wobei sich speziell hyaliner Knorpel zudem durch ein hohes Wasseraufnahmevermögen auszeichnet. Knorpel besteht aus in Interzellularsubstanz eingebetteten Knorpelzellen, wobei die Interzellularsubstanz im Wesentlichen aus Kollagenfasern, Proteoglykanen, Hyaluronsäure und Wasser zusammengesetzt ist. Als einziges Gewebe ist Knorpel nicht durchblutet, so dass die Zuführung von Nährstoffen in das Gewebe und die Abführung von Stoffwechselprodukten aus dem Gewebe ausschließlich durch Diffusion erfolgt. Wichtige Beispiele für Knorpel sind beispielsweise hyaline Knorpel, wie Gelenk-, Rippen- und Nasenknorpel, Faserknorpel, wie Meniskus oder Labrum glenoidale des Schultergelenks, und elastischer Knorpel, wie Kehldeckel oder Ohrtrompete. Knorpel unterscheidet sich damit fundamental von anderen Geweben und insbesondere von anderen in der Transplantation eingesetzten Geweben, wie beispielsweise Knochen und Blutgefäßen, welche allesamt durchblutet sind. Zudem unterscheiden sich Knorpel von Blutgefäßen auch darin, dass Knorpel eine sehr viel geringere Zelldichte als Blutgefäßen aufweisen. Ein weiterer Unterschied zwischen Knochen und Knorpel ist, dass auf dem in Knochen enthaltendem Kollagen das Mineral Hydroxylapatit abgelagert ist.
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Ein bekanntes Verfahren zur Aufbereitung von u. a. Knorpelgewebe zur Verwendung als allogenes oder xenogenes Transplantat ist aus der
WO 2010/108945 A1 bekannt. Bei diesem Verfahren wird eine entsprechende Gewebeprobe zunächst einer Behandlung mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von mehr als 12, wie insbesondere Natronlauge, unterworfen, bevor die so behandelte Probe mit einem starken chaotropen Salz, insbesondere Guanidiumhydrochlorid, behandelt und dann getrocknet wird. Dabei sollen durch die alkalische Behandlung Kontaminanten, wie Proteine und Lipide, größtenteils hydrolysiert werden, Pathogene, wie Viren und Bakterien, inaktiviert werden und zudem eine Quellung des Gewebes erreicht werden, was die Wirksamkeit der in den nachfolgenden Schritten eingesetzten Chemikalien erhöhen soll. Außerdem sollen durch die nachfolgende Behandlung mit einem starken chaotropen Salz nicht-kollagene Bestandteile des Gewebes denaturiert werden. Allerdings führt der alkalische Behandlungsschritt zu irreversiblen Schäden an der nativen Struktur des Knorpelgewebes, so dass die mit diesem Verfahren erhaltenen Knorpelgewebe als unbefriedigend empfunden werden.
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Ausgehend davon liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Konservierung von tierischem Knorpelgewebe bereitzustellen, welches einfach, schnell und kostengünstig durchgeführt werden kann und zu einem Knorpelgewebetransplantat führt, dessen Morphologie der nativen Struktur des Ausgangsgewebes zumindest weitgehend entspricht. Zudem soll dieses Verfahren insbesondere zur Konservierung von porcinem Knorpelgewebe geeignet sein.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Konservierung von tierischem Knorpelgewebe, insbesondere von porcinem Knorpelgewebe, gelöst, welches die nachfolgenden Schritte umfasst:
- a) Bereitstellen von tierischem Knorpelgewebe,
- b) ein- oder mehrmaliges Behandeln des in dem Schritt a) bereitgestellten tierisches Knorpelgewebes mit einer in Bezug auf die Knorpelgewebezellen hypertonen Lösung von einem oder mehreren Alkalimetallhalogenidsalzen,
- c) ein- oder mehrmaliges Behandeln des gemäß dem Schritt b) behandelten tierischen Knorpelgewebes mit einem Oxidationsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peroxiden, Hypochloriten, Percarbonsäuren, Ozon und beliebigen Mischungen hiervon sowie
- d) ein- oder mehrmaliges Behandeln des gemäß dem Schritt c) behandelten tierischen Knorpelgewebes mit einem Lösungsmittel, welches mit Wasser bei 20°C vollständig mischbar ist,
wobei das tierische Knorpelgewebe während des Verfahrens nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 12 oder mehr in Kontakt gebracht wird.
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Diese Lösung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass durch die Behandlung von tierischem Knorpelgewebe mit einer hypertonen Lösung von einem oder mehreren Alkalimetallhalogenidsalzen, bevorzugt wässriger Natriumchloridlösung, durch nachfolgendes Behandeln mit einem spezifischen Oxidationsmittel, bevorzugt Wasserstoffperoxid, und durch anschließendes Trocknen des so erhaltenen Gewebes mit einem mit Wasser bei 20°C vollständig mischbaren Lösungsmittel, bevorzugt Aceton, eine hervorragende Konservierung von Knorpelgewebe erreicht wird, wobei eine Schädigung der Kollagenmatrix des Knorpelgewebe vollständig oder zumindest nahezu vollständig verhindert wird, so dass ein Knorpelgewebetransplantat erhalten wird, dessen Morphologie der nativen Struktur des Ausgangsgewebes zumindest weitgehend entspricht. Insbesondere wird mit diesem Verfahren ein konserviertes Knorpelgewebe erhalten, welches keine lebenden Knorpelzellen mehr enthält, welches einfach schneidbar ist sowie keine Risse und Unebenheiten aufweist. Dabei werden die Knorpelzellen in dem Verfahrensschritt b) durch die Behandlung mit einer – in Bezug auf die Knorpelgewebezellen – hypertonen Lösung von einem oder mehreren Alkalimetallhalogenidsalzen zum Platzen gebracht, so dass die intrazellulären Bestandteile aus den Zellen herausgewaschen und entfernt werden können, ohne aber die Struktur des Knorpelgewebes und insbesondere des Kollagens zu beeinträchtigen. Die nachfolgende oxidative Behandlung in dem Verfahrensschritt c) führt zu einer Inaktivierung von in dem Gewebe enthaltenen Pathogenen und zu einer Denaturierung wasserlöslicher Antigene, wiederum aber nicht zu einer Beeinträchtigung der Struktur des Knorpelgewebes und insbesondere des Kollagens. Schließlich führt die Behandlung mit vollständig mit Wasser mischbarem Lösungsmittel in dem Verfahrensschritt d) zu einer schonenden, die native Struktur des Knorpelgewebes bewahrenden Entwässerung bzw. Trocknung des Gewebes. Auf diese Weise kann schnell, einfach und kostengünstig tierisches Knorpelgewebe konserviert und tierisches Knorpelgewebetransplantat erhalten werden, dessen Morphologie der nativen Struktur des Ausgangsgewebes zumindest weitgehend entspricht. Dabei ist dieses Verfahren insbesondere zur Konservierung von porcinem Knorpelgewebe geeignet. Entscheidend ist dabei, dass aufgrund der Verfahrensschritte b) bis d) und insbesondere aufgrund der Behandlung des Knorpelgewebes in dem Verfahrensschritt b) mit einer in Bezug auf die Knorpelgewebezellen hypertonen Lösung von einem oder mehreren Alkalimetallhalogenidsalzen auf alkalische Behandlungsschritte und auch auf Behandlungsschritte mit stark chaotropen Substanzen, wie Guanidiumhydrochlorid, welche die Gewebestruktur verändern, verzichtet werden kann.
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Wie dargelegt, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Konservierung von allen tierischen Knorpelgeweben und insbesondere zur Konservierung von allen porcinen Knorpelgeweben. Aufgrund der Tatsache, dass Knorpelgewebetransplantate aus Schweinen physiologisch den Anforderungen an den menschlichen Körper besonders gut genügen, wird in dem Verfahrensschritt a) bevorzugt porcines Knorpelgewebe und bevorzugt porcines Rippenknorpelgewebe bereitgestellt.
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In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird es vorgeschlagen, in dem Verfahrensschritt a) porcines Knorpelgewebe bereitzustellen, welches aus einem Schwein mit einem Alter von maximal 2 Jahren stammt. Überraschenderweise hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung herausgestellt, dass insbesondere Knorpelgewebe derart junger Schweine zu Knorpelgewebetransplantat mit besonders guten Eigenschaften führt. Ohne an eine Theorie gebunden werden zu wollen, wird es erachtet, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass das Knorpelgewebe älterer Schweine oder älterer anderer Tiere bereits zu einem gewissen Ausmaß verkalkt ist, was in Bezug auf die Eigenschaften des mit dem Verfahren hergestellten Transplantats nachteilig ist.
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Grundsätzlich kann das tierische Knorpelgewebe in dem Verfahrensschritt b) mit einer beliebigen Lösung von einem beliebigen Alkalimetallhalogenid oder mit einer beliebigen Lösung von einer Mischung aus mehreren beliebigen Alkalimetallhalogeniden behandelt werden, sofern das Lösungsmittel die Struktur des Knorpelgewebes nicht oder zumindest nicht merklich angreift. Gute Ergebnisse werden dabei insbesondere erzielt, wenn das tierische Knorpelgewebe in dem Verfahrensschritt b) mit einer wässrigen Lösung von einem beliebigen Alkalimetallhalogenid oder mit einer wässrigen Lösung von einer Mischung aus mehreren beliebigen Alkalimetallhalogeniden behandelt wird. Dabei besteht die Lösung und bevorzugt die wässrige Lösung vorzugsweise aus dem Lösungsmittel und dem bzw. den Alkalimetallhalogenid(en), enthält also keine weitere Verbindung(en). Dabei weist die in dem Verfahrensschritt b) eingesetzte Lösung bevorzugt einen pH-Wert von maximal 9, besonders bevorzugt einen pH-Wert von maximal 8 und ganz besonders bevorzugt einen pH-Wert von maximal 7,5 auf.
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Dabei wird als Lösungsmittel mit Vorteil Wasser mit einem hohen Reinheitsgrad eingesetzt und besonders bevorzugt destilliertes Wasser oder Wasser mit einem destilliertem Wasser entsprechenden Reinheitsgrad.
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Als Alkalimetallhalogenid kann dabei jedes beliebige eingesetzt werden, also Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Rubidiumchlorid, Cäsiumchlorid und/oder Franciumchlorid, wobei gute Ergebnisse jedoch insbesondere mit einem oder mehreren Alkalimetallhalogeniden ausgewählt aus Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und beliebigen Mischungen von zwei oder mehr hiervon erzielt werden.
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Ganz besonders bevorzugt wird in dem Verfahrensschritt b) eine Natriumchloridlösung und höchst bevorzugt eine wässrige Natriumchloridlösung eingesetzt.
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Prinzipiell kann die in dem Verfahrensschritt b) eingesetzte Salzlösung jede Salzkonzentration aufweisen, solange die Lösung in Bezug auf die Knorpelgewebezellen hyperton ist. Dabei sollte die Konzentration jedoch so hoch gewählt werden, dass ein Platzen der Zellen in der Zeit, für welche der Verfahrensschritt durchgeführt wird, zuverlässig erreicht wird, oder aber so niedrig, dass die Struktur und Morphologie des Knorpelgewebes nicht oder zumindest nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Gute Ergebnisse werden diesbezüglich erzielt, wenn das tierische Knorpelgewebe in dem Verfahrensschritt b) mit einer wässrigen Lösung behandelt wird, welche 5 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 12 Gew.-% und höchst bevorzugt etwa 10 Gew.-% eines Alkalimetallhalogenids oder einer Mischung aus zwei oder mehr verschiedener Alkalimetallhalogenid enthält. Vorzugsweise wird in dem Verfahrensschritt b) eine wässrige Lösung eingesetzt, welche 5 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 15 Gew.-% und besonders bevorzugt 8 bis 12 Gew.-% Natriumchlorid enthält. Ferner ist es bevorzugt, dass die eingesetzte Lösung neben dem eingesetzten Lösungsmittel und darin enthaltenen Alkalimetallhalogenid, insbesondere Natriumchlorid, kein weiteres Salz und auch keine sonstigen Verbindungen enthält und vorzugsweise einen pH-Wert von maximal 9, besonders bevorzugt einen pH-Wert von maximal 8 und ganz besonders bevorzugt einen pH-Wert von maximal 7,5 aufweist.
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Um eine besonders vollständige Entfernung der intrazellulären Bestandteile aus dem eingesetzten Knorpelgewebe zu erreichen, wird es in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, das tierische Knorpelgewebe in dem Verfahrensschritt b) 1- bis 20-mal, bevorzugt 3- bis 15-mal, besonders bevorzugt 5- bis 10-mal, ganz besonders bevorzugt 7- bis 9-mal und höchst bevorzugt 8-mal mit jeweils frischer hypertoner Salzlösung zu behandeln. Zwischen den einzelnen Teilschritten kann das Knorpelgewebe optional ein oder mehrmals mit Wasser oder einem anderen hypotonen Medium gespült werden. Durch eine solche Wechselbadbehandlung mit hypertoner Salzlösung/Wasser bzw. hypertoner Lösung wird der Transport von zellulären Bestandteilen aus der Gewebestruktur durch Diffusionsvorgänge infolge wechselnder osmotischer Verhältnisse in dem Gewebe begünstigt und somit der Effekt der Salzbehandlung verbessert.
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Gute Ergebnisse werden dabei insbesondere erzielt, wenn jede Behandlung in dem Verfahrensschritt b) für 1 bis 48 Stunden, bevorzugt für 5 bis 36 Stunden, besonders bevorzugt für 12 bis 24 Stunden und ganz besonders bevorzugt für 14 bis 20 Stunden durchgeführt wird, und zwar bevorzugt mit einem, bezogen auf das Gewicht des tierischen Knorpelgewebes, 5- bis 15-fachen Volumen, bevorzugt 6- bis 14-fachen Volumen, insbesondere bevorzugt 7- bis 13-fachen Volumen, weiter bevorzugt 8- bis 12-fachen Volumen und ganz besonders bevorzugt 9- bis 11-fachen, wie insbesondere 10-fachen, Volumen an hypertoner Salzlösung.
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Dabei kann der Verfahrensschritt b) optional beispielsweise auf einer Rüttelvorrichtung oder in einer rotierenden Trommel durchgeführt werden. Optional kann die in dem Verfahrensschritt b) eingesetzte Lösung mit Ultraschall beaufschlagt werden.
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In dem Verfahrensschritt c) wird das zuvor mit Salzlösung behandelte Knorpelgewebe mit einem Oxidationsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peroxiden, Hypochloriten, Percarbonsäuren, Ozon und beliebigen Mischungen hiervon behandelt, um in dem Gewebe enthaltene Pathogene zu inaktivieren und wasserlösliche Antigene zu denaturieren. Vorzugsweise werden dabei wässrige Lösungen ein oder mehrerer diese Substanzen eingesetzt. Dabei beträgt die Konzentration des Oxidationsmittels oder, im Falle des Einsatzes eine Mischung aus zwei oder mehr Oxidationsmittel, die Summe der Konzentrationen der Oxidationsmittel vorzugsweise 0,5 bis 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 bis 5 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 2 bis 4 Gew.-%, wie insbesondere bevorzugt etwa 3 Gew.-%. Ferner ist es bevorzugt, dass die eingesetzte Lösung neben dem eingesetzten Lösungsmittel und dem darin enthaltenen Oxidationsmittel keine weiteren Verbindungen enthält und vorzugsweise einen pH-Wert von maximal 9, besonders bevorzugt einen pH-Wert von maximal 8 und ganz besonders bevorzugt einen pH-Wert von maximal 7,5 aufweist.
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Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in dem Verfahrensschritt c) eine wässrige Wasserstoffperoxidlösung eingesetzt, welche 0,5 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 5 Gew.-% und besonders bevorzugt 2 bis 4 Gew.-%, wie insbesondere 3 Gew.-%, Wasserstoffperoxid enthält. Dabei wird als Lösungsmittel mit Vorteil Wasser mit einem hohen Reinheitsgrad und besonders bevorzugt destilliertes Wasser oder Wasser mit einem destillierten Wasser entsprechenden Reinheitsgrad eingesetzt.
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Um eine besonders vollständige Inaktivierung von in dem Gewebe enthaltenen Pathogenen und eine besonders vollständige Denaturierung wasserlöslicher Antigene zu erreichen, wird es in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, das tierische Knorpelgewebe in dem Verfahrensschritt c) 1- bis 5-mal, bevorzugt 1- bis 3-mal und besonders bevorzugt 2-mal mit jeweils frischem Oxidationsmittel und bevorzugt mit frischer wässriger Wasserstoffperoxidlösung zu behandeln. Zwischen den einzelnen Teilschritten kann das Knorpelgewebe optional ein oder mehrmals mit Wasser, Oxidationsmittel oder physiologischer Kochsalzlösung gespült werden.
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Gute Ergebnisse werden dabei insbesondere erzielt, wenn jede Behandlung in dem Verfahrensschritt c) für 1 bis 48 Stunden, bevorzugt für 5 bis 36 Stunden, besonders bevorzugt für 12 bis 24 Stunden und ganz besonders bevorzugt für 14 bis 20 Stunden durchgeführt wird, und zwar bevorzugt mit einem, bezogen auf das des tierischen Knorpelgewebes, 5- bis 15-fachen Volumen, bevorzugt 6- bis 14-fachen Volumen, insbesondere bevorzugt 7- bis 13-fachen Volumen, weiter bevorzugt 8- bis 12-fachen Volumen und ganz besonders bevorzugt 9- bis 11-fachen, wie insbesondere 10-fachen, Volumen an Oxidationsmittel und bevorzugt wässriger Wasserstoffperoxidlösung durchgeführt wird.
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Dabei kann der Verfahrensschritt b) optional beispielsweise auf einer Rüttelvorrichtung oder in einer rotierenden Trommel durchgeführt werden. Optional kann die in dem Verfahrensschritt b) eingesetzte Lösung mit Ultraschall beaufschlagt werden.
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Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das tierische Knorpelgewebe in dem Verfahrensschritt d) mit einem Lösungsmittel behandelt, welches aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Methylethylketon und beliebigen Mischungen aus zwei oder mehr dieser Verbindungen besteht. Durch diese Lösungsmittel wird in dem Verfahrensschritt d) eine besonders schonende Entwässerung bzw. Trocknung des Knorpelgewebes erreicht, und zwar unter Beibehaltung oder zumindest nahezu vollständiger Beibehaltung der nativen Struktur des Knorpelgewebes. Besonders gute Ergebnisse werden dabei insbesondere erreicht, wenn in dem Verfahrensschritt d) als Lösungsmittel Aceton eingesetzt wird. Vorzugsweise wir reines Lösungsmittel eingesetzt, d. h. Lösungsmittel, welche keine weiteren Verbindungen enthält.
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Um eine wirksame Entwässerung bzw. Trocknung sicherzustellen, ist es gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass das tierische Knorpelgewebe in dem Verfahrensschritt d) 1- bis 15-mal, bevorzugt 3- bis 10-mal, besonders bevorzugt 4- bis 9-mal, ganz besonders bevorzugt 6- bis 8-mal und höchst bevorzugt 7-mal mit jeweils frischem Lösungsmittel, insbesondere Aceton, behandelt wird.
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Dabei wird mit Vorteil jede Behandlung in dem Verfahrensschritt d) für 1 bis 48 Stunden, bevorzugt für 5 bis 36 Stunden, besonders bevorzugt für 12 bis 24 Stunden und ganz besonders bevorzugt für 14 bis 20 Stunden durchgeführt, und zwar bevorzugt mit einem, bezogen auf das des tierischen Knorpelgewebes, 5- bis 15-fachen Volumen, bevorzugt 6- bis 14-fachen Volumen, insbesondere bevorzugt 7- bis 13-fachen Volumen, weiter bevorzugt 8- bis 12-fachen Volumen und ganz besonders bevorzugt 9- bis 11-fachen, wie insbesondere 10-fachen, Volumen Lösungsmittel.
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Dabei kann der Verfahrensschritt b) optional beispielsweise auf einer Rüttelvorrichtung oder in einer rotierenden Trommel durchgeführt werden. Optional kann die in dem Verfahrensschritt b) eingesetzte Lösung mit Ultraschall beaufschlagt werden.
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Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nach der Trocknung von dem Knorpel in einem Verfahrensschritt e) die Knorpelhaut bzw. das Perichondrium entfernt, wonach der Knorpel ferner optional auf die gewünschten Ausmaße geschnitten wird. Dabei wird die Entfernung des Perichondriums bevorzugt mechanisch durchgeführt, und zwar besonders bevorzugt durch Fräsen, wie beispielsweise mit Hilfe eines Dremels.
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Anschließend wird das Knorpelgewebe bevorzugt in einer wässrigen Lösung und besonders bevorzugt in einer wässrigen physiologischen Kochsalzlösung rehydratisiert und gelagert.
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Anschließend kann der in Flüssigkeit gelagerten Knorpel verpackt und bevorzugt sterilisiert werden. Dabei wird die Sterilisierung vorzugsweise durch Bestrahlung erreicht, und zwar beispielsweise durch Bestrahlung mit gamma-Strahlen mit einer Dosis von 1 bis 100 kGy, bevorzugt 5 bis 50 kGy, besonders bevorzugt 10 bis 30 kGy und höchst bevorzugt etwa 20 kGy.
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Wie vorstehend dargelegt, ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Konservierung von tierischem Knorpelgewebe dadurch gekennzeichnet, dass das tierische Knorpelgewebe während des Verfahrens nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 12 oder mehr in Kontakt gebracht wird. Dabei ist es bevorzugt, dass das Knorpelgewebe während des Verfahrens nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 11 oder mehr, weiter bevorzugt nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 10 oder mehr, besonders bevorzugt nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 9 oder mehr und ganz besonders bevorzugt nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 8 oder mehr in Kontakt gebracht wird. Dadurch kann eine Beeinträchtigung der nativen Morphologie und Struktur des eingesetzten Knorpelgewebes zuverlässig verhindert werden.
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Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die nachfolgenden Schritte:
- a) Bereitstellen von porcinem Knorpelgewebe, welches aus einem Schwein mit einem Alter von maximal 2 Jahren stammt,
- b) ein- oder mehrmaliges Behandeln des porcinem Knorpelgewebes mit einer wässrigen Lösung, welche 5 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 15 Gew.-% und besonders bevorzugt 8 bis 12 Gew.-% Natriumchlorid enthält,
- c) ein- oder mehrmaliges Behandeln des tierisches Knorpelgewebes mit einer 1 bis 5 Gew.-% Wasserstoffperoxid enthaltenden wässrigen Lösung und
- d) ein- oder mehrmaliges Behandeln des tierisches Knorpelgewebes mit Aceton,
wobei das tierische Knorpelgewebe während des Verfahrens nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 12 oder mehr, bevorzugt nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 11 oder mehr, weiter bevorzugt nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 10 oder mehr, besonders bevorzugt nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 9 oder mehr und ganz besonders bevorzugt nicht mit einem alkalischen Medium mit einem pH-Wert von 8 oder mehr in Kontakt gebracht wird. Dadurch kann eine Beeinträchtigung der nativen Morphologie und Struktur des eingesetzten Knorpelgewebes zuverlässig verhindert werden.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein tierisches Knorpelgewebetransplantat und bevorzugt porcines Knorpelgewebetransplantat, welches mit dem zuvor beschriebenen Verfahren erhältlich ist.
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Zudem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des zuvor beschriebenen tierischen Knorpelgewebetransplantats zur Rekonstruktion von Knorpel- und/oder Knochenstrukturen. Dabei kann das tierische Knorpelgewebetransplantat insbesondere in der Rhinoplastik eingesetzt werde, wie beispielsweise zur Rekonstruktion der Nasenscheidewand oder des Nasendorsums. Weitere besonders geeignete Verwendungsmöglichkeiten liegen in der Rekonstruktion des Orbitalbodens oder der Gaumenspalte.
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Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand eines diese nicht beschränkenden Ausführungsbeispiels näher erläutert.
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Beispiel
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Aus einem frisch geschlachteten Schwein mit einem Alter von 0,5 Jahren wurde Rippenknorpel isoliert und etwaig daran haftendes Fett und dieses umgebendes Gewebe entfernt. Der Knorpel wurde in Stücke mit Ausmaßen von jeweils 6 cm × 1 cm × 1 cm geschnitten.
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Danach wurden porcine Rippenknorpelstücke in einer Trommel gemäß dem nachfolgenden Behandlungsschema behandelt:
Schritt | Aktion | Zeit (h) |
1 | Spülen mit Wasser (3×) | |
2 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 10 Gew.-% Natriumchloridlösung | 20 Std. |
3 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
4 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 10 Gew.-% Natriumchloridlösung | 20 Std. |
5 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
6 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 10 Gew.-% Natriumchloridlösung | 20 Std. |
7 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
8 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 10 Gew.-% Natriumchloridlösung | 20 Std. |
9 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
10 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 10 Gew.-% Natriumchloridlösung | 20 Std. |
11 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
12 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 10 Gew.-% Natriumchloridlösung | 20 Std. |
13 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
14 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 10 Gew.-% Natriumchloridlösung | 20 Std. |
15 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
16 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 10 Gew.-% Natriumchloridlösung | 20 Std. |
17 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
18 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 3 Gew.-% Wasserstoffperoxidlösung | 24 Std. |
19 | Behandeln mit 10-fachem Volumen wässriger 3 Gew.-% Wasserstoffperoxidlösung | 72 Std. |
20 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
21 | Spülen mit wässriger 0,9 Gew.-% Natriumchloridlösung (3×) | Je 15 Min. |
22 | Spülen mit H2O (3×) | Je 5 Min. |
23 | Behandeln mit 10-fachem Volumen Aceton | 16 Std. |
24 | Behandeln mit 10-fachem Volumen Aceton | 24 Std. |
25 | Behandeln mit 10-fachem Volumen Aceton | 24 Std. |
26 | Behandeln mit 10-fachem Volumen Aceton | 24 Std. |
27 | Behandeln mit 10-fachem Volumen Aceton | 24 Std. |
28 | Behandeln mit 10-fachem Volumen Aceton | 24 Std. |
29 | Behandeln mit 10-fachem Volumen Aceton | 24 Std. |
30 | Umlufttrocknung | 72 Std. |
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Als Wasser wurde in allen Lösungen destilliertes Wasser bzw. Wasser mit einem entsprechenden Reinheitsgrad eingesetzt.
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Nach der chemischen Behandlung wurde von den Rippenknorpelstücken jeweils die Knorpelhaut entfernt. Danach wurden die die porcinen Rippenknorpelstücke auf die gewünschten Ausmaße geschnitten und schließlich jeweils in 1,5 Gew.-% Wasserstoffperoxid und 0,9 Gew.-% Natriumchlorid enthaltenden wässrigen Lösungen rehydratisiert und gelagert, wobei das Wasserstoffperoxid dem Zweck dient, ein etwaiges Keimwachstum in dem Knorpelgewebe zu verhindern. Anschließend wurden die einzelnen, in Flüssigkeit gelagerten Rippenknorpelstücke verpackt und zwecks Sterilisierung bestrahlt, und zwar mit gamma-Strahlen mit einer Dosis von 20 kGy.
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Die so hergestellten Transplantate wiesen eine der nativen Struktur nahezu identische Morphologie auf.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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